TW202045158A - Mdm2抑制劑的治療方法和生物標記物 - Google Patents

Mdm2抑制劑的治療方法和生物標記物 Download PDF

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Abstract

提供了預測MDM2抑制劑治療癌症患者療效的生物標記物。還提供了用於評估生物標記物的組合物，例如套組，以及使用該生物標記物預測癌症患者對MDM2抑制劑反應的方法。該訊息可用於確定癌症患者的預後和治療選擇。

Description

MDM2抑制劑的治療方法和生物標記物
本發明關於用MDM2抑制劑來治療病況和疾病的治療方法和生物標記物，其中抑制MDM2和MDM2相關蛋白會提供益處。
MDM2（鼠雙微體2）抑制劑干擾MDM2癌蛋白與腫瘤抑制因子p53蛋白的結合，且作爲具有藥理作用的p53活化劑。新證據顯示，p53功能障礙也會加劇炎症並支持腫瘤免疫逃避，因此p53功能障礙可作爲腫瘤發生的免疫驅動因子（Guo G, Cancer Research, 2017; 77（9）:2292）。
MDM2和p53是自調節反饋迴路的一部分（Wu et al.,Genes Dev. 7:1126 (1993)）。MDM2在轉錄上是由p53活化，MDM2進而藉由至少三種機制來抑制p53活性（Wu et al.,Genes Dev. 7:1126 (1993)）。第一、MDM2蛋白直接結合到p53反式活化結構域，並且因此抑制p53介導的反式活化。第二、MDM2蛋白含有核輸出訊號序列，並且在結合到p53時，誘導p53的核輸出，從而阻止p53與所靶向的DNA結合。第三、MDM2蛋白是一種E3泛素連接酶並且在結合到p53時，能夠促進p53降解。
化合物C是一種新型的、生物可利用的、高效的MDM2抑制劑。
Figure 02_image001
化合物C目前正在患有晚期實體瘤或淋巴瘤的患者中進行臨床試驗。鑒於化合物C的效力，進一步增强該候選藥物在癌症治療中的功效將是有利的。
在本案中，冠詞「一」、「一個」和「該」在本文中用於代表一個或多個（即，至少一個）該冠詞的語法對象。舉例來說，「一種方法」是指一種方法或一種以上方法。
本案的發明人現已發現，對具有某些生物標記物特徵的患者施用MDM2抑制劑或其藥學上可接受的鹽特別有效。特別地，令人驚訝地發現在此類患有癌症的受試者中用MDM2抑制劑（例如化合物C）治療可以導致反應等級的增加、更多的完全消退（CR）反應者、延遲的腫瘤生長，以及將抗藥性腫瘤轉化爲反應性腫瘤。
因此，本文提供了一種用MDM2抑制劑在有此需要的受試者中治療癌症的方法，該方法包括向該受試者施用治療有效量的MDM2抑制劑，其中該受試者已被鑑定爲具有i）ATM的失活改變(alteration)，ii）MDM2的增多，或iii）兩者。
在一些實施方式中，所述失活改變包括ATM的失活突變，或ATM的功能或表現缺失（loss）。
在一些實施方式中，ATM的失活突變包括H1380Y、N1983S、c.3154-2A>G或其任何組合。
在一些實施方式中，ATM的失活突變是H1380Y。
在一些實施方式中，被鑑定爲在MDM2中具有增多的受試者是被鑑定爲在MDM2中具有> 3的拷貝數變異（CNV）。
在一些實施方式中，所述受試者被鑑定爲具有ATM的H1380Y突變和MDM2的增多兩者。
在一些實施方式中，所述受試者被進一步鑑定爲具有野生型p53。
在另一方面，本文提供一種鑑定和/或選擇患有癌症的患者以用MDM2抑制劑治療的方法，該方法包括： a）獲得包含癌細胞的患者樣品；以及 b）檢測所述樣品中ATM中ATM是否存在失活改變（例如H1380Y突變、N1983S突變、c.3154-2A>G或其任意組合）， 其中ATM中存在失活改變鑑定出將對使用MDM2抑制劑的治療有反應的患者。
在一些實施方式中，該方法還包括： c）檢測所述樣品中MDM2的拷貝數變異，以確定MDM2中是否存在增多， 其中ATM中存在失活改變的和MDM2中存在增多，共同鑑定出將對使用MDM2抑制劑的治療有反應的患者。
在一些實施方式中，所述癌細胞已被鑑定爲具有野生型p53。
在另一方面，本文提供一種鑑定對用MDM2（鼠雙微體，Murine Double Minute 2）抑制劑的治療很可能有反應的患有癌症的受試者的方法，所述方法包括： a）提供來自受試者的生物樣品； b）測定所述生物樣品中： i. 是否存在ATM（毛細血管擴張共濟失調突變，Ataxia-Telangiectasia Mutated）和/或ATR（毛細血管擴張共濟失調和Rad3相關蛋白，Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein）的活性或表現量不足；及/或 ii. 是否存在MDM2的活性或表現量增多；以及 c）基於以下條件鑑定所述受試者爲對所述用MDM2抑制劑的治療很可能有反應：所述生物樣品中存在i）所述ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）所述MDM2的活性或表現量增多，或i）和ii）兩者都有。
在一些實施方式中，其中所述方法還包括： d）將MDM2抑制劑施用於鑑定爲對所述用MDM2抑制劑的治療很可能有反應的受試者。
本文還提供一種用MDM2抑制劑治療患有癌症的受試者的方法，所述方法包括： a）測定來自所述受試者的生物樣品中： i. 是否存在ATM和/或ATR的活性或表現量不足；及/或 ii．是否存在MDM2的活性或表現量增多；以及 b）基於以下條件向所述受試者施用MDM2抑制劑：所述生物樣品中存在i）所述ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）所述MDM2的活性或表現量增多，或i）和ii）兩者都有。
在一些實施方式中，所述測定步驟包括在所述生物樣品中檢測在ATM和/或ATR中是否存在一種或多種失活突變，其中ATM和/或ATR中存在所述失活突變，表示所述ATM和/或ATR的活性或表現量不足。
在一些實施方式中，所述失活突變包括ATM和/或ATR中的降低絲胺酸/蘇胺酸激酶活性的易位、缺失、插入、取代或其任何組合。
在一些實施方式中，所述ATM中的失活突變包括選自圖1B、1C和1D中相對於SEQ ID NO：2的突變，或相對於SEQ ID NO. 1的c.3154-2A>G，或其任何組合。
在一些實施方式中，ATM中的所述失活突變包括：相對於SEQ ID NO：2的H1380Y、N1983S、N2875S、R2598Q、1599_1600del、V2716A、K1903fs、V2906I、A1127V、K1101E、Q912*、S2165F或H1083Y；或相對於SEQ ID NO：1的c.3154-2A>G；或其任何組合。
在一些實施方式中，ATR中的所述失活突變包括相對於SEQ ID NO：4的K243T、Q1926H、I774fs、K1379N、L1483F或其任何組合。
在一些實施方式中，所述測定步驟包括測定相對於參考基準，生物樣品中ATM和/或ATR的表現量是否降低，並且其中所述ATM和/或ATR的表現量的降低，表示所述ATM和/或ATR的活性或表現量不足。
在一些實施方式中，所述測定步驟包括測定相對於參考基準，生物樣品中MDM2基因的拷貝數變異、MDM2基因産物的表現量或MDM2蛋白活性是否增加，並且其中所述增加表示所述MDM2的活性或表現量的增多。
在一些實施方式中，MDM2的拷貝數變異（CNV）>3表示所述MDM2的活性或表現量的增多。
在一些實施方式中，藉由RNA定序（RNAseq）測量，所述MDM2基因産物的表現量相對於所述參考基準增加至少50％，表示所述MDM2的活性或表現量的增多。
在一些實施方式中，其中所述鑑定步驟包括： c）基於以下條件鑑定所述受試者爲對所述用MDM2抑制劑的治療很可能有反應：所述生物樣品中存在以下兩者i）ATM和/或ATR中存在所述失活改變，和ii）所述MDM2基因的CNV的增加或所述MDM2基因産物的表現量的增加。
在一些實施方式中，所述測定步驟還包括測定所述生物樣品中存在或不存在功能性p53。
在一些實施方式中，所述測定步驟還包括測定所述生物樣品中p53是否爲野生型。
在一些實施方式中，所述鑑定步驟包括： c）基於以下條件鑑定所述受試者很可能對所述用MDM2抑制劑的治療有反應：生物樣品中存在i）ATM和/或ATR中存在所述失活改變；ii）所述MDM2基因的CNV的增加或所述MDM2基因産物的表現量的增加；且iii）存在野生型p53。
在一些實施方式中，藉由擴增試驗、雜交試驗、定序試驗或免疫試驗測量i）所述ATM和/或ATR的活性或表現量，或ii）所述MDM2的活性或表現量的增多，或iii）存在或不存在所述功能性p53。
本文還提供用MDM2抑制劑治療患有癌症的受試者的方法，其中已經藉由本文提供的任何方法將所述受試者鑑定爲對所述用MDM2抑制劑的治療很可能有反應。
在一些實施方式中，所述生物樣品包括癌細胞或非癌細胞。
在一些實施方式中，所述癌症是實體瘤或血液系統惡性腫瘤。在一些實施方式中，所述癌症是胃癌、膽管癌、肺癌、黑色素瘤、乳癌、結腸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌（例如肝細胞癌）、膀胱癌、胰腺癌、腎癌、食道癌、頭頸癌、甲狀腺癌、皮膚鱗狀細胞癌、膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、泌尿膀胱癌（urinary bladder cancer）、子宮癌（hysterocarcinoma）、黑色素瘤、骨肉瘤、淋巴瘤（例如外套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤）、白血病（例如T細胞幼淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病或急性骨髓性白血病）、多發性骨髓瘤、結直腸癌、肺腺癌、子宮肉瘤（CS）、肺鱗狀細胞癌、子宮頸癌、肉瘤、嫌色細胞癌（chromophobe）、腎細胞癌（RCC）、透明細胞RCC、乳頭狀RCC、葡萄膜黑色素瘤、睾丸生殖細胞、低等神經膠質瘤（LGG）、間皮瘤、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(PCPG)或胸腺瘤。在一些實施方式中，所述癌症是胃癌。
在一些實施方式中，MDM2抑制劑在抑制MDM2與p53的結合中具有如藉由螢光偏振MDM2結合試驗所測定的不大於1μM的IC50 （例如，不大於500 nM、400 nM、300 nM、200 nM、150 nM、100 nM、50 nM、20 nM、10 nM或5nM）。
在一些實施方式中，MDM2抑制劑選自依沙那林（idasanutlin, 又稱RG7388）、RG7112、HDM201、KRT-232、AMG 232、BI907828、SAR-405838（又稱MI-77301）、MK-8242（又稱SCH 900242）、DS3032-b、ALRN-6924和CGM097；或前述任一項的藥學上可接受的鹽。
在一些實施方式中，所述MDM2抑制劑包含具有下式（I）的化合物：
Figure 02_image003
（I） 或其藥學上可接受的鹽，其中：
Figure 02_image005
選自以下群組：
Figure 02_image007
； B是C4-7 碳環； R1 是H、取代或未取代的C1-4 烷基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基、ORa 或NRa Rb ； n是0、1或2； R2 、R3 、R4 、R5 、R7 、R8 、R9 和R10 獨立地選自由H、F、Cl、CH3 和CF3 組成的群組； R6 是
Figure 02_image009
或
Figure 02_image011
； Ra 是氫或取代或未取代的C1-4 烷基； Rb 是氫或取代或未取代的 C1-4 烷基； Rc 和Rd 是環B的一個碳原子上的取代基，其中： Rc 是 H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-ORa 、ORa 、或鹵代； Rd 是 H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-ORa 、ORa 、或鹵代；或 Rc 和Rd 與它們所連接的碳一起形成4至6員螺環取代基，所述取代基任選地含有氧原子；並且 Re 是-C(=O)ORa 、-C(=O)NRa Rb 、或-C(=O)NHSO2 CH3 。
在一些實施方式中，
Figure 02_image005
是
Figure 02_image013
； B 是
Figure 02_image015
；且 Rc 和Rd 分别是F和F、H和H、OH和CH3 、OH和H、CH3 和CH3 、CH3 和OH、H和OH、CH2 CH3 和CH2 CH3 、或CH2 OH和CH2 OH。
在一些實施方式中，
Figure 02_image017
是H、CH3 或CH2 CH3 。
在一些實施方式中，R2 是H；R3 是鹵代；R4 和R5 均是H。
在一些實施方式中，R7 是氟代；R8 、R9 和R10 中的每一個是H；且Re 是-C(═O)OH、-C(═O)NH2 或-C(═O)NHSO2 CH3 。
在一些實施方式中，所述MDM2抑制劑爲選自以下的化合物：
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
、
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
和
Figure 02_image047
；		  
或所述化合物的藥學上可接受的鹽。
在一些實施方式中，所述MDM2抑制劑是：
Figure 02_image049
或
Figure 02_image001
或其藥學上可接受的鹽。
在一些實施方式中，所述MDM2抑制劑是化合物C或其藥學上可接受的鹽。
在一些實施方式中，所述方法還包括進一步施用有效量的一種或多種額外的療法。
在一些實施方式中，一種或多種額外的療法包括放療、化療、靶向癌症療法或使用免疫檢查點分子的調節劑的療法。
在一些實施方式中，一種或多種額外的療法包括施用抗PD-1抗體、Bcl-2抑制劑、FAK抑制劑、MEK抑制劑或MET抑制劑。
在一些實施方式中，所述方法還包括進一步施用有效量的一種或多種額外的療法，所述額外的療法包括施用免疫檢查點分子的調節劑。
在一些實施方式中，所述MDM2抑制劑是化合物C或其藥學上可接受的鹽，並且所述免疫檢查點分子的調節劑是抗PD-1抗體。
本文還提供一種用於預測患有癌症的受試者對用MDM2抑制劑的治療的反應性的套組，包括： a）一種或多種用於檢測ATM和/或ATR中存在一種或多種失活突變的試劑；或一種或多種用於測量ATM和/或ATR表現量的試劑；和/或 b）一種或多種用於測量MDM2拷貝數變異的試劑，或一種或多種用於測量MDM2表現量的試劑。
在一些實施方式中，所述套組還包括一種或多種用於檢測存在或不存在功能性p53的試劑。在一些實施方式中，所述套組還包括一種或多種用於檢測存在野生型p53。
定義
根據本案並且如本文所使用，除非另有明確說明，否則以下術語具有以下含義。除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語、符號和其他科學或醫學術語旨在具有化學和醫學領域具有通常知識者通常理解的含義。
如本文所用，術語「生物標記物」是指作爲某些生物狀態或狀況的可測量指示物的生物分子。本文使用的術語「生物標記物」旨在涵蓋靶多核苷酸或多肽（例如由靶多核苷酸編碼）。本文提供的生物標記物的實例可以是基因（例如基因組DNA、cDNA）或該基因的産物，例如從該基因轉錄的mRNA，以及由該基因編碼的蛋白質。本文提供的生物標記物的具體實例包括ATM、ATR、MDM2和p53。
如本文所用，「ATM」是共濟失調毛細血管擴張突變（ataxia telangiectasia mutated）或ATM絲胺酸/蘇胺酸激酶的縮寫。術語「ATM」旨在涵蓋ATM基因以及ATM基因産物（例如mRNA、蛋白質）。人ATM的例示性序列可在UniProtKB資料庫中以登錄號Q13315（ATM-HUMAN）獲得，在GenBank資料庫中以NCBI登錄號爲AAB65827獲得，並且還揭露在文獻諸如Savitsky K et al.,Hum Mol Genet. 4:2025-2032 (1995)；Platzer M. et al.,Genome Res. 7:592-605 (1997)；Bryd P. J. et al.,Hum Mol Genet. 5:145-149 (1996)；以及Chen G. et al.,J Biol Chem. 271:33693-33697 (1996)。
如本文所用，「ATR」是ATM和Rad3相關（Ataxia Telangiectasia and Rad3-related）或ATR絲胺酸/蘇胺酸激酶的縮寫。術語ATR旨在涵蓋ATR基因以及ATR基因産物（例如mRNA，蛋白質）。人ATR的例示性序列可在UniProtKB資料庫中以登錄號爲Q13535（ATR-HUMAN）獲得，在GenBank資料庫中以NCBI登錄號爲AAK26749.1獲得，並且還揭露在文獻諸如Bentley et al.,EMBO J. 15:6641-6651 (1996)及Cimprich et al.,Proc Natl Acad Sci USA 107:18575-18480 (1996)。
如本文所用，「 MDM2」是鼠雙微體2（Murine Double Minute 2）的縮寫。術語MDM2旨在涵蓋MDM2基因以及MDM2基因産物（例如mRNA、蛋白質）。人MDM2的例示性序列以NCBI登錄號ABT17086、ABT17084.1、ABT17085.1或ABT17083.1可獲得。
術語「 TP53」和「 p53」在本文可互換使用，並且是腫瘤蛋白P53的縮寫。替代名稱包括例如抗原NY-CO-13、磷酸化蛋白p53、腫瘤抑制物p53和細胞腫瘤抗原p53。TP53和p53均可指生物標記物p53的蛋白質或DNA或RNA序列。人p53的例示性序列可在UniProtKB資料庫中以登錄號P04637（P53-HUMAN）獲得。人p53的例示性序列可以從NCBI登錄號AYF55702.1或AXU92429.1獲得。
關於諸如ATM、ATR、MDM2和/或p53的生物標記物的術語「表現量」是指樣品中存在的目標生物標記物的量或數量。這樣的量或數量可以表示爲絕對術語，即樣品中生物標記物的總量，或表示爲相對術語，即樣品中生物標記物的濃度或百分比。可以在DNA表現量（例如由染色體區域中基因的量或數量或拷貝數表示）、RNA表現量（例如以mRNA量或數量）或蛋白質表現量（例如以蛋白質的量或數量）測量生物標記物的表現量。
關於諸如ATM、ATR、MDM2和/或p53的生物標記的術語「活性」是指如本文所述的蛋白質的生物活性（例如催化或調節能力）。
