FR2751347A1 - Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides - Google Patents
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Abstract
Gène chimère à plusieurs gènes de tolérance herbicide, cellule végétale et plante tolérantes à plusieurs herbicides. Elle est tolérante à la fois à plusieurs herbicides, notamment aux inhibiteurs de l'HPPD et à ceux de l'EPSPS et/ou aux dihalogénohydroxybenzonitriles. Utilisation pour le désherbage de plantes avec plusieurs herbicides.
Description
Gène chimère à plusieurs gènes de tolérance herbicide, cellule végétale et plante
tolérantes à plusieurs herbicides.
tolérantes à plusieurs herbicides.
La présente invention a pour objet un gène chimère à plusieurs gènes de tolérance herbicide, une cellule végétale et une plante tolérantes à plusieurs herbicides.
Dans la suite de la description, les herbicides seront désignés selon le nom commun en particulier référencé dans "The Pesticide Manual" 10 th edition par British Crop Protection
Council.
Council.
On connaît des plantes qui ont été transformées pour être tolérantes à certains herbicides comme notamment les dihaîogenohydroxybenzonitriles, en particulier le bromoxynil et l'ioxynil, grâce au gène codant pour la nitrilase dégradant ces herbicides ou encore celles tolérantes aux herbicides inhibiteurs de 1'EPSPS notamment le glyphosate, le sulfosate ou la fosametine ou encore aux inhibiteurs de l'aeétolactatesynthase (ALS) du type des sulfonylurées ou encore aux inhibiteurs de la dihydro-pteroate synthase tel que l'asulam ou encore aux inhibiteurs de la glutamine synthase tels que le glufosinate.
On connaît certains herbicides tels que les isoxazoles décrites notamment dans les demandes de brevets français 95 06800 and 95 13570 et notamment l'isoxaflutole, herbicide sélectif du mais, les dicétonitriles tels que ceux décrits dans les demandes européennes 0 496 630, 0 496 631, en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl- 1-(2-SO2 CH34-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2 CH3-4-2,3 C12 phényl) propane-l, 3-dione, les tricétones décrites dans les demandes européennes 0 625 505 et 0 625 508, en particulier la sulcotrione ou encore celles décrites dans l'USP 5 506 195, ou encore les pyrazolinates. De plus le gène codant pour 1'HPPD conférant une tolérance à ces derniers herbicides a été isolé et des plantes transgéniques le contenant obtenues montrant une tolérance significative et font l'objet des demandes françaises non publiées N"95/06800, 95/13570 et 96/05944.
Cependant la pratique agricole montre que les agriculteurs aiment disposer pour le traitement des plantes, et notamment des cultures, d'associations d'herbicides en particulier pour répondre à différents problèmes de désherbage dûs aux limites du spectre des herbicides pris isolément. I1 peut être en outre intéressant de disposer d'un gène de marquage de sélection associé à un gène de tolérance herbicide. 11 y a donc un besoin de plantes et notamment de cultures présentant une tolérance à plusieurs herbicides, de préférence au moins deux ou trois.
Il a maintenant été découvert qu'on pouvait conférer à une cellule végétale et donc à une plante un tolérance herbicide multiple.
La présente invention a pour objet un gène chimère comprenant au moins deux gènes chimères élémentaires contenant chacun , dans le sens de la transcription, des éléments de régulation nécessaires à sa transcription dans les plantes c'est à dire au moins une séquence de régulation promotrice, au moins une partie codante hétérologue comprenant une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation.
Comme séquence codante, on peut notamment utiliser toutes celles connues pour conférer la tolérance de plantes à certains inhibiteurs telles que: - celle de l'EPSPS pour la tolérance au glyphosate, au sulfosate ou à la fosamétine, notamment celles de la protéine mutée ou non, on peut citer notamment les brevets;
- USP 4 535 060, EP 115 673, USP 4 769 061, USP 5 094 945; USP 4 971 908, USP 5 145 783, EP 293 358; EP 378 985 , WO 91/04323; WO 92 044 449; WO 9206201. Dans la suite ce type de gène sera désigné par séquence ou gène "EPSPS".
- USP 4 535 060, EP 115 673, USP 4 769 061, USP 5 094 945; USP 4 971 908, USP 5 145 783, EP 293 358; EP 378 985 , WO 91/04323; WO 92 044 449; WO 9206201. Dans la suite ce type de gène sera désigné par séquence ou gène "EPSPS".
On peut également citer la glyphosate oxydoréductase (cf WO 92/ 000 377) enzyme de détoxification du glyphosate.
- celle du gène de la nitrilase de Klebsiella sp. pour la tolérance aux dihalogénobenzonitriles décrite dans 1'USP 4 810 648 et en particulier celui issu de Klebsiella ozaenae, qui sera désigné dans la suite par gène ou séquence "OXY".
- celle de l'HPPD telle décrite dans les demandes françaises non publiées N"95/06800, 95/13570 et 96/05944 citées ci-dessus. Cette HPPD peut être de toute nature.
Plus particulièrement cette séquence peut être d'origine bactérienne, telle que notamment le genre Pseudomonas ou encore d'origine végétale, telle que notamment de plante monocotylédone ou dicotylédone, notamment d'Arabidopsis ou d'ombelliferes comme par exemple la carotte (Daucus carota). Elle peut être native ou sauvage ou éventuellement mutée tout en gardant fondamentalement une propriété de tolérance herbicide contre les inhibiteurs de 1'HPPD, tels que les herbicides de la famille des isoxazoles ou de celle des tricétones ou des pyrazolinates.
D'autres séquences peuvent être utilisées:
- celle de la phosphinotrycine acétyl transférase ou celle de la glutamine
syntahse pour la tolérance au glufosinate (cf EP 0 242 236)
- celle de la dihydroptéroate synthase pour la tolérance à l'asulam (cf EP 0 369
367)
- celle de l'ALS pour la tolérance aux sulfonylurées
- celle de la Protoporphyrogen oxydase ("protox") pour la tolérance aux herbicides de la tamille des diphényléthers tels que l'acifluorfen ou l'oxyfluorfen ou celle des oxadiazoles tels que ltoxadiazon ou l'oxadiargyl ou celle des imides cycliques tels que le chlorophthalim ou celle des phénylpyrrazoles tel que le TNP ou celles des pyridines et les phénopylates et analogues carbamates (cf WO 95/34659).
- celle de la phosphinotrycine acétyl transférase ou celle de la glutamine
syntahse pour la tolérance au glufosinate (cf EP 0 242 236)
- celle de la dihydroptéroate synthase pour la tolérance à l'asulam (cf EP 0 369
367)
- celle de l'ALS pour la tolérance aux sulfonylurées
- celle de la Protoporphyrogen oxydase ("protox") pour la tolérance aux herbicides de la tamille des diphényléthers tels que l'acifluorfen ou l'oxyfluorfen ou celle des oxadiazoles tels que ltoxadiazon ou l'oxadiargyl ou celle des imides cycliques tels que le chlorophthalim ou celle des phénylpyrrazoles tel que le TNP ou celles des pyridines et les phénopylates et analogues carbamates (cf WO 95/34659).
De préférence l'un des gènes chimères contient une séquence codante de l'HPPD. Dans ce cas l'autre ou les autres séquences peuvent être quelconques. De préférence les autres séquences sont choisies dans le groupe comprenant le gène de la nitrilase de tolérance aux dihalogénohydroxybenzonitriles et un gène EPSPS.
Comme séquence de régulation promotrice on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou de celui d'un gène de l'oc tubuline (Demande européennne EP n" 0 652 286), ou encore d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CaMV 19S ou 35S), mais tout promoteur convenable connu peut être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP 0507698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de trancription "enhancer", comme par exemple l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV) décrit dans la demande W087/07644, ou des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, constituée d'une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande européenne n" 0 508 909.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP n" 0 633 317.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules végétales par intégration d'au moins deux gènes, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les demandes et brevets cités dans la présente demande.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Selon l'invention ces ADN peuvent être portés par les memes particules ou par des bombardements différents.
Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation.
L'homme de métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de la plante, notamment de son caractère monocotylédone ou dicotylédone.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales, de plantes monocotylédones ou dicotylédones, notamment des cultures, transformées selon l'un des procédés décrits ci-dessus et contenant dans leur génome une quantité efficace d'un gène exprimant l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD). On a observé que des plantes transformées de cette façon présentent une tolérance importante à certains herbicides récents tels que les isoxazoles décrites notamment dans les demandes de brevets français 9506800 and 95 13570 et notamment du 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl) benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole,ou "isoxaflutole", herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles tels que ceux décrits dans les demandes européennes 0 496 630, 0 496 631, en particulier la 2-cyano-3 cyclopropyl- l-(2-SO2 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl1-(2-S02 CH3-4-2,3 Cl2 phényl) propane- 1, 3-dione, les tricétones décrites dans les demandes européennes 0 625 505 et 0 625 508, en particulier la sulcotrione et les pyrazinolates.
La présente invention a encore pour objet les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les demandes ci-dessus. Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents, chacun d'eux portant l'un des gènes de tolérance herbicide décrites.
L'invention a enfin pour objet un procédé de désherbage de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un herbicide de ce type, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.
Selon l'invention l'un des gènes de tolérance herbicides présents dans les plantes peut être utilisé comme marqueur de sélection.
Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.
Exemple I: Isolement du gène de l'HPPD de P. fluorescens A32 .
A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 ( publié par Rüetschi U. et al. 1992. Eur. J. Biochem. 205: 459-466), on déduit la séquence de différents oligonucléotides pour amplifier par PCR une partie de la séquence codante de l'HPPD de P. fluorescens A32 (isolée par McKellar, R.C. 1982. J. Appl Bacteriol. 53:305316). Un fragment d'amplification du gène de cette HPPD a été utilisé pour cribler une banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et ainsi isoler le gène codant pour cette enzyme.
A) Préparation de l'ADN génomique de P. fluorescens A32.
La bactérie a été cultivée dans 40 ml de milieu minimum M63 (KH2P04 13,6g/l, (NH4)2S04 2g/l, MgSO4 0,2g/l, FeSO4 0,005 g/l pH7 plus L-tyrosine 10mM comme seule source de carbone) à 28"C pendant 48 heures.
Après lavage, les cellules sont reprises dans 1 ml de tampon de lyse (tris HCl 100 mM pH 8,3, NaCI 1,4 M et EDTA 10 mM) et incubées 10 minutes à 65"C. Après un traitement au phénol/chloroforme (24/1) et un traitement au chloroforme, les acides nucléiques sont précipités par addition d'un volume d'isopropanol puis repris dans 300 pI d'eau stérile et traités à la RNAse 10 pg/ml final. L'ADN est de nouveau traité au phénol/chloroforme, chloroforme et reprécipité par addition de 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M pH5 et 2 volumes d'éthanol. L'ADN est ensuite repris dans de l'eau stérile et dosé.
B) Choix des oligonucléotides et synthèses.
A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 on choisit cinq oligonucléotides, deux dirigés dans le sens NH2 terminal de la protéine vers le COOH terminal de la protéine et trois dirigés dans le sens inverse (voir figure 1). Le choix a été dicté par les deux règles suivantes:
-une extrémité 3' de l'oligonucléotide stable, c'est à dire au moins deux bases sans ambiguité.
-une extrémité 3' de l'oligonucléotide stable, c'est à dire au moins deux bases sans ambiguité.
-une dégénérescence la plus faible possible.
