CN104220051B - 自然杀伤/t细胞淋巴瘤(nktcl)易感性预测，诊断和治疗 - Google Patents

自然杀伤/t细胞淋巴瘤(nktcl)易感性预测，诊断和治疗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种自然杀伤/T细胞淋巴瘤(NKTCL)易感性的预测、诊断和治疗。本发明涉及一种用于在受试者中预测自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或诊断NKTCL的方法，该方法包括测试JAK突变。本发明还涉及一种使用包括至少一种JAK突变的细胞系筛选能够治疗NKTCL的候选药剂方法。本发明包括一种包括至少一种JAK突变的NKTCL动物模型。本发明还包括用于治疗NKTCL的JAK抑制剂。

Description

自然杀伤/T细胞淋巴瘤(NKTCL)易感性预测，诊断和治疗
技术领域
本发明涉及癌症的治疗和/或诊断。特别地，本发明涉及自然杀伤/T细胞淋巴瘤(NKTCL)的治疗和/或诊断。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞淋巴瘤是一类非霍奇金淋巴瘤(NHL)。大多数的NHL(90％)是B细胞起源的。NK细胞淋巴瘤不是由B细胞形成的。然而，对于NK细胞淋巴瘤由正常细胞形成仍然存在争论。尤其是，是否NK细胞淋巴瘤表征真正的NK细胞的存在或仅仅表征具有异常细胞标记的T细胞的存在是有争论的。在缺乏NK细胞淋巴瘤的确切血统的明确证明的情况下，分类时许多研究者倾向于使用术语NK/T细胞淋巴瘤(NKTCL)。
自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)多见于亚洲国家和拉丁美洲的一些地区。在亚洲，它占所有成熟T细胞淋巴瘤病例的高达一半(1)。然而，相对于更常见的B细胞淋巴瘤，很少有人知道它的分子特征及发病机理。在这种亚型的淋巴瘤中，基础科学和临床研究几乎没有进展，由于目前还没有对于NKTCL公认的标准第一线治疗，继续构成在治疗这些患者中的重大挑战。无论多药化疗和受累野放疗，5年总生存率约为对非鼻NKTCL为9％和对鼻NKTCL为42％(2，3)。
与相对多见的B细胞淋巴瘤相比，关于NKTCL的分子特征和发病机理知之甚少。这部分原因可能是西方的相对稀有性和难以获取足够的活检。NKTCL的常规化疗治疗迄今取得效果差，其结果对III期或IV期的患者几乎总是致命的。
理想的是识别新的遗传畸变，和NKTCL中的潜在的治疗靶，以及NKTCL的潜在治疗剂。
发明内容
本发明涉及癌症的治疗和/或诊断，特别是自然杀伤/T细胞淋巴瘤(NKTCL)的治疗和/或诊断。
根据第一方面，本发明涉及一种用于在受试者中预测自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或诊断NKTCL的方法，其包括测试所述受试者至少一种JAK基因的基因型，其中，突变型JAK基因的存在表明受试者具有形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
本发明还涉及一种用于在受试者中预测自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或诊断NKTCL的方法，其包括测试所述受试者是否表达野生型或突变型JAK蛋白，其中突变型JAK蛋白的表达表明该受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
根据第二方面，本发明涉及用于筛选能够治疗NKTCL的药剂的方法，其包括：
(i)提供包含至少一个突变型JAK基因的NKTCL细胞系；
(ii)用所述药剂接触所述NKTCL细胞系；和
(iii)确定药剂对哺乳动物NKTCL细胞系的效果；
其中，所述药剂的降低NKTCL细胞系的生活力、生长和/或增殖和/或增加NKTCL细胞系凋亡的能力是药剂治疗NKTCL的能力的指示。
根据第三方面，本发明涉及用于筛选能够降低至少一种JAK蛋白的活性的药剂的方法，该方法包括：
(i)提供携带突变型JAK基因的NKTCL细胞系；
(ii)用所述药剂接触所述NKTCL细胞系；和
(iii)确定所述药剂对于NKTCL细胞系的效果；
其中，所述药剂降低生活力、生长和/或增殖和/或增加凋亡的能力是候选药剂降低至少一种JAK蛋白的活性的能力的指示。
根据第四方面，提供一种包含至少一个突变型JAK基因的NKTCL动物模型。
根据第五方面，本发明涉及一种治疗自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的方法，其包括给受试者施用JAK抑制剂。
本发明还包括JAK抑制剂在制备用于治疗自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的药物中的用途。
本发明还包括用于治疗自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的JAK抑制剂。