如本文所用，受試者對治療「很可能」有反應是對受試者中發生治療反應的可能性的度量，指的是大於推測（speculation）但小於確定性的概率。因此，如果理性的人使用常識、訓練或經驗得出在給定情況下治療反應是很可能的，則治療反應是有機率的(probable)。在一個實施方式中，術語 「很可能」表示發生治療反應的可能性的百分比形式的機會。在一些實施方式中，具有被鑑定爲「很可能反應」的患有癌症的受試者是指具有大於30％的機會，大於40％的機會，大於50％的機會，大於60％的機會，大於70%的機會，大於80％的機會，大於90％的機會對用MDM2抑制劑的治療有反應的患有癌症的受試者。
在受試者對癌症療法的治療反應的上下文中使用的術語「反應」或「反應性」可互換使用，並且是指受試者對治療的與不利反應（即不良反應事件）相對立的有益反應。在受試者中，有益反應可以根據許多臨床參數的形式來表現，包括可能導致腫瘤消退或排斥的可檢測的腫瘤消失（完全緩解）、腫瘤大小和/或癌細胞數量減少（部分緩解）、腫瘤生長停滯（穩定疾病）或增强抗腫瘤免疫反應；與腫瘤有關的一種或多種症狀在某種程度上減輕；治療後的生存時間增加；和/或治療後給定時間點死亡率降低。腫瘤大小和/或癌細胞數量和/或腫瘤轉移的持續增加，表示缺乏對治療的有益反應，以及由此地反應性的降低。
如本文所用，「癌症」是範圍廣泛的細胞惡性腫瘤的通用名稱，其特徵在於生長不受調節、缺乏分化以及侵入局部組織和轉移的潛力或能力。這些腫瘤性惡性腫瘤以不同程度的患病率（prevalence）影響體內的各個組織和器官。癌症是關於存在具有致癌細胞典型特徵的細胞，這些特徵爲例如不受控制的增殖、永生、轉移潛力，快速生長和增殖速率以及某些特徵形態特徵。通常，癌細胞會以腫瘤的形式出現，但是這類細胞可能單獨存在，也可能作爲獨立細胞（例如白血病細胞）在血流中循環。
如本文所用，「藥學上可接受的」組分是適合用於人和/或動物而沒有過度的不利副作用（例如毒性、刺激和過敏性反應）的組分，與合理的獲益/風險比相稱。
術語「測定」、「測量」和「檢測」可以互換使用，且指定量和半定量測定兩者。
術語「雜交」是指核酸分子的至少部分互補的鏈的結合、雙鏈化（deplexing）或配對。當具有足夠程度的互補性時，核酸鏈可以與靶核酸鏈專一性雜交以避免與非靶核酸序列非專一性結合。
術語「核酸」和「多核苷酸」可互換使用，並且是指任何長度的核苷酸（去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物）的聚合形式。多核苷酸的非限制性實例包括基因，任何序列的基因片段、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、shRNA、單鏈短或長RNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、分離的DNA、核酸探針和引子。所述核酸分子可以是線性的或環形的。
術語「互補性」或「互補」是指在核酸序列和另一核酸序列之間藉由傳統的華生-克里克（Watson-Crick）或其他非傳統類型進行鹼基配對的能力。互補可以是部分的也可以是全部的。當一個或多個核酸鹼基根據鹼基配對規則不匹配時，發生部分互補。互補百分比表示核酸分子中可以與第二個核酸序列形成鹼基對（例如華生-克里克鹼基對）的核酸鹼基的百分比，例如在10個鹼基中有5、6、7、8、9或10個鹼基配對時爲50％、60％、70％、80％、90％或100％互補性。
如本文所用，術語「預後」是指疾病或病症的未來病程或結果的預測或預計。
通常，「蛋白質」是多肽（即由肽鍵彼此連接的一串至少兩個胺基酸）。蛋白質可以包括胺基酸以外的部分（例如可以是糖蛋白）和/或可以以另外方式被加工或修飾。本領域具有通常知識者將理解，「蛋白質」可以是由細胞産生的完整多肽鏈（具有或不具有訊號序列），或者可以是其功能部分。本領域具有通常知識者將進一步理解，蛋白質有時可包含多於一個的多肽鏈，例如藉由一個或多個二硫鍵連接或藉由其他方式相關聯。
除非另有說明，否則本文所用的術語「治療」或「處理」是指在受試者中部分或完全逆轉、減輕、抑制其進程或預防腫瘤生長、腫瘤轉移或其他引起腫瘤的細胞或贅生細胞。
如本文所用，「共同施用」或「聯合療法」應理解爲使用分開的製劑或單一藥物製劑，施用兩種或更多種活性劑，或以任何順序連續施用使得存在一段時間兩種（或全部）活性劑同時發揮其生物學活性。本文中預期一種活性劑（例如，MDM2抑制劑）可以改善第二種藥物的活性，例如可以使靶細胞（例如癌細胞）對第二種藥物的活性敏感。共同給藥不需要同時，以相同的頻率或藉由相同的給藥途徑來給藥。
術語「施用」或「給藥」等包括將藥物組合物或藥劑遞送到受試者的系統或受試者特定區域的任何方法。在某些實施方式中，藉由口服或腸胃外遞送藥劑。在某些實施方式中，藉由注射或輸注遞送藥劑，或藉由包括經黏膜遞送的局部遞送。在某些實施方式中，藉由吸入遞送藥劑。在本發明的某些實施方式中，藉由腸胃外遞送施用藥劑，包括靜脈內、肌肉內、皮下、髓內注射，以及鞘內、直接心室內、腹膜內、鼻內或眼內注射。在一個實施方式中，可以藉由直接注射到腫瘤來施用藥劑。在一些實施方式中，可以藉由靜脈內注射或靜脈內輸注施用藥劑。在某些實施方式中，可以藉由連續輸注使用藥劑。在某些實施方式中，給藥不是口服。在某些實施方式中，給藥是全身性的。在某些實施方式中，給藥是局部的。在一些實施方式中，可以組合一種或多種施用途徑，例如靜脈內給藥和瘤內給藥，或靜脈內給藥和經口給藥（peroral），或靜脈內給藥和口服，或靜脈內給藥和局部給藥，或靜脈內給藥和透皮或經黏膜給藥。施用藥劑可以由許多工作者協調。施用藥劑包括，如將待施用的藥劑開處方給受試者，並/或提供指導（直接或藉由其他人）以服用特定藥物，藉由自我遞送（如藉由口服遞送、皮下遞送、經中央管線的靜脈內遞送）；或由經過培訓的專業人員遞送（例如靜脈內輸送、肌肉內輸送、腫瘤內輸送、連續輸注等）。
如本文所用，術語「受試者」是指人類或任何非人類的動物或哺乳動物（例如小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、猪、綿羊、馬或靈長類動物）。在許多實施例中，受試者是人類。受試者可以是患者，其是指向醫療提供者提出以診斷或治療疾病的人。術語「受試者」在本文中與「個體」或「患者」互換使用。受試者可以患有疾病或病症或易患該疾病或病症，但是可以顯示或不顯示該疾病或病症的症狀。
術語「治療有效量」或「有效量」是指以適用於任何治療的以合理的受益/風險比産生某種期望的局部或全身治療效果的藥劑的量。當施用用於預防疾病時，該量足以避免或延遲疾病的發作。治療有效量或有效量不需要治癒疾病或病症或預防疾病或病症的在任何時候的發生。在某些實施方式中，藥劑的治療有效量將取决於其治療指數、溶解度等。
「預防」是指降低患疾病或病症的風險。預防不需要疾病或病症在受試者中永遠不會發生或復發。
在本發明所存在的一系列列舉數值的所有情況中，應理解爲，任何所述數值可以是數值範圍的上限或下限。應進一步理解爲，本發明包括所有這些數值範圍，即具有數值上限和數值下限的組合的範圍，其中每個上限和下限的數值可以是本發明所述的任何數值。本發明提供的範圍應理解爲包括該範圍內的所有值。例如1~10應理解爲包括所有值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，以及適當的分數值。由「至少」界定的範圍被理解爲包括所提供的低值和所有較高的數值。
如本發明所用，「約」應理解爲包括平均值的三個標準偏差內或在特定領域中容許的標準範圍內。在某些實施方式中，約應理解爲不大於0.5的變化。
這裡使用的「一」和「一個」指的是一個或多於一個（即至少一個）語法對象。舉例來說，「一個元素」表示一個元素或多於一個元素。
術語「包括」在本發明中用於表示術語「包括但不限於」，並且可與其互換使用。
術語「或」在本案中的用法是包括性的，用於表示術語「和/或」，並與其互換使用，除非上下文另有明確規定。
I 、預測對用 MDM2 抑制劑治療的反應性的生物標記物
本文所述的方法部分地基於生物標記物的發現，所述生物標記物的表現量和/或活性和/或突變可預示患有癌症的受試者對用MDM2抑制劑治療的反應性。先前已經描述了MDM2抑制劑作爲抗癌治療劑（參見例如美國專利號9,745,314，其全部內容藉由引用併入本文），並且在人類中評估所述抗癌治療劑作爲單一療法或與標準照護化療劑組合用於治療疾病和病症，在所述疾病和病症中藉由抑制MDM2和MDM2相關蛋白的活性可提供益處。
本文描述了鑑定對用MDM2抑制劑的治療很可能有反應的癌症患者的方法，用MDM2抑制劑治療癌症患者的方法，以及用於預測癌症患者對用MDM2抑制劑的治療的反應性的套組。發現可用於本文提供的方法的生物標記物包括ATM、ATR、MDM2和/或p53。
ATM被認爲是MDM2的主要的翻譯後調節因子（參見例如Cheng Q. et al.,EMBO J. 28:3857-3867 (2009)；以及Maya R et al.,Gene Dev. 15:1067-1077 (2001)）。ATM在DNA雙鏈斷裂（DSB）的修復中起著核心作用。ATM不足會使得雙鏈斷裂DNA的修復喪失，進而增加基因組不穩定性。換言之，ATM中的失活改變（例如ATM突變）可能導致與MDM2過表現誘導的類似的作用。如圖1A所總結，ATM失活增加MDM2功能，並降低p53功能。
在本文中用作生物標記物的ATM可以是ATM蛋白以及編碼ATM蛋白的多核苷酸（例如DNA或RNA）。在某些實施方式中，ATM的基因包含SEQ ID NO：1的基因序列。在某些實施方式中，ATM的蛋白質包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
ATR與ATM高度同源，並調節細胞對DNA損傷的反應（參見例如Blackford A.N. et al.,Mol Cell 66:801-817 (2017)）。ATR與ATM的不同之處在於，其活性會因不同的遺傳毒性壓力而增加；ATR對引起雙鏈或單鏈DNA上大體積加成物（adducts）的試劑（包括電離輻射）作出反應。然而，ATR以類似於ATM的方式起作用，其直接磷酸化一組靶蛋白，例如靶蛋白、p53、chk1、chk2、c-Abl等（參見例如EP專利1617875B1）。
用作本文生物標記物的ATR可以是ATR蛋白以及編碼ATR蛋白的多核苷酸（例如DNA或RNA）。在某些實施方式中，ATR的基因包含SEQ ID NO：3的基因序列。在某些實施方式中，ATR的蛋白質包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列。
MDM2被p53轉錄活化，而MDM2又藉由至少三種機制反過來抑制p53活性（Wu et al.,Genes Dev. 7:1126 (1993)），包括抑制p53介導的反式活化、防止p53與靶DNA結合、及促進p53降解。發現MDM2在某些癌症中經常過表現，並且可以藉由消除p53功能來增强其致癌潛力和對細胞凋亡的抵抗力。
用作本文生物標記物的MDM2可以是MDM2蛋白以及編碼MDM2蛋白的多核苷酸（例如DNA或RNA）。在某些實施方式中，MDM2的基因包含SEQ ID NO：5的基因序列。在某些實施方式中，MDM2的蛋白質包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列。
p53是一種能夠調節許多基因的轉錄因子，這些基因調節細胞週期和凋亡。p53蛋白受MDM2控制。藉由結合p53的N末端，MDM2抑制p53反式活化。此外，作爲E3泛素連接酶的MDM2也將p53靶向蛋白酶體細胞質降解。因此，阻斷p53-MDM2相互作用可以減少對p53功能的負向調節，並使p53介導其下游功能。因此，認爲功能性p53的存在對用MDM2抑制劑的治療的反應是有益的。
如本文所用，術語「功能性p53」是指野生型p53和保留野生型p53活性的至少約5％（例如野生型p53活性的至少約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％或更多）的p53的突變體或等位基因變體。
用作本文生物標記物的p53可以是p53蛋白以及編碼p53蛋白的多核苷酸（例如DNA或RNA）。在某些實施方式中，將編碼p53的基因在本案中稱爲TP53。在某些實施方式中，p53的基因包含SEQ ID NO：7的基因序列。在某些實施方式中，p53的蛋白質包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
II 、用於鑑別患者、治療指導和預後的方法
在一個方面，本文提供一種鑑定對用MDM2抑制劑的治療很可能有反應的患有癌症的受試者的方法。在某些實施方式中，該方法包括：提供來自受試者的生物樣品；測定所述生物樣品中：是否存在ATM和/或ATR的活性或表現量不足；和/或是否存在MDM2的活性或表現量增多；並且基於以下條件鑑定所述受試者爲對所述用MDM2抑制劑的治療很可能有反應：所述生物樣品中存在i）所述ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）所述MDM2的活性或表現量增多，或i）和ii）兩者都有。
在某些實施方式中，鑑定對用MDM2抑制劑的治療很可能有反應的患有癌症的受試者的方法進一步包括將MDM2抑制劑施用於鑑定爲很可能對用MDM2抑制劑的治療有反應的受試者。
在另一方面，本文提供選擇患有癌症的受試者以用MDM2抑制劑治療的方法。在某些實施方式中，該方法包括：提供來自受試者的生物樣品；測定所述生物樣品中：是否存在ATM和/或ATR的活性或表現量不足；和/或是否存在MDM2的活性或表現量增多；並且基於以下條件選擇所述受試者以用MDM2抑制劑治療：所述生物樣品中存在i）所述ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）所述MDM2的活性或表現量增多，或i）和ii）兩者都有。
在某些實施方式中，選擇患有癌症的受試者以用MDM2抑制劑治療的方法進一步包括向所選擇的受試者施用MDM2抑制劑。
在另一方面，本文提供了預測患有癌症的受試者對用MDM2抑制劑的治療的反應性的方法。在某些實施方式中，該方法包括：提供來自受試者的生物樣品；測定所述生物樣品中：是否存在ATM和/或ATR的活性或表現量不足；及/或是否存在MDM2的活性或表現量增多；並且基於以下條件預測所述受試者爲對用MDM2抑制劑的治療有高度反應：所述生物樣品中存在i）所述ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）所述MDM2的活性或表現量增多，或i）和ii）兩者都有。
在另一方面，本文提供了一種用MDM2抑制劑治療患有癌症的受試者的方法。在某些實施方式中，所述方法包括：測定來自所述受試者的生物樣品中是否存在ATM和/或ATR的活性或表現量不足；及/或是否存在MDM2的活性或表現量增多；並且基於以下條件向所述受試者施用MDM2抑制劑：所述生物樣品中存在i）所述ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）所述MDM2的活性或表現量增多，或i）和ii）兩者都有。
在本文提供的方法的某些實施方式中，所述測定步驟進一步包括在所述生物樣品中測定p53是否爲功能性p53（例如野生型p53）。
i 、樣品準備
在某些實施方式中，本文提供的方法包括提供來自受試者的生物樣品。
可從受試者獲得任何適合進行本文提供的方法的生物樣品。如本文所用，「生物樣品」是指藉由從受試者採樣而獲得的生物樣品，可選地進行額外處理。在某些實施方式中，樣品可以是包含癌細胞或非癌細胞的生物樣品。例如，非癌細胞可以來自與發現癌細胞相同的組織或器官。在一些實施方式中，生物樣品是例如藉由腫瘤活檢或細針抽吸從腫瘤組織獲得的新鮮或存檔的樣品。在一些實施方式中，樣品可以是含有癌細胞或非癌細胞（例如，周邊血單核細胞（PBMC））的任何生物流體。按照（例如在活檢期間）醫院或診所通常所遵循的標準方案從受試者採集樣品，生物樣品的實例包括但不限於體液，例如血液、血漿、血清、尿液、陰道液、子宮或陰道沖洗液、胸液、腹水、腦脊髓液、唾液、汗液、眼淚、痰、支氣管肺泡灌洗液液體等，以及組織，例如活檢組織（例如活檢的骨組織、骨髓、乳腺組織、腸胃道組織、肺組織、肝組織、前列腺組織、腦組織、神經組織、腦膜組織、腎組織、子宮內膜組織、子宮頸組織、淋巴結組織、肌肉組織或皮膚組織）、石蠟包埋組織。在另一個實施方式中，生物樣品包含細胞、組織、血液、血漿、血清、尿液、漱口水、糞便、唾液及其任何組合。在另一個實施方式中，生物樣品是血液、血漿、血清或尿液。在一個較佳的實施方式中，生物樣品是血液。在另一個較佳的實施方式中，生物樣品是腫瘤組織。
在某些實施方式中，可以藉由需要的方法進一步處理樣品以測定至少一種生物標記物的活性或表現量。
在某些實施方式中，所述方法進一步包括從由受試者獲得的生物流體樣品（例如周邊血樣品）或組織樣品中分離或萃取癌細胞（例如循環腫瘤細胞）。癌細胞可以藉由免疫磁分離技術來分離，例如可從Immunicon（Huntingdon Valley, Pa.）獲得的技術。
在某些實施方式中，可以對組織樣品進行處理以進行原位雜交。例如，可以在將組織樣品固定在顯微鏡玻璃載玻片上之前，用石蠟包埋並接著用溶劑（通常爲二甲苯）脫蠟。
在某些實施方式中，如果要測量生物標記物的RNA或DNA表現量，所述方法還包括從樣品中分離核酸。多種萃取方法適用於從細胞或組織中分離DNA或RNA，例如苯酚和氯仿萃取，以及在例如Ausubel et al.,Current Protocols of Molecular Biology (1997) John Wiley＆Sons；以及Sambrook & Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed. (2001)中所述其他各種方法。
市售套組也可用於分離RNA，包括例如NucliSens萃取套組（Biomerieux，Marcy l'Etoile，法國）、QIAampTM微型血液套組、Agencourt GenfindTM 、Rneasy® 微型柱（Qiagen）、PureLink® RNA微型套組（Thermo Fisher Scientific）和Eppendorf Phase Lock GelsTM 。具有通常知識者可以按照製造商的方案輕鬆萃取或分離RNA或DNA。
ii 、測定、測量和檢測生物標記物
在某些實施方式中，本文提供的方法包括在生物樣品中測定是否存在ATM和/或ATR的活性或表現量的不足。如發明人驚奇地發現的，ATM和/或ATR的活性或表現量的不足與患有癌症的受試者對用本文提供的MDM2抑制劑治療産生反應的可能性有關。
如本文所用，「不足」是指活性或表現量不足，並且可以包括例如小於正常的活性或表現量，或者活性或表現量不存在或爲零。例如，ATM和/或ATR的活性或表現量不足可導致在生物樣品中的ATM和/或ATR不具有或低於正常功能，或者ATM和/或ATR的表現量不存在或降低。