Les oligonucléotides choisis ont les séquences suivantes:
P1: 5'TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG3'
P2: 5 'GA(G/A)ACIGGICClATGGA3'
P3: 5'AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3'
P4: 5 'AAIGClAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3'
P5: 5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCICC3'
Ils ont été synthétisés sur le synthétiseur "Cyclone plus DNA Synthesizer" de marque
MILLPORE.
P1: 5'TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG3'
P2: 5 'GA(G/A)ACIGGICClATGGA3'
P3: 5'AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3'
P4: 5 'AAIGClAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3'
P5: 5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(C/T)TCICC3'
Ils ont été synthétisés sur le synthétiseur "Cyclone plus DNA Synthesizer" de marque
MILLPORE.
Avec ces cinq oligonucléotides par PCR les fragments d'amplification que l'on doit obtenir théoriquement d'après la séquence SEQ ID N l ont les tailles suivantes: avec les amorces PI et P3
environ 690 bp avec les amorces PI et P4
environ 720 bp avec les amorces PI et P5
environ 1000 bp avec les amorces P2 et P3
environ 390 bp avec les amorces P2 et P4
environ 420 bp avec les amorces P2 et P5
environ 700 bp
C) Amplification d'une partie codante de l'HPPD de P. fluorescens A32.
environ 690 bp avec les amorces PI et P4
environ 720 bp avec les amorces PI et P5
environ 1000 bp avec les amorces P2 et P3
environ 390 bp avec les amorces P2 et P4
environ 420 bp avec les amorces P2 et P5
environ 700 bp
C) Amplification d'une partie codante de l'HPPD de P. fluorescens A32.
Les amplifications ont été faites sur un appareil PCR PERKIN ELMER 9600 et avec la
Taq polymérase PERKIN ELMER avec son tampon dans les conditions standards, c'est à
dire pour 50Cll de réaction il y a les dNTP à 2OOpM, les primers à 20 M, la Taq polymérase
2,5 unités et 1' ADN de P. fluorescens A32 2,5 llg.
Taq polymérase PERKIN ELMER avec son tampon dans les conditions standards, c'est à
dire pour 50Cll de réaction il y a les dNTP à 2OOpM, les primers à 20 M, la Taq polymérase
2,5 unités et 1' ADN de P. fluorescens A32 2,5 llg.
Le programme d'amplification utilisé est, 5 min à 950C puis 35 cycles < 45 sec 95"C, 45
sec 49"C, 1 min 72"C > suivis de 5 min à 72"C.
sec 49"C, 1 min 72"C > suivis de 5 min à 72"C.
Dans ces conditions, tous les fragments d'amplification obtenus ont une taille
compatible avec les tailles théoriques données au-dessus, ce qui est une bonne indication de
la spécificité des amplifications.
compatible avec les tailles théoriques données au-dessus, ce qui est une bonne indication de
la spécificité des amplifications.
Les fragments d'amplifications obtenus avec les jeux d'amorces P1/P4, P1/P5 et P2/P4
sont ligués dans pBSII SK(-) après digestion de ce plasmide par Eco RV et traitement à la terminal transférase en présence de ddTTP comme décrit dans HOLTON T.A. and
GRAHAM M.W. 1991. N.A.R. vol 19, n 5 pu 156.
sont ligués dans pBSII SK(-) après digestion de ce plasmide par Eco RV et traitement à la terminal transférase en présence de ddTTP comme décrit dans HOLTON T.A. and
GRAHAM M.W. 1991. N.A.R. vol 19, n 5 pu 156.
Un clone de chacun des trois types est séquencé partiellement; ceci permet de confirmer
qu'on a bien amplifié dans les trois cas une partie de la région codante de l'HPPD de P.
qu'on a bien amplifié dans les trois cas une partie de la région codante de l'HPPD de P.
fluorescens A32. Le fragment P1/P4 est retenu comme sonde pour cribler une banque
génomique partielle de P. fluorescens A32 et isoler le gène complet de l'HPPD.
génomique partielle de P. fluorescens A32 et isoler le gène complet de l'HPPD.
D) Isolement du gène.
Par Southern on montre qu'un fragment de 7 Kbp après digestion de l'ADN de P.
fluorescens A32 par l'enzyme de restriction BamHI s'hybride avec la sonde HPPD P1/P4. On a donc fait digérer 400,ug d'ADN de P. fluorescens A32 par l'enzyme de restriction BamHI et purifier sur gel d'agarose les fragments d'ADN faisant environ 7Kbp.
Ces fragments sont ligués dans pBSII SK(-), lui-même digéré par Bam HI et déphosphorylé par traitement à la phosphatase alcaline. Après transformation dans E. coli
DHlOb, la banque génomique partielle est criblée avec la sonde HPPD P1/P4.
DHlOb, la banque génomique partielle est criblée avec la sonde HPPD P1/P4.
Un clone positif a été isolé et appelé pRP A. Sa carte simplifiée est donnée figure 2. Sur cette carte est indiqué la position de la partie codante du gène HPPD. Elle est composée de
1077 nucléotides qui codent pour 358 acides aminés (voir SEQ ID N 1 ). L'HPPD de P.
1077 nucléotides qui codent pour 358 acides aminés (voir SEQ ID N 1 ). L'HPPD de P.
fluorescens A32 présente une bonne homologie en acides aminés avec celle de Pseudomonas sp. strain P.J. 874, il y a en effet 92% d'identité entre ces deux protéines ( voir figure 3 ).
Exemple 2 : Construction de deux gènes chimères avec une séquence HPPD.
Pour conférer la tolérance de plantes aux herbicides inhibant l'HPPD, on construit deux gènes chimères:
Le premier consiste à mettre la partie codante du gène de l'HPPD de P. fluorescens A32 sous le contrôle du promoteur double histone (Demande de Brevet européen N" 0 507 698) suivi du Tobacco etch virus translational enhancer (TEV) (pRTL-GUS (Carrington and
Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) avec le terminateur du gène de la nopaline synthase.
Le premier consiste à mettre la partie codante du gène de l'HPPD de P. fluorescens A32 sous le contrôle du promoteur double histone (Demande de Brevet européen N" 0 507 698) suivi du Tobacco etch virus translational enhancer (TEV) (pRTL-GUS (Carrington and
Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) avec le terminateur du gène de la nopaline synthase.
L'HPPD sera alors localisée dans le cytoplasme.
Le deuxième sera identique au premier, à ceci près qu'entre l'activateur de translation
TEV et la partie codante de l'HPPD, on intercale le peptide de transit optimisé (OTP) (Demande européenne EP n 0 508 909). L'HPPD sera alors localisée dans le chloroplaste.
TEV et la partie codante de l'HPPD, on intercale le peptide de transit optimisé (OTP) (Demande européenne EP n 0 508 909). L'HPPD sera alors localisée dans le chloroplaste.
A) Construction du vecteur pRPA-RD-153:
- pRPA-RD- 1 1 Un dérivé de pBS-II SK(-) (Stratagene catalog #212206) contenant le site de polyadenylation de la nopaline synthase (NOS polyA) (Demande européennne n 0 652 286) est cloné entre les sites XpnI et Sali. Le site KpnI est transformé en un site NotI par traitement avec la T4 ADN polymerase I en présence de 150 ,uM de deoxynucleotide triphoshates puis ligation avec un linker NotI (Stratagene catalog #1029). Ainsi on obtient une cassette de clonage NOS poly A.
- pRPA-RD- 1 1 Un dérivé de pBS-II SK(-) (Stratagene catalog #212206) contenant le site de polyadenylation de la nopaline synthase (NOS polyA) (Demande européennne n 0 652 286) est cloné entre les sites XpnI et Sali. Le site KpnI est transformé en un site NotI par traitement avec la T4 ADN polymerase I en présence de 150 ,uM de deoxynucleotide triphoshates puis ligation avec un linker NotI (Stratagene catalog #1029). Ainsi on obtient une cassette de clonage NOS poly A.
- pRPA-RD-127: Un dérivé de pRPA-BL-466 (Demande européenne EP n 0 337 899) cloné dans pRPA-RD- 1 1 créant une cassette d'expression du gène oty et contenant le promoteur de la petite sous unité de la ribulose-biscarboxylase:
"promoteur (SSU) - oxy gene - NOS polyA"
Pour créer ce plasmide, pRPA-BL-488 a été digéré avec XbaI et Hindi pour isoler un fragment de 1.9 kpb contenant le promoteur SSU et le gène oty, qui a été ligué dans le plasmide pRPA-RD- 1 1 digéré avec des enzymes compatibles.
"promoteur (SSU) - oxy gene - NOS polyA"
Pour créer ce plasmide, pRPA-BL-488 a été digéré avec XbaI et Hindi pour isoler un fragment de 1.9 kpb contenant le promoteur SSU et le gène oty, qui a été ligué dans le plasmide pRPA-RD- 1 1 digéré avec des enzymes compatibles.
- pRPA-RD-132: C'est un dérivé de pRPA-BL-488 (Demande européenne EP n 0 507 698) cloné dans pRPA-RD-127 avec création d'une cassette d'expression du gène oxy avec le promoteur double histone:
" promoteur double histone - ov gène - NOS polyA"
Pour fabriquer ce plasmide, pRPA-BL-466 est digéré par HindIII, traité par la Klenow puis redigéré avec NcoI. Le fragment de 1.35 kbp purifié contenant le promoteur double histone H3A748 est ligué avec le plasmide pRPA-RD-127 qui avait été digéré par XbaI, traité Klenow et redigéré par NcoI.
" promoteur double histone - ov gène - NOS polyA"
Pour fabriquer ce plasmide, pRPA-BL-466 est digéré par HindIII, traité par la Klenow puis redigéré avec NcoI. Le fragment de 1.35 kbp purifié contenant le promoteur double histone H3A748 est ligué avec le plasmide pRPA-RD-127 qui avait été digéré par XbaI, traité Klenow et redigéré par NcoI.
- pRPA-RD-153: C'est un derivé de pRPA-RD-132 contenant l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV). pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590 1597) est digéré avec Ncol et EcoRI et le fragment de 150 bp est ligué dans pRPA-RD-132 digéré avec les mêmes enzymes. Donc on a créé une cassette d'expression contenant le promoteur:
"double histone promoteur - TEV -oxy u - NOS polyA"
B) Construction du vecteur pRPA-RD-185:
pUCl9/GECA: Un dérivé de pUC-l9 (Gibco catalog #15364-011) contenant de nombreux sites de clonage. pUC-19 est digéré avec EcoRI et ligué avec l'oligonucleotide linker 1:
Linker 1: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG
CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTOGGAT CCCCCGGGC TTAA
Le clone sélectionné contient un site EcoRI suivi du polylinker qui contient les sites suivants: EcoRI,Apal,AvrII,PmeI,SfiI,SacI,KpnI,SmaI,BamHI,XbaI,SalI,PstI,SphI et
HindIII.