附图说明
图1示出了导致NKTCL样品中JAK3A572V和A573V突变的识别的高分辨率熔解(HRM)和Sanger测序数据。图1(a)表示在JAK3基因的JH2假性激酶结构域上的A572V和A573V突变的位置。用于验证JAK3突变的高分辨率熔解(HRM)和Sanger测序数据示于图1(b)到(h)。具体地：图1(b)以饼图示出了JAK3A572V和A573V突变的百分率(n＝65)。图1(c)示出了标准化为野生型样品的三种基因型的HRM差异图(在平行测定中)：野生型JAK3、杂合JAK3(c.1715C＞T，p.Ala572Val)和纯合JAK3(c.1715C＞T，p.Ala572Val)。图1(d)示出了测序且证实为杂合JAK3(c.1718C＞T，p.Ala573Val)突变的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)NKTCL样品的代表性HRM差异曲线。值得注意的是，由于相同的C＞T的转换，具有JAK3A572V或A573V突变的样品的HRM差异曲线是类似的。JAK3野生型等位基因的代表性的测序图谱示于图1(e)中，A572V杂合突变的代表性的测序图谱示于图1(f)中，A573V杂合突变的代表性的测序图谱示于图1(g)中，A572V纯合突变的代表性的测序图谱示于图1(h)中。
图2示出了证明IL-2对JAK3，以及STAT5磷酸化和CP-690，550对NKTCL细胞系治疗作用的数据。图2(a)示出了用或不用重组人IL-2(200IU/ml)培养，在48h后收集，并通过免疫印迹测定JAK3和STAT5磷酸化的NK-S1(JAK-突变)和KHYG-1(野生型)细胞的免疫印迹结果。用泛JAK抑制剂CP-690，550处理NK-S1、KHYG-1和K562(对照)细胞系，评价结果示于图2(b)至图2(d)。图2(b)显示了在48小时通过免疫印迹评估样品中的STAT5磷酸化。图2(c)显示了在72小时通过MTS测定分析的细胞存活率。图2(d)显示了在72小时通过膜联蛋白V-FITC染色进行评估并通过流式细胞术分析的药物诱导的细胞凋亡。实验至少重复3次。c和d中的结果代表重复3次的平均值±标准误差。*表示通过配对Student′s-t检验p＜0.05。
图3提供显示突变NKTCL细胞系NK-S1的细胞因子非依赖性生长的数据。尤其是，用或不用重组人IL-2(0至200IU/ml)培养NK-S1(JAK3突变)和KHYG-1(JAK3野生型)。NK-S1的细胞生活力数据示于图3(a)中和KHYG-1的细胞生活力数据示于图3(b)中。用MTS测定每天监测细胞生活力持续七天，细胞生长表示为490nm处的吸光度减去在650nm处的参考。在a和b中的结果表示重复3次的平均±标准差
图4显示了证明JAK3A572V突变导致NKTCL细胞的组成型JAK3活性和IL-2非依赖性增殖的数据。图4A示出之前用100nM的JAK3siRNA(si-JAK3)或对照siRNA(si-Ctrl)处理24小时和进行增殖测定直至72小时(右面板)的NK-S1细胞的数据。同时，收集这些细胞，以及用抗磷酸化JAK3(pJAK3)、磷酸化STAT5(pSTAT5)、JAK3、STAT5或β-肌动蛋白的抗体作为正常化对照对蛋白质提取液进行Western印迹。图4B显示了用野生型JAK3(JAK3WT)或突变型JAK3的表达载体(即JAK3A572V)瞬时转染的KHYG-1细胞的数据。通过Western印迹检测这些细胞中相对的pJAK3、pSTAT5、JAK3和STAT5的水平(上面板)，用或不用IL-2进行使用这些细胞的增殖测定48小时(下面板)。所有结果表示为三次独立实验的平均值SEM。*相对于载体对照(载体)p＜0.05。
释义
如在本说明书中使用的术语“抑制剂”是指能够降低蛋白质的活性的任何物质，例如JAK抑制剂能够降低JAK蛋白的活性。特别地，JAK3抑制剂能降低JAK3蛋白的活性。降低蛋白质的活性可以是直接或间接的，例如，通过干扰蛋白质的表达或蛋白质在生物背景中发挥功能的机制。例如，JAK3激酶可能需要ATP分子与ATP结合位点的结合，这样，通过特异性结合并阻断ATP结合位点，降低JAK3激酶的活性。JAK蛋白的活性也可能需要另一种蛋白的活性，例如细胞因子受体，因而这种蛋白的活性的干扰也可以降低JAK蛋白的活性。可选择地，少数的JAK3激酶蛋白可以通过干扰在相关核酸结构域中的基因表达(例如相应mRNA的翻译)来表达，。
按照WHO分类(6)，NKTCL指的是NK/T细胞淋巴瘤。术语“自然杀伤T细胞淋巴瘤”、NKTCL和“NK/T细胞淋巴瘤”可互换使用，是指一类非B-细胞来源的非霍奇金淋巴瘤(NHL)。NKTCL具有肿瘤坏死的典型形态，血管中心(angiocentricity)以及相应的免疫表型，特别是CD56、胞质CD3的存在以及EBER几乎普遍的存在。NK/T细胞淋巴瘤不同于成熟T细胞白血病/淋巴瘤，它是T细胞谱系的疾病且与HTLV-1感染相关。