在某些實施方式中，ATM和/或ATR中存在失活突變可以表示ATM和/或ATR的活性或表現量的不足。因此，爲了測定生物樣品中是否存在ATM和/或ATR的活性或表現量不足，本文提供的方法可以包括在生物樣品中檢測ATM和/或ATR中是否存在一種或多種失活突變的步驟。
如本文所用，術語「失活突變」在用於生物標記物時是指一種突變，其導致生物標記物的基因或基因産物的功能或活性的至少部分（或完全）喪失，或導致生物標記物的基因或基因産物無功能。例如，受影響的生物標記物的基因或基因産物的活性將明顯低於野生型對應物或甚至被消除。在某些實施方式中，ATM和/或ATR中的失活突變可以是使ATM和/或ATR的生物學活性降低的易位、缺失、插入、取代或其任何組合。在某些實施方式中，失活突變使ATM和/或ATR的絲胺酸/蘇胺酸激酶活性降低。
如本文所用，「取代」是在多核苷酸序列中將一個核鹼基替換爲另一個，或在多肽序列中將一個胺基酸殘基替換爲另一個的突變，多核苷酸序列的取代可以：1）將密碼子改變爲編碼不同胺基酸殘基的密碼子，因此將導致所産生蛋白質中胺基酸序列的改變；或2）改變爲編碼相同胺基酸殘基的密碼子從而不會改變所産生的蛋白質；或3）將編碼胺基酸的密碼子更改爲單個「終止」密碼子並導致蛋白質不完整（不完整的蛋白質通常是無功能的）。多肽序列中的取代可以表示爲AnB，其中「n」是表示多肽序列中第n個胺基酸殘基的數字，「A」是野生型多肽序列中第n個殘基的胺基酸殘基，並且「B」是在第n個殘基處的突變的胺基酸殘基。當突變的殘基顯示爲「*」時，是指核苷酸序列中導致無義密碼子的突變，其導致截短的不完整多肽。例如，「H1380Y」表示第1380個胺基酸殘基組氨酸（H）變爲酪胺酸（Y）； 「Q912 *」表示編碼胺基酸殘基912（穀胺醯胺，Q）的核苷酸變爲終止密碼子，並且所得到的多肽被截短。又例如，相對於SEQ ID NO：1的「3154-2A>G」表示在SEQ ID NO：1的核苷酸殘基3154上游2個核苷酸的位置（在內含子）中的A到C取代，其影響剪接受體位點並導致移碼。
如本文所用，「插入」是一個或多個額外的核鹼基對被插入到多核苷酸序列的位置中，或者一個或多個胺基酸殘基被插入到多肽序列中的突變。例如，「L348_M349insYIV」表示在胺基酸殘基348（亮胺酸，L）和349（甲硫胺酸，M）之間的插入胺基酸序列YIV。
如本文所用，「缺失」是一個或多個核鹼基對從多核苷酸序列中丟失或缺失，或一個或多個胺基酸殘基從多肽序列中丟失或缺失的突變。多肽的缺失在缺失位點兩側的胺基酸殘基編號之後用「del」表示。例如，「1599_1600del」表示缺失胺基酸殘基1599-1600。又例如，「S2855_V2856delinsRI」表示自胺基酸殘基2855（絲胺酸，S）至2856（纈胺酸，V）缺失兩個胺基酸，並在該同一位點插入精胺酸（R）和異亮胺酸（I）。
如本文所用，「易位」是指由兩個非同源染色體之間的遺傳物質交換引起的一種染色體異常。易位可能是平衡的，也可能是非平衡的；平衡的易位不會導致物質的獲得或損失，而非平衡的易位可能會導致特定染色體片段的三體性或單體性。染色體易位通常見於白血病病例，例如急性骨髓性白血病。
在某些實施方式中，多核苷酸序列中的插入或缺失可引起移碼，移碼改變密碼子的閱讀框並導致與原始基因翻譯産物完全不同的基因翻譯産物。這通常會産生導致功能喪失的截短的蛋白質。多肽中的移碼表示爲「AnBfs * m」，其表示從第n個胺基酸殘基起始並終止於下游的第m個殘基的閱讀框的移位，從而導致蛋白質過早終止，其中「A」和「B」具有與上述相同的含義。例如，「K1903fs」表示以胺基酸殘基1903（賴胺酸，K）作爲第一個受影響的胺基酸殘基的移碼改變。又例如，「K468Efs*18」表示從胺基酸殘基468（賴胺酸，K）作爲第一個受影響胺基酸殘基的開始並在下游18個殘基終止的移碼。
在許多類型的癌症或腫瘤中已經發現有ATM和/或ATR的失活突變。例如，在兩個ATM等位基因中的失活突變與T細胞幼淋巴細胞性白血病相關；在外套細胞淋巴瘤中觀察到ATM突變，例如在編碼激酶結構域的基因區域內的截短突變或錯義突變。ATM基因座雜合性的喪失常見於B細胞慢性淋巴細胞性白血病中（參見例如Choi M.,Mol Cancer Ther. 15(8):1781-91 (2016)）；在子宮內膜癌中描述了ATR基因的A10重複序列中的截短突變，並且該突變與生物學侵襲性有關（Zighelboim I.,J Clin Oncol. 27:3091-3096 (2009)；以及在乳癌中發現ATR外顯子33中核苷酸的缺失，所述缺失導致了缺少幾個功能性結構域的推定的截短ATR（Durocher F.,BMC Cancer 6 (2006)。
迄今爲止已經鑑定出ATM基因中的許多突變。例如如癌症體細胞突變目錄（Catalogue of Somatic Mutations in Cance，COSMIC）資料庫中所述，已在ATM中鑑定出超過2750種突變，該資料庫可從以下網站鏈接獲得：（https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis?ln=ATM#variants）。還已經在不同的癌症中報導了ATM突變，例如Boultwood J.,J Clin Pathol. 54:512-526 (2001)；Choi M. et al.,Mol Cancer Ther. 15:1781-1791 (2016)；Wan Y. et al.,Blood 121:4627-4634 (2013)；Bullrich F. et al.,Cancer Res. 59:24-27 (1999)；Roberts N.J. et al.,Cancer Discov. 2:41-46 (2012)； Shen L. et al.,Mol Biol Rep. 39:5719-5725 (2012)；以及Dombemowsky S.I. et al., JClin Oncol. 26:3057-3062 (2008)。
類似地，已經鑑定出ATR基因中的許多突變，並且在COSMIC資料庫中已經發布了超過1652種ATR突變，可從以下網站鏈接獲得：（https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis?ln=ATR#variants）。還已經在不同的癌症中報導了ATR突變，例如：Durocher F. et al.,BMC Cancer 6:230 (2006)；Tanaka A. et al.,Am J Hum Genet. 90:511-517 (2012)；Heikkinen K. et al.,Breast Cancer Res. 7:R495-R501 (2005)；Stephens P. et al.,Nature Genetics 37:590-2 (2005)；Sjöblom T. et al.,Science 314: 268-74 (2006)；以及Zighelboim I. et al.,J Clin Oncol. 27:3091-3096 (2009)。
應當理解，本案不限於任何特定的ATM或ATR突變。ATM或ATR中的任何失活突變都可用於本案。在一些實施方式中，ATM中的失活突變包括但不限於圖1B中的一種或多種突變。在一些實施方式中，ATM中的失活突變包括選自圖1B、1C和1D中的相對於SEQ ID NO：2的突變，或相對於SEQ ID NO: 1的c.3154-2A>G，或其任何組合。
在一些實施方式中，ATM中的失活突變包括但不限於相對於SEQ ID NO：2的H1380Y、N1983S、N2875S、R2598Q、1599_1600del、V2716A、K1903fs、V2906I、A1127V、K1101E、Q912*、S2165F或H1083Y，或相對於SEQ ID NO：1的c.3154-2A>G，或前述突變的任何組合。
ATR中的失活突變的實例包括但不限於相對於SEQ ID NO：4的K243T、Q1926H、I774fs、K1379N、L1483F或其任何組合。
在某些實施方式中，可以由生物樣品中ATM和/或ATR的表現量或拷貝數表示ATM和/或ATR的活性或表現量的不足。因此，爲了測定生物樣品中是否存在ATM和/或ATR的活性或表現量的不足，本文提供的方法可以包括測定與參考基準相比，生物樣品中ATM和/或ATR的表現量或拷貝數是否降低的步驟。
在某些實施方式中，本案的方法包括測量ATM和/或ATR的表現量或基因拷貝。不希望受到任何理論的束縛，發現在某些情況下，ATM突變可導致ATM蛋白表現的降低或喪失，在某些情況下，ATM啟動子的甲基化也可能導致蛋白表現量降低。
在某些實施方式中，本文提供的方法可包括或進一步包括在生物樣品中測定是否存在MDM2的活性或表現量的增多。
關於基因或基因産物（例如MDM2）的術語「增多」是指與參考基準相比，即與不具有所述增多的參考基準相比，基因或其産物的量或活性的增加。例如，增多可以在於MDM2基因的拷貝數（即，擴增）、MDM2基因産物的表現量或MDM2蛋白的功能/活性。如本文所用，「拷貝數」是指個體基因組中特定基因或特定基因組序列的拷貝數。「拷貝數變異」或「CNV」是指一個個體與另一個個體間基因組的特定基因或特定DNA序的拷貝數變化。例如，儘管認爲基因以每個基因組兩個拷貝出現，但是發現在不同的個體中一些基因或基因組序列以一個、三個或三個以上拷貝存在，或者甚至缺失（即0個拷貝）。
在某些實施方式中，本案的方法包括測量MDM2的拷貝數變異或測量MDM2的表現量。
在某些實施方式中，本文提供的方法還包括在生物樣品中測定存在或不存在功能性p53（例如野生型p53或TP53基因）。在某些實施方式中，本案的方法包括在生物樣品中測定p53是否爲野生型。
本文提供的生物標記物ATM、ATR、MDM2和/或p53旨在涵蓋包括mRNA、蛋白質以及DNA（例如基因組DNA）的不同形式。因此，這些生物標記物的表現量和/或活性可以用相應生物標記物的RNA（例如mRNA）、蛋白質或DNA（例如基因組DNA）來測量。類似地，生物標記物的突變狀態和/或野生型狀態也可以用DNA（例如基因組DNA）、RNA（例如mRNA）或蛋白質來測量（例如藉由測量由突變基因編碼的改變的蛋白質産物）。
生物標記物在DNA或RNA表現量的突變狀態可以藉由本領域已知的任何方法來測量，例如但不限於擴增試驗、雜交試驗或定序試驗。蛋白質表現量的突變狀態可以藉由本領域已知的任何方法來測量，例如但不限於免疫試驗。
生物標記物在DNA或RNA的表現量可以藉由本領域已知的任何方法來測量，例如但不限於擴增試驗、雜交試驗或定序試驗。生物標記物在蛋白質表現量的表現量可以藉由本領域已知的任何方法來測量，例如但不限於免疫試驗。
生物標記物的活性表現量可以藉由本領域已知的合適的功能性試驗來測量，例如但不限於藉由磷酸化試驗。
這些方法在本領域中是衆所周知的，並且在下面進行詳細描述作爲例示性說明。
擴增試驗
核酸擴增試驗法是關於複製靶核酸（例如DNA或RNA），從而增加被擴增的核酸序列的拷貝數。擴增可以是指數的或線性的。例示性核酸擴增方法包括但不限於使用聚合酶鏈反應的擴增（「PCR」，參見美國專利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications (Innis et al.,Eds. 1990)）、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、即時定量PCR（qRT-PCR）、定量PCR（例如TaqMan® ，巢式PCR，連接酶鏈反應（參見Abravaya K. et al.,Nucleic Acids Research 23:675-682 (1995)）、分支DNA訊號擴增（參見Urdea M.S. et al.,AIDS 7(suppl 2):S11-S14 (1993)）、可擴增的RNA報導子、Q-beta複製（參見Lizardi et al.,Biotechnology (1988) 6:1197）、基於轉錄的擴增（參見Kwoh et al.,Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86: 1173-1177）、回旋鏢（boomerang）DNA擴增、鏈置換活化、循環探針技術、自我維持的序列複製（Guatelli et al.,Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:1874-1878）、滾環複製（美國專利號5,854,033）、基於等溫核酸序列的擴增（NASBA）和基因表現系列分析（SAGE）。
在一些實施方式中，爲了測量生物標記物的mRNA表現量，在擴增之前將生物標記物的靶RNA逆轉錄爲cDNA。可以使用各種逆轉錄酶，包括但不限於MMLV RT、MMLV RT的RNase H突變體（例如Superscript和Superscript II（Life Technologies，GIBCO BRL，Gaithersburg，MD））、AMV RT和來自嗜熱栖熱菌（Thermus thermophilus）的熱穩定逆轉錄酶。例如，可用於將RNA轉化爲cDNA的一種方法是改編自Superscript II預擴增系統的方案（Life Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.；目錄號18089-011），如Rashtchian A.所述（PCR Methods Appl . 4:S83-S91 (1994)）。
在某些實施方式中，在核酸擴增試驗後定量生物標記物的RNA（例如mRNA）的表現量或DNA的拷貝數變異。例如，可以使用標準凝膠電泳方法在瓊脂糖凝膠上分離擴增的産物，並用溴化乙錠染色，然後進行檢測和定量。或者，可以用合適的可檢測標記物（例如放射性或螢光核苷酸）整體標記擴增的産物，然後使用X射線底片或在合適的激發光譜下可視化。
在某些實施方式中，在核酸擴增試驗期間定量生物標記物的RNA（例如mRNA）的表現量或DNA的拷貝數變異，這也稱爲即時擴增或定量擴增。定量擴增的方法揭露於例如美國專利第6,180,349、6,033,854和5,972,602號，以及例如在Gibson et al.,Genome Research (1996) 6:995-1001；DeGraves et al.,Biotechniques (2003) 34(1):106-10, 112-5；Deiman B. et al.,Mol Biotechnol. (2002) 20(2):163-79。定量通常基於對可檢測訊號的監測，所述可檢測訊號代表擴增（例如PCR）反應循環中模板的拷貝。可藉由嵌入性試劑（例如SYBR GREEN™和SYBR GOLD™）或擴增過程中使用的標記引子或標記探針産生可檢測訊號。
在某些實施方式中，標記的引子或標記的探針包含含有螢光團的可檢測標記物。在某些實施方式中，標記的引子或標記的探針可以進一步包含淬滅劑物質。一個引子或探針中同時存在螢光團和淬滅劑物質（「雙標記」）可有助於提供一種自猝滅探針，例如TaqMan（美國專利號5,210,015和5,538,848）或Molecular Beacon探針（美國專利號5,118,801和5,312,728），或其他無莖或線性信標探針（Livak et al., 1995,PCR Method Appl. 4:357-362；Tyagi et al., 1996,Nature Biotechnology 14:303-308；Nazarenko et al., 1997,Nucl Acids Res. 25:2516-2521；美國專利號5,866,336和6,117,635）。在完整的引子或探針中，淬滅劑物質和螢光團非常接近，因此當螢光團被輻射激發時，它會藉由螢光共振能量轉移（FRET）將能量轉移到同一探針中的猝滅劑物質，從而不發出訊號。
在定量擴增試驗（例如即時PCR）中，可以使用本領域已知的方法來定量RNA（例如mRNA）的表現量或生物標記物的DNA的拷貝數變化。例如，在擴增期間，可以在每個PCR循環期間監測和計算螢光訊號。可以進一步計算臨界值週期或Ct值。Ct值是螢光與預定值相交的週期。可以使用標準曲線將Ct與核酸的初始量或起始細胞數相關。構建標準曲線以關聯Ct值之間的差異與所測生物標記物的對數表現量。
作爲質量控制措施，可以測量內參生物標記物的表現量或拷貝數變化。本領域具有通常知識者將理解，內參生物標記物可以固有地存在於樣品中，並且其表現量或拷貝數變化可用於標準化目標生物標記物的所測得表現量或拷貝數變化，以抵消樣品絕對量的任何差異。
雜交試驗
核酸雜交試驗使用探針與靶核酸雜交，從而允許檢測靶核酸。雜交試驗的非限制性實例包括Northern墨點分析、Southern墨點分析、原位雜交、微陣列分析和基於多重雜交的試驗。
在某些實施方式中，用於雜交試驗的探針被可檢測地標記。在某些實施方式中，用於雜交試驗的基於核酸的探針是未標記的。這種未標記的探針可以固定在固體支持物如微陣列上，並且可以與可檢測地標記的靶核酸分子雜交。
在某些實施方式中，雜交試驗可以藉由以下進行：分離核酸（例如RNA或DNA）、區分核酸（例如藉由凝膠電泳），然後將區分的核酸轉移到合適的膜濾器（filter）（例如硝酸纖維素濾器），在膜濾器上探針與靶核酸雜交並允許檢測。參見例如《分子克隆：實驗室手册》，J.Sambrook等人編輯，第二版，冷泉港實驗室出版社，1989，第7章。可以藉由本領域已知的方法檢測或測量探針和靶核酸的雜交。例如，可以藉由將雜交的濾器對照相底片曝光來進行雜交的放射自顯影檢測。對經雜交的濾器曝光的照相底片進行光密度掃描，可提供靶核酸表現量的準確測量。電腦成像系統也可以用於量化生物標記物的表現量。
在一些實施方式中，可以在微陣列上進行雜交試驗。微陣列提供了一種同時測量大量靶核酸分子的表現量的方法。靶核酸可以是RNA、DNA、從mRNA逆轉錄的cDNA或染色體DNA。可以使靶核酸與包含基底的微陣列雜交，所述基底具有多個固定的核酸探針，以每平方釐米基底表面多達幾百萬個探針的密度排列。樣品中的RNA或DNA與陣列上的互補探針雜交，然後藉由雷射掃描進行檢測。測定陣列上每個探針的雜交强度，並將其轉換爲代表RNA或DNA相對表現量的定量值。參見美國專利號6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316。
使用機械合成方法合成這些陣列的技術在例如美國專利號5,384,261中有所描述。儘管經常採用平面陣列表面，但是該陣列可以被製造在基本上任何形狀甚至多個表面的表面上。陣列可以是在珠子、凝膠、聚合物表面、諸如光纖的纖維、玻璃或任何其他合適的基底上的肽或核酸，參見美國專利號5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992。可以以允許對全包（all-inclusive）設備進行診斷或其他操作的方式包裝陣列。有用的微陣列也是可商購的，例如購自Affymetrix的微陣列，購自Nano String Technologies，Panomics的QuantiGene 2.0 Multiplex Assay。