"double histone promoteur - TEV -oxy u - NOS polyA"
B) Construction du vecteur pRPA-RD-185:
pUCl9/GECA: Un dérivé de pUC-l9 (Gibco catalog #15364-011) contenant de nombreux sites de clonage. pUC-19 est digéré avec EcoRI et ligué avec l'oligonucleotide linker 1:
Linker 1: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG
CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTOGGAT CCCCCGGGC TTAA
Le clone sélectionné contient un site EcoRI suivi du polylinker qui contient les sites suivants: EcoRI,Apal,AvrII,PmeI,SfiI,SacI,KpnI,SmaI,BamHI,XbaI,SalI,PstI,SphI et
HindIII.
pRPA-RD-185: c'est un dérivé de pUC19/GECA contenant un polylinker modifié.
pUC 1 9/GECA est digéré par Hindi et ligué avec l'oligonucleotide linker 2:
Linker2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCTGGTTCAGGG
AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA
Le clone sélectionné contient un site Hindlll site au milieu du polylinker qui contient maintenant les sites suivants: EcoRI,ApaI,AvrII,PmeI,SfiI,SacI,KpnI,SmaI,BamHI,
XbaI,SalI,PstI,SphI,HindIII,PacI,AscI XhoI et EcoNI.
Linker2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCTGGTTCAGGG
AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA
Le clone sélectionné contient un site Hindlll site au milieu du polylinker qui contient maintenant les sites suivants: EcoRI,ApaI,AvrII,PmeI,SfiI,SacI,KpnI,SmaI,BamHI,
XbaI,SalI,PstI,SphI,HindIII,PacI,AscI XhoI et EcoNI.
C) Construction du vecteur pRP T:
- pRP O: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de 1'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - terminateur Nos. Pour fabriquer pRP O, pRPA-RD153 est digéré par Hind m, traité par la Klenow puis redigéré par NcoI pour enlever le gène ony et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide pRP A par digestion
BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par NcoI.
- pRP O: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de 1'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - terminateur Nos. Pour fabriquer pRP O, pRPA-RD153 est digéré par Hind m, traité par la Klenow puis redigéré par NcoI pour enlever le gène ony et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide pRP A par digestion
BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par NcoI.
- pRP R: pour l'obtenir le plasmide pRP O a été digéré par PvuII et Saci, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pRPA-RD- 185 lui-même digéré par PvuII et SacI.
- pRP T: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP R après digestion par
SacI et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 digéré par les mêmes enzymes (Demande européenne EP n 0 508 909).
SacI et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 digéré par les mêmes enzymes (Demande européenne EP n 0 508 909).
Le gène chimère du vecteur pRP T a donc la structure suivante:
<tb> Promoteur <SEP> double <SEP> histone <SEP> TEV <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> I'HPPD <SEP> | <SEP> Terminateur
<tb>
D) Construction du vecteur pRP V
- pRP P: c'est un dérivé de pRPA-RD-7 (Demande européennne EP n 0 652 286) contenant le peptide de transit optimisé suivi du gène de l'HPPD. Il a été obtenu par ligation de la partie codante de l'HPPD sorti de pRP A par digestion BstEII et NcoI, traitement à la
Klenow et du plasmide pRPA-RD-7 lui-même digéré SphI et AccI et traité à la DNAse polymérase T4.
<tb>
D) Construction du vecteur pRP V
- pRP P: c'est un dérivé de pRPA-RD-7 (Demande européennne EP n 0 652 286) contenant le peptide de transit optimisé suivi du gène de l'HPPD. Il a été obtenu par ligation de la partie codante de l'HPPD sorti de pRP A par digestion BstEII et NcoI, traitement à la
Klenow et du plasmide pRPA-RD-7 lui-même digéré SphI et AccI et traité à la DNAse polymérase T4.
- pRP Q: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - OTP - gène HPPD - terminateur Nos. Pour le construire le plasmide pRPA-RD-153 est digéré par Sal I, traité par la Klenow puis redigéré par NcoI pour enlever le gène oxy et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide pRP P par digestion BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par NcoI.
- pRP S: pour l'obtenir, le plasmide pRP Q a été digéré par PvuII et SacI pour sortir le gène chimère qui a été ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvuII et Saci.
- pRP V: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP S après digestion par
SacI et Hindm dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 (Demande européennne EP n 0 508 909).
SacI et Hindm dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 (Demande européennne EP n 0 508 909).
Le gène chimère du vecteur pRP Q a donc la structure suivante:
<tb> Promoteur <SEP> double <SEP> TEV <SEP> OTP <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> 1'HPPD <SEP> Terminateur <SEP> nos
<tb> <SEP> histone
<tb>
Exemple 3 : Transformation du tabac industriel PBD6.
<tb> <SEP> histone
<tb>
Exemple 3 : Transformation du tabac industriel PBD6.
Afin de déterminer l'efficacité de ces deux gènes chimériques, ceux-ci ont été transférés dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n 0 508 909.
1) Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101 (Hood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291(Komari et al,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh R. et al. (1985) Science, 227, 1229-1231.
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101 (Hood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291(Komari et al,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh R. et al. (1985) Science, 227, 1229-1231.
2) Régénération:
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/l de saccharose ainsi que 100 pg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires(Science 1985,Vol 227, p.1229-1231) en trois étapes successives:la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu
MS additionné de 30 g/l de saccharose mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours.
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/l de saccharose ainsi que 100 pg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires(Science 1985,Vol 227, p.1229-1231) en trois étapes successives:la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu
MS additionné de 30 g/l de saccharose mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours.
Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre. Les plantes obtenues sont appellées Co 17.
Au sortir de l'in-vitro, les plantules de tabac transformées ont été acclimatées à la serre (60% d'humidité relative; température: 20"C la nuit et 23"C la jour) pendant cinq semaines puis traitées au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl) benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole.
Le tabac témoin, non transformé et traité au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl)benzoyl]-5- cyclopropyl isoxazole à des doses allant de 50 à 400 g/ha, développe en environ 72 heures des chloroses, qui s'intensifient pour évoluer vers des nécroses très prononcées en une semaine (couvrant environ 80% des feuilles terminales).
Après transformation ce même tabac, qui surexprime l'HPPD de P. fluorescens, est très bien protégé contre un traitement au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl) benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole à la dose de 400 g/ha.
Si l'enzyme surexprimée est dans le chloroplaste, c'est à dire si la transformation a été faite avec le gène porté par le vecteur pRP V, alors la plante est parfaitement protégée, ne présente aucun symptôme.
Exemple 4: Transformation du tabac industriel PBD6. avec gène EPSPS pour > construction 173
Isolement d'un ADNc codant pour une EPSPS de maïs:
Les différentes étapes, qui ont conduit à l'obtention de l'ADNc d'EPSPS de maïs, qui a servi de substrat à l'introduction des deux mutations, sont décrites ci-dessous. Toutes les opérations décrites ci-dessous sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in
Molecular Biology" Volumes I et 2, Ausubel F.M. et ai , publiés par Greene Publishing
Associates et Wiley -Interscience (1989)(Par la suite, les références à des protocoles décrits dans cet ouvrage seront notées "réf. CPMB"). Les opérations concernant l'ADN, qui ont été effectuées selon les protocoles décrits dans cet ouvrage sont, en particulier les suivantes: ligation de fragments d'ADN, traitements par l'ADN polymérase de Klénow et la T4 ADN polymérase, préparation d'ADN de plasmides et de bactériophages X soit en mi
Isolement d'un ADNc codant pour une EPSPS de maïs:
Les différentes étapes, qui ont conduit à l'obtention de l'ADNc d'EPSPS de maïs, qui a servi de substrat à l'introduction des deux mutations, sont décrites ci-dessous. Toutes les opérations décrites ci-dessous sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in
Molecular Biology" Volumes I et 2, Ausubel F.M. et ai , publiés par Greene Publishing
Associates et Wiley -Interscience (1989)(Par la suite, les références à des protocoles décrits dans cet ouvrage seront notées "réf. CPMB"). Les opérations concernant l'ADN, qui ont été effectuées selon les protocoles décrits dans cet ouvrage sont, en particulier les suivantes: ligation de fragments d'ADN, traitements par l'ADN polymérase de Klénow et la T4 ADN polymérase, préparation d'ADN de plasmides et de bactériophages X soit en mi
Deux oligonucleotides simples brins et partiellement complémentaires de séquences respectives:
5'- AATTCCCGGG -3'
5'- CCCGGG- 3' (ce dernier étant phosphorylé)
sont ligués avec les ADNc double brin à extrémités franches.
5'- AATTCCCGGG -3'
5'- CCCGGG- 3' (ce dernier étant phosphorylé)
sont ligués avec les ADNc double brin à extrémités franches.
Cette ligation des adaptateurs résulte en la création de sites Sma I accolés aux ADNc double brin et EcoRI sous forme cohésive à chaque extrémité des ADNc double brin.
d) Création de la bibliothèque:
Les ADNc présentant à leurs extrémités les sites artificiels cohésifs EcoRI sont
ligués avec le ADNc du bactériophage hgtl0 coupé par EcoRI et déphosphorylé
selon le protocole du fournisseur New England Biolabs.
Les ADNc présentant à leurs extrémités les sites artificiels cohésifs EcoRI sont
ligués avec le ADNc du bactériophage hgtl0 coupé par EcoRI et déphosphorylé
selon le protocole du fournisseur New England Biolabs.
Une aliquote de la réaction de ligation a été encapsidée in vitro avec des extraits
d'encapsidation: Gigapack Gold selon les instructions du fournisseur, cette librairie
a été titrée en utilisant la bactérie E.coli C6Oohfl. la librairie ainsi obtenue est
amplifiée et stockée selon les instructions du même fournisseur et constitue la
librairie de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS.
d'encapsidation: Gigapack Gold selon les instructions du fournisseur, cette librairie
a été titrée en utilisant la bactérie E.coli C6Oohfl. la librairie ainsi obtenue est
amplifiée et stockée selon les instructions du même fournisseur et constitue la
librairie de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS.
3. Criblage de la bibliothèque de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana:
Le protocole suivi est celui de "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et ai , publiés par Greene Publishing Associates et S (1989)(CPMB). En bref, environ 106 phages recombinants sont étalés sur boîte LB à une densité moyenne de 100 phages /cm2 Les plages de lyses sont répliqués en doubles sur membrane Hybond N d'Amersham.
Le protocole suivi est celui de "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et ai , publiés par Greene Publishing Associates et S (1989)(CPMB). En bref, environ 106 phages recombinants sont étalés sur boîte LB à une densité moyenne de 100 phages /cm2 Les plages de lyses sont répliqués en doubles sur membrane Hybond N d'Amersham.
h) L'ADN a été fixé sur les filtres par traitement UV 1600kJ (Stratalinker de
Stratagene). Les filtres iont été préhydridés dans: 6xSSC/0,1%SDS/0,25 lait écrémé pendant 2h à 65"C. La sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été marquée au 32P-dCTP par "random-priming" selon les instructions du fournisseur (Kit Ready to Go de Pharmacia).
Stratagene). Les filtres iont été préhydridés dans: 6xSSC/0,1%SDS/0,25 lait écrémé pendant 2h à 65"C. La sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été marquée au 32P-dCTP par "random-priming" selon les instructions du fournisseur (Kit Ready to Go de Pharmacia).
L'activité spécifique obtenue est de l'ordre de 108 cpm par Hg de fragment. Après dénaturation pendant 5 min à 100"C, la sonde est ajoutée dans le milieu de préhybridation et l'hybridation est poursuivie pendant 14 heures à 55"C. Les filtres sont fluorographiés 48h à 80"C avec un film Kodak XAR5 et des écrans renforçateurs Hyperscreen RPN d'Amersham.