术语“治疗/处理”包括减轻、预防和/或消除一种或多种与疾病(例如自然杀伤/T细胞淋巴瘤(NKTCL))相关的症状。
本发明的详细说明
本发明涉及癌症的治疗和/或诊断，特别是自然杀伤/T细胞淋巴瘤(NKTCL)的治疗和/或诊断。
根据第一方面，提供一种用于在受试者中预测自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或诊断NKTCL的方法，其包括测试所述受试者至少一个JAK基因的基因型，其中，突变型JAK基因的存在表明受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。杂合或纯合突变型JAK基因的存在表明受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
可以测试任何JAK基因的任何一种或组合。受测试的JAK基因可以选自JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。例如，可以测试JAK3和/或JAK1基因。通常，SEQ ID NO：1表示野生型JAK3基因。在一个实例中，包括在SEQ ID NO：1的核苷酸15792位点由T置换C和/或在核苷酸15795位点由T置换C的突变型JAK3基因的存在表示受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
通常，SEQ ID NO：3表示野生型JAK1基因。在另一实例中，包括在SEQ ID NO：3的核苷酸124823位点由G置换T的突变型JAK1基因的存在表示受试者是易受感染的和/或具有NKTCL。突变型JAK1和JAK3基因的同时存在还表明受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
所述方法可以在来自受试者的分离的细胞样品上进行。分离的细胞样品可以是来自血液和/或肿瘤的样品。因此，该方法可以进一步包括提供来自受试者的分离的细胞样品用于测试。该方法可以进一步包括从受试者、血液样品和/或分离的细胞样品中分离核酸分子用于所述测试。所述分离的核酸分子可以包括基因组DNA或mRNA。特别地，所述测试可以在基因组DNA、mRNA和/或cDNA中来进行。
任何合适的技术可以用于测试。例如，测试可以是通过序列分析、限制性片段长度多态性分析、杂交、聚合酶链式反应(PCR)和/或逆转录PCR。特别是，例如Sanger测序和高分辨率熔解(High resolution melt)技术可以用于测试。
在本发明的另一方面中，提供了一种用于在受试者中预测自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或诊断NKTCL的方法，其包括测试所述受试者是否表达野生型或突变型JAK蛋白，其中，突变型JAK蛋白的表达表明该受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
可以测试任何JAK蛋白的任何一种或组合。受测试的JAK蛋白可以选自JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。例如，可以测试JAK3和/或JAK1蛋白。通常，SEQ ID NO：2表示野生型JAK3蛋白。在一个实例中，包括在SEQ ID NO：2的氨基酸572位点由V置换A和/或在氨基酸573位点由V置换A的突变型JAK3基因的存在表明受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
通常，SEQ ID NO：4表示野生型JAK1蛋白。在另一实例中，包括在SEQ ID NO：4的氨基酸652位点由D置换Y的突变型JAK1蛋白的存在表明受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。突变型JAK3和JAK1蛋白的同时存在也表明受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
所述方法可以在来自受试者的分离的血液和/或细胞样品中进行。所述分离的细胞样品可以是来自肿瘤。因此，所述方法可以进一步包括提供来自受试者的分离的血液和/或细胞样品用于测试。所述方法可以进一步包括从受试者、血液样品和/或分离的细胞样品中分离蛋白分子用于所述测试。
可以使用任何合适的方法以检测相关的野生型和/或突变型JAK蛋白是否表达。例如，可以通过蛋白质测序和/或抗体检测来测试。特别地，可以利用使用对于相关的野生型和/或突变型JAK蛋白具有特异性的至少一种抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)。
在本发明的第二方面中，提供了一种用于筛选能够治疗NKTCL的药剂的方法，其包括：
(a)提供包含至少一个突变型JAK基因的NKTCL细胞系；
(b)使所述药剂与NKTCL细胞系接触；和
(c)确定所述药剂对NKTCL细胞系的效果；
其中，所述药剂的降低NKTCL细胞系的生活力、生长和/或增殖和/或增加NKTCL细胞系凋亡的能力可以指示药剂治疗NKTCL的能力。