在某些實施方式中，雜交試驗可以是原位雜交試驗。原位雜交試驗可用於檢測目標生物標記物（例如ATM、ATR和/或MDM2）的基因座存在的拷貝數變化（例如增加或擴增）。用於原位雜交試驗的探針可以是基因座專一性探針，其與染色體上的特定基因座雜交以檢測存在或不存在特定目的基因座（例如ATM、ATR和/或MDM2）。其他類型的探針也可能有用，例如染色體計數探針（例如可與目標染色體中的重複序列區域雜交以指示整個染色體的存在或不存在）和染色體臂探針（例如可與染色體區域雜交並指示是否存在或不存在特定染色體的臂）。美國專利號5,447,841描述了使用獨特序列探針進行原位雜交的方法，其藉由引用併入本文。可以使用螢光顯微鏡以及對每種螢光團合適的濾光片來查看探針，也可以使用雙或三帶通濾光片組觀察多個螢光團。參見例如授予Bittner等人的美國專利號5,776,688，其藉由引用併入本文。任何合適的顯微成像方法都可以用於可視化雜交探針，包括自動數字成像系統。或者可以使用諸如流式細胞術的技術來檢查探針的雜交模式。
定序方法
定序方法允許測定靶核酸的核酸序列，並且還可以允許對被定序的靶核酸進行計數，從而測量靶核酸的表現量。定序方法的實例包括但不限於RNA定序、焦磷酸定序和高通量定序。
高通量定序涉及合成法定序（sequencing-by-synthesis）、連接法定序（sequencing-by-ligation）和超深度定序（例如Marguiles et al.,Nature 437(7057):376-80 (2005)中所述）。合成法定序是關於藉由在聚合酶擴增中摻入標記的核苷酸或核苷酸類似物來合成靶核酸的互補鏈。在成功摻入標記核苷酸之後或之時，立即測量標記物的訊號並記錄核苷酸的身份。在重複摻入、檢測和鑑定步驟之前，除去摻入核苷酸上的可檢測標記物。合成法定序的實例是本領域已知的，並且例如在美國專利號7,056,676、8,802,368和7,169,560中描述，其內容藉由引用併入本文。可以使用折返（fold-back）PCR和錨定引子在固體表面（或微陣列或晶片）上進行合成法定序。靶核酸片段可藉由與錨定引子雜交而附著於固體表面並橋接擴增。該技術在例如Illumina® 定序平台中使用。
焦磷酸定序是關於在聚合酶存在下，藉由順序地摻入對應於鹼基A、C、G和T（U）的去氧核苷酸三磷酸，使靶核酸區域與引子雜交並延伸新鏈。每次摻入鹼基都伴隨著焦磷酸鹽的釋放，而焦磷酸的釋放則被巰基化酶轉化爲ATP，從而推動了氧化螢光素的合成和可見光的釋放。由於焦磷酸鹽的釋放與摻入的鹼基數等莫耳，因此在任一步驟中發出的光與添加的核苷酸數成正比。重複該過程，直到確定了整個序列。
在某些實施方式中，本文所述的目標生物標記物的突變和/或野生型狀態的檢測以及表現量的測量是藉由全轉錄組定序或RNA定序（例如RNA-Seq）進行的。已經描述了RNA定序的方法（參見Wang Z., Gerstein M. & Snyder M., Nature Review Genetics (2009) 10:57-63；Maher C.A. et al.,Nature (2009) 458:97-101；Kukurba K. & Montgomery S.B.,Cold Spring Harbor Protocols (2015) 11:951-969）。簡而言之，將從樣品中萃取的mRNA反轉錄爲cDNA，然後剪切爲片段。選擇適當長度範圍內的片段，並與定序轉接子連接，然後進行擴增，定序並將讀取結果映射到參考基因組。
在某些實施方式中，使用全外顯子組定序（WES）確定生物標記物的CNV。WES是關於使用高通量定序技術對DNA外顯子（即蛋白質編碼區）進行定序 WES的，更多詳細訊息可以在例如Ng S.B. et al.,Nature 461(7261):272-276 (2009)以及Bao R. et al.,Cancer Inform . 2014, 13(Suppl 2):67-82中找到，將其全部內容併入本文。
免疫試驗
免疫試驗通常是關於使用專一性結合生物標記物多肽或蛋白質（例如本文所提供的ATM、ATR、MDM2和/或p53蛋白質）的抗體，以檢測或測量靶多肽或蛋白質的存在或表現量。此類抗體可以使用本領域已知的方法獲得（參見例如Huse et al.,Science (1989) 246:1275-1281；Ward et al.,Nature (1989) 341:544-546），或者可以從商業來源得到。免疫測定的實例包括但不限於蛋白質墨點分析、酵素結合免疫吸附試驗（ELISA）、酵素免疫試驗（EIA）、放射免疫試驗（RIA）、夾心試驗、競爭性試驗、免疫螢光染色和成像、免疫組織化學（IHC）和螢光活化細胞分選（FACS）。有關免疫學和免疫試驗程序的綜述，請參見基礎和臨床免疫學（Basic and Clinical Immunology, Stites & Terr eds., 7th ed. 1991）。此外，可以以多種式樣中的任一種進行免疫試驗，其在酵素免疫測定（Enzyme Immunoassay, Maggio, Ed. 1980）和上文的Harlow＆Lane中被廣泛綜述。有關一般免疫試驗的綜述，另請參見《細胞生物學方法：細胞生物學中的抗體》（Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology , vol. 37, Asai, Ed. 1993）；基礎和臨床免疫學（Basic and Clinical Immunology , Stites & Terr, Eds., 7th ed. 1991）。
某些實施方式中，抗體被可檢測地標記，或者不被標記但是可以與被可檢測地標記的第二分子反應（例如可檢測地標記的第二抗體）。也可以使用其他檢測系統，例如時間分辨螢光、內反射螢光、擴增（例如聚合酶鏈反應）和拉曼光譜儀。
在某些實施方式中，抗體可以固定在固體基質上。固定可以藉由共價連接或非共價連接（例如包被）進行。固體基質的實例包括多孔和無孔材料、乳膠顆粒、磁性顆粒、微粒、條、珠、膜、微量滴定孔和塑料管。根據所需的試驗形式性能特徵，確定固相材料的選擇和可檢測地標記抗原或抗體試劑的方法。
活性試驗
可以使用生物試驗來測量蛋白質的生物活性。例如ATM和ATR都是DNA損傷修復蛋白，它們的DNA修復活性可以在存在DNA損傷誘導劑的情況下藉由DNA損傷標記物來確定。MDM2是一種激酶，可以藉由檢測MDM2或磷酸化MDM2的表現量來測定其激酶活性；p53的活性可以藉由檢測p53的在位置15的胺基酸殘基的磷酸化或檢測p53的下游靶基因表現量的變化來測定。由於蛋白質具有發揮多種生物活性的能力，因此對於一種特定的蛋白質可能存在幾種可接受的生物試驗。用於測量ATM、ATR、MDM2或p53活性的例示性功能性試驗可見於以下：Lee J.-H. et al.,J Biol Chem . 288:12840-12851 (2013)；Loughery J. et al.,Nucleic Acids Research 42:7666-7680 (2014)；Thompson T. et al.,Journal Biological Chemistry 279:53015-53022 (2004)；Wienken M. et al.,J Mol Cell Biol. 2017; 9(1):74-80。
III 、預測對用 MDM2 抑制劑的治療的反應性
在某些實施方式中，所述方法進一步包括基於以下方面鑑定對用MDM2抑制劑的治療很可能有反應的受試者：在生物樣品中存在i）ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）MDM2的活性或表現量的增多，或i）和ii）兩者都有。
在某些實施方式中，在生物樣品中ATM和/或ATR中存在一種或多種失活突變，表示ATM和/或ATR的活性或表現量不足。在某些實施方式中，基於在ATM和/或ATR中具有一種或多種失活突變，鑑定該受試者對用MDM2抑制劑的治療很可能有反應。
ATM中例示性失活突變包括選自圖1B、1C和1D中的相對於SEQ ID NO：2的突變（例如H1380Y、N1983S、N2875S、R2598Q、1599_1600del、V2716A、K1903fs、V2906I、A1127V、K1101E、Q912*、S2165F或H1083Y）；或相對於SEQ ID NO：1的c.3154-2A>G；或其任何組合。ATM中例示性失活突變包括但不限於相對於SEQ ID NO：4的K243T、Q1926H、I774fs、K1379N、L1483F或其任何組合。
在某些實施方式中，所述受試者被鑑定爲對MDM2抑制劑的治療很可能有反應，基於在生物樣品中存在ATM的一種或多種失活突變，所述失活突變包括選自圖1B、1C和1D中的相對於SEQ ID NO：2的突變（例如H1380Y、N1983S、N2875S、R2598Q、1599_1600del、V2716A、K1903fs、V2906I、A1127V、K1101E、Q912*、S2165F或H1083Y），或相對於SEQ ID NO：1的c.3154-2A>G，或其任何組合，和/或在ATR中具有選自以下的一種或多種失活突變：相對於SEQ ID NO：4的K243T、Q1926H、I774fs、K1379N、L1483F或其任何組合。
在某些實施方式中，與ATM和/或ATR基因産物的參考基準相比，ATM和/或ATR基因産物的表現量降低（例如降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％），表示在生物樣品中ATM和/或ATR的活性或表現量不足。
在某些實施方式中，與MDM2的CNV的參考基準相比，生物樣品中MDM2的拷貝數變化（CNV）的升高，表示MDM2活性或表現量的增多。
在某些實施方式中，在MDM2基因中具有＞3的拷貝數變異（CNV）的受試者被認爲在MDM2基因中具有增多。CNV> 3表示該受試者基因組中該基因的拷貝數高於3。
在某些實施方式中，與MDM2基因産物的參考基準相比，MDM2基因産物的表現量增加（例如至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％），表示MDM2的活性或表現量增加。
在某些實施方式中，基於以下將受試者鑑定爲對用MDM2抑制劑的治療很可能有反應：生物樣品中MDM2的拷貝數變異（CNV）與MDM2的CNV參考基準相比升高；生物樣品中MDM2基因産物的表現量與MDM2基因産物的參考基準相比升高。
在某些實施方式中，基於以下將受試者鑑定爲很可能對用MDM2抑制劑的治療有反應：在生物樣品中i）在ATM和/或ATR具有一種或多種失活突變，和ii）MDM2拷貝數變異升高（與MDM2的CNV的參考基準相比）兩者都有。在某些實施方式中，基於以下將受試者鑑定爲對用MDM2抑制劑的治療很可能有反應：在生物樣品中i）在ATM和/或ATR具有一種或多種失活突變，和ii）MDM2的基因産物的表現量升高（與MDM2的基因産物的參考基準相比）兩者都有。
在某些實施方式中，該方法進一步包括在生物樣品中測定存在或不存在功能性p53。在某些實施方式中，該方法進一步包括在生物學樣品中測定p53是否爲野生型。在某些實施方式中，基於以下將受試者鑑定爲對用MDM2抑制劑的治療很可能有反應：在生物樣品中i）ATM和/或ATR中存在一種或多種失活突變；ii）MDM2基因的CNV升高或MDM2基因産物的表現量增加；且iii）存在功能性p53（例如野生型p53）。
在某些實施方式中，生物標記物的表現量可以相對於內參數值或標準曲線進行標準化。例如，可以相對於標準標記物的標準表現量將本文所述的每種生物標記物的表現量標準化。可以預測定標準標記物的標準表現量，或在從受試者獲得樣品的同時或之後測定標準標記物的標準表現量。標準標記物可以在相同的測定中運行，或者可以是先前測定中已知的標準標記物。在藉由定序試驗（例如RNA定序）確定生物標記物表現量的情況下，可以相對於定序的總讀數將生物標記物的表現量標準化。
本文描述的生物標記物的術語「參考基準」可以是生物標記物的正常表現量或基準線表現量，例如，健康細胞或組織樣品中生物標記物的表現量，或在一般癌症患者群體（a general cancer patient popultion）中或特定目標癌症的癌症患者群體中生物標記物的平均表現量。
在某些實施方式中，參考基準可以是典型表現量、測得表現量或者是通常在一種或多種健康細胞或組織樣品中或在一種或多種對照細胞或組織樣品中觀察到的相應生物標記物的表現量的範圍。在某些實施方式中，參考基準可以是在健康受試者群體中或在一般癌症患者群體中或特定目標癌症的癌症患者群體中的相應生物標記物的平均表現量。例如，參考基準可以是生物標記物的經驗表現量，認爲該經驗表現量代表對照樣品或一般癌症樣品（a general cancer sample）。在某些實施方式中，本文描述的生物標記物的參考基準是使用與本文提供的生物標記物的表現量的測量中所使用的相同或可比較的測量方法或試驗獲得的。
如本文所用，「一般癌症患者群體」是指患有不同種類的癌症的患者或癌症受試者群體。例如，一般癌症患者群體可能是至少三種（四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種）癌症患者的群體，其中某些患者患有第一類癌症，某些患有第二種癌症，某些患有第三種癌症，依此類推。例如，一般癌症患者人群可以是患有各種癌症或多種癌症類型的人群。在某些實施方式中，參考基準也可以是被認爲代表一般癌症患者群體的經驗表現量。
在某些實施例中，參考基準可以是預先測定的。例如，可以基於對照生物樣品（例如來自健康受試者的樣品或來自對照癌症患者的樣品）的集合中生物標記物表現量的測量值來計算或概括參考基準。又例如，參考基準可以基於健康受試者或一般癌症患者群體中通常觀察到的生物標記物表現量的統計資料。
IV 、治療鑑定爲對用 MDM2 抑制劑的治療很可能有反應的受試者
在某些實施方式中，本文提供的方法進一步包括將MDM2抑制劑施用於鑑定爲對用MDM2抑制劑的治療很可能有反應的受試者。在某些實施方式中，將MDM2抑制劑以治療有效量施用於受試者。
在某些實施方式中，本案提供了用MDM2抑制劑治療患有癌症的受試者的方法，其中已經藉由本文提供的任何方法將所述受試者鑑定爲很可能對使用MDM2抑制劑的治療有反應。在某些實施方式中，所述治療步驟包括將MDM2抑制劑以治療有效量施用於已經被鑑定爲對用所述MDM2抑制劑的治療很可能有反應的受試者。
本發明中揭露的MDM2抑制劑抑制p53或p53相關蛋白與MDM2或MDM2相關蛋白之間的相互作用。藉由抑制MDM2或MDM2相關蛋白對p53或p53相關蛋白的負面效應，本發明的MDM2抑制劑使細胞對細胞凋亡和/或細胞週期停滯的誘導劑敏感。在一個實施方式中，本發明的MDM2抑制劑誘導凋亡和/或細胞週期停滯。
MDM2抑制劑的活性可以藉由如美國專利號9,745,314B2中所述的螢光偏振MDM2結合試驗來測定，所述實驗是MDM2抑制劑與基於p53的擬肽化合物競爭性結合MDM2蛋白的競爭性結合試驗。
競爭性結合的螢光偏振測量如下進行：用未標記的競爭物的滴定目標蛋白與螢光標記的探針的混合物與並顯示螢光偏振降低至用自由的螢光標記的探針觀察到的值（Moerke N.,Current Protocols in Chemical Biology (2009) 1:1）。螢光偏振MDM2結合試驗中使用重組人His標記的MDM2蛋白（殘基1~118）和螢光標記的基於p53的肽（稱爲PMDM6-F）（Garcia-Echeverria et al.,J Med Chem. 43: 3205-3208 (2000)），測定PMDM6-F與重組MDM2蛋白的Kd值。然後在存在預先孵育的MDM2蛋白和PMDM6-F肽的條件下，用系列稀釋的待測定的MDM2抑制劑進行劑量依賴性競爭性結合實驗。測量偏正值並使用非線性最小二乘法從圖中確定IC50 值。
在一些實施方式中，MDM2抑制劑在抑制MDM2與P53結合中具有如螢光偏振MDM2結合試驗所測定的不大於1μM的IC 50（例如不大於900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、200 nM、150 nM、100 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、或1nM）。
在一些實施方式中，MDM2抑制劑選自依沙那林（idasanutlin，又稱RG7388）、RG7112（PubChem化合物CID：57406853）、HDM201（PubChem化合物CID：71678098）、KRT-232（也稱爲AMG232，PubChem化合物CID：58573469）、AMG 232（PubChem化合物CID：58573469）、BI907828（可在NCI Thesaurus（版本：19.10d）中以代碼C156709訪問）、SAR-405838（也稱爲MI-77301，PubChem化合物CID：53476877）、MK-8242（也稱爲SCH 900242，可在NCI Thesaurus（版本：19.10d）中以代碼C116867訪問）、DS3032-b（PubChem化合物CID：9051550）、ALRN-6924（PubChem化合物CID：381833444）和CGM097（（PubChem化合物CID：53240420）；或前述任一項的的藥學上可接受的鹽。
在一些實施方式中，所述MDM2抑制劑包含以下式（I）表示的化合物：
Figure 02_image003
（I） 或其藥學上可接受的鹽，其中：
Figure 02_image005
選自以下群組：
Figure 02_image007
； B是C4-7 碳環； R1 是H、取代或未取代的C1-4 烷基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基、ORa 或NRa Rb ； n是0、1或2； R2 、R3 、R4 、R5 、R7 、R8 、R9 ,和R10 獨立地選自由H、F、Cl、CH3 和CF3 組成的群組； R6 是
Figure 02_image009
或
Figure 02_image011
； Ra 是氫或取代或未取代的C1-4 烷基； Rb 是氫或取代或未取代的 C1-4 烷基； Rc 和Rd 是環B的一個碳原子上的取代基，其中 Rc 是 H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-ORa 、ORa 、或鹵代； Rd 是 H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-ORa 、ORa 、或鹵代；或 Rc 和Rd 與它們所連接的碳一起形成4至6員螺環取代基，所述取代基任選地含有氧原子；並且 Re 是-C(=O)ORa 、-C(=O)NRa Rb 、或-C(=O)NHSO2 CH3 。
