JP5850460B2 - 蛋白質ライブラリ調製を目的としたオリゴヌクレオチドライブラリの高速成熟化法 - Google Patents
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Description
成熟化の対象とする9アミノ酸をコードするコドンを含むランダムオリゴヌクレオチドライブラリの5’側にFLAG配列,3’側にミック配列を付加した状態でDNA合成した(配列番号1:ATGGACTATAAAGATGACGATGACAAAnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsGAGCAGAAGCTGATCTCTGAGGAGGATCTG)。3‘末端にFLAG配列を付加したT7プロモーターおよびSD配列を含む5’ UTR配列もDNA合成した(配列番号2:gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggactataaagatgacgatgacaaa)。M13ファージのgeneIIIの部分配列(アミノ酸残基220−326位)はM13KO7由来ファージゲノムを鋳型としてプライマーMyc−g3p(配列番号3:GAGCAGAAGCTGATCTCTGAGGAGGATCTGGAATATCAAGGCCAATCGTCTGAC)及び,プライマーg3p−SecMstop(配列番号4:CTCGAGTTATTCATTAGGTGAGGCGTTGAGGGCCAGCACGGATGCCTTGCGCCTGGCTTATCCAGACGGGCGTGCTGAATTTTGCGCCGGAAACGTCACCAATGAAAC)を用いてKOD Plus DNA Polymerase(東洋紡製)によってPCR増幅(変性:94℃,15秒;アニーリング:57℃,30秒;伸長:68℃,60秒;25サイクル)後,精製カラム(キアゲン社製)によって精製した。5’ UTR, ランダムオリゴヌクレオチドライブラリ,g3pの3種類のDNAをそれぞれ1 pmol,5’ プライマー(配列番号5:gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag) 10 pmol,SecMストップ配列(配列番号6:ggattagttattcattaggtgaggcgttgagg) 10 pmol,KOD Plus DNA ポリメラーゼ を含むPCR反応液を調製し,10サイクルのPCR反応(変性:94℃,15秒;アニーリング:57℃,30秒;伸長:68℃,60秒)を実行した。1%アガロースを用いた電気泳動によって,3遺伝子がつながったバンドを確認後,そのバンドを切り出した後カラム精製し(キアゲン製),最終的なランダム配列を含む成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリとした。
精製した成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリDNA 1μgを20μlのインビトロ転写キット(RibomaxTM Large Scale RNA Production System−T7, プロメガ社)によってmRNAとし,カラム精製した(RNeasy mini カラム,キアゲン社)。
予め5% SuperBlockで4℃において一晩ブロッキングしておいたFLAG M2 担体(50μLスラリー,シグマ社製)を500 μl Wash緩衝液でMicroSpin(登録商標)カラム(GEヘルスケア社製)を用いて2回洗浄後,回収したFLAG M2 担体に翻訳反応液を加え4℃で1時間ローテーションによって攪拌した。MicroSpin(登録商標)カラム(GEヘルスケア社製)によって上清を廃棄し,回収したFLAG M2 担体に1 mL のWash緩衝液を加え,4℃で5分ローテーションによって攪拌した。この操作を20回繰り返した後,100μlエルーション(Elution)緩衝液(50 mM Tris−OAc, pH7.5,150 mM NaCl,50 μg FLAGペプチド(シグマ社製))を回収したFLAG M2担体に加え,4℃で15分静置した。このようにして,複合体をFLAG M2担体から遊離させた。MicroSpin(登録商標)カラム(GEヘルスケア社製)によって上清を回収し,RNeasy Micro(キアゲン社製)によってmRNAを回収,精製した。
回収したmRNAはトランスクリプションハイフィデリティcDNA合成キット(ロッシュ社)によってcDNAとした後,KODプラスDNAポリメラーゼを用いてPCR反応(変性:94℃,15秒;アニーリング:57℃,30秒;伸長:68℃,60秒;20サイクル)を行った。なお,使用したプライマーを以下に示す。
Myc−R (配列番号7:CAGATCCTCCTCAGAGATCAGC)
選択前および選択後のDNA(100 ng)をrTaq DNAポリメラーゼ(東洋紡社製)によって3’末端にAを付加した。その後,TOPO TAクローニングキット(インビトロジェン社製)によってサブクローニングを行った。サブクローニングは,このキットの説明書に基づいて行った。形質転換後の大腸菌シングルコロニーをそれぞれ20コロニー3mlLB培地で培養し,増幅した大腸菌からプラスミドを回収し,塩基配列解析に使用した。
図1に,成熟化前後のランダムオリゴヌクレオチドライブラリ(NNS配列)を示す。
図1に示されるように,成熟化前の塩基配列解析の結果,ストップコドン(TAG)を含むオリゴヌクレオチドの出現頻度は40パーセント(8/20),塩基の欠失では5パーセント(1/20),塩基の挿入では0%(0/20)であり,最終的に完全なインフレームオリゴヌクレオチドの出現頻度は55%(11/20)であった。また,成熟化後においては,ストップコドン,塩基の欠失,挿入を含むものの出現頻度は0パーセント(0/20)であり,すべてのオリゴヌクレオチドがインフレームであることが確認された。この結果は,本法によるインフレームオリゴヌクレオチドの選択がほぼ完全に達成されていることを示しており,本法の有効性が証明された。
nは任意の塩基を表す。
sはグアニン又はシトシンを表す。
配列番号2:T7プロモーター,SD配列および開始コドンを含むオリゴヌクレオチド
配列番号3〜8:プライマー
Claims (8)
- 成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの5’末端にタグ配列を付加するとともに,前記成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの3’末端にリボソームの翻訳伸長を停止させるアレスト配列を付加し,前記成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの末端修飾物を得る工程と,
前記末端修飾配列物を転写させ,転写物を得る転写工程と,
前記転写物をインビトロで翻訳し、mRNA−リボソーム−オリゴペプチドの3者複合体を形成させるインビトロ翻訳工程と,
前記タグ配列を有するオリゴペプチドを含むmRNA−リボソーム−オリゴペプチドの3者複合体を選択することにより、アレスト配列まで翻訳されたインフレームのオリゴヌクレオチドを選択する工程
を含み,
前記成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリがランダムオリゴヌクレオチドライブラリである,
成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法。 - 前記ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは,NNK配列,NNS配列又はNNY配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリである請求項1に記載の方法。
- 前記リボソームの翻訳伸長を停止させるアレスト配列は,SecM配列である請求項1又は2に記載の方法。
- 前記タグ配列は,FLAG配列である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インビトロ翻訳工程は,
無細胞翻訳系を用いて前記転写物をインビトロで翻訳する工程である,
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記インビトロ翻訳工程は,
大腸菌無細胞翻訳系を用いて前記転写物をインビトロで翻訳する工程である,
請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記インビトロ翻訳工程は,
再構成型無細胞翻訳系を用いて前記転写物をインビトロで翻訳する工程である, 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記タグ配列に対する抗体を用いて、前記タグ配列を有するオリゴペプチドを含むmRNA−リボソーム−ポリペプチド3者複合体を選択する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
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