JP2013226138A - タンパク質多量体の効率的な提示法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の工程を含む、タンパク質多量体及び当該タンパク質多量体のいずれか1つの対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を製造する方法:i)in vitro翻訳系により対象構成因子をコードする核酸から対象構成因子への翻訳反応を行い、対象構成因子−核酸複合体を含有する翻訳反応産物を得る;ii)i)で得られた翻訳反応産物に、非対象構成因子をコードする核酸を添加して翻訳反応を行い、産生した当該非対象構成因子をi)の対象構成因子対象構成因子と会合させタンパク質多量体を形成させて、タンパク質多量体及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を得る。
【選択図】なし
Description
i)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸から対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体を含有する翻訳反応産物を得ること、
ii)i)で得られた翻訳反応産物に、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸を添加し、非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を産生せしめ、当該非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を得ること。
[2]i)のin vitro翻訳系が非対象構成因子をコードする核酸を含まない、[1]に記載の方法。
[3]タンパク質多量体−核酸複合体及び対象構成因子−核酸複合体がリボソームを含む、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]ii)において、i)で得られた翻訳反応産物にリボソームを添加する、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]タンパク質多量体−核酸複合体1分子につき、タンパク質多量体1分子、及び対象構成因子をコードする核酸1分子が含まれる、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]in vitro翻訳系が、独立に精製された因子からなる、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]独立に精製された因子の少なくとも1つが原核生物から抽出された因子である、[6]に記載の方法。
[8]タンパク質多量体が二量体である、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]タンパク質多量体が多量体として機能するものである、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]タンパク質多量体が抗体である、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]抗体がFab断片である、[10]に記載の方法。
[12]対象構成因子がL鎖及びH鎖からなる群から選択されるいずれか一方であり、非対象構成因子が他方である、[10]又は[11]に記載の方法。
[13]対象構成因子をコードする核酸が、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーである、[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]以下の工程を含む、タンパク質多量体、及び当該タンパク質多量体のいずれか1つの対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを製造する方法:
i)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーから対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体のライブラリーを含有する翻訳反応産物を得ること、
ii)i)で得られた翻訳反応産物に、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸を添加し、非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を産生せしめ、当該非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを得ること。
[15]以下の工程を含む、タンパク質多量体、及び当該タンパク質多量体のいずれか1つの対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を製造する方法:
i’)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸から対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体を含有する翻訳反応産物を得ること、
ii’)in vitro翻訳系により、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を含有する翻訳反応産物を得ること、
iii’)i’)の翻訳反応産物をii’)の翻訳反応産物と混合し、非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を得ること。
[16]i’)のin vitro翻訳系が非対象構成因子をコードする核酸を含まない、[15]に記載の方法。
[17]ii’)のin vitro翻訳系が対象構成因子をコードする核酸を含まない、[15]又は[16]に記載の方法。
[18]タンパク質多量体−核酸複合体及び対象構成因子−核酸複合体が更にリボソームを含む、[15]〜[17]のいずれかに記載の方法。
[19]タンパク質多量体−核酸複合体1分子につき、タンパク質多量体1分子、及び対象構成因子をコードする核酸1分子が含まれる、[15]〜[18]のいずれかに記載の方法。
[20]in vitro翻訳系が、独立に精製された因子からなる、[15]〜[19]のいずれかに記載の方法。
[21]独立に精製された因子の少なくとも1つが原核生物から抽出された因子である、[20]に記載の方法。
[22]タンパク質多量体が二量体である、[15]〜[21]のいずれかに記載の方法。
[23]タンパク質多量体が多量体として機能するものである、[15]〜[22]のいずれかに記載の方法。
[24]タンパク質多量体が抗体である、[15]〜[23]のいずれかに記載の方法。
[25]抗体がFab断片である、[24]に記載の方法。
[26]対象構成因子がL鎖及びH鎖からなる群から選択されるいずれか一方であり、非対象構成因子が他方である、[24]又は[25]に記載の方法。
[27]対象構成因子をコードする核酸が、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーである、[15]〜[26]のいずれかに記載の方法。
[28]以下の工程を含む、タンパク質多量体、及び当該タンパク質多量体のいずれか1つの対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを製造する方法:
i’)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーから対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体のライブラリーを含有する翻訳反応産物を得ること、
ii’)in vitro翻訳系により、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を含有する翻訳反応産物を得ること、
iii’)i’)の翻訳反応産物をii’)の翻訳反応産物と混合し、非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを得ること。
i)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸から対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体を含有する翻訳反応産物を得ること、
ii)i)で得られた翻訳反応産物に、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸を添加し、非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を産生せしめ、当該非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を得ること。
i’)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸から対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体を含有する翻訳反応産物を得ること、
ii’)in vitro翻訳系により、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を含有する翻訳反応産物を得ること、
iii’)i’)の翻訳反応産物をii’)の翻訳反応産物と混合し、非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を得ること。
(1)mRNAからタンパク質に翻訳すること。
(2)DNAからmRNAに転写し、更にmRNAからタンパク質に翻訳すること。
(1)各因子(タンパク質)をコードする遺伝子を単離し、発現ベクターに導入後、適当な宿主細胞に形質転換して発現させ、回収する。
(2)各因子をコードする遺伝子を単離し、in vitro翻訳系で合成し、回収する。
(1)では、はじめに発現制御領域を含む発現ベクターに、該領域の制御により目的とする因子が発現されるように各因子の遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを作成する。ベクターを構成する発現制御領域とは、例えば、エンハンサー、プロモーター、及びターミネーターなどを指す。発現ベクターは、薬剤耐性マーカーなどを含むこともできる。次に、この発現プラスミドで宿主細胞を形質転換し、各因子を発現させる。
開始因子 (Initiation Factor; IF)、
伸長因子 (Elongation Factor; EF)、
解離因子(Release Factor; RF)、
アミノアシルtRNA合成酵素(Aminoacyl-tRNA synthetase; AARS)、
リボソーム、
アミノ酸、
ヌクレオシド三リン酸、及び
tRNA。
これらの因子は、大腸菌等の原核細胞由来のものに限らず、真核細胞由来のものも使用できる。
T7 RNAポリメラーゼ
T3 RNAポリメラーゼ
SP6 RNAポリメラーゼ
反応系においてエネルギーを再生するための酵素:
クレアチンキナーゼ;
ミヨキナーゼ;及び
ヌクレオシドジホスフェートキナーゼなど
反応系においてエネルギーを再生するための酵素の基質:
クレアチンリン酸など
転写・翻訳で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素:
無機ピロホスファターゼなど
(1)目的遺伝子下流のスペーサーをコードする配列を含む。
(2)スペーサーの下流にSecMの部分配列等のアレスト配列を含む。
(3)終止コドンが除去されている。
(1)適当なライブラリーなどから、対象構成因子をコードするDNA領域を、5'UTR配列(プロモーター及びSD配列を含む)を含むプライマーと、スペーサー配列の一部を含み、終止コドンが除去されたプライマーを使用したPCRで増幅する。
(2)増幅したDNAを、5'UTR部分のプライマーと、スペーサー部分とSecM配列を含むプライマーで再度増幅する。
このように構築したDNAを必要に応じてさらに増幅し、それを鋳型としてRNAポリメラーゼで転写することにより、翻訳反応の鋳型となるmRNAを得ることができる。
i)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーから対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体のライブラリーを含有する翻訳反応産物を得て、
ii)i)で得られた翻訳反応産物に、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸を添加し、非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を産生せしめ、当該非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを得ることができる。
i’)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーから対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体のライブラリーを含有する翻訳反応産物を得て、
ii’)in vitro翻訳系により、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を含有する翻訳反応産物を得て、
iii’)i’)の翻訳反応産物をii’)の翻訳反応産物と混合し、非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを得ることができる。
(1)固相担体に固定化した標的物質に複合体を接触させる。もしくは、固相担体に捕捉される結合パートナーで標識されている標的物質に複合体を接触させ、その後に複合体と結合した標的物質を固相担体に固定化する。
(2)標的物質に結合しなかった複合体を除去する。例えば、洗浄により除去することができる。
(3)除去されなかった複合体を回収する。
(4)必要に応じ(1)から(3)の操作を複数回繰り返す。
<方法>
リボソームディスプレイ用抗TNF-α抗体遺伝子の構築
抗TNF-α抗体のH鎖及びL鎖の遺伝子は、特許第3861118号を参考に化学合成し(GenScript)、その際に、H鎖の3’末端にはFLAG tag配列+停止コドン、L鎖の3’末端にはc-Myc tag 配列を付加した。
ATGGAGGTGCAATTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCCGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAATGGGTCTCAGCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGATACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCTCGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCTTCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTGAATTCGACTATAAAGATGACGATGACAAATAATGA(配列番号1)