如本發明所用的術語「烷基」指的是直鏈和支鏈飽和C1-10 烴基，包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、以及2-乙基丁基。術語Cm-n 意指烷基具有「m」個至「n」個碳原子。術語「亞烷基」指的是具有取代基的烷基。例如甲基的烷基或例如-CH2 -基團的亞烷基可以被獨立選擇的例如鹵代、三氟甲基、三氟甲氧基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、烷氨基、或氨基中的一個或多個，並且通常一個至三個取代。
如本發明所用的術語「鹵代」被定義爲氟代、氯代、溴代、或碘代。
術語「羥基」被定義爲-OH。
術語「烷氧基」被定義爲-OR，其中R是烷基。
術語「氨基」被定義爲-NH2 ，並且術語「烷氨基」被定義爲-NR2 ，其中至少一個R是烷基並且第二個R是烷基或氫。
術語「氨甲醯基」被定義爲-C(＝O)NR2 。
術語「羧基」被定義爲-C(＝O)OH或其鹽。
術語「硝基」被定義爲-NO2 。
術語「氰基」被定義爲-CN。
術語「三氟甲基」被定義爲-CF3 。
術語「三氟甲氧基」被定義爲-OCF3 。
本發明所用的術語「芳基」指的是單環或多環芳族基團，較佳地是單環或雙環芳族基團。芳基的實例包括但不限於苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基、芘基、聯苯、以及三聯苯。芳基環指的是雙環碳環和三環碳環，其中一個環是芳族的並且其它環是飽和的、部分不飽和的、或芳族的，例如二氫萘基、茚基、茚滿基、或四氫萘基(萘滿基)。除非另外指示，否則芳基可以是未取代的或被一個或多個，並且特別是一個至四個獨立地選自例如以下各項的基團取代：鹵代、烷基、烯基、-OCF3 、-NO2 、-CN、-NC、-OH、烷氧基、氨基、烷氨基、-CO2 H、-CO2 烷基、-OCO烷基、芳基及雜芳基。
如本發明所用的術語「雜環」指的是雜芳基環系和雜環烷基環系。
如本發明所用的術語「雜芳基」指的是含有一個或兩個芳環並且在芳環中含有至少一個氮、氧或硫原子的單環系或雙環系。雜芳基的每一個環可以含有一個或兩個O原子、一個或兩個S原子、和/或一個至四個N原子，前提條件是每一個環中雜原子的總數是四個或更少並且每一個環含有至少一個碳原子。在某些實施方式中，雜芳基具有5個至20個、5個至15個、或5個至10個環原子。單環雜芳基的實例包括但不限於呋喃基、咪唑基、異噻唑基、異噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、四唑基、三嗪基、以及三唑基。雙環雜芳基的實例包括但不限於苯並呋喃基、苯並咪唑基、苯並異噁唑基、苯並吡喃基、苯並噻二唑基、苯並噻唑基、苯並噻吩基、苯並三唑基、苯並噁唑基、呋喃並吡啶基、咪唑並吡啶基、咪唑並噻唑基、吲哚嗪基、吲哚基、吲唑基、異苯並呋喃基、異苯並噻吩基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、萘啶基、噁唑並吡啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡啶並吡啶基、吡咯並吡啶基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噻二唑並嘧啶基、以及噻吩並吡啶基。除非另外指示，否則雜芳基可以是未取代的或被一個或多個，並且特別是一個至四個選自例如以下各項的取代基取代：鹵代、烷基、烯基、-OCF3 、-NO2 、-CN、-NC、-OH、烷氧基、氨基、烷氨基、-CO2 H、-CO2 烷基、-OCO烷基、芳基以及雜芳基。
如本發明所用的術語「環烷基」意指含有三個至八個碳原子的單環或雙環、飽和或部分不飽和的環系，包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、以及環辛基，所述環系任選地被獨立選擇的例如鹵代、三氟甲基、三氟甲氧基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、烷氨基、或氨基中的一個或多個，並且通常一個至三個取代。
如本發明所用的術語「雜環烷基」意指總共含有4個至12個原子的單環或雙環、飽和或部分不飽和的環系，其中所述原子中的一個至五個獨立地選自氮、氧、以及硫並且其餘原子是碳。雜環烷基的非限制性實例是氮雜環丁基、吡咯烷基、呱啶基、呱嗪基、二氫吡咯基、嗎啉基、硫代嗎啉基、二氫吡啶基、氧雜環庚基、二氧雜環庚基、硫雜環庚基、二氮雜環庚基，它們各自任選地在環的原子上被獨立選擇的鹵代、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、氰基、氨基、氨甲醯基、硝基、羧基、C2-7 烯基、C2-7 炔基等中的一個或多個，並且通常一個至三個取代。
在一些實施方式中
Figure 02_image005
是
Figure 02_image013
；
在一些實施方B 是
Figure 02_image015
；
在一些實施方式中，n是0或1並且R1 是H或CH3 。
在一些實施方式中，
Figure 02_image017
是H、CH3 或CH2 CH3 。
在一些實施方式中，R2 是H。在其它實施方式中，R3 是鹵代，並且較佳地是氯代。在另外的實施方式中，R4 是H，R5 是H，或R4 和R5 這兩者均是H。
在一些實施方式中，R7 是鹵代，并且更佳地是氟代。
在一些實施方式中，R8 、R9 以及R10 中的每一個是H。
在一些實施方式中，Ra 和Rb 單獨地是H、CH3 或CH2 CH3 。
在一些實施方式中，Rc 和Rd 單獨地是H、鹵代、OH、CH3 、CH2 CH3 或CH2 OH。
在一些實施方式中，Rc 和Rd 分别是F和F、H和H、OH和CH3 、OH和H、CH3 和CH3 、CH3 和OH、H和OH、CH2 CH3 和CH2 CH3 、以及CH2 OH和CH2 OH。
在一些實施方式中，Re 是-C(═O)OH、-C(═O)NH2 或-C(═O)NHSO2 CH3 。
在一些實施方式中，MDM2抑制劑是選自以下的化合物：
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
、
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
和
Figure 02_image047
；		  
或所述化合物的藥學上可接受的鹽。
在一個實施方式中，所述MDM2抑制劑是：
Figure 02_image049
, 或其藥學上可接受的鹽。
在一個實施方式中，所述MDM2抑制劑是：
Figure 02_image001
或其藥學上可接受的鹽。
在美國專利號9,745,314中進一步揭露了可用於本案的更多MDM2抑制劑和MDM2抑制劑合成方法，該專利藉由引用併入本發明中。
本文提供的MDM2抑制劑可以鹽的形式存在。本文提供的MDM2抑制劑的藥學上可接受的鹽在本發明的方法中常常是較佳的。如本發明所用的術語「藥學上可接受的鹽」指的是結構式（I）的化合物的鹽形式或兩性離子形式。式（I）的化合物的鹽可以在化合物的最終分離和純化期間製得或單獨地藉由使化合物與具有合適的陽離子的酸反應來製得，所述陽離子諸如但不限於鹼金屬離子和鹼土金屬離子，例如Na+ 、K+ 、Ca2+ 和Mg2+ ；以及有機陽離子，諸如但不限於銨離子和取代的銨離子，例如NH4 + 、NHMe3 + 、NH2 Me2 + 、NHMe3 + 以及NMe4 + 。單價的和二價的藥學上可接受的陽離子的實例論述於例如Berge,J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1997)中。
結構式（I）的化合物的藥學上可接受的鹽可以是與藥學上可接受的酸形成的酸加成鹽。可以用於形成藥學上可接受的鹽的酸的實例包括無機酸，如硝酸、硼酸、鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸；以及有機酸，如草酸、馬来酸、琥珀酸和檸檬酸。本發明的化合物的鹽的非限制性實例包括但不限於鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、2-羥基乙磺酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、抗壞血酸鹽、羥乙基磺酸鹽、水楊酸鹽、甲磺酸鹽、均三甲苯磺酸鹽、萘磺酸鹽、烟酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、撲酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、三氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、葡萄糖酸鹽、甲磺酸鹽、乙二磺酸鹽以及苯磺酸鹽。此外，本發明的化合物中存在的可供使用的氨基可以被以下各項季銨化：甲基、乙基、丙基以及丁基氯化物、溴化物以及碘化物； 硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯以及硫酸二戊酯；癸基、十二烷基、十四烷基以及硬脂基氯化物、溴化物以及碘化物；以及苯甲基溴和苯乙基溴。根據上文，本發明出現的任何對本發明的化合物的提及均意圖包括結構式（I）的化合物以及其藥學上可接受的鹽。
本申請的具有一個或多個掌性中心的化合物可以以各種立體異構形式存在。所述立體異構體是僅在空間排列上不同的化合物。所述立體異構體包括所有非對映異構、對映異構和差向異構形式以及外消旋體及其混合物。
術語「幾何異構體」是指具有至少兩個取代基的環狀化合物，其中兩個取代基均位於環的同一側（順式），或其中取代基各自位於環的相對側（反式）。當揭露的化合物是藉由結構命名或描述而沒有表示立體化學時，這應當理解爲，所述名稱或結構包括一種或多種可能的立體異構體、或幾何異構體、或包含的立體異構體或幾何異構體的混合物。
當通過名稱或結構描繪幾何異構體時，應理解存在比另一異構體更大的程度的被命名或被描繪的異構體，即按重量計，被命名或被描繪的幾何異構體的幾何異構體純度高於50％，例如至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％。幾何異構體純度是藉由將混合物中被命名或被描繪的幾何異構體的重量除以混合物中所有幾何異構體的總重量而確定的。
外消旋混合物是指包含50％對映異構體和50％相對應的對映異構體。當具有一個掌性中心的化合物被命名或描述而沒有指明掌性中心的立體化學時，這應當理解爲，該名稱或結構包括該化合物的兩種可能的對映體形式（例如，兩種對映異構體光學純的、對映體富集的或外消旋的）。當具有兩個或更多個掌性中心的化合物被命名或描述，而沒有指明掌性中心的立體化學時，這應當理解爲，所述名稱或結構包括所有可能的非對映異構形式（例如非對映異構體純的、非對映異構體富集的和化合物的一個或多個非對映異構體（例如外消旋混合物））。
所述對映體和非對映體混合物可藉由衆所周知的方法拆分成其組分的對映體或立體異構體，所述方法例如掌性相氣相層析法、掌性相高效液相層析法、使化合物結晶爲對掌性鹽錯合物，或使化合物在對掌性溶劑中結晶。對映異構體和非對映異構體也可以通過衆所周知的不對稱合成方法，從非對映異構或對映異構純的中間體、試劑和催化劑中獲得。
當本發明所述化合物通過名稱或結構描述並指明爲單一對映異構體時，除非另有說明，該化合物的光學純度至少爲60％、70％、80％、90％、99％或99.9％（也稱爲「對映體純的」）。光學純度是所命名或描述的對映體的混合物中的重量除以兩種對映體的混合物中的總重量。
當所揭露化合物的立體化學藉由結構來命名或描述時，並且所命名或所描述的結構包含多於一種立體異構體（例如，在非對映異構體對中）時，這應當理解爲包括所包含的立體異構體之一或所包含的立體異構體的任何混合物。也應當進一步理解爲，所述命名或所描述立體異構體的立體異構體純度以重量計算爲至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％。在這種情況下，立體異構體純度藉由將混合物中所述名稱或結構所包含的立體異構體的總重量除以混合物中所有立體異構體的總重量來確定。
在某些實施方式中，MDM2抑制劑作爲藥物組合物施用。藥物組合物可以包含MDM2抑制劑或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體或稀釋劑。
「藥學上可接受的載體」和「藥學上可接受的稀釋劑」是指有助於將活性劑配製和/或施用於受試者和/或被受試者吸收，並且可以包括在本發明的組合物中而沒有對受試者造成顯著不良毒性反應的物質。藥學上可接受的載體和/或稀釋劑的非限制性實例可包括水、NaCl、標準（normal）鹽水溶液、乳酸林格氏液（Ringer’s）、標準蔗糖、標準葡萄糖、黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑、包衣、甜味劑、調味劑、鹽溶液（例如林格式溶液）、醇類、油類、明膠類、碳水化合物如乳糖、直鏈澱粉或澱粉、羥甲基纖維素、脂肪酸酯、聚乙烯吡咯烷和顔料等。載體、稀釋劑和/或賦形劑在與藥物組合物的其他成分相容並且對其接收者無害的意義上是「可接受的」。
Figure 02_image001
在一些實施方式中，藥物組合物包含稱爲化合物C的以下結構的MDM2抑制劑或其藥學上可接受的鹽。
在一些實施方式中，藥物組合物是固體劑型。在一些實施方式中，固體劑型是膠囊。在一些實施方式中，固體劑型是乾填充膠囊。在一些實施方式中，固體劑型是乾填充的1號明膠膠囊。在一些實施方式中，膠囊包含約10~500mg的MDM2抑制劑，例如化合物C。在一些實施方式中，藥物組合物或膠囊包含矽化微晶纖維素。
在一些實施方式中，藥物組合物或膠囊包含MDM2，例如化合物C，其量爲約10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、35 mg、40 mg、45 mg、50 mg、55 mg、60 mg、65 mg、70 mg、75 mg、80 mg、85 mg、90 mg、95 mg、100 mg、105 mg、110 mg、120 mg、130 mg、140 mg、150 mg、160 mg、170 mg、180 mg、190 mg、210 mg、220 mg、230 mg、240 mg、250 mg、260 mg、270 mg、280 mg、290 mg、或300 mg。
在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以每天至少一個劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以每天至少兩個劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以每天至少三個劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以每天一個劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以每天兩個劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以每天三個劑量施用。此外，已經提供MDM2抑制劑（例如化合物C）合適的治療方案，例如在美國專利號9,745,314中所述，其全部內容藉由引用明確地併入本發明中。
本領域具有通常知識者藉由常規實驗是能夠確定用於治療癌症的MDM2抑制劑（例如化合物C）的有效的無毒劑量。例如MDM2抑制劑（例如化合物C）在治療有效量可以根據如疾病階段（例如I期相對於IV期）、年齡、性別、醫學並發症（例如免疫抑制的病症或疾病）和受試者的體重、以及MDM2抑制劑（例如化合物C）在受試者中引發所需反應的能力等因素變化。在某些實施方式中，治療有效量是安全量的MDM2抑制劑，其足以産生期望的治療性反應，而沒有與使用時合理的獲益/風險比相稱的不適當的不利副作用（例如毒性、刺激性或過敏反應）。可以調整劑量方案以提供最佳治療反應。例如，可以每天施用幾個分開的劑量或藉由連續輸注施用，或者劑量根據緊急性治療情況按比例減少。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以單獨遞送時的治療有效的量施用，如MDM2抑制劑（例如化合物C）被施用和/或充當治療性抗癌症藥物，並非主要作爲改善其他化學療法或其他癌症治療的副作用的藥劑。
在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以有效改善或增强對腫瘤的免疫反應的量施用。下面提供的劑量可用於MDM2抑制劑（例如化合物C）的任何給藥方式，包括局部給藥、吸入給藥和靜脈內給藥（例如連續輸注）。
在某些實施方式中，施用約0.5 mg/kg至約10000 mg/kg、約5 mg/kg至約5000 mg/kg，約10 mg/kg至約3000 mg/kg的MDM2抑制劑（例如化合物C）。在一個實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約10 mg/kg至約1400 mg/kg的範圍施用。在一個實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約10 mg/kg至約650 mg/kg的範圍施用。在一個實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約10 mg/kg至約200 mg/kg的範圍施用。在各種實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約1 mg/kg、2 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、55 mg/kg、60 mg/kg、65 mg/kg、70 mg/kg、75 mg/kg、80 mg/kg、85 mg/kg、90 mg/kg、95 mg/kg、100 mg/kg、105 mg/kg、110 mg/kg、120 mg/kg、130 mg/kg、140 mg/kg、150 mg/kg、160 mg/kg、170 mg/kg、180 mg/kg、190 mg/kg、210 mg/kg、220 mg/kg、230 mg/kg、240 mg/kg、250 mg/kg、260 mg/kg、270 mg/kg、280 mg/kg、290 mg/kg或300 mg/kg的劑量施用。