在本发明的第三方面中，提供了一种用于筛选能够降低至少一种JAK蛋白的活性的药剂的方法，其包括：
(i)提供携带至少一个突变型JAK基因的NKTCL细胞系；
(ii)用所述药剂接触所述NKTCL细胞系；和
(iii)确定所述药剂对NKTCL细胞系的效果；
其中，所述药剂降低细胞系的生活力、生长和/或增殖和/或增加细胞系凋亡的能力是候选药剂降低至少一种JAK蛋白的活性的能力的指示。
所述NKTCL细胞系可以携带任何突变型JAK1、JAK2、JAK3或TYK2基因中的任何一种或组合。例如，NKTCL细胞系可以携带突变型JAK3基因和/或突变型JAK1基因。特别是，哺乳动物NKTCL细胞系可携带下列突变中的至少一种：
(i)在SEQ ID NO：1的核苷酸15792位点由T置换C(在JAK3基因中)；
(ii)在SEQ ID NO：1的核苷酸15795位点由T置换C(在JAK3基因中)；和
(iii)在SEQ ID NO：3的核苷酸124823位点由G置换T(在JAK1基因中)。
根据第四方面，本发明还涉及一种包含至少一种突变型JAK基因的NKTCL动物模型。例如，所述NKTCL动物模型可以包括选自突变型JAK1、JAK2、JAK3和TYK2基因中的至少一种突变。特别地，所述NKTCL动物模型包含突变型JAK3基因和/或突变型JAK1基因。更特别地，所述NKTCL动物模型包括下列突变中的至少一种：
(i)在SEQ ID NO：1的核苷酸15792位点由T置换C；
(ii)在SEQ ID NO：1的核苷酸15795位点由T置换C；和
(iii)在SEQ ID NO：3的核苷酸124823位点由G置换T。
所述NKTCL动物模型也可以用于筛选能够治疗NKTCL的候选药剂。
根据第五方面，提供了一种治疗自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的方法，其包括给受试者施用至少一种JAK抑制剂。可以使用任何合适的JAK抑制剂。在本发明的另一方面中，提供至少一种JAK抑制剂在制备用于治疗自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的药物中的用途。在本发明的另一方面中提供了一种用于治疗自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的JAK抑制剂。所述JAK抑制剂能够降低JAK3蛋白的活性。
例如，所述JAK抑制剂可以抑制JAK1、JAK2、JAK3和/或TYK2中的至少一种。因此，所述抑制剂可以是泛JAK抑制剂(pan-JAK inhibitor)。在一个具体的实例中，所述JAK抑制剂可以抑制JAK3和/或JAK1。更特别地，所述JAK抑制剂可以抑制JAK3或所述JAK抑制剂还可以抑制JAK1。
在第一具体实例中，所述JAK抑制剂可以包括3-[(3R，4R)-4-甲基-3-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]哌啶-1-基]-3-氧代丙腈(也称为CP-690，550)。在第二具体实例中，可以包括(E)-2-氰基-3-(4-硝基苯基)-N-((R)-1-苯基乙基)丙烯酰胺(也称为WP-1034)。
施用JAK抑制剂的受试者可以包括哺乳动物。所述受试者可以包括人类。受试者可以在至少一种JAK基因/JAK蛋白中携带纯合或杂合突变。例如，所述受试者可以在JAK1/JAK1、JAK2/JAK2、JAK3/JAK3和/或TYK2/TYK2中携带纯合或杂合突变。特别地，受试者可以在JAK1/JAK1和/或JAK3/JAK3中携带纯合或杂合突变。更特别地，受试者可以具有选自JAK3-A572V、JAK3-A573V和JAK1-Y652D中的至少一种突变。然而，所述受试者还可以包含纯合野生型的表型。受试者可以具有JAK基因、其转录和/或翻译产物(蛋白质)中任一种的增加的表达，无论其是否携带纯合野生型、杂合或纯合突变基因。
CP-690，550是一种JAK抑制剂。它被称为托法替尼(Tofacitinib)、他索西替尼(Tasocitinib)，或者以其商品名XELJANZ。其化学名称为3-[(3R，4R)-4-甲基-3-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]哌啶-1-基]-3-氧代丙腈，其结构式为：
已经记载了WP-1034在急性髓细胞样白血病中具有促凋亡和抗白血病活性(Faderl等，Anticancer Research25：1841-1850(2005))(8)。它是酪氨酸激酶抑制剂的酪氨酸磷酸化抑制剂家族的成员，其主要研究作为JAK-STAT通路的抑制剂。它的化学结构和名称如下：
WP1034-(E)-2-氰基-3-(4-硝基苯基)-N((R)-1-苯基乙基)丙烯酰胺
现在已经一般性地描述了本发明，通过参考通过举例说明，而不是试图限制本发明的方式提供的下述实施例，可以更容易地理解本发明。
实施例