L'alignement des spots positifs sur le filtre avec les boîtes d'où ils sont issus permet de prélever, sur la boîte, des zones correspondant aux phages présentant une réponse d'hybridation positive avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Cette étape d'étalement, transfert, hybridation, récupération est répétée jusqu'à ce que tous les spots de la boîte des phages successivement purifiés se révèlent positifs à 100% en hybridation. Une plage de lyse par phage indépendant est alors prélevée dans du milieu X diluant (Tris-Cl pH= 7,5; MgSO4 l0mM; NaCI 0,1M; gélatine 0,1%), ces phages en solution constituant les clones positifs de
I' EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS.
I' EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS.
4. Préparation et analyse de l'ADN des clones d'EPSPS de la suspension cellulaire de maïs BMS.
On ajoute environ 5.108 phages à 20 ml de bactéries C600hfl à 2 OD 600nm/ml et incubés 15 minutes à 37"C. Cette suspension est alors diluée dans 200ml de milieu de croissance des bactéries dans un Erlen de 1 1 et agitée dans un agitateur rotatif à 250 rpm. La lyse est constatée par clarification du milieu, correspondant à 1 lyse des bactéries turbides et se produit après environ 4 h d'agitation. Ce surnageant est alors traité comme décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". L'ADN obtenu correspond aux clones d'EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS.
Un à deux tag de cet ADN sont coupés par EcoRI et séparés sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) à 0,8%. Une dernière vérification consiste à s'assurer que 1' ADN purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana.
Après l'électrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur membrane Hybond N d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Current Protocols in Molecular
Biology". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone présentant un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana et contenant le plus long fragment EcoRI a une taille estimée sur gel à environ 1,7kpb.
Biology". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone présentant un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana et contenant le plus long fragment EcoRI a une taille estimée sur gel à environ 1,7kpb.
5. Obtention du clone pRPA-ML-711:
Dix pg de l'ADN du clone phagique contenant l'insert de 1,7kpb sont digérés par EcoRI et séparés sur gel d'agarose LGTAJTBE (réf. CPMB) à 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert de 1,7kpb est excisé du gel par coloration BET et le fragment est traité à la ,B-agarase selon le protocole du fournisseur New a Biolabs. L'ADN purifié du fragment de 1,7kpb est ligué à 12"C pendant 14h avec l'ADN du plasmide pUC 19 (New England Biolabs) coupé par EcoRI selon le protocole de ligation décrit dans "Current Protocols in Molecular
Biology". Deux pi du mélange de ligation ci-dessus sont utilisés pour la transformation d'une aliquote d'E.coli DH1OB électro compétentes; la transformation se fait par électroporation en utilisant les conditions suivantes: le mélange de bactéries compétentes et de milieu de ligation est introduit dans une cuvette d'électroporation d'épaisseur 0,2 cm (Biorad) prélablement refroidie à 0 C. Les conditions physiques de l'électroporation utilisant un électroporateur de marque Biorad sont 2500 Volts, 25 IlFarad et 200 fl. Dans ces conditions, le temps de décharge moyen de condensateur est de l'ordre de 4,2 millisecondes. Les bactéries sont alors reprises dans 1 ml de milieu SOC (réf. CPMB) et agitées pendant 1 heure à 200 rpm sur un agitateur rotatif dans des tubes Corning de 15 ml. Après étalement sur milieu LB/agar supplémenté à 100 Clg/ml de carbéniciline, les mini-préparations des clones bactériens ayant poussé après une nuit à 37 "C est réalisée selon le protocole décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". Après digestion par EcoRI de l'ADN et séparation en électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) à 0,8%, les clones présentant un insert de 1,7kpb sont conservés. Une dernière vérification consiste à s'assurer que 1' ADN purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Après l'électrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur membrane Hybond
N d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Current Protocols in Molecular
Biology". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone plasmidique présentant un insert de 1,7kpb et hybridant avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été préparé à plus grande échelle et l'ADN résultant de la lyse des bactéries purifié sur gradient de CsCl ainsi que décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". L'ADN purifié a été partiellement séquencé avec un kit Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur et en utilisant comme amorces, les amorces universelles de M13 directes et inverses commandées chez le même fournisseur. La séquence partielle réalisée couvre environ 0,5 kpb. La séquence dérivée en acides aminés dans la région de la protéine mature (environ 50 résidus acides aminés) présente une identité de 100% avec la séquence aminée correspondante de l'EPSPS mature de maïs décrite dans le brevet américain USP 4 971 908). Ce clone correspondant à un fragment EcoRI de 1,7kpb de l'ADN de 1' EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS a été nommé pRPA-ML-711. La séquence complète de ce clone a été réalisée sur les deux brins en utilisant le protocole du kit Pharmacia et en synthétisant des oligonucléotides complémentaires et de direction opposée tous les 250 pb environ. La séquence complète de ce clone de 1713 pb obtenue est présentée par SEQ ID N" 2.
Dix pg de l'ADN du clone phagique contenant l'insert de 1,7kpb sont digérés par EcoRI et séparés sur gel d'agarose LGTAJTBE (réf. CPMB) à 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert de 1,7kpb est excisé du gel par coloration BET et le fragment est traité à la ,B-agarase selon le protocole du fournisseur New a Biolabs. L'ADN purifié du fragment de 1,7kpb est ligué à 12"C pendant 14h avec l'ADN du plasmide pUC 19 (New England Biolabs) coupé par EcoRI selon le protocole de ligation décrit dans "Current Protocols in Molecular
Biology". Deux pi du mélange de ligation ci-dessus sont utilisés pour la transformation d'une aliquote d'E.coli DH1OB électro compétentes; la transformation se fait par électroporation en utilisant les conditions suivantes: le mélange de bactéries compétentes et de milieu de ligation est introduit dans une cuvette d'électroporation d'épaisseur 0,2 cm (Biorad) prélablement refroidie à 0 C. Les conditions physiques de l'électroporation utilisant un électroporateur de marque Biorad sont 2500 Volts, 25 IlFarad et 200 fl. Dans ces conditions, le temps de décharge moyen de condensateur est de l'ordre de 4,2 millisecondes. Les bactéries sont alors reprises dans 1 ml de milieu SOC (réf. CPMB) et agitées pendant 1 heure à 200 rpm sur un agitateur rotatif dans des tubes Corning de 15 ml. Après étalement sur milieu LB/agar supplémenté à 100 Clg/ml de carbéniciline, les mini-préparations des clones bactériens ayant poussé après une nuit à 37 "C est réalisée selon le protocole décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". Après digestion par EcoRI de l'ADN et séparation en électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) à 0,8%, les clones présentant un insert de 1,7kpb sont conservés. Une dernière vérification consiste à s'assurer que 1' ADN purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Après l'électrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur membrane Hybond
N d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Current Protocols in Molecular
Biology". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone plasmidique présentant un insert de 1,7kpb et hybridant avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été préparé à plus grande échelle et l'ADN résultant de la lyse des bactéries purifié sur gradient de CsCl ainsi que décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology". L'ADN purifié a été partiellement séquencé avec un kit Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur et en utilisant comme amorces, les amorces universelles de M13 directes et inverses commandées chez le même fournisseur. La séquence partielle réalisée couvre environ 0,5 kpb. La séquence dérivée en acides aminés dans la région de la protéine mature (environ 50 résidus acides aminés) présente une identité de 100% avec la séquence aminée correspondante de l'EPSPS mature de maïs décrite dans le brevet américain USP 4 971 908). Ce clone correspondant à un fragment EcoRI de 1,7kpb de l'ADN de 1' EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS a été nommé pRPA-ML-711. La séquence complète de ce clone a été réalisée sur les deux brins en utilisant le protocole du kit Pharmacia et en synthétisant des oligonucléotides complémentaires et de direction opposée tous les 250 pb environ. La séquence complète de ce clone de 1713 pb obtenue est présentée par SEQ ID N" 2.
6. Obtention du clone pRPA-ML-715:
L'analyse de la séquence du clone pRPA-ML-711 et en particulier la comparaison de la séquence d' acides aminés dérivés avec celle de maïs montre une extension de séquence de 92 pb en amont du codon GCG codant pour l'Alanine NH2-terminale de la partie mature de l'BPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908). De même une extension de 288 pb en aval du codon AAT codant pour l'asparagine COOH-terminale de la partie mature de l'EPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908) est observée. Ces deux parties pourraient correspondre, pour l'extension NH2-terminale à une portion de la séquence d'un peptide de transit pour la localisation plastidiale et pour l'extension COOH-terminale à la région 3' non traduite de l'ADNc.
L'analyse de la séquence du clone pRPA-ML-711 et en particulier la comparaison de la séquence d' acides aminés dérivés avec celle de maïs montre une extension de séquence de 92 pb en amont du codon GCG codant pour l'Alanine NH2-terminale de la partie mature de l'BPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908). De même une extension de 288 pb en aval du codon AAT codant pour l'asparagine COOH-terminale de la partie mature de l'EPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908) est observée. Ces deux parties pourraient correspondre, pour l'extension NH2-terminale à une portion de la séquence d'un peptide de transit pour la localisation plastidiale et pour l'extension COOH-terminale à la région 3' non traduite de l'ADNc.
Afin d'obtenir un ADNc codant pour la partie mature de l'ADNc de l'EPSPS de maïs, telle que décrite dans 1' USP 4 971 908, les opérations suivantes ont été réalisées:
a) Elimination de la région 3' non traduite: construction de pRPA-ML-712:
Le clone pRPA-ML-711 a été coupé par l'enzyme de restriction AseI et les extrémités résultant de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I selon le protocole décrit dans CPMB. Une coupure par l'enzyme de restriction SaclI a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces opérations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) 1%.
a) Elimination de la région 3' non traduite: construction de pRPA-ML-712:
Le clone pRPA-ML-711 a été coupé par l'enzyme de restriction AseI et les extrémités résultant de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I selon le protocole décrit dans CPMB. Une coupure par l'enzyme de restriction SaclI a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces opérations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) 1%.
Le fragment de gel contenant l'insert "AseI-extrémités franches/SacII" de 0,4 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. L'ADN du clone pRPA-ML-7 Il a été coupé par l'enzyme de restriction HindIII située dans le polylinker du vecteur de clonage pUC19 et les extrémités résultant de cette coupure ont été rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction Sacll a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) 0,7%.
Le fragment de gel contenant l'insert HindE-extrémités franches/SacII de environ 3,7kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus.
Les deux inserts ont été ligués, et 2 pi du mélange de ligation ont servi à transformer
E. coli DH1OB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5.
E. coli DH1OB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5.
On analyse le contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite pour pRPA-ML-711. Un des clones plasmidique retenu contient un insert EcoRI- Hindi de 1,45 kpb environ. La séquence des extrémités terminales de ce clone révèle que l'extrémité 5' de l'insert correspond exactement à l'extrémité correspondante de pRPA-ML711 et que l'extrémité 3' terminale présente la séquence suivante: "5'-...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3"'.
La séquence soulignée correspond au codon de l'acide aminé COOH-terminal asparagine, le codon suivant correspondant au codon stop de la traduction. Les nucléotides en aval correspondent à des éléments de séquence du polylinker de pUCI9. Ce clone comprenant la séquence de pRPAML-711 jusqu'au site de terminaison de la traduction de l'EPSPS mature de maïs et suivie de séquences du polylinker de pUC 19 jusqu'au site
Hindi a été nommé pRPA-ML-712.
Hindi a été nommé pRPA-ML-712.
b) Modification de l'extrémité 5' de pRPA-ML-712: construction de pRPA-ML-715
Le clone pRPA-ML-712 a été coupé par les enzymes de restrictions PstI et Hindi.