應當理解的是，具有這些值中任何一個作爲上限或下限的範圍都可以成爲本發明的一部分。例如，約50 mg/kg至約200 mg/kg，或約650 mg/kg至約1400 mg/kg。在一個實施方式中，施用的劑量至少約1 mg/kg、至少約2 mg/kg、至少約5 mg/kg、至少約10 mg/kg、至少約12.5 mg/kg、至少約20 mg/kg、至少約25 mg/kg、至少約30 mg/kg、至少約35 mg/kg、至少約40 mg/kg、至少約45 mg/kg、至少約50 mg/kg、至少約55 mg/kg、至少約60 mg/kg、至少約65 mg/kg、至少約70 mg/kg、至少約75 mg/kg、至少約80 mg/kg、至少約85 mg/kg、至少約90 mg/kg、至少約95 mg/kg、至少約100 mg/kg、至少約104 mg/kg、至少約125 mg/kg、至少約150 mg/kg、至少約175 mg/kg、至少約200 mg/kg、至少約250 mg/kg、至少約300 mg/kg、或至少約400 mg/kg。
在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約10 mg/kg/天（24 h）至約150 mg/kg/天（24 h）的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以選自下列的劑量施用：約1 mg/kg/天（24 h）、約2 mg/kg/天（24 h）、約5 mg/kg/天（24 h）、約10 mg/kg/天（24 h）、約15 mg/kg/天（24 h）、約20 mg/kg/天（24 h）、約25 mg/kg/天（24 h）、約30 mg/kg/天（24 h）、約35 mg/kg/天（24 h）、約40 mg/kg/天（24 h）、約45 mg/kg/天（24 h）、約50 mg/kg/天（24 h）、約55 mg/kg/天（24 h）、約60 mg/kg/天（24 h）、約65 mg/kg/天（24 h）、70 mg/kg/天（24 h）、約75 mg/kg/天（24 h）、約80 mg/kg/天（24 h）、約85 mg/kg/天（24 h）、約90 mg/kg/天（24 h）、約95 mg/kg/天（24 h）、約100 mg/kg/天（24 h）、約105 mg/kg/天（24 h）、約110 mg/kg/天（24 h）、約120 mg/kg/天（24 h）、約130 mg/kg/天（24 h）、約mg/kg/天（24 h）、約150 mg/kg/天（24 h）、約160 mg/kg/天（24 h）、約170 mg/kg/天（24 h）、約180 mg/kg/天（24 h）、約190 mg/kg/天（24 h）、約200 mg/kg/天（24 h）、約210 mg/kg/天（24 h）、約220 mg/kg/天（24 h）、約230 mg/kg/天（24 h）、約240 mg/kg/天（24 h）、約250 mg / kg /天（24 h）、約260 mg/kg/天（24 h）、約270 mg/kg/天（24 h）、約280 mg/kg/天（24 h）、約290 mg/kg/天（24 h）、約300 mg/kg/天（24 h）。
在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約10 mg/天（24 h）至約150 mg/天（24 h）的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以下列劑量使用：約1 mg/天（24 h）、約2 mg/天（24 h）、約5 mg/天（24 h）、約10 mg/天（24 h）、約15 mg/天（24 h）、約20 mg/天（24 h）、約25 mg/天（24 h）、約30 mg/天（24 h）、約35 mg/天（24 h）、約40 mg/天（24 h）、約45 mg/天（24 h）、約50 mg/天（24 h）、約55 mg/天（24 h）、約60 mg/天（24 h）、約65 mg/天（24 h）、70 mg/天（24 h）、約75 mg/天（24 h）、約80 mg/天（24 h）、約85 mg/天（24 h）、約90 mg/天（24 h）、約95 mg/天（24 h）、約100 mg/天（24 h）、約105 mg/天（24 h）、約110 mg/天（24 h）、約120 mg/天（24 h）、約130 mg/天（24 h）、約140 mg/天（24 h）、約150 mg/天（24 h）、約160 mg/天（24 h）、約170 mg/天（24 h）、約180 mg/天（24 h）、約190 mg/天（24 h）、約200 mg/天（24 h）、約210 mg/天（24 h）、約220 mg/天（24 h）、約230 mg/天（24 h）、約240 mg/天（24 h）、約250 mg/天（24 h）、約260 mg/天（24 h）、約270 mg/天（24 h）、約280 mg/天（24 h）、約290 mg/天（24 h）、約300 mg/天（24 h）。
在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約10 mg/kg/週的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約25 mg/kg/週的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約50 mg/kg/週的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約75 mg/kg/週的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約100 mg/kg/週的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約125 mg/kg/週的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以約150 mg/kg/週的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以選自下列劑量施用：約5 mg/kg/週、約10 mg/kg/週、約25 mg/kg/週、約50 mg/kg/週、約75 mg/kg/週、約100 mg/kg/週、約125 mg/kg/週、約150 mg/kg/週、約175 mg/kg/週、約200 mg/kg/週、約225 mg/kg/週、約250 mg/kg/週、約300 mg/kg/週、約350 mg/kg/週、約400 mg/kg/週、約450 mg/kg/週、約500 mg/kg/週、約550 mg/kg/週、約600 mg/kg/週、約650 mg/kg/週、和約700 mg/kg/週。
在一些實施方式中，每隔一天（QOD）口服施用MDM2抑制劑（例如化合物C）或其藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）或其藥學上可接受的鹽以約30 mg到約250 mg的量每隔一天口服施用。在一些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）或其藥學上可接受的鹽以約50 mg到約200 mg的量每隔一天口服施用。在一些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）或其藥學上可接受的鹽，每隔一天以約50 mg、100 mg、150 mg或200 mg的量口服施用。
值得注意的是，當MDM2抑制劑（例如化合物C）在小鼠中應用的劑量範圍爲如本文提供的實施例中所揭示的10 mg/kg至50 mg/kg時，對於60kg的人相應的臨床相關劑量分別爲48.8 mg/天和244 mg/天。這裡使用轉換因子12.3是將小鼠劑量轉換爲人體等同劑量（HED）。將動物劑量（mg/kg）乘以km+轉換爲HED mg/m2 。見「Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」，美國衛生和公衆服務部，食品和藥物管理局，藥物評價和研究中心（CDER），2005年7月，藥理學和毒理學。
聯合療法
在一些實施方式中，MDM2抑制劑還可以與一種或多種額外的療法聯合施用於受試者，所述受試者藉由本案所提供的任何方法被鑑定爲對所述用MDM2抑制劑的治療很可能有反應的受試者。在一些實施方式中，治療患有癌症的受試者的方法包括向該受試者聯合施用治療有效量的MDM2抑制劑與一種或多種額外的療法，其中所述受試者已被確定在從所述受試者獲得的生物樣品中具有i）ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）MDM2的活性或表現量的增多，或i）和ii）兩者都有。
。在一些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）以不同於（例如低於）爲治療具體腫瘤在標準照護治療下用於治療腫瘤的MDM2抑制劑的標準劑量的劑量施用。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）的施用劑量比在具體的腫瘤疾病中MDM2抑制劑（例如化合物C）分子的標準劑量低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些實施方式中，MDM2抑制劑（例如化合物C）分子的給藥劑量是針對具體癌症的MDM2抑制劑（例如化合物C）分子的標準劑量的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些實施方式中，一種或多種額外的療法包括放療、化療、靶向癌症療法或使用免疫檢查點分子的調節劑的療法。在一些實施方式中，一種或多種額外的療法包括施用抗PD-1抗體、Bcl-2抑制劑、FAK抑制劑、MEK抑制劑或MET抑制劑。應注意到額外的療法可以包括施用傳統的有機化學小分子，或者施用大分子（例如蛋白質、抗體、肽、DNA、RNA）或此類大分子的片段。
如本文所用，術語「放療」是指用電離輻射治療癌症。術語「化療」是指使用特定化學藥劑治療癌症。術語「靶向癌症療法」是指用與所選生物分子選擇性相互作用的藥劑（化合物或大分子）治療癌症。
在一些實施方式中，所述額外的療法包括施用免疫檢查點分子的調節劑。如本發明所用，「免疫檢查點」或「免疫檢查點分子」是免疫系統中調節訊號的分子。免疫檢查點分子可以是共刺激檢查點分子，即上調訊號，或抑制檢查點分子，即下調訊號。如本文所用的「共刺激檢查點分子」是免疫系統中上調訊號分子或共刺激的分子。如本文所用，「抑制性檢查點分子」是免疫系統中下調訊號分子或共抑制的分子。
如本發明所用，「免疫檢查點分子的調節劑」是能夠改變受試者中免疫檢查點活性的試劑。在某些實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑改變一種或多種免疫檢查點分子的功能，包括：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、CD160、2B4、TGF β、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、ICAM-1、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、和CD83。免疫檢查點的調節劑可以是免疫檢查點的活化劑（例如促效劑）或抑制劑（例如拮抗劑）。在一些實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑是免疫檢查點結合蛋白（例如抗體、抗體Fab片段、雙價抗體（divalent antibody）、抗體藥物偶聯物、scFv、融合蛋白、二價抗體或四價抗體）。在一些實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑是單株抗體或其抗原結合片段。在其他實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑是小分子。在一個具體實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑是抗PD-1抗體。在一個具體實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑是抗-CTLA-4抗體。
在某些實施方式中，免疫檢查點調節劑分子的調節劑恢復抗腫瘤T細胞活性或阻斷T細胞抑制性細胞的活性。在一些實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑是共刺激檢查點分子的活化劑，並且所述共刺激檢查點分子的活化劑改變了完全T細胞活化所需的共刺激訊號。在一些實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑是帕博利珠單株抗體、伊匹單株抗體、納武單株抗體、阿特珠單株抗體、阿維單株抗體、德瓦魯單株抗體、AGEN-1884、BMS-986016、CS-1002、LAG525、MBG453、MEDI-570、OREG-103 / BY40、lirilumab、tremelimumab、帕博利珠單株抗體、納武單株抗體、AMP-224、AMP-514、BGB-A317、cemiplimab、JS001、PDR-001、CS1001、PF-06801591、IBI-308、pidilizumab、SHR-1210、TSR-042、阿特珠單株抗體、阿維單株抗體、德瓦魯單株抗體、AMP-224、JS003、LY3300054、MDX-1105、SHR-1316、KN035或CK-301。
在一些實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑和MDM2抑制劑同時施用。在一些實施方式中，免疫檢查點分子的調節劑和MDM2抑制劑依序施用。
疾病
在某些實施方式中，所述個體具有癌症。在某些實施方式中，所述個體被診斷爲具有癌症或具有癌症狀態。在某些實施方式中，所述個體是癌症患者。
在某些實施方式中，癌症是實體瘤或血液系統惡性腫瘤。在各種實施方式中，所述癌症選自白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌(carcinoma)和肉瘤。在一些實施方式中，癌症選自腎上腺皮質癌、晚期癌症、肛門癌、再生障礙性貧血、膽管癌、膀胱癌、骨癌、骨轉移、成人腦/中樞神經系統腫瘤、兒童腦/中樞神經系統腫瘤、乳癌、男性乳癌、兒童癌症、原發癌未知癌症、Castleman病、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤因家族腫瘤、眼癌、膽囊癌、腸胃道類癌、腸胃道間質瘤（GIST）、妊娠滋養細胞疾病、頭頸癌、霍奇金病、卡波西肉瘤、腎癌、喉癌和下咽癌、白血病-急性淋巴細胞癌（ALL）成人、白血病-急性骨髓細胞（AML）、白血病-慢性淋巴細胞（CLL）、白血病-慢性骨髓細胞白血病（CML）、白血病-慢性骨髓單核細胞白血病（CMML）、兒童白血病、肝癌、肺癌-非小細胞、肺癌 -小細胞、肺類癌、皮膚淋巴瘤、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合症、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、兒童非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、陰莖癌、垂體瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤-成人軟組織癌、皮膚癌-基底和鱗狀細胞、皮膚癌-黑色素瘤、小腸癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、華氏巨球蛋白血症和腎母細胞瘤。在一個實施方式中，組合療法用於治療選自以下的癌症：黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、肺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、Merkel細胞癌、尿路上皮癌、微衛星標記高度不穩定或錯配修復缺陷的實體瘤（Solid tumors that are microsatellite instability – high or mismatch repair-deficient）、肉瘤、結腸癌、前列腺癌、絨毛膜癌、乳癌、視網膜母細胞瘤、胃癌、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤或白血病。
在某些實施方式中，其中所述癌症選自胃癌、膽管癌、肺癌、黑色素瘤、乳癌、結腸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌（例如肝細胞癌）、膀胱癌、胰腺癌、腎癌、食道癌、頭頸癌、甲狀腺癌、皮膚鱗狀細胞癌、膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、泌尿膀胱癌（urinay bladder cancer）、子宮癌（hysterocarcinoma）、黑色素瘤、骨肉瘤、淋巴瘤（例如外套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤）、白血病（例如T細胞幼淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病或急性骨髓性白血病）、多發性骨髓瘤、結直腸癌、肺腺癌、子宮肉瘤（CS）、肺鱗狀細胞癌、子宮頸癌、肉瘤、嫌色細胞癌（chromophobe）、腎細胞癌（RCC）、透明細胞RCC、乳頭狀RCC、葡萄膜黑色素瘤、睾丸生殖細胞、低等神經膠質瘤（LGG）、間皮瘤、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(PCPG)或胸腺瘤。
在某些實施方式中，癌症是局部晚期或轉移性實體瘤或淋巴瘤。在某些實施方式中，所述受試者經歷過治療並且顯示出疾病進展。如本文所用，「經歷過治療」是指已經用抗癌療法治療過的受試者。可以藉由對先前治療的反應性降低的迹象（例如腫瘤大小增加、腫瘤細胞數目增加或腫瘤生長）表徵疾病進展。
在一個實施方式中，施用如本文所述的MDM2抑制劑（例如化合物C）導致以下一項或多項：腫瘤尺寸、重量或體積減小，至進展的時間增加，腫瘤生長抑制和/或患有癌症的受試者的生存期延長。
V 、套組