自然杀伤/T细胞淋巴瘤(NKTCL)的分子发病机理还不是很清楚。尚未完全确定导致NK/T细胞淋巴瘤的基因突变。在这项研究中，在四个NKTCL患者中的两个中，通过全外显子组测序鉴定了两面神激酶3(JAK3)体细胞激活突变(A572V和A573V)。在额外的61个病例中，通过Sanger测序和高分辨率熔解(HRM)分析确定JAK3突变的发生率的进一步验证。总体而言，65个病例中的23个(35.4％)包含JAK3突变。包含JAK3A572V突变的突变型NKTCL细胞系显示IL-2非依赖性生长和提示其致癌作用的组成的JAK3和STAT5磷酸化。JAK3突变的功能特性支持其涉及导致加速的细胞生长的细胞因子无关的JAK/STAT组成性活化。这些突变可能在NKTCL的发病机制中发挥显著作用。此外，用新型泛JAK抑制剂CP-690，550，同时治疗JAK3-突变体和野生型NKTCL细胞系，导致剂量依赖性磷酸化STAT5降低，降低细胞生活力和增加细胞凋亡。CP-690，550是一种泛JAK抑制剂，不仅对于JAK3而且对于JAK1具有抑制作用。这可能是重要的，因为在JAK-STAT信号通路系统中，JAK1和JAK3在它们的功能中相互干扰，可能一种抑制响应于其它的抑制的一些补偿性上调。例如，如果抑制JAK3，可能上调JAK1以补偿JAK3的活性降低，这可能会保留JAK-STAT信号。反之亦然。进一步举例，使用不仅能够降低JAK1活性而且还降低JAK3的活性的泛JAK抑制剂的NKTCL治疗可能在抑制JAK-STAT信号中特别有效。
因此，针对解除管制JAK/STAT通路可能是对于NKTCL患者有前景的治疗。这些发现对于NKTCL患者的治疗具有重要意义。
材料和方法
组织样品
从4位知情同意的NKTCL患者中获得匹配的新鲜冷冻的组织和外周血样品。本发明人进一步鉴定来自61位证实的NKTCL患者的石蜡包埋的组织块。NKTCL的诊断是根据2008年世界卫生组织(WHO)造血和淋巴组织的肿瘤分类(6)进行。所有样品均集中由新加坡保健服务集团血液病理学者审查。这项研究由新加坡的新加坡保健服务集团集中机构审查委员会(SingHealth Centralized Institutional Review Board)批准。
DNA的分离
根据制造商的用法说明，分别使用DNeasy血液和组织微型试剂盒(Qiagen)和QIAmp DNA血液中型试剂盒(Qiagen)分离冷冻组织和配对的血液样本的DNA。对于福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样品，从来自每个样品中的一个或两个10μm切片提取基因组DNA，用二甲苯除去石蜡，用100％乙醇将组织洗涤两次，然后蛋白酶K消化过夜。然后使用DNeasy血液和组织微型试剂盒(Qiagen)提取DNA。
在两面神激酶中的体细胞突变的检测
使用REPLI-g WGA中型试剂盒(Qiagen)对从每个样品中提取的基因组DNA进行全基因组扩增。对JAK1、JAK2、JAK3和TYK2的编码外显子序列通过Sanger测序进行测序以检测突变。当仅在肿瘤中而没有在配对的血液样品中检测到所述突变时，确认所述突变的体细胞来源。
所述突变序列信息如在下表1中和在用以下序列的标识符的附加的基因组DNA、蛋白质和eDNA序列表(SEQ ID No.：1至SEQ ID No.：6)中所提供：
SEQ ID NO：1-JAK3野生型基因组DNA
SEQ ID NO：2-JAK3野生型氨基酸序列
SEQ ID NO：3-JAK1野生型基因组DNA
SEQ ID NO：4-JAK3野生型氨基酸序列
SEQ ID NO：5-JAK3野生型eDNA
SEQ ID NO：6-JAK1野生型eDNA
表1：JAK1和JAK3突变信息
蛋白 ORF1 cDNA 基因
JAK1 Y652D6 T1954G T2203G2 T124823G4
JAK3 A572V7 C1715T C1815T3 C15792T5
JAK3 A573V7 C1718T C1818T3 C15795T5
表1的说明：
1ORF：开放阅读框，编码区，从ATG开始
2NCBI参考序列：NM_002227.2(SEQ ID NO：6)
3NCBI参考序列：NM_000215.3(SEQ ID NO：5)
4NCBI参考序列：NG_023402.1(SEQ ID NO：3)
5NCBI参考序列：NG_007273.1(SEQ ID NO：1)
6NCBI参考序列：NP_002218.2(SEQ ID NO：4)
7GenBank：AAC50950.1(SEQ ID NO：2)
采用高分辨率熔解(HRM)和双向Sanger测序分析的突变验证
高分辨率熔解(HRM)和Sanger测序用于证实JAK1和JAK3突变和确认其在NKTCL患者群体中的流行率。结合这两种方法将大大提高FFPE样品中突变检测的精度。所述JAK2V617F突变也用上述两种方法测序。用于验证的引物组的序列列于表2(见下文)，并包括在相应的标识符下的所附序列表中。
表2：用于Sanger测序和HRM分析的验证引物组