Le clone pRPA-ML-712 a été coupé par les enzymes de restrictions PstI et Hindi.
L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/'TBB (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert PstIlEcoRI de 1,3 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. Cet insert a été mis en ligation en présence de quantité équimoléculaire de chacun des deux oligonucléotides partiellement complémentaires, de séquence:
Oligol: 5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3'
Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3'
ainsi qu'en présence d'ADN du plasmide pUC19 digéré par les enzymes de restrictions
BamHI et Hindi.
Oligol: 5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3'
Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3'
ainsi qu'en présence d'ADN du plasmide pUC19 digéré par les enzymes de restrictions
BamHI et Hindi.
Deux ul du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHIOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5. Après analyse du contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite ci-dessus au paragraphe 5, un des clones présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été conservé pour analyses ultérieures. La séquence de l'extrémité 5' terminale du clone retenu révèle que la séquence ADN dans cette région est la suivante: séquence du polylinker de pUC19 des sites EcoRI à BamHI, suivi de la séquence des oligonucléotides utilisés lors du clonage, suivi du reste de la séquence présente dans pRPAML-712. Ce clone a été nommé pRPA-ML-713. Ce clone présente un codon methionine ATG inclus dans un site NcoI en amont du codon Alanine N-terminal de l'BPSPSynthase mature. De plus, les codons alanine et glycine de l'extrémité N-terminale ont été conservées, mais modifiées sur la troisième base variable : GCbGGT initial donne GCCGGC modifié.
Le clone pRPA-ML-713 a été coupé par l'enzyme de restriction Hindi et les extrémités de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de la ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacI a ensuite été effectuée.
L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/'TBB (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert "HindE-extrémités franches/SacI" de 1,3 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. Cet insert a été mis en ligation en présence d'ADN du plasmide pUC19 digéré par l'enzyme de restriction XbaI et les extrémités de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacI a ensuite été effectuée. Deux pi du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHlOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5. Après analyse du contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite ci-dessus au paragraphe 5, un des clones présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été conservé pour analyses ultérieures. La séquence des extrémités terminales du clone retenu révèle que la séquence ADN est la suivante: séquence du polylinker de pUCl9 des sites EcoRI à Saci, suivie de la séquence des oligonucléotides utilisés lors du clonage délétée des 4 pb GATCC de l'oligonucléotide 1 décrit ci-dessus, suivi du reste de la séquence présente dans pRPA
ML-712 jusqu'au site Hindi et séquence du polylinker de pUC19 de XbaI à HindIll. Ce clone a été nommé pRPA-ML-715.
ML-712 jusqu'au site Hindi et séquence du polylinker de pUC19 de XbaI à HindIll. Ce clone a été nommé pRPA-ML-715.
7) Obtention d'un ADNc codant pour une EPSPS de maïs mutée
Toutes les étapes de mutagénèse ont été réalisées avec le U.S.E. mutagenesis kit de
Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur. Le principe de ce système de mutagénèse est le suivant: 1'ADN plasmidique est dénaturé par la chaleur et réassocié en présence d'un excès molaire d'une part de l'oligonucléotide de mutagénèse, et d'autre part d'un oligonucléotide permettant d'éliminer un site d'enzyme de restriction unique présent dans le polylinker. Après l'étape de réassociation, la synthèse du brin complémentaire est réalisée par l'action de la T4 ADN polymérase en présence de T4 ADN ligase et de protéine du gène 32 dans un tampon approprié fourni. Le produit de synthèse est incubé en présence de l'enzyme de restriction, dont le site est supposé avoir disparu par mutagénèse. La souche d'E. coli présentant, en particulier, la mutation mutS est utilisée comme hôte pour la transformation de cet ADN. Après croissance en milieu liquide, l'ADN plasmidique total est préparé, incubé en présence de l'enzyme de restriction utilisée précédemment. Après ces traitements, la souche d'E. coli DHlOB est utilisée comme hôte pour la transformation.
Toutes les étapes de mutagénèse ont été réalisées avec le U.S.E. mutagenesis kit de
Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur. Le principe de ce système de mutagénèse est le suivant: 1'ADN plasmidique est dénaturé par la chaleur et réassocié en présence d'un excès molaire d'une part de l'oligonucléotide de mutagénèse, et d'autre part d'un oligonucléotide permettant d'éliminer un site d'enzyme de restriction unique présent dans le polylinker. Après l'étape de réassociation, la synthèse du brin complémentaire est réalisée par l'action de la T4 ADN polymérase en présence de T4 ADN ligase et de protéine du gène 32 dans un tampon approprié fourni. Le produit de synthèse est incubé en présence de l'enzyme de restriction, dont le site est supposé avoir disparu par mutagénèse. La souche d'E. coli présentant, en particulier, la mutation mutS est utilisée comme hôte pour la transformation de cet ADN. Après croissance en milieu liquide, l'ADN plasmidique total est préparé, incubé en présence de l'enzyme de restriction utilisée précédemment. Après ces traitements, la souche d'E. coli DHlOB est utilisée comme hôte pour la transformation.
L'ADN plasmidique des clones isolés est préparé et la présence de la mutation introduite vérifiée par séquençage.
A)- modifications de sites ou de séquence sans incidence a priori sur le caractère de résistance de 1'EPSPS de maïs aux produits inhibiteurs compétitifs de l'activité EPSP synthase: élimination d'un site NcoI interne de pRPA-ML-715.
La séquence de pRPA-ML-715 est numérotée arbitrairement en plaçant la première base du codon Alanine N-terminal GCC en position 1. Cette séquence présente un site NcoI en position 1217. L'oligonucléotide de modification du site présente la séquence: 5 '-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'.
Après séquençage selon les références données ci-dessus, la séquence lue après mutagénèse correspond à celle de l'oligonucléotide utilisé. Le site NcoI a bien été éliminé et la traduction en acides aminés dans cette région conserve la séquence initiale présente sur pRPA-ML-715.
Ce clone a été nommé pRPA-ML-716.
La séquence de 1340 bp de ce clone est présentée SEQ ID N" 3 et SEQ ID N" 4.
B) modifications de séquence permettant l'augmentation du caractère de résistance de l'EPSPS de maïs aux produits inhibiteurs compétitifs de l'activité EPSP synthase.
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés:
a) mutation Thr 102 * Ile.
a) mutation Thr 102 * Ile.
5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'
b) mutation Pro 106 u* Ser.
b) mutation Pro 106 u* Ser.
5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
c) mutations Gly 101 r Ala et Thr 102 ll Ile.
c) mutations Gly 101 r Ala et Thr 102 ll Ile.
5 ' -CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3 '
d) mutations Thr 102 * Ile et Pro 106 i- Ser.
d) mutations Thr 102 * Ile et Pro 106 i- Ser.
5 '-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3 '
Après séquençage, la séquence lue après mutagénèse sur les trois fragments mutés est identique à la séquence de l'ADN parental pRPA-ML-716 à l'exception de la région mutagénéisée qui correspond à celle des oligonucléotides de mutagénèse utilisés. Ces clones ont été nommés : pRPA-ML-717 pour la mutation Thr 102 F Ile, pRPA-ML-718 pour la mutation Pro 106 1lx Ser, pRPA-ML-719 pour les mutations Gly 101 # Ala et Thr 102 lll Ile et pRPA-ML-720 pour les mutations Thr 102 4 Ile et Pro 106 1* Ser.
Après séquençage, la séquence lue après mutagénèse sur les trois fragments mutés est identique à la séquence de l'ADN parental pRPA-ML-716 à l'exception de la région mutagénéisée qui correspond à celle des oligonucléotides de mutagénèse utilisés. Ces clones ont été nommés : pRPA-ML-717 pour la mutation Thr 102 F Ile, pRPA-ML-718 pour la mutation Pro 106 1lx Ser, pRPA-ML-719 pour les mutations Gly 101 # Ala et Thr 102 lll Ile et pRPA-ML-720 pour les mutations Thr 102 4 Ile et Pro 106 1* Ser.
La séquence de 1340 bp de pRPA-ML-720 est présentée SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6.
L'insert Ncoi-Hlndïii de 1395 pb est à la base de toutes les constructions utilisées pour la transformation des plantes pour l'introduction de la résistance aux herbicides inhibiteurs compétitifs de l'EPSPS et en particulier la résistance au glyphosate. Cet insert sera nommé dans la suite des descriptions "le double mutant de l'EPSPS de maïs".
B Tolérance au glyphosate des différents mutants in vitro.
2.a: Extraction de 1'EPSP synthase.
Les différents gènes d'EPSP synthases sont introduits sous forme d'une cassette NcoI-Hindm dans le vecteur plasmidique pTrc99a (Pharmacia, ref: 27-5007-01) coupé par NcoI et Hindi. Les E. coli DH1OB recombinantes surexprimant les différents EPSP synthases sont soniquées dans 40 ml de tampon par 10 g de cellules culottées et lavées avec ce même tampon (tris HCI 200 mM pH 7,8, mercaptoethanol 50 mM, EDTA 5 mM et PMSF 1 mM), auxquels on ajoute 1 g de polyvinylpyrrolidone. La suspension est agitée pendant 15 minutes à 4 C, puis centrifugée 20 minutes à 27000g et 4 C.
Le surnageant est additionné de sulfate d'ammonium pour amener la solution à 40% de la saturation en sulfate d'ammonium. Le mélange est centrifugé 20 minutes à 27000g et 40C.
Le nouveau surnageant est additionné de sulfate d'ammonium pour amener la solution à 70% de la saturation en sulfate d'ammonium. Le mélange est centrifugé 30 minutes à 27000g et 4 C. L'EPSP synthase, présente dans ce culot protéique, est reprise dans 1 ml de tampon (tris Cl 20 mM pH 7,8 et mercaptoethanol 50 mM). Cette solution est dialysée une nuit contre deux litres de ce même tampon à 4 C.
2.b: Activité enzymatique.
L'activité de chaque enzyme ainsi que sa résistance au glyphosate est mesurée in vitro sur 10 minutes à 37 C dans le mélange réactionnel suivant: acide maléique 100 mM pH 5,6, phosphoénol pyruvate 1 mM, shikimate-3-phosphate 3 mM (préparé selon Knowles P.F. et
Sprinson D.B. 1970. Methods in Enzymol 17A, 351-352 à partir de Aerobacter aerogenes strain ATCC 25597) et fluorure de potassium 10 mM. L'extrait enzymatique est ajouté au dernier moment après l'addition de glyphosate dont la concentration finale varie de 0 à 20 mM.
Sprinson D.B. 1970. Methods in Enzymol 17A, 351-352 à partir de Aerobacter aerogenes strain ATCC 25597) et fluorure de potassium 10 mM. L'extrait enzymatique est ajouté au dernier moment après l'addition de glyphosate dont la concentration finale varie de 0 à 20 mM.
L'activité est mesurée par dosage du phosphate libéré selon la technique de Tausky H.A. et Shorr E. 1953. J. Biol. Chem. 202, 675-685.
Dans ces conditions, l'enzyme sauvage (WT) est inhibée à 85% dès la concentration de 0,12 mM de glyphosate. A cette concentration, I'enzyme mutante connue Ser106 n'est inhibée qu'à 50% et les trois autres mutants Ile 102, 1le102/Serl06, Ala101/Ile102 ne sont pas ou peu inhibées.