在另一方面，本案進一步提供了用於本文所述的方法的套組。在某些實施方式中，套組包含一種或多種試劑，例如本文提供的引子、探針和/或抗體或微陣列。引子、探針和/或抗體可以被或不可被檢測地標記。在某些實施方式中，套組可進一步包含其他試劑以進行本文所述的方法。在此類應用中，套組可包括以下的任何或全部：合適的緩衝液、用於分離核酸的試劑、用於擴增核酸的試劑（例如聚合酶、dNTP混合物）、用於雜交核酸的試劑、用於對核酸進行定序的試劑、用於定量核酸的試劑（例如嵌入劑、檢測探針）、用於分離蛋白質的試劑和用於檢測蛋白質的試劑（例如第二抗體）。通常，可用於本文提供的任何方法的試劑被包含在載體或分隔的容器中。載體可以是例如袋子、盒子、管子、架子形式的容器或支撑物，並且可選地是分隔的。
在一個實施方式中，套組包括一種或多種用於檢測ATM和/或ATR中是否存在一種或多種失活突變的試劑；或一種或多種用於測量ATM和/或ATR表現量的試劑。在一個實施方式中，套組包括一種或多種用於測量MDM2拷貝數變異的試劑，或一種或多種用於測量MDM2表現量的試劑。在一個實施方式中，套組進一步包括一種或多種用於檢測存在或不存在功能性p53（例如野生型p53）的試劑。
在一個實施方式中，所述套組包括用於檢測ATM和/或ATR中是否存在一種或多種失活突變、測量ATM和/或ATR表現量、測量MDM2拷貝數變異、測量MDM2表現量、和/或檢測存在或不存在功能性p53（例如野生型p53）的試劑。所述測量可以在RNA表現量、DNA表現量、和/或蛋白質表現量。可以使用用於檢測靶RNA、靶DNA或靶蛋白的合適試劑。在某些實施方式中，檢測試劑包含可以與ATM、ATR、MDM2或p53的多核苷酸雜交的引子或探針。在某些實施方式中，檢測試劑包含可以專一性結合ATM、ATR、MDM2或p53的蛋白質的抗體。
如本文所用，術語「引子」是指由於至少一部分引子在靶多核苷酸序列的序列內的序列互補性，而可與靶多核苷酸序列專一性雜交的寡核苷酸。引子的長度可以爲至少8個核苷酸，通常爲8至70個核苷酸，或通常爲18至26個核苷酸。爲了與靶序列正確雜交，引子可與靶多核苷酸序列的雜交部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列互補性。可用作引子的寡核苷酸可以化學合成，其根據首先由Beaucage & Caruthers,Tetrahedron Letts. (1981) 22:1859-1862描述的固相亞磷醯胺三酯方法，使用自動合成儀，如Needham-Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12:6159-6168中所描述。
引子可用於核酸擴增反應，其中引子被延伸以産生多核苷酸的新鏈。具有通常知識者使用本領域已知的常識可以容易地設計引子，使得它們可以與本文提供的至少一種生物標記物的靶核苷酸序列的核苷酸序列專一性退火。通常，將引子的3'核苷酸設計成與靶序列在相應的核苷酸位置互補，以提供藉由聚合酶的最佳的引子延伸。
如本文所用，術語「探針」是指可與靶多核苷酸序列專一性雜交的寡核苷酸或其類似物，因爲探針的至少一部分在靶多核苷酸序列的序列內具有序列互補性。例示性探針可以是例如DNA探針、RNA探針或蛋白質核酸（PNA）探針。探針的長度可以爲至少8個核苷酸，通常爲8至70個核苷酸，或通常爲18至26個核苷酸。爲了與靶序列正確雜交，探針可與靶多核苷酸序列的雜交部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列互補性。探針也可以根據如上所述的固相亞磷醯胺三酯方法化學合成。DNA和RNA探針的製備方法及其與靶核苷酸序列雜交的條件，在《分子克隆：實驗室手册》（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），J. Sambrook等，第2版中有描述。冷泉港實驗室出版社，1989年，第10和11章。
如本文所用，術語「抗體」是指可以與靶蛋白抗原專一性結合的免疫球蛋白或其抗原結合片段。可以藉由從噬菌體或類似載體中的重組抗體庫中選擇抗體來鑑定和製備抗體，以及藉由對動物（例如兔或小鼠）進行免疫來製備多株和單株抗體（參見例如Huse et al.,Science (1989) 246:1275-1281；Ward et al.,Nature (1989) 341:544-546）。
在某些實施方式中，本文提供的引子或探針包含可與SEQ ID NO：1、3、5或7的序列內的一部分雜交的多核苷酸序列。在某些實施方式中，本文提供的引子或探針包含與SEQ ID NO：1、3、5或7的序列內的一部分具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互補性的多核苷酸序列。在某些實施方式中，本文提供的抗體包含能夠與具有SEQ ID NO：2、4、6或8的序列的蛋白或多肽內的表位專一性結合的抗原結合區。
在某些實施方式中，本文提供的引子、探針和抗體被可檢測地標記。適用於標記引子、探針和抗體的可檢測標記物的實例包括，例如生色團、放射性同位素、螢光團、化學發光部分、顆粒（可見或螢光）、核酸、配體或催化劑例如酶。
放射性同位素的實例包括但不限於123 I、124 I、125 I、131 I、35 S、3 H、111 In、112 In、14 C、64 Cu、67 Cu、86 Y、88 Y、90 Y、177 Lu、211 At、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi和32 P。
螢光團的實例包括但不限於吖啶（Acridine）、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸（AMCA）、BODIPY、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、Edans、曙紅、赤蘚紅、螢光素、6-FAM、TET、JOC、HEX、Oregon Green、若丹明（Rhodamine）、Rhodol Green、Tamra、Rox和Texas Red TM（Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.）。
酶的實例包括但不限於鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶。
配體的實例包括但不限於生物素、抗生物素蛋白、抗體或抗原。
應該理解的是，可檢測標記物不必産生可檢測的訊號，例如，在一些實施方式中，它可以與可檢測的伴侶反應或與一種或多種其他化合物反應以産生可檢測訊號。例如可檢測標記物可以是一種配體，其能夠用作與標記的配體（例如二級標記的抗體）形成專一性結合對的成員。再例如，酶可以用作可檢測標記物，因爲其催化活性可以催化生色（chromo-），生螢光或發光受質而産生可檢測的訊號。
在某些實施方式中，本文提供的可檢測標記的引子、探針或抗體可進一步包含淬滅劑物質。淬滅劑物質是指一種物質，當其存在於與螢光物質足夠接近的附近時，由於例如螢光共振能量轉移（FRET）的結果可以淬滅由螢光物質發出的螢光。
淬滅劑物質的實例包括但不限於Tamra、Dabcyl或Black Hole Quencher（BHQ，Biosearch Technologies）、DDQ（Eurogentec）、Iowa Black FQ（Integrated DNA Technologies）、QSY-7（Molecular Probes），和Eclipse淬滅劑（Epoch Biosciences）。
引子和探針可以藉由切口平移法或藉由隨機引子法以高專一性活性（specific activity）被標記。有用的探針標記技術描述於文獻中（Fan Y.-S.,Molecular cytogenetics: protocols and applications, Humana Press, Totowa, N.J. xiv, 411 (2002)）。
另外，套組可包括指導材料，該指導材料包含用於實施本文提供的方法的指導（即方案）。儘管指導材料通常包括書面或印刷材料，但它們不限於此。
在某些實施例中，套組可進一步包含儲存在電腦可讀取媒體上的電腦程式産品。當電腦程式産品由電腦執行時，它基於以下進行將受試者鑑定爲很可能對用MDM2抑制劑的治療有反應的步驟：在生物樣品中存在i）ATM和/或ATR不足，或ii）MDM2增多，或i）和ii）兩者都有。本發明考慮任何能夠儲存此類電腦可執行指令並將其傳送給最終使用者的媒體。這樣的媒體包括但不限於電子儲存媒體（例如磁盤、磁帶、磁帶盒（cartridge）、晶片）、光學媒體（例如CD ROM）等。此類媒體可以包括提供此類指導材料的網際網路網站的網址。
也可以使用載波訊號對電腦程式進行編碼和傳輸，這些載波訊號適用於經由符合包括網際網路的各種協議的有線網路、光學網路和/或無線網路進行傳輸。因此，可以使用此類程式編碼的資料訊號來創建根據本發明的實施方式的電腦可讀取媒體。可以將程式代碼編碼的電腦可讀取媒體與兼容設備打包在一起，或者與其他設備分開（例如，藉由網際網路下載）提供。任何這樣的電腦可讀取媒體可以駐留在單個電腦産品（例如硬碟驅動器、CD或整個電腦系統）上或內部，並且可以存在於系統或網路內的不同電腦産品上或內部。
在一些實施方式中，本案提供了附接到固體支持物（例如陣列載玻片或晶片）上的寡核苷酸探針，例如，如描述於Bowtell和Sambrook編輯的DNA微陣列：分子克隆手册（2003）冷泉港實驗室出版社中（DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual(2003) Cold Spring Harbor Laboratory Press）。此類裝置的構建在本領域中是熟知的，例如如在以下美國專利和專利揭露中所述：美國專利號5,837,832；PCT申請W0 95/11995；美國專利號5,807,522；美國專利號7,157,229、7,083,975、6,444,175、6,375,903、6,315,958、6,295,153和5,143,854、2007/0037274、2007/0140906、2004/0126757、2004/0110212、2004/0110211、2003/0143550、2003/0003032和2002/0041420。還在以下參考文獻中綜述了核酸陣列：Biotechnol Annu Rev (2002) 8:85-101；Sosnowski et al.,Psychiatr Genet. (2002) 12(4):181-92；Heller,Annu Rev Biomed Eng. (2002) 4:129-53；Kolchinsky et al.,Hum. Mutat. (2002) 19(4):343-60；以及McGail et al.,Adv Biochem Eng Biotechnol (2002) 77:21-42。
提供以下實施例以更好地說明所要求保護的發明，並且不應將其解釋爲限制本發明的範圍。下文描述的所有特定的組合物、材料和方法（全部或部分）均落入本發明的範圍內。這些特定的組合物、材料和方法不旨在限制本發明，而僅僅是爲了說明落入本發明的範圍內的特定實施方式。本領域具有通常知識者可以開發等同的組合物、材料和方法，而無需使用創造力，並且不脫離本發明的範圍。應理解的是，可以在本文描述的程序中做出許多變化，同時仍然保持在本發明的範圍內。發明人意在將此類變化包括在本發明的範圍內。
實施例
雖然我們已經描述了本發明的多個實施方式，但是顯然可以改變我們的基本實施例以提供利用本案的方法的其他實施方式。因此，本案的範圍將理解爲由所附申請專利範圍而不是由已經藉由實施例表示的特定實施方式來定義。
貫穿本案引用的所有參考文獻（包括文獻、已公告的專利、公開的專利申請和共同待審的專利申請）的內容在此明確地全文引入作爲參考。除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語均與本領域具有通常知識者通常已知的含義一致。
實施例 1 、 開發化合物 C 的預測性生物標記物
研究目的
這項研究的目的是評估化合物C單藥在BALB/c裸鼠MDM2擴增（amp）皮下PDX模型中的體內抗腫瘤功效。
1 、建立來源於患者的異種移植物（ PDX ）模型
最初藉由手術切除的臨床樣品建立PDX模型，並植入裸鼠（定義爲第0代（P0））。從P0腫瘤植入的下一個傳代定義爲第1代（P1），並在小鼠連續植入過程中依此類推。P3-P7腫瘤組織將用於研究。實驗設計表（表1和表2）中列出了10種PDX模型及其對應的測試物。
表 1 、 10 種 PDX 模型的描述
模型名稱 腫瘤類型
ST-02-0075 胃癌
ST-02-0164 胃癌
ST-02-0203 胃癌
CH-17-0044 膽管癌
LU-01-0566 肺癌
LU-01-0448 肺癌
LU-01-0582 肺癌
CC6658 膽管癌
LU0861 肺癌
ME2194 黑色素瘤
表 2 、 試驗設計描述
組 數量 治療 劑量 (mg/kg) 給藥體積 ( mL/kg) 給藥途徑 給藥方案
1 2 溶劑對照 -- 10 p.o Q2D x 3W
2 2 化合物 C 200 10 p.o Q2D x 3W
註：p.o., 口服 ； Q2D, 每兩日； W, 週。
2 、 腫瘤接種和動物分組 將在每隻小鼠右側皮下植入腫瘤切片（slice）（約30 mm3 ）以産生腫瘤。對於胃癌，將腫瘤切片直接植入Balb/c裸鼠中。當平均腫瘤尺寸達到約150~200 mm3 時，將動物隨機分組並開始治療以進行功效研究。對於膽管癌和肺癌模型，首先將腫瘤切片植入NOD SCID小鼠中，當腫瘤長到適當大小時，將它們傳代給Balb/c裸鼠。當平均腫瘤尺寸達到約150~200 mm3 時，將動物隨機分組並開始治療以進行功效研究。以下試驗設計表3顯示了各組的測試物給藥和動物數量。
3 、 測試物製備
表 3 、 測試物製備描述
化合物 包裝 製備 濃度 (mg/mL) 儲存
溶劑 -- 0.2% HPMC -- 室溫（RT）
化合物C 2.011g/包 在8 mL 0.2% HPMC中研磨160 mg化合物C以製備均質懸浮液 20 4 ºC
註：臨使用前輕輕地上下旋轉試管以確保製劑均勻。
4 、 基因突變檢測
藉由全外顯子定序（WES）、RNA定序（RNA-seq）或微陣列分析了TP53、MDM2和ATM基因狀態。對於MDM2的拷貝數變異（CNV），將CNV> 3定義爲擴增。
5 、腫瘤測量和終點
主要終點是觀察是否可以延遲腫瘤生長或是否可以治癒小鼠。使用卡尺每週兩次在兩個維度上測量腫瘤大小，並使用以下公式以mm3 表示體積：V = 0.5a × b2 其中a 和b 分別是腫瘤的長徑和短徑。然後將腫瘤大小用於計算TGI和T/C值。使用以下公式計算各組的TGI：TGI（％）= [1-（Ti-T0）/（Vi-V0）]×100；Ti是給定日治療組的平均腫瘤體積，T0是開始治療當日治療組的平均腫瘤體積，Vi是溶劑對照組在與Ti的同一日的平均腫瘤體積，V0是治療開始當日的溶劑組的平均腫瘤體積。T/C值（以百分比表示）是抗腫瘤效力的指標；T和C分別是給定日的治療組和對照組的平均體積。
結果
在所有10個PDX模型中，總反應率（ORR）爲4/10（40％）。在TP53wt /MDM2amp /ATMmut PDX模型中，對化合物C的反應率爲60％，而在TP53wt /MDM2amp /ATMwt PDX模型中，反應率爲20％（表4）。因此，在MDM2amp /p53wt PDX模型中，ATM突變可進一步區分對化合物C的反應者（圖2）。
表 4 、化合物 C 對每種 PDX 模型的腫瘤生長抑制
模型 癌症種類 基因背景 ATM 突變 平均 TGI% 反應者 (TGI%>60%)
1 ST-02-0075 胃癌 MDM2amp /p53wt p.H1380Y 96 是
2 LU0861 肺癌 MDM2amp /p53wt p.N1983S 89 是
3 LU-01-0448 肺癌 MDM2amp /p53wt p.H1380Y 73 是
4 ME2194 黑色素瘤 MDM2amp /p53wt p.N1983S 23 否
5 CC6658 膽管癌 MDM2amp /p53wt p.N1983S 1 否
6 ST-02-0164 胃癌 MDM2amp /p53wt 野生型 81 是
7 ST-02-0203 胃癌 MDM2amp /p53wt 野生型 17 否
8 CH-17-0044 膽管癌 MDM2amp /p53wt 野生型 12 否
9 LU-01-0582 肺癌 MDM2amp /p53wt 野生型 9 否
10 LU-01-0566 肺癌 MDM2amp /p53wt 野生型 3 否
註釋：wt表示野生型；amp表示擴增。
實施例 2 、 開發化合物 C 的預測性生物標記物
該研究的目的是評估化合物C單藥在Balb/c裸鼠的10種TP53 野生型（wt）且MDM2 正常的皮下PDX模型中的體內抗腫瘤功效。
實驗方法和步驟與實施例1中的描述相似。表5顯示實驗設計。
表 5 、實驗設計描述
組 數量 治療 劑量 (mg/kg) 給藥體積 ( mL/kg) 給藥途徑 給藥方案
1 2 溶劑對照 -- 10 p.o QD x 2W
2 2 化合物C 100 10 p.o QD x 2W
註釋：p.o., 口服 ； QD, 每日； W, 週。
中期(interim)結果（表6以及圖3A和3B）顯示在所有10個PDX模型中，總反應率（ORR）爲4/10（40％）。
表 6 、化合物 C 對每種 PDX 模型的腫瘤生長抑制
模型 癌症種類 ATM 突變 ATR 突變 TGI% T/C %
ST-02-0173 胃癌 p.N2875S wt 76 24
ST-02-0316 胃癌 p.H1380Y wt 74 26
CO-04-0001 結腸癌 p.R2598Q p.K243T 73 27
ST-02-0328 胃癌 p.1599_1600del wt 68 32
ME-21-0015 黑色素瘤 p.H1380Y wt 50 50
CO-04-0114 結腸癌 p.H1380Y wt 49 51
LI-03-0842 肝癌 p.I2865V wt 39 61
LU-01-052 肺癌 p.Q476R wt 6 94
LU-01-0439 肺癌 p.N1650S wt -1 101
LU-01-0556 肺癌 p.R2741T wt -44 144
註釋：wt表示野生型
實施例 3 、化合物 C 在癌細胞系中的體外細胞活性
在具有所示的TP53、ATM和ATR遺傳狀態的各種癌細胞系中測試化合物C的活性。繪製化合物C在TP53WT ATMWT 細胞系中相對於在TP53WT ATRMUT 或TP53WT ATMMUT 細胞系中的活性（IC50 ，uM）（圖4，MUT表示突變體；WT表示野生型）。圖4顯示，與TP53WT ATMWT 細胞系相比，TP53WT ATRMUT 或TP53WT ATMMUT 細胞系對化合物C具有更高的敏感性。在化合物C的IC50 值小於0.3uM的例示性癌細胞系中，進一步確定了MDM2的拷貝數和MDM2 mRNA的表現量，結果顯示在表7中。