L chain:
ATGGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCAAGTCAGGGCATCAGAAATTACTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAGGTATAACCGTGCACCGTATACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCTCGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGATTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGGAGCAGAAGCTGATCTCTGAGGAGGATCTGCAT(配列番号2)
L chain 5’ UTR:
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaATGGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG(配列番号4)
GAGCAGAAGCTGATCTCTGAGGAGGATCTGCATGAATATCAAGGCCAATCGTCTGAC(配列番号5)
プライマーg3p-SecMstop:
CTCGAGTTATTCATTAGGTGAGGCGTTGAGGGCCAGCACGGATGCCTTGCGCCTGGCTTATCCAGACGGGCGTGCTGAATTTTGCGCCGGAAACGTCACCAATGAAAC(配列番号6)
精製したH,L鎖遺伝子DNA 1μgを20μLのIn vitro transcription Kit (RibomaxTMLarge Scale RNA Production System-T7, Promega社)によってmRNAへと変換し、カラム(RNeasy mini カラム、QIAGEN)により精製した。
タンパク質合成反応試薬であるin vitro翻訳系(PUREシステム)は既報(Shimizu et al. (2005) Methods, vol,36, p299-304)に従い調製した。
調製した反応液(10μL)に終濃度3mMの酸化型グルタチオン(GSSG:シグマ)、終濃度1μMの予め調製しておいた大腸菌DsbCタンパク質、1 pmolのL鎖-g3p mRNA、1 pmolのH鎖mRNAを加え、30℃で60分インキュベートした。
調製した反応液(5μL)に終濃度3mMの酸化型グルタチオン(GSSG:シグマ)、終濃度1μMの予め調製しておいた大腸菌DsbCタンパク質、1 pmolのL鎖-g3p mRNAを加え、30℃でインキュベートした。また同時に、調製した反応液(5μL)に終濃度3mMの酸化型グルタチオン(GSSG:シグマ)、終濃度1μMの予め調製しておいた大腸菌DsbCタンパク質、1 pmolのH鎖mRNAを加え、30℃でインキュベートした。それぞれ30分間インキュベートしたのち、それぞれの反応液を混合したのち、さらに30℃で30分間インキュベートした。
調製した反応液(10μL)に終濃度3mMの酸化型グルタチオン(GSSG:シグマ)、終濃度1μMの予め調製しておいた大腸菌DsbCタンパク質、1 pmolのL鎖-g3p mRNAを加え、30℃でインキュベートした。30分後、1 pmolのH鎖mRNA、5 pmolのリボソームを加え、さらに30℃で30分間インキュベートした。
購入したTNF-αタンパク質(TOYOBO)は、EZ-Link NHS-PEO4-Biotin(PIERCE)の標準プロトコールに従ってビオチン化した。ビオチン化したそれぞれの抗原タンパク質はSDS-PAGEによるバンドの移動度のシフトよりビオチン化が確認され、BCA Protein Assay Kit(PIERCE)を用いて濃度を決定した。
予め5 % SuperBlock(Thermo scientific)で4℃で一晩BlockingしておいたDynabeads MyOne streptavidin T1磁性体ビーズ(10μLスラリー、Invitrogen)を500 μL Wash緩衝液でMagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)を用いて2回洗浄後、1 nmol ビオチン化TNF-αタンパク質を加え、4℃で磁性体ビーズに固定化した。30分後、500 μL Wash緩衝液でMagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)を用いて3回洗浄後、回収した磁性体ビーズに翻訳反応液を加え、4℃で1時間ローテーションによって攪拌した。MagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)によって上清を廃棄し、回収した磁性体ビーズに1 mL のWash緩衝液を加え、4℃で5分ローテーションによって攪拌した。この操作を30回繰り返した後、50 μL Elution緩衝液(50 mM Tris-OAc, pH7.5、150 mM NaCl、50 mM EDTA)を回収した磁性体ビーズに加え、4℃で10分静置する事によって、複合体を磁性体ビーズから遊離させた。MagneSphere Magnetic Separation Stand(Promega)によって上清を回収し、RNeasy Micro(QIAGEN)によってmRNAを回収、精製した。
In vitro selection後、回収したmRNA 1μL、プライマーRealtime-F:GAGCAAAGCAGATTACGAGAAACAC(配列番号10)、プライマーMyc-R:CAGATCCTCCTCAGAGATCAGC(配列番号11)及びRNA-direct SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO)を含む反応液を調製し、LightCycler (Roche)を用いる標準プロトコールに従い、最終的なmRNA量を定量した。
図1に、条件1,2のそれぞれの条件で翻訳後、In vitro 選択して回収したmRNA量の比較を条件2の場合を100%として示した。その結果、mRNA回収量に、条件1と条件2では約5倍差が認められた。また、図2に、図1と同様に条件1,3のそれぞれの条件から得られたmRNA量の比較を、条件3の場合を100%として示した。その結果、条件1と条件3では約28倍の差が認められた。
この結果から、
・ライブラリー遺伝子(ここでは抗体のL鎖)のリボソームディスプレイ複合体をin vitro翻訳系でまず形成させた後で、同一チューブ内でペアタンパク質遺伝子(ここでは抗体のH鎖)を発現させることにより、或いは
・in vitro翻訳系による、ライブラリー遺伝子(ここでは抗体のL鎖)のリボソームディスプレイ複合体の形成と、ペアタンパク質遺伝子(ここでは抗体のH鎖)の翻訳を異なるチューブで行った後で、全ての翻訳産物を混合することにより、
高い効率でタンパク質多量体を含むリボソームディスプレイ複合体を形成させることができ、選択後のmRNA回収量が大幅に改善されることが示された。
Claims (28)
- 以下の工程を含む、タンパク質多量体、及び当該タンパク質多量体のいずれか1つの対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を製造する方法:
i)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸から対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体を含有する翻訳反応産物を得ること、
ii)i)で得られた翻訳反応産物に、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸を添加し、非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を産生せしめ、当該非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を得ること。 - i)のin vitro翻訳系が非対象構成因子をコードする核酸を含まない、請求項1に記載の方法。
- タンパク質多量体−核酸複合体及び対象構成因子−核酸複合体がリボソームを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- ii)において、i)で得られた翻訳反応産物にリボソームを添加する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質多量体−核酸複合体1分子につき、タンパク質多量体1分子、及び対象構成因子をコードする核酸1分子が含まれる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- in vitro翻訳系が、独立に精製された因子からなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 独立に精製された因子の少なくとも1つが原核生物から抽出された因子である、請求項6に記載の方法。
- タンパク質多量体が二量体である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質多量体が多量体として機能するものである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質多量体が抗体である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がFab断片である、請求項10に記載の方法。
- 対象構成因子がL鎖及びH鎖からなる群から選択されるいずれか一方であり、非対象構成因子が他方である、請求項10又は11に記載の方法。
- 対象構成因子をコードする核酸が、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、タンパク質多量体、及び当該タンパク質多量体のいずれか1つの対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを製造する方法:
i)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーから対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体のライブラリーを含有する翻訳反応産物を得ること、
ii)i)で得られた翻訳反応産物に、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸を添加し、非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を産生せしめ、当該非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを得ること。 - 以下の工程を含む、タンパク質多量体、及び当該タンパク質多量体のいずれか1つの対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を製造する方法:
i’)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸から対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体を含有する翻訳反応産物を得ること、
ii’)in vitro翻訳系により、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を含有する翻訳反応産物を得ること、
iii’)i’)の翻訳反応産物をii’)の翻訳反応産物と混合し、非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体を得ること。 - i’)のin vitro翻訳系が非対象構成因子をコードする核酸を含まない、請求項15に記載の方法。
- ii’)のin vitro翻訳系が対象構成因子をコードする核酸を含まない、請求項15又は16に記載の方法。
- タンパク質多量体−核酸複合体及び対象構成因子−核酸複合体がリボソームを含む、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質多量体−核酸複合体1分子につき、タンパク質多量体1分子、及び対象構成因子をコードする核酸1分子が含まれる、請求項15〜18のいずれか1項に記載の方法。
- in vitro翻訳系が、独立に精製された因子からなる、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 独立に精製された因子の少なくとも1つが原核生物から抽出された因子である、請求項20に記載の方法。
- タンパク質多量体が二量体である、請求項15〜21のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質多量体が多量体として機能するものである、請求項15〜22のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質多量体が抗体である、請求項15〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がFab断片である、請求項24に記載の方法。
- 対象構成因子がL鎖及びH鎖からなる群から選択されるいずれか一方であり、非対象構成因子が他方である、請求項24又は25に記載の方法。
- 対象構成因子をコードする核酸が、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーである、請求項15〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、タンパク質多量体、及び当該タンパク質多量体のいずれか1つの対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを製造する方法:
i’)in vitro翻訳系により、対象構成因子をコードする核酸のライブラリーから対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、対象構成因子、及び対象構成因子をコードする核酸を含む対象構成因子−核酸複合体のライブラリーを含有する翻訳反応産物を得ること、
ii’)in vitro翻訳系により、対象構成因子と共に当該タンパク質多量体を構成する非対象構成因子をコードする核酸から非対象構成因子への翻訳反応を行うことにより、非対象構成因子を含有する翻訳反応産物を得ること、
iii’)i’)の翻訳反応産物をii’)の翻訳反応産物と混合し、非対象構成因子を対象構成因子−核酸複合体に含まれる対象構成因子と会合させ、タンパク質多量体を形成させることにより、タンパク質多量体、及び対象構成因子をコードする核酸を含むタンパク質多量体−核酸複合体のライブラリーを得ること。
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