II faut multiplier la concentration de glyphosate par dix, soit 1,2 mM, pour inhiber l'enzyme mutante Ile 102 à 50%, les mutants lie 102/Serl06, Ala/Ile et Ala n'étant toujours pas inhibés.
Il faut noter que l'activité des mutants Ala/Ile et Ala n'est pas inhibée jusqu'à des concentrations de 10 mM de glyphosate, et que celle du mutant IlelO2/SerlO6 n'est pas réduite même si la concentration en glyphosate est multipliée par 2, soit 20 mM.
C
Résistance des plantes de tabac transformés.
Résistance des plantes de tabac transformés.
0-1 Constructions des plasmides:
pRPA-RD-124: Addition d'un signal de polyadénylation "nos" à pRPA-ML-720, obtenu précédemment, avec création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS double mutant de maïs (Thr 102 < fle et Pro 106 e Ser). pRPA-ML-720 est digéré avec
Hind ffl, traité avec le fragment de Kienow de l'ADN polymérase I d'E. coli pour produire une extrémité franche. On effectue une seconde digestion avec Nco I et le fragment EPSPS est purifié. Le gène EPSPS est ensuite ligué avec pRPA-RD-12 purifié (une cassette de clonage contenant le signal de polyadénylation de la nopaline synthase) pour donner pRPA
RD-124. Pour obtenir le vecteur pRPA-RD-12 purifié utile, il a fallu que celui-ci soit préalablement digéré par SalI, traité avec l'ADN polymérase de Klenow, puis digéré une seconde fois avec NcoI.
pRPA-RD-124: Addition d'un signal de polyadénylation "nos" à pRPA-ML-720, obtenu précédemment, avec création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS double mutant de maïs (Thr 102 < fle et Pro 106 e Ser). pRPA-ML-720 est digéré avec
Hind ffl, traité avec le fragment de Kienow de l'ADN polymérase I d'E. coli pour produire une extrémité franche. On effectue une seconde digestion avec Nco I et le fragment EPSPS est purifié. Le gène EPSPS est ensuite ligué avec pRPA-RD-12 purifié (une cassette de clonage contenant le signal de polyadénylation de la nopaline synthase) pour donner pRPA
RD-124. Pour obtenir le vecteur pRPA-RD-12 purifié utile, il a fallu que celui-ci soit préalablement digéré par SalI, traité avec l'ADN polymérase de Klenow, puis digéré une seconde fois avec NcoI.
pRPA-RD-125: Addition d'un peptide de transit optimisé (OTP) à pRPA-RD-124 avec création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS ciblé sur les plasmides.
pRPA-RD-7 (demande de brevet européen EP 652 286) est digéré avec Sph I, traité avec la
T4 ADN polymérase, puis digéré avec Spe 1 et le fragment OTP est purifié. Ce fragment
OTP est cloné dans pRPA-RD-124 qui a été préalablement digérée par NcoI, traité avec l'ADN polymérase de Kienow pour enlever la partie protubérante 3', puis digérée par Spe I.
T4 ADN polymérase, puis digéré avec Spe 1 et le fragment OTP est purifié. Ce fragment
OTP est cloné dans pRPA-RD-124 qui a été préalablement digérée par NcoI, traité avec l'ADN polymérase de Kienow pour enlever la partie protubérante 3', puis digérée par Spe I.
Ce clone est alors séquencé pour assurer la fusion traductionnelle correcte entre le OTP et le gène d'EPSPS. On obtient alors pRPA-RD-125.
pRPA-RD-159: Addition du promoteur double d'histone d'arabidopsis H4A748 (demande de brevet EP 507 698 ) à pRPA-RD-125 avec création d'une cassette pour expression dans les plantes pour l'expression du gène "OTP- gène d'EPSPS double mutant" dans les tissus de dicotylédones. pRPA-RD-132 (une cassette contenant le promoteur double H4A748 (demande de brevet EP 507 698)) est digérée avec Nco I et Sac I. Le fragment purifié du promoteur est ensuite cloné dans qui a été digéré avec Eco I et Sac I.
pRPA-RD-173: Addition du gène "promoteur H4A748-OTP-gène d'EPSPS double mutant" de pRPA-RD-159 dans plasmide pRPA-BL-150A (demande de brevet européen 508 909) avec création d'un vecteur de transformation Agrobacterium tumefaciens. pRPA
RD- 159 est digéré avec Not I et traité avec la polymérase de Klenow. Ce fragment est ensuite cloné dans pRPA-BL-150A avec Sma I.
RD- 159 est digéré avec Not I et traité avec la polymérase de Klenow. Ce fragment est ensuite cloné dans pRPA-BL-150A avec Sma I.
- I - Transformation.
Le vecteur pRPA-RD-173 est introduit dans la souche dAgrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood et al.,1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari et al.,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al.(1985).
1-2- Régénération.
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 200 llg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et transformées selon la technique des disques foliaires (Science, 1985,Vol 227,p. 1229-1231) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30g/1 de saccharose contenant 0,05 mg/I d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
1-3- Résistance au glyphosate.
Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la construction pRPA-RD-173. Ces plantes ont été traitées en serre au stade S feuilles avec une suspension acqueuse de RoundUp correspondant à 0,8kg de matière active glyphosate par hectare.
Les résultats correspondent à l'observation d'indices de phytotoxicité relevés 3 semaine après traitement. Dans ces conditions, on constate que les plantes transformées par la construction pRPA-RD-173 présentent une très bonne tolérance alors que les plantes témoins non transformées sont complètement détruites.
Ces résultats montrent clairement l'amélioration apportée par l'utilisation d'un gène chimère selon l'invention pour un même gène codant pour la tolérance au glyphosate.
Exemple 5: Transformation du tabac industriel PBD6. avec gène de la nitrilase (pour n construction 238:
Ce tabac est obtenu selon l'enseignement de la demande européenne n" 0 337 899 page 6 ligne 50 et suivantes à partir de la construction 238, qui est celle décrite sous le nom de pRPA-BL 238.
Ce tabac est obtenu selon l'enseignement de la demande européenne n" 0 337 899 page 6 ligne 50 et suivantes à partir de la construction 238, qui est celle décrite sous le nom de pRPA-BL 238.
Exemple 6: Croisement par pollinisation
On procède par pollinisation en serre au croisement respectivement des lignées Co 17, 173 et 238: - Co 17 avec 238 pour obtenir des plantes de tabac PBD6 à tester sur la double tolérance à l'isoxaflutole et au bromoxynil (" plantes HPPD + OXY") et - Co 17 avec 173 pour obtenir des plantes de tabac PBD6 à tester sur la double tolérance à l'isoxaflutole et au glyphosate ( "plantes HPPD + EPSPS").
On procède par pollinisation en serre au croisement respectivement des lignées Co 17, 173 et 238: - Co 17 avec 238 pour obtenir des plantes de tabac PBD6 à tester sur la double tolérance à l'isoxaflutole et au bromoxynil (" plantes HPPD + OXY") et - Co 17 avec 173 pour obtenir des plantes de tabac PBD6 à tester sur la double tolérance à l'isoxaflutole et au glyphosate ( "plantes HPPD + EPSPS").
Les trois lignées sont homozygotes vis à vis du gène concerné: en conséquence la descendance est hemizygote pour chacun des deux gènes introduits par croisement.
Les plantes croisées sont obtenues au bout de six semaines.
Exemple 7: Mesure de la tolérance du tabac en traitement de postlevée avec l'isoxaflutole et de postlevée avec le bromoxvnil ou le glyphosate.
Dans cet essai, chaque test est effectué sur un échantillon de 10 plantes, 10 plantes étant gardées non traitées.
Tous les traitements sont effectués par pulvérisation à raison de 5001 de bouillie par hectare.
Pour le traitement en postlevée, on fait un semis puis on repique les plantes en godets de 9cm x 9cm.
Les traitements de post levée sont faits à un stade bien développé (3-4 feuilles)Des lots de plantes respectivement sauvage et génétiquement transformées obtenues ci-dessus sont répartis en plusieurs parts, avec: a) un lot non traité, b) d'autres lots qui sont traités respectivement avec un herbicide seul,
- de l'isoxaflutole en post levée, à deux doses (respectivement 200 et 400 g/ha),
- du bromoxynil en post levée à deux doses (respectivement 400 et 800 g/ha),,
- du glyphosate en post levée à deux doses (respectivement 800 et 1200 g/ha), c) d'autres lots qui sont traités respectivement avec deux herbicides, en post levée, en mélange extemporané:
- de l'isoxaflutole et du bromoxynil à deux doses (respectivement 200/400 et 400/800 g/ha)
- de l'isoxaflutole et du glyphosate à deux doses (respectivement 200/800 et 400/1200 g/ha).
- de l'isoxaflutole en post levée, à deux doses (respectivement 200 et 400 g/ha),
- du bromoxynil en post levée à deux doses (respectivement 400 et 800 g/ha),,
- du glyphosate en post levée à deux doses (respectivement 800 et 1200 g/ha), c) d'autres lots qui sont traités respectivement avec deux herbicides, en post levée, en mélange extemporané:
- de l'isoxaflutole et du bromoxynil à deux doses (respectivement 200/400 et 400/800 g/ha)
- de l'isoxaflutole et du glyphosate à deux doses (respectivement 200/800 et 400/1200 g/ha).
Les traitements sont effectués avec les formulations suivantes: isoxaflutole à 75%, le bromoxynil ( produit commercial PARDNER) sous forme octanoate en concentré émulsionnable à 225g /1 et le glyphosate (Round-UP)
Dans ces conditions, on observe 17 jours après le traitement les phytotoxicités suivantes, exprimées en pourcentage de destruction indiquées dans le tableau suivant, ainsi que le nombre de plantes par lot et les doses d'herbicide(s) exprimées en gramme de matière active par hectare:
Traitement de postlevée avec l'isoxaflutole
et de postlevée avec le bromoxynil ou le glyphosate
Dans ces conditions, on observe 17 jours après le traitement les phytotoxicités suivantes, exprimées en pourcentage de destruction indiquées dans le tableau suivant, ainsi que le nombre de plantes par lot et les doses d'herbicide(s) exprimées en gramme de matière active par hectare:
Traitement de postlevée avec l'isoxaflutole
et de postlevée avec le bromoxynil ou le glyphosate
<tb> <SEP> Herbicide <SEP> Plantes <SEP> avec <SEP> gène <SEP> de <SEP> tolérance
<tb> <SEP> en
<tb> <SEP> * <SEP> HPPD <SEP> * <SEP> HPPD+ <SEP> * <SEP> SANS <SEP> =
<tb> <SEP> + <SEP> OXY <SEP> EPSPS <SEP> Sauvage
<tb> <SEP> Contrôles <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> <SEP> isoxaflutole <SEP> 200 <SEP> 20 <SEP> 4% <SEP> 20 <SEP> 2% <SEP> 10 <SEP> 75%
<tb> <SEP> seul <SEP> 400 <SEP> 20 <SEP> 5% <SEP> 20 <SEP> 3% <SEP> 85%
<tb> <SEP> bromoxynil <SEP> 400 <SEP> 10 <SEP> 3% <SEP> /1111 <SEP> lo <SEP> oO/o
<tb> <SEP> seul <SEP> 800 <SEP> 10 <SEP> 0% <SEP> 10
<tb> <SEP> Glyphosate <SEP> 800 <SEP> 20 <SEP> 0% <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> seul <SEP> 1200 <SEP> 20 <SEP> 0% <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> Isoxaflutole <SEP> 200 <SEP> 20 <SEP> 20% <SEP> II <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> +bromoxynil <SEP> 400
<tb> <SEP> Isoxanutole <SEP> 400 <SEP> 20 <SEP> 30 <SEP> 10 <SEP> 1006
<tb> <SEP> +bromoxynil <SEP> 800
<tb> <SEP> Isoxanutole <SEP> 200 <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> + <SEP> bromoxynil <SEP> 800 <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP>
<tb> <SEP> Isoxaflutole <SEP> 200 <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> 40 <SEP> 5% <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> +glyphosate <SEP> 800
<tb> Isoxaflutole <SEP> 400 <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> 40 <SEP> 10% <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> +glyphosate <SEP> 1200
<tb> * nombre de plants
Exemple 8
Dans le but d'étudier si le gène de l'HPPD de Pseudomonasfluorescens peut être utilisé comme gène marqueur au cours du cycle "transformation - régénération" d'une espèce végétale, le tabac a été transformé avec le gène de l'HPPD et des plantes transformées ont été obtenues après sélection sur isoxaflutole.