Figure 02_image078
實施例 4 、在化合物 C 與派姆單株抗體（ Pembrolizumab ）組合在不可切除或轉移性黑色素瘤或晚期實體瘤患者中的 Ib / II 期研究
Ib/II研究由兩部分組成，劑量爬坡研究和Simon兩階段II期研究。在劑量爬坡研究中，將化合物C與派姆單株抗體聯合使用用於治療轉移性實體瘤患者，這些患者的先前的標準治療均失敗。測試化合物C的四個劑量表現量：50、100、150和200 mg。在21天週期的連續2週中，每隔一天（QOD）口服給予化合物C。在21天週期的第1天，以200 mg的劑量靜脈內（IV）施用注射派姆單株抗體。劑量爬坡研究的主要目標是確定安全性、耐受性以及確定MTD和RP2D。
結果
在劑量爬坡研究中，總共有14名患者以4組接受了化合物C（50 mg、100 mg、150 mg、200 mg）與派姆單株抗體的聯合治療。100mg組的一名患有晚期卵巢癌（ATM種系突變）的患者獲得「確認的完全消退（CR）」（仍在進行中）；100 mg組的另一例晚期NSCLC患者獲得「確認的部分消退（PR）」（仍在進行中），該患者的先前的6線療法（包括3個月的納武單株抗體(nivolumab)治療）均失敗。5名患者經過兩個週期的治療後獲得了「穩定疾病（SD）」，其中2名獲得「確認的SD」（仍在進行中）。PK分析顯示，從50到100 mg的劑量表現量，暴露呈近似劑量成比例增加。初步PD結果顯示，化合物C治療後血清MIC-1表現量升高，表示患者中潛在的p53活化。
結論
當與派姆單株抗體聯合使用時，化合物C在幾種腫瘤類型中顯示出有希望的抗腫瘤效果。
實施例 5 、在 A549 細胞中敲除 ATM 基因提高了細胞對體外治療的敏感性
試驗方法
CTG分析
藉由CellTiter-Glo® 發光細胞活力測定套組測量ATP，定量確定了化合物C在親代和ATM基因敲除的A549細胞系中的抗增殖作用。將細胞接種在96孔盤中，並用不同濃度的測試劑如所示處理。利用多至8個系列濃度測試化合物C，每個濃度使用三個平行複孔進行測試。
試驗方法簡述如下： 首先使細胞生長至對數期，藉由離心收集細胞。將細胞重懸、計數並稀釋至所需濃度。將細胞充分混合，然後將90 μL細胞懸浮液（8×103 個細胞）添加到96孔盤的每個孔中，並在37°C恆溫箱中，5％CO2 孵育過夜。將僅包含培養基（100 μL/孔）而沒有細胞的三個或更多空白對照孔放在同一盤中，以獲取背景發光訊號。
以1：3的比例連續稀釋化合物C，製備5~8個系列濃度的化合物C溶液，並將10μL/孔稀釋化合物C溶液添加到96孔盤中。將板在5％CO2 培養箱中37℃，培養3天或5天。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長。
處理結束後，將96孔盤從培養箱中取出並平衡至室溫，然後將30 μL CellTiter-Glo® 試劑（避光）添加到每個孔中。 將96孔盤置於震盪器上，將細胞與試劑充分混合2分鐘以使細胞裂解。使96孔盤在室溫下再保持10分鐘，以穩定發光訊號。然後使用Biotek synergy H1酶標儀檢測發光訊號。利用複孔的平均螢光訊號值，藉由以下公式計算細胞活力的百分比：
細胞活力百分比（％）＝（測試細胞螢光訊號值-陰性對照細胞螢光訊號值）/（對照細胞螢光訊號值-陰性對照細胞螢光訊號值）×100％。
使用Graphpad Prism 6.0軟件（Golden軟件，Golden，Colorado，USA）的非線性回歸資料分析方法計算IC50值，並繪製細胞存活曲線。
流式細胞儀分析細胞凋亡
使用膜聯蛋白V-PI（碘化丙啶）染色套組檢測細胞凋亡。試驗簡述如下：藥物處理72小時後收取細胞，並用PBS洗滌。將細胞用Annexin-V和PI染色，並按照製造商的說明藉由Attune NxT流式細胞儀進行分析。藉由分析每種實驗條件下的20,000個細胞獲得凋亡數據。
結果
爲了檢查ATM對化合物C活性的影響，我們利用CRISPR / Cas9技術（參考如Ran A.F. et al.,Cell (2013) 154:1380-1389 和Cho S.W. et al.,Nature Biotechnology (2013) 31:230-232中所述方法），在A549細胞中敲除了ATM基因。成功敲除ATM基因後（圖5A，p表示具有ATM的親代細胞，KO表示敲除ATM的細胞），我們隨後檢查了ATM丟失後，化合物C對細胞活性的影響。如圖5B和5C所示，A549 ATM KO細胞在體外對化合物C處理更敏感（藥物處理5天後，化合物C在親代細胞中的IC50 爲1.4 μM，而在敲除ATM的細胞中的IC50 爲0.9 μM）。此外，與親代細胞相比，化合物C在A549 ATM KO細胞中誘導的細胞凋亡更多（圖5D）。
實施例 6 、 A549 ATM KO 細胞比親代細胞具有更高的 ROS 表現量，並且化合物 C 處理誘導 ATM KO 細胞中産生更多 ROS
試驗方法
流式細胞儀分析ROS的生成
使用活性氧（ROS）檢測套組（Beyotime, Cat. # S0033）檢測ROS的産生，該套組使用螢光探針DCFH-DA檢測ROS。處理後48小時收集細胞，並根據套組說明書裝載螢光探針。使用Attune NxT流式細胞儀測量螢光强度。
試驗結果
如圖6A所示，A549敲除ATM的細胞比親代細胞具有更高的基準線ROS表現量。與親代細胞相比，化合物C處理可在ATM KO細胞中誘導生成更多ROS（圖6B），ROS是已知的凋亡誘導劑。這些數據顯示，ATM敲除導致ROS表現量升高，因此降低了化合物C誘導細胞凋亡的臨界值。
無。
圖1A顯示ATM的失活增加了MDM2功能，並且降低了p53功能。圖1B顯示ATM中的例示性失活突變。圖1C和圖1D顯示可能引起ATM活性或表現量不足的ATM中的例示性突變。
圖2顯示在MDM2amp/p53wt PDX模型中進行的對化合物C的小鼠實驗中，ATM突變區分了從20％到50％的反應者。
圖3A和3B顯示化合物C在TP53wt/ATRmut PDX模型中的活性。
圖4顯示相對於TP53wt/ATMwt/ATRwt PDX模型，化合物C在TP53wt/ATMmut或ATRmut PDX模型中的活性。
圖5A至5D顯示在基因表現量敲除A549細胞的ATM基因可提高細胞對化合物C治療的體外敏感性。其中，圖5A顯示來自A549細胞和ATM敲除(KO)細胞的裂解物的ATM免疫墨點分析結果。圖5B和5C顯示A549 ATM KO細胞在體外對化合物C處理更敏感。圖5D顯示化合物C在A549 ATM KO細胞中比在親代細胞中誘導更多的細胞凋亡。
圖6A和6B顯示 A549 ATM KO細胞比親代細胞具有更高的ROS表現量，且化合物C處理導致ATM KO細胞中誘導生成更多ROS。圖6A顯示A549親代細胞和A549 ATM敲除細胞中ROS的基準線表現量。圖6B顯示將細胞處理48小時，並藉由流式細胞術檢測ROS表現量。
圖7顯示本文提供的生物標記物的例示性序列。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
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Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049

Claims (33)

  1. 一種鑑定對用MDM2（鼠雙微體2，Murine Double Minute 2）抑制劑的治療很可能有反應的患有癌症的受試者的方法，該方法包括： a）提供來自受試者的生物樣品； b）測定該生物樣品中： i. 是否存在ATM（毛細血管擴張共濟失調突變，Ataxia-Telangiectasia Mutated）和/或ATR（毛細血管擴張共濟失調和Rad3相關蛋白，Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein）的活性或表現量不足（deficiency）；及/或 ii. 是否存在MDM2的活性或表現量增多(gain)；以及 c）基於以下條件鑑定該受試者爲對該用MDM2抑制劑的治療很可能有反應：該生物樣品中存在i）該ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）該MDM2的活性或表現量增多，或i）和ii）兩者都有。
  2. 如請求項1所述的方法，其還包括： d）將MDM2抑制劑施用於鑑定爲對該用MDM2抑制劑的治療很可能有反應的受試者。
  3. 一種用MDM2抑制劑治療患有癌症的受試者的方法，其包括： a）測定來自該受試者的生物樣品中： i. 是否存在ATM和/或ATR的活性或表現量不足；及/或 ii．是否存在MDM2的活性或表現量增多；以及 b）基於以下條件向該受試者施用MDM2抑制劑：該生物樣品中存在i）該ATM和/或ATR的活性或表現量不足，或ii）該MDM2的活性或表現量增多，或i）和ii）兩者都有。
  4. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該測定步驟包括在該生物樣品中檢測在ATM和/或ATR中是否存在一種或多種失活突變，其中ATM和/或ATR中存在該失活突變，表示該ATM和/或ATR的活性或表現量不足。
  5. 如請求項4所述的方法，其中該失活突變包括ATM和/或ATR中的降低絲胺酸/蘇胺酸激酶活性的易位、缺失、插入、取代或其任何組合。
  6. 如請求項5所述的方法，其中ATM中的該失活突變包括選自圖1B、1C和1D中的相對於SEQ ID NO：2的突變（例如H1380Y、N1983S、N2875S、R2598Q、1599_1600del、V2716A、K1903fs、V2906I、A1127V、K1101E、Q912*、S2165F或H1083Y）；或相對於SEQ ID NO：1的c.3154-2A>G；或其任何組合。
  7. 如請求項5所述的方法，其中ATR中的該失活突變包括相對於SEQ ID NO：4的K243T、Q1926H、I774fs、K1379N、L1483F或其任何組合。
  8. 如請求項1至3中任一項所述的方法，其中該測定步驟包括： 測定相對於參考基準，生物樣品中ATM和/或ATR的表現量是否降低， 並且其中該ATM和/或ATR的表現量的降低，表示該ATM和/或ATR的活性或表現量不足。
  9. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該測定步驟包括： 測定相對於參考基準，生物樣品中MDM2基因的拷貝數變異、MDM2基因産物的表現量或MDM2蛋白活性是否增加， 並且其中該增加表示該MDM2的活性或表現量的增多。
  10. 如請求項9所述的方法，其中MDM2的拷貝數變異（CNV）>3表示該MDM2的活性或表現量的增多。
  11. 如請求項10所述的方法，其中藉由RNA定序（RNAseq）測量，該MDM2基因産物的表現量相對於該參考基準增加至少50％，表示該MDM2的活性或表現量的增多。
  12. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該鑑定步驟包括： c）基於以下條件鑑定該受試者爲對該用MDM2抑制劑的治療很可能有反應：該生物樣品中存在以下兩者i）ATM和/或ATR中存在該失活突變，以及ii）該MDM2基因的CNV的增加或該MDM2基因産物的表現量的增加。
  13. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該測定步驟還包括： 測定該生物樣品中存在或不存在功能性p53。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的方法，其中該測定步驟還包括： 測定該生物樣品中p53是否爲野生型。
  15. 如請求項14所述的方法，其中該鑑定步驟包括： c）基於以下條件鑑定該受試者很可能對該用MDM2抑制劑的治療有反應：生物樣品中存在i）ATM和/或ATR中存在該失活突變；ii）該MDM2基因的CNV的增加或該MDM2基因産物的表現量的增加；且iii）存在野生型p53。
  16. 如前述請求項中任一項的方法，其中藉由擴增試驗、雜交試驗、定序試驗或免疫試驗測量i）該ATM和/或ATR的活性或表現量，或ii）該MDM2的活性或表現量的增多，或iii）存在或不存在該功能性p53。
  17. 一種用MDM2抑制劑治療患有癌症的受試者的方法，其中已經藉由請求項1和4至16中任一項所述的方法將該受試者鑑定爲對該用MDM2抑制劑的治療很可能有反應。
  18. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該生物樣品包括癌細胞或非癌細胞。
  19. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該癌症是實體瘤或血液系統惡性腫瘤。
  20. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該癌症是胃癌、膽管癌、肺癌、黑色素瘤、乳癌、結腸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌（例如肝細胞癌）、膀胱癌、胰腺癌、腎癌、食道癌、頭頸癌、甲狀腺癌、皮膚鱗狀細胞癌、膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、泌尿膀胱癌（urinary bladder cancer）、子宮癌（hysterocarcinoma）、黑色素瘤、骨肉瘤、淋巴瘤（例如外套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤）、白血病（例如T細胞幼淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病或急性骨髓性白血病）、多發性骨髓瘤、結直腸癌、肺腺癌、子宮肉瘤（CS）、肺鱗狀細胞癌、子宮頸癌、肉瘤、嫌色細胞癌（chromophobe）、腎細胞癌（RCC）、透明細胞RCC、乳頭狀RCC、葡萄膜黑色素瘤、睾丸生殖細胞、低等神經膠質瘤（LGG）、間皮瘤、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(PCPG)或胸腺瘤。
  21. 如請求項20所述的方法、其中該癌症是胃癌。
  22. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該MDM2抑制劑包含具有下式（I）的化合物：
    Figure 03_image003
    （I） 或其藥學上可接受的鹽，其中：
    Figure 03_image005
    選自以下群組：
    Figure 03_image007
    ； B是C4-7 碳環； R1 是H、取代或未取代的C1-4 烷基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基、ORa 或NRa Rb ； n是0、1或2； R2 、R3 、R4 、R5 、R7 、R8 、R9 和R10 獨立地選自由H、F、Cl、CH3 和CF3 組成的群組； R6 是
    Figure 03_image009
    或
    Figure 03_image011
    ； Ra 是氫或取代或未取代的C1-4 烷基； Rb 是氫或取代或未取代的 C1-4 烷基； Rc 和Rd 是環B的一個碳原子上的取代基，其中： Rc 是 H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-ORa 、ORa 、或鹵代； Rd 是 H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-ORa 、ORa 、或鹵代；或 Rc 和Rd 與它們所連接的碳一起形成4至6員螺環取代基，該取代基任選地含有氧原子；並且 Re 是-C(=O)ORa 、-C(=O)NRa Rb 、或-C(=O)NHSO2 CH3 。
  23. 如請求項22所述的方法，其中：
    Figure 03_image005
    是
    Figure 03_image013
    ； B 是
    Figure 03_image015
    ；且 Rc 和Rd 分别是F和F、H和H、OH和CH3 、OH和H、CH3 和CH3 、CH3 和OH、H和OH、CH2 CH3 和CH2 CH3 、或CH2 OH和CH2 OH。
  24. 如請求項22或23所述的方法，其中
    Figure 03_image017
    是H、CH3 或CH2 CH3 。
  25. 如請求項22至24中任一項所述的方法，其中R2 是H；R3 是鹵代；R4 和R5 均是H。
  26. 如請求項22至25中任一項所述的方法，其中R7 是氟代；R8 、R9 和R10 中的每一個是H；且Re 是-C(-O)OH、-C(-O)NH2 或-C(-O)NHSO2 CH3 。
  27. 如請求項22所述的方法，其中該MDM2抑制劑爲選自以下的化合物：
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    、
    Figure 03_image029
    、
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    和
    Figure 03_image047
    ；      
    或該化合物的藥學上可接受的鹽。
  28. 如請求項22所述的方法，其中該MDM2抑制劑是：
    Figure 03_image049
    或
    Figure 03_image001
    或其藥學上可接受的鹽。
  29. 如請求項1至22中任一項所述的方法，其中該MDM2抑制劑是化合物C或其藥學上可接受的鹽。
  30. 如請求項2至29中任一項所述的方法，其還包括進一步施用有效量的一種或多種額外的療法，該額外的療法包括施用免疫檢查點分子的調節劑。
  31. 如請求項30所述的方法，其中該MDM2抑制劑是化合物C或其藥學上可接受的鹽，並且該免疫檢查點分子的調節劑是抗PD-1抗體。
  32. 一種用於預測患有癌症的受試者對用MDM2抑制劑的治療的反應性的套組，包括： a）一種或多種用於檢測ATM和/或ATR中存在一種或多種失活突變的試劑；或一種或多種用於測量ATM和/或ATR表現量的試劑；以及/或 b）一種或多種用於測量MDM2拷貝數變異的試劑，或一種或多種用於測量MDM2表現量的試劑。
  33. 如請求項32所述的套組，其還包括： c）一種或多種用於檢測存在或不存在功能性p53的試劑。
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