HRM曲线分析用于辨别点突变的存在。SsoFastTMEvaGreen(BioRad，产品编号172-5200)用于扩增包括来自基因组DNA样品的相关突变的靶DNA片段。以600nM的终浓度使用HRM引物，用BioRad公司的CFX96实时PCR检测系统重复进行反应。循环和熔化条件如下：98℃2分钟一个循环；98℃5秒、58℃10秒39个循环；95℃30分钟一个循环，以0.2℃/秒从72℃至95℃升温熔化。用Biorad Precision Melt AnalysisTM软件分析HRM曲线。偏离野生型曲线的HRM差异曲线被认为是包含突变。
对于Sanger测序，用Invitrogen公司的Platinum Taq聚合酶(产品编号10966-083)进行PCR，循环为：在95℃，10分钟；95℃30秒39个循环；60℃30秒，72℃1分钟以及72℃最终延伸10分钟。用ABI的BigDye Terminator V3.1(产品编号4337457)进行测序PCR，循环为：在96℃1分钟；96℃10秒29个循环；50℃5秒和60℃4分钟。由此产生的产物在ABI3730DNA分析仪上运行。
细胞系、细胞生活力和细胞凋亡检测
NK-S1是来自先前描述的NKTCL异种移植(7)建立的细胞系。所述异种移植来源于来自发现有JAK1(Y652D)和JAK3(A572V)突变的同一患者的睾丸的转移性肿瘤。NK-S1在添加抗生素、热灭活的胎牛血清(10％)和马血清(ES)(10％)的DMEM培养基中培养超过60代。通过细胞内染色，表型分析显示表面CD3-CD56+、粒酶B+。对NK-S1NKTCL细胞系进行测序，证实携带JAK3A572V的纯合突变，以及在JAK1密码子652上的突变。KHYG-1是从JapaneseCollection of Research Bioresources得到的IL-2依赖的侵略性NK白血病细胞株，它培养在补充有抗生素、热灭活FBS(10％)、ES(10％)和200IU/ml的重组人IL-2(阿地白介素，诺华)7的RPMI培养基中。对KHYG-1进行测序，发现为JAK3密码子572和573、JAK1密码子652和658野生型。K562(CCL-234，ATCC)是对BCR-ABL融合基因呈阳性的慢性髓细胞性白血病(CML)细胞系。
为了研究NKTCL细胞系对泛JAK抑制剂：CP-690，550(塞莱克化学，产品编号S5001)的敏感性，在96孔板中以2x104细胞/100μL/孔接种细胞，并用CP-690，550以各种浓度或用载体对照处理。使用CellTiter含水非放射性细胞增殖测定试剂盒(普洛麦格)通过MTS法评估生活力，读取在490nm和650nm(作为参考)的吸光度。药物诱导的细胞凋亡的程度是通过膜联蛋白V-FITC(BD生物科学公司)染色进行评价。在FACSCalibur流式细胞仪(BD生物科学公司)中进行数据的采集。
免疫印迹
使用或不使用重组人IL-2(阿地白介素，诺华)，或存在或不存在CP-690，550孵育后，在指定的时间间隔采集细胞。用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并溶解在50μl冰冷的RIPA缓冲液[25mM Tris-HCl，pH值7.6，150mM NaCl，1％诺乃洗涤剂P-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1X磷酸酶抑制剂(产品编号78420，赛默飞世尔科技公司)，1X蛋白酶抑制剂(产品编号12978000，罗氏诊断公司)和1mM原钒酸钠]中。此后，细胞裂解液在冰上进行两次10秒、20Amp超声处理，在冰上搅拌另外15分钟。于4℃下在14,000g下离心15分钟后，除去上清液，使用Bio-Rad蛋白测定(产品编号500-0006，Bio-Rad实验室)测定蛋白质浓度。在5％层积和8％分解SDS-聚丙烯酰胺凝胶上使用微型-变形蛋白四电泳系统(产品编号165-8006，Bio-Rad实验室)分离蛋白样品，并使用微型转印迹电泳转移细胞(产品编号170-3930EDU，Bio-Rad实验室)在100V持续120分钟转移到0.45μM硝化纤维素膜(产品编号162-0115，Bio-Rad实验室)。用在PBST中的5％牛奶封闭膜，接着是在PBST中的5％牛血清白蛋白以及5mM原钒酸钠的兔抗-磷酸-jak1(Tyr1022/1023)(产品编号3331，Cell Signaling)、兔抗磷酸-JAK3(Tyr980/981)(D44E3)(产品编号5031，Cell Signaling)、鼠抗磷酸-Stat5(Tyr694)(产品编号9356，Cell Signaling)和兔抗磷酸-Stat3(Tyr705)(D3A7)(产品编号9145，Cell Signaling)的过夜孵育。使用增强化学发光(ECL)(产品编号3407，赛默飞世尔科技公司，和产品编号RPN2132，Amersham)进行可视化。使用Jak1(6G4)(产品编号3344，Cell Signaling)、Jak3(产品编号3775，Cell Signaling)、Stat5(产品编号9363，CellSignaling)和β-肌动蛋白(产品编号A1978，Sigma)抗体以检测未磷酸化的蛋白质或作为负载对照。所有抗体在推荐的稀释液中使用。