<tb> <SEP> en
<tb> <SEP> * <SEP> HPPD <SEP> * <SEP> HPPD+ <SEP> * <SEP> SANS <SEP> =
<tb> <SEP> + <SEP> OXY <SEP> EPSPS <SEP> Sauvage
<tb> <SEP> Contrôles <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> <SEP> isoxaflutole <SEP> 200 <SEP> 20 <SEP> 4% <SEP> 20 <SEP> 2% <SEP> 10 <SEP> 75%
<tb> <SEP> seul <SEP> 400 <SEP> 20 <SEP> 5% <SEP> 20 <SEP> 3% <SEP> 85%
<tb> <SEP> bromoxynil <SEP> 400 <SEP> 10 <SEP> 3% <SEP> /1111 <SEP> lo <SEP> oO/o
<tb> <SEP> seul <SEP> 800 <SEP> 10 <SEP> 0% <SEP> 10
<tb> <SEP> Glyphosate <SEP> 800 <SEP> 20 <SEP> 0% <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> seul <SEP> 1200 <SEP> 20 <SEP> 0% <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> Isoxaflutole <SEP> 200 <SEP> 20 <SEP> 20% <SEP> II <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> +bromoxynil <SEP> 400
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<tb> <SEP> +bromoxynil <SEP> 800
<tb> <SEP> Isoxanutole <SEP> 200 <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> + <SEP> bromoxynil <SEP> 800 <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP>
<tb> <SEP> Isoxaflutole <SEP> 200 <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> 40 <SEP> 5% <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> +glyphosate <SEP> 800
<tb> Isoxaflutole <SEP> 400 <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> 40 <SEP> 10% <SEP> 10 <SEP> 100%
<tb> <SEP> +glyphosate <SEP> 1200
<tb> * nombre de plants
Exemple 8
Dans le but d'étudier si le gène de l'HPPD de Pseudomonasfluorescens peut être utilisé comme gène marqueur au cours du cycle "transformation - régénération" d'une espèce végétale, le tabac a été transformé avec le gène de l'HPPD et des plantes transformées ont été obtenues après sélection sur isoxaflutole.
Matériel et méthodes et résultats
Le gène chimérique pRP V décrit ci-dessous est transféré dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n" 0 508 909.
Le gène chimérique pRP V décrit ci-dessous est transféré dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n" 0 508 909.
Le gène chimère du vecteur pRP V a la structure suivante:
<tb> Promoteur <SEP> double <SEP> TEV <SEP> OTP <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> 1'HPPD <SEP> Terminateur <SEP> nos
<tb> <SEP> histone
<tb>
Le gène chimère est introduit dans les lignées C017x173 et C017x238 obtenues à l'exemple 6 aux constructions 173 et 238.
<tb> <SEP> histone
<tb>
Le gène chimère est introduit dans les lignées C017x173 et C017x238 obtenues à l'exemple 6 aux constructions 173 et 238.
1)Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101(Hood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291(Komari et al,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al(1985).
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101(Hood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291(Komari et al,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al(1985).
2) Régénération:
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30gon de saccharose ainsi que 350 mg/l de cefotaxime et 1 mg/l d'isoxaflutole. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985,Vol 227,p.1229-1231) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30gel de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 1 mg/l d'isoxaflutole. Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/l de saccharose et 1 mg/l d'isoxaflutole mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et 1 mg/l d'isoxaflutole et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30gon de saccharose ainsi que 350 mg/l de cefotaxime et 1 mg/l d'isoxaflutole. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985,Vol 227,p.1229-1231) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30gel de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 1 mg/l d'isoxaflutole. Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/l de saccharose et 1 mg/l d'isoxaflutole mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et 1 mg/l d'isoxaflutole et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
Toutes les plantules obtenues selon ce protocole sont analysées par PCR avec des amorces spécifiques de I'HPPD de Pfluorescens. Cette analyse PCR a permis de confirmer que toutes les plantules ainsi obtenues ont bien intégré le gène de l'HPPD.
En conclusion, cet essai confirme que le gène de l'HPPD peut être utilisé comme gène marqueur et que, associé à ce gène, I'isoxaflutole peut être un bon agent de sélection.
Les séquences illustrées sont les suivantes:
SEQ ID N" 1
Séquence du gène de l'HPPD de Pseudomonasfluorescens A32.
SEQ ID N" 1
Séquence du gène de l'HPPD de Pseudomonasfluorescens A32.
SEQIDN 2
Séquence d' ADNc d'EPSPS d'Arabidopsis thaliana SEQ ID N" 3 et 4 séquences respectivement du gène et de la protéine de l'EPSPS de maïs mutée, partie
1340 pb du clone pRPA-ML-716 SEQ ED n S etSEQ ED n 6 séquences respectivement du gène et de la protéine de l'EPSPS de maïs mutée, partie
1340 pb du clone pRPA-ML-720
Les figures ci-après sont données à titre indicatif pour illustrer l'invention.
Séquence d' ADNc d'EPSPS d'Arabidopsis thaliana SEQ ID N" 3 et 4 séquences respectivement du gène et de la protéine de l'EPSPS de maïs mutée, partie
1340 pb du clone pRPA-ML-716 SEQ ED n S etSEQ ED n 6 séquences respectivement du gène et de la protéine de l'EPSPS de maïs mutée, partie
1340 pb du clone pRPA-ML-720
Les figures ci-après sont données à titre indicatif pour illustrer l'invention.
La Figure 1 représente la séquence protéique de l'HPPD de Pseudomonas sp. strain P.J. 874 et la séquence nucléotidique théorique de la partie codante correspondante; les cinq oligonucléotides choisis pour faire l'amplification d'une partie de cette région codante sont symbolisés par les cinq fléches.
La Figure 2 représente la cartographie du plasmide avec le fragment d'ADN génomique de 7 kb contenant le gène de 1'HPPD de P. fluorescens A32.
La Figure 3 donne la comparaison des séquences en acides aminés de 1' HPPD de P.
fluorescens A32 et de l'HPPD de Pseudomonas sp strain P.J. 874 (seuls les acides aminés divergents entre les deux séquences sont indiqués) ainsi que la séquence consensus.
Liste des séquences
SEQ ID N I
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:
ATGGCAGATC TATACGAAAA CCCAATGGGC CTGATGGGCT TTGAATTCAT CGAATTAGCG 60
TCGCCGACGC CGGGTACCCT GGAGCCGATC TTCGAGATCA TGGGCTTCAC CAAAGTCGCG 120
ACCCACCGTT CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 180
AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCCTACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 240
ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 300
CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 360
GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420
GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGGAGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480
GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGGTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 540
AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600
ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCGGACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660
TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 720
CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 780
ATGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT 840
GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 900
GTGSAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 960
TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020
CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGACCAGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA 1077
SEQ ID N 2
AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60
ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120
CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCGTCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA 180
TCCTCCTACT CGCCGCCCTG TCCGAGGGGA CAACAGTGGT TGATAACCTG CTGAACAGTG 240
AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300
AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTGTTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360
AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGGCCA TTGACAGCAG 420
CTGTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA AGAATGAGGG 480
AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTGTCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540
TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600
AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCAGCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660
CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGATTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720
TCGAAATGAC ATTGAGATTG ATGGAGCGTT TTGGTGTGAA AGCAGAGCAT TCTGATAGCT 780
GGGACAGATT CTACATTAAG GGAGGTCAAA AATACAAGTC CCCTAAAAAT GCCTATGTTG 840
AAGGTGATGC CTCAAGCGCA AGCTATTTCT TGGCTGGTGC TGCAATTACT GGAGGGACTG 900
TGACTGTGGA AGGTTGTGGC ACCACCAGTT TGCAGGGTGA TGTGAAGTTT GCTGAGGTAC 960
TGGAGATGAT GGGAGCGAAG GTTACATGGA CCGAGACTAG CGTAACTGTT ACTGGCCCAC 1020
CGCGGGAGCC ATTTGGGAGG AAACACCTCA AGGCGATTGA TGTCAACATG AACAAGATGC 1080
CTGATGTCGC CATGACTCTT GCTGTGGTTG CCCTCTTTGC CGATGGCCCG ACAGCCATCA 1140
GAGACGTGGC TTCCTGGAGA GTAAAGGAGA CCGAGAGGAT GGTTGCGATC CGGACGGAGC 1200
TAACCAAGCT GGGAGCATCT GTTGAGGAAG GGCCGGACTA CTGCATCATC ACGCCGCCGG 1260
AGAAGCTGAA CGTGACGGCG ATCGACACGT ACGACGACCA CAGGATGGCC ATGGCCTTCT 1320
CCCTTGCCGC CTGTGCCGAG GTCCCCGTCA CCATCCGGGA CCCTGGGTGC ACCCGGAAGA 1380
CCTTCCCCGA CTACTTCGAT GTGCTGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440
ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTGATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500
CTGTTTTTCT CTTTCACGGG ATTAAGTTTT GAGTCTGTAA CGTTAGTTGT TTGTAGCAAG 1560
TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTGTGCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620
GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1680
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCCGGGAA TTC 1713
SEQ ID N 3
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys glu Ile
1 5 10
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95
Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile
15 20 25 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAG CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu
35 40 45
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu
50 55 60
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Gly Leu Ser Val glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val
65 70 75
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln
80 85 90
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT 335
Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala
95 100 105 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro
115 120 125
AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln
130 135 140
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479
Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val
145 ; 150 155
CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT
Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser
160 165 170
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT
Gly Ser Ila Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC
Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser
195 '200 205
ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671
Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val
210 215 220
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719
Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly
225 230 235
SEQ ID N 3 (suite)
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767
Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser
240 245 250
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007
Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg 335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr 415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val L
435 440
TAA 1340
SEQ ID N 4
Aie Gly Ala Glu Glu rie Val Leu Gin Pro ile Lys Glu Ile Ser Gly
5 5 10 15
Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ser Clu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn
35 40 45
Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu gly leu
50 55 60
Ber Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ais Val Val Val Gly Cys
65 70 75 80
Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu As; Ais Lys Glu Glu Val Gln Leu Ph.