结果
Sanger测序法用于对来自具有额外节点NKTCL的四个患者的新鲜冰冻肿瘤和血液样品中的JAK1、JAK2、JAK3和TYK2的外显子区域测序。确定两种JAK3突变：A572V(p.Ala572Val，c.1715C＞T)和A573V(p.Ala573Val，c.1718C＞T)，以及一种新JAK1突变：Y652D(p.Tyr652Asp，c.1954T＞G)。有趣的是，在相同的样品中发现JAK3A572V和JAK1Y652D突变。两种JAK3突变均位于JH2假性激酶结构域上的外显子12(图1a)，已知其对JH1激酶结构域具有自动抑制效果。在JAK1和JAK3中确定的所有三个错义突变被证实是体细胞起源的且通过Polyphen预测是可能有害的。
用ENKTCL在额外的61例患者的FFPE样本中验证识别的突变，以确认他们的流行率。由该验证研究，通过Sanger测序识别另外21例具有JAK3突变的患者。总体而言，发现65例NKTCL患者中的23例患者(35.4％)具有JAK3突变(图1b)。对40个FFPE样品进行高分辨率熔解(HRM)分析和检测到14例JAK3突变(35％)。在23例具有JAK3突变的患者当中，有17例杂合A572V，两例纯合A572V，两例杂合A573V突变，一例纯合A573V突变和一例同时具有A572V和A573V杂合突变的患者(图1c-h)。没有发现额外的JAK1Y652D突变。此外，没有发现具有JAK2V617F(p.Val617Phe或c.1849G＞T)突变的患者，最近发现JAK2V617F突变存在于大部分的具有典型BCR/ABL阴性的慢性骨髓增殖性疾病的患者中和若干具有其它纯血液癌症例如骨髓增生异常综合征和急性髓细胞性白血病的患者中。
讨论
JAK3A572V激活突变赋予细胞因子非依赖性增长
IL-2是NK细胞的增殖和活化必需的基本细胞因子(4)。JAK1和JAK3通过STAT转录因子的磷酸化介导IL-2受体信号(5)。根据确定的激活JAK3突变的功能的重要性，我们测试JAK3突变是否能够赋予IL-2相对于包含纯合JAK3A572V突变的NKTCL细胞系(NK-S1)非依赖性生长。JAK-突变(NK-S1)细胞显示IL-2非依赖性生长(图3)和JAK3和STAT5的组成型磷酸化(图2a)。与此相反，JAK3-野生型KHYG-1细胞为明确的IL-2依赖性(图3和图2a)。重要的是，与用对照siRNA处理的细胞相比，用JAK3siRNA处理的NK-S1细胞在细胞增殖中表现出显著的降低，且减低的JAK3和STAT5的自磷酸化作用(图4A)。相反地，瞬时过量表达突变的JAK3(JAK3A572V)cDNA的KHYG-1细胞显示出IL-2非依赖性增殖和JAK3和STAT5的自磷酸化(图4B)。这些结果表明，JAK3激活突变是功能等位基因的增益，有助于在IL-2独立性方式中JAK/STAT通路的组成性活性。
这项研究表明，JAK突变赋予衍生自同时包含JAK3A572V和JAK1Y652D突变的患者样品的异种移植建立的NKTCL细胞系细胞因子非依赖性生长。与经检测不携带鉴定的JAK1和JAK3突变的野生型KHYG-1(图2a)相比，NK-S1显示IL-2非依赖性生长(图3)、组成型JAK3和STAT5磷酸化(图2a)。
CP-690，550对于NKTCL细胞系的影响
对泛JAK抑制剂CP-690，550抑制JAK-STAT通路的能力进行评价。由于活化的JAK蛋白直接使STAT蛋白磷酸化，用增加浓度的CP-690，550处理所述JAK突变细胞系(NK-S1)和野生型NKTCL细胞系(KHYG-1)，并通过免疫印迹分析pSTAT5(图2b)。NK-S1和KHYG-1细胞系都显示pSTAT5的剂量依赖性降低(图2a)，以及对于所述抑制剂的处理后的降低的细胞生活力(图2b)。由于其STAT5磷酸化与激活的JAK3无关，在对照K562细胞系中，CP-690，550并没有抑制pSTAT5(图2b)。如通过膜联蛋白V(Annexin V)染色显示，NK-S1的生存力减小与增加的细胞凋亡相关(图2c)。
综上所述，通过自然杀伤/T细胞淋巴瘤(NKTCL)的两面神激酶(JAK)的外显子测序在NKTCL患者中识别JAK3A572和A573V和JAK1Y652D突变，证实JAK3突变的流行率为35.4％。包含JAK3A572V突变的突变NKTCL细胞系显示IL-2非依赖性生长和提示突变在相应的核酸结构域的致癌作用的组成性JAK3和STAT5磷酸化。体外研究表明，泛JAK抑制剂可能是一种对于NKTCL患者的新的治疗剂。泛JAK抑制剂CP-690，550显示降低细胞生活力并导致在JAK3野生型(KHYG-1)和突变型(NK-S1)细胞系中的细胞凋亡。KHYG-1是IL-2依赖性NKTCL细胞系，从而其对泛JAK抑制剂敏感。
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Claims (15)

1.一种用于测试受试者中包含SEQ ID NO：1的在核苷酸15792位点的由T对C的置换和/或在核苷酸15795位点的由T对C的置换的突变型JAK3基因和/或包含SEQ ID NO：3的在核苷酸124823位点的由G对T的置换的突变型JAK1基因的存在的试剂在制备用于在所述受试者中预测自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或诊断NKTCL的试剂中的用途，其中，所述突变型JAK3基因和/或所述突变型JAK1基因中的至少一种的存在表明受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
2.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括提供来自所述受试者的分离的血液和/或细胞样品用于所述测试。
3.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括：提供从所述受试者分离的核酸分子用于所述测试。
4.根据权利要求2所述的用途，其进一步包括提供从来自所述受试者的分离的血液和/或细胞样品中分离的核酸分子用于所述测试。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其中，所述分离的核酸分子由基因组DNA或mRNA组成。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述测试是在基因组DNA、mRNA和/或cDNA上进行的。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其中，所述测试包括以下的一种或多种：序列分析、限制性片段长度多态性分析、杂交、聚合酶链式反应(PCR)和/或逆转录PCR。
8.一种用于测试受试者是否表达包含SEQ ID NO：2的在氨基酸572位点的由V对A的置换和/或在氨基酸573位点的由V对A的置换的突变型JAK3蛋白和/或包含SEQ ID NO：4的在氨基酸652位点的由D对Y的置换的突变型JAK1蛋白的试剂在制备用于在所述受试者中预测自然杀伤T细胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或诊断NKTCL的试剂中的用途，其中，所述突变型JAK3蛋白和/或所述突变型JAK1蛋白中的至少一种的表达表明所述受试者面临形成NKTCL的风险和/或具有NKTCL。
9.根据权利要求8所述的用途，进一步包括提供来自所述受试者的分离的血液和/或细胞样品用于所述测试。
10.根据权利要求8所述的用途，进一步包括提供来自所述受试者的至少一种分离的蛋白质用于所述测试。
11.根据权利要求9所述的用途，进一步包括提供来自所述受试者的所述分离的血液和/或细胞样品中的至少一种蛋白质用于所述测试。
12.根据权利要求8或9所述的用途，其中，所述测试包括蛋白测序和/或抗体检测方法。
13.一种用于筛选能够治疗NKTCL的药剂的方法，所述方法包括：
(i)提供包含至少一个突变型JAK3基因和/或突变型JAK1基因的NKTCL细胞系，所述突变型JAK3基因包含SEQ ID NO：1的在核苷酸15792位点的由T对C的置换和/或在核苷酸15795位点的由T对C的置换，以及所述突变型JAK1基因包含SEQ ID NO：3的在核苷酸124823位点的由G对T的置换；
(ⅱ)用所述药剂接触所述NKTCL细胞系；和
(iii)确定所述药剂对哺乳动物NKTCL细胞系的效果；
其中，所述药剂的降低NKTCL细胞系的生活力、生长和/或增殖和/或增加NKTCL细胞系凋亡的能力是药剂治疗NKTCL的能力的指示。
14.一种用于筛选能够降低至少一种JAK蛋白的活性的药剂的方法，所述方法包括：
(i)提供携带至少一个突变型JAK3基因和/或突变型JAK1基因的NKTCL细胞系，所述突变型JAK3基因包含SEQ ID NO：1的在核苷酸15792位点的由T对C的置换和/或在核苷酸15795位点的由T对C的置换，以及所述突变型JAK1基因包含SEQ ID NO：3的在核苷酸124823位点的由G对T的置换；
(ⅱ)用所述药剂接触所述NKTCL细胞系；和
(iii)确定所述药剂对于NKTCL细胞系的效果；
其中，所述药剂降低细胞系的生活力、生长和/或增殖和/或增加细胞系凋亡的能力是候选药剂降低至少一种JAK蛋白的活性的能力的指示。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述NKTCL细胞系携带以下JAK突变中的至少一种：
(i)在SEQ ID NO：1的核苷酸15792位点由T置换C；
(ii)在SEQ ID NO：1的核苷酸15795位点由T替换C；和
(iii)在SEQ ID NO：3的核苷酸124823位点由G置换T。
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