SEQ ID N I
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:
ATGGCAGATC TATACGAAAA CCCAATGGGC CTGATGGGCT TTGAATTCAT CGAATTAGCG 60
TCGCCGACGC CGGGTACCCT GGAGCCGATC TTCGAGATCA TGGGCTTCAC CAAAGTCGCG 120
ACCCACCGTT CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 180
AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCCTACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 240
ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 300
CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 360
GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420
GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGGAGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480
GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGGTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 540
AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600
ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCGGACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660
TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 720
CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 780
ATGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT 840
GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 900
GTGSAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 960
TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020
CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGACCAGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA 1077
SEQ ID N 2
AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60
ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120
CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCGTCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA 180
TCCTCCTACT CGCCGCCCTG TCCGAGGGGA CAACAGTGGT TGATAACCTG CTGAACAGTG 240
AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300
AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTGTTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360
AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGGCCA TTGACAGCAG 420
CTGTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA AGAATGAGGG 480
AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTGTCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540
TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600
AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCAGCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660
CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGATTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720
TCGAAATGAC ATTGAGATTG ATGGAGCGTT TTGGTGTGAA AGCAGAGCAT TCTGATAGCT 780
GGGACAGATT CTACATTAAG GGAGGTCAAA AATACAAGTC CCCTAAAAAT GCCTATGTTG 840
AAGGTGATGC CTCAAGCGCA AGCTATTTCT TGGCTGGTGC TGCAATTACT GGAGGGACTG 900
TGACTGTGGA AGGTTGTGGC ACCACCAGTT TGCAGGGTGA TGTGAAGTTT GCTGAGGTAC 960
TGGAGATGAT GGGAGCGAAG GTTACATGGA CCGAGACTAG CGTAACTGTT ACTGGCCCAC 1020
CGCGGGAGCC ATTTGGGAGG AAACACCTCA AGGCGATTGA TGTCAACATG AACAAGATGC 1080
CTGATGTCGC CATGACTCTT GCTGTGGTTG CCCTCTTTGC CGATGGCCCG ACAGCCATCA 1140
GAGACGTGGC TTCCTGGAGA GTAAAGGAGA CCGAGAGGAT GGTTGCGATC CGGACGGAGC 1200
TAACCAAGCT GGGAGCATCT GTTGAGGAAG GGCCGGACTA CTGCATCATC ACGCCGCCGG 1260
AGAAGCTGAA CGTGACGGCG ATCGACACGT ACGACGACCA CAGGATGGCC ATGGCCTTCT 1320
CCCTTGCCGC CTGTGCCGAG GTCCCCGTCA CCATCCGGGA CCCTGGGTGC ACCCGGAAGA 1380
CCTTCCCCGA CTACTTCGAT GTGCTGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440
ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTGATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500
CTGTTTTTCT CTTTCACGGG ATTAAGTTTT GAGTCTGTAA CGTTAGTTGT TTGTAGCAAG 1560
TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTGTGCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620
GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1680
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCCGGGAA TTC 1713
SEQ ID N 3
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys glu Ile
1 5 10
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95
Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile
15 20 25 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAG CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu
35 40 45
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu
50 55 60
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Gly Leu Ser Val glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val
65 70 75
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln
80 85 90
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT 335
Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala
95 100 105 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro
115 120 125
AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln
130 135 140
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479
Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val
145 ; 150 155
CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT
Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser
160 165 170
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT
Gly Ser Ila Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC
Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser
195 '200 205
ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671
Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val
210 215 220
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719
Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly
225 230 235
SEQ ID N 3 (suite)
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767
Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser
240 245 250
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007
Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg 335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr 415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val L
435 440
TAA 1340
SEQ ID N 4
Aie Gly Ala Glu Glu rie Val Leu Gin Pro ile Lys Glu Ile Ser Gly
5 5 10 15
Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ser Clu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn
35 40 45
Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu gly leu
50 55 60
Ber Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ais Val Val Val Gly Cys
65 70 75 80
Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu As; Ais Lys Glu Glu Val Gln Leu Ph.
85 90 . 95
Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr
100 105 110
Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met
115 120 125
Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly len Lys Gln Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val
145 150 155 160
Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gla Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala
180 185 190
Leu Gly kp Val Glu Ile Glu ils Ile As; Lys Leu Ile Ber Ile Pro
195 200 205
Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala
210 215 220
Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys
225 230 235 240
Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala
245 250 255
Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ma Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val
260 265 270
Glu Gly C'a Gly Thr Thr Ser Leu Gin Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu
275 280 285
Val Leu Glu Moi Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val
290 295 300
Thr Val Thr @ Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys Nia Leu Lys
305 310 315 320
Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu
325 330 335
Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val
340 345 350
Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys
370 375 380
Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr
385 390 395 400
Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu
405 410 415
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro
420 425 430
Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
SEQ ID N 5
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile
1 5 10
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC MG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95
Ser Giy Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile
15 20 25 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu
35 40 45
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu
50 55 60
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Gly Leu Ser Val Glu Als Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val
65 70 75
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln
80 85 90
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ATC GCA ATG CGG TCC TTG ACA GCA GCT
Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala ala
95 100 105 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro
115 120 125
AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gin
130 135 140
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT
Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val
145 150 155
CGT GTC MT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527
Arg Val Asn Gly Ile Giy Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser
160 165 170
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT
Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC
Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser
195 200 205
ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG
Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val
210 215 220
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT
Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly
225 230 235
SEQ ID N0 S (suite)
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA
Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser
240 245 250
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG
Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg 335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC
Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCG ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr 415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
TAA 1340
SEQ ID N 6
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu
20 25
Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn
35 40 45
Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu
50 55 60
Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys
65 70 75 80
Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe
85 90 95
Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr
100 105 110
Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met
115 120 125
Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val
145 150 155 160
Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala
180 185 190
Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro
195 200 205
Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala
210 215 220
Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys
225 230 235 240
Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala
245 250 255
Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val
260 265 270
Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu
275 280 285
Val Leu Glu Net Net Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val
290 295 300
Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320
Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu
325 330 335
Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp val
340 345 350
Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met val Ala Ile Arg Thr
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys
370 375 380
Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr
385 390 395 400
Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu
405 410 415
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro
420 425 430
Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr
100 105 110
Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met
115 120 125
Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly len Lys Gln Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val
145 150 155 160
Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gla Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala
180 185 190
Leu Gly kp Val Glu Ile Glu ils Ile As; Lys Leu Ile Ber Ile Pro
195 200 205
Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala
210 215 220
Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys
225 230 235 240
Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala
245 250 255
Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ma Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val
260 265 270
Glu Gly C'a Gly Thr Thr Ser Leu Gin Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu
275 280 285
Val Leu Glu Moi Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val
290 295 300
Thr Val Thr @ Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys Nia Leu Lys
305 310 315 320
Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu
325 330 335
Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val
340 345 350
Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys
370 375 380
Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr
385 390 395 400
Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu
405 410 415
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro
420 425 430
Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
SEQ ID N 5
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile
1 5 10
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC MG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95
Ser Giy Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile
15 20 25 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu
35 40 45
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu
50 55 60
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Gly Leu Ser Val Glu Als Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val
65 70 75
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln
80 85 90
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ATC GCA ATG CGG TCC TTG ACA GCA GCT
Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala ala
95 100 105 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro
115 120 125
AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gin
130 135 140
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT
Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val
145 150 155
CGT GTC MT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527
Arg Val Asn Gly Ile Giy Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser
160 165 170
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT
Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC
Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser
195 200 205
ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG
Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val
210 215 220
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT
Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly
225 230 235
SEQ ID N0 S (suite)
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA
Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser
240 245 250
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG
Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg 335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC
Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCG ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr 415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
TAA 1340
SEQ ID N 6
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu
20 25
Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn
35 40 45
Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu
50 55 60
Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys
65 70 75 80
Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe
85 90 95
Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr
100 105 110
Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met
115 120 125
Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val
145 150 155 160
Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala
180 185 190
Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro
195 200 205
Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala
210 215 220
Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys
225 230 235 240
Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala
245 250 255
Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val
260 265 270
Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu
275 280 285
Val Leu Glu Net Net Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val
290 295 300
Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320
Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu
325 330 335
Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp val
340 345 350
Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met val Ala Ile Arg Thr
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys
370 375 380
Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr
385 390 395 400
Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu
405 410 415
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro
420 425 430
Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
Claims (34)
- codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide.des éléments de régulation nécessaires à sa transcription dans les plantes et une séquenceRevendications 1. Gène chimère comprenant au moins deux gènes chimères élémentaires contenant chacun
- 2. Gène chimère selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre untroisième gène chimère contenant une séquence codante pour une enzyme conférant auxplantes une tolérance herbicide.
- 3. Gène chimère selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'une desséquences codantes code pour l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD).
- 4. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la secondeséquence codante est issu d'une nitrilase Klebsiella sp.conférant une tolérance à unherbicide de la famille des dihalogénohydroxybenzonitriles.
- 5. Gène chimère selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'herbicide est le bromoxynil.
- 6. Gène chimère selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'herbicide est l'ioxynil.
- 7. Gène chimère selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la secondeséquence codante code pour une EPSPS conférant une tolérance à un herbicide inhibiteur de 1'EPSPS.
- 8. Gène chimère selon la revendication 7, caractérisé en ce que la seconde séquence codantecode pour une EPSPS conférant une tolérance au glyphosate.
- 9. Gène chimère selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que la séquencecodante pour l'HPPD est issue de Pseudomonas sp.
- 10. Gène chimère selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence codantepour l'FIPPD est issue de Pseudomonas fluorescens.
- 11. Gène chimère selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que la séquencecodante pour l'HPPD est d'origine végétale.
- 12. Gène chimère selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence codante pourl'HPPD est issue d'Arabidopsis thaliana.
- 13. Gène chimère selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence codante pourl'HPPD est issue de Daucus carota.
- 14. Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimère selon l'une des revendications1 à 13.
- 15. Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est constitué par un plasmide.
- 16. Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux gènes chimèresélémentaires contenant chacun des éléments de régulation et une séquence codante codantpour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide.
- 17. Cellule végétale selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle contient trois gèneschimères élémentaires contenant chacun des éléments de régulation et une séquencecodante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide.
- 18. Cellule végétale selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisée en ce qu'ellecontient au moins un gène chimère, selon l'une des revendications 1 à 13.
- 19. Cellule végétale selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisée en ce qu'elle contientau moins un vecteur comprenant une séquence codante pour l'hydroxy-phényl pyruvatedioxygénase (HPPD).
- 20. Plante, caractérisée en ce qu'elle contient une cellule végétale selon l'une desrevendications 16 à 19.
- 21. Procédé de transformation des plantes pour les rendre tolérantes à au moins d euxherbicides, caractérisé en ce qu'on insère dans une cellule végétale un gène selon lesrevendications 1 à 13 et que les cellules transformées sont soumises à une régénération.
- 22. Procédé d'obtention de plantes à tolérance herbicide multiple par trangénèse des plantes,caractérisé en ce que:- dans une première étape, on insère dans plusieurs cellules respectivement un des gènesélémentaires contenant chacun des éléments de régulation nécessaires à satranscription dans les plantes et une séquence codante codant pour une enzymeconférant aux plantes la tolérance à un herbicide, et que- ensuite les plantes sont croisées pour obtenir des plantes à tolérance multiple.
- 23. Procédé de traitement herbicide de plantes selon la revendication 22, caractérisé en cequ'on applique au moins deux herbicides.
- 24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'on applique trois herbicides.
- 25. Procédé selon l'une des revendications 22 à24, caractérisé en ce que l'un des herbicidesest un inhibiteur de 1'HPPD.
- 26. Procédé selon l'une des revendications 23 à 25, caractérisé en ce que les deux herbicidessont appliqués simultanément.
- 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que les deux herbicides sontappliqués sous la forme d'une seule composition prête à l'emploi.
- 28. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que les deux herbicides sontappliqués sous la forme d'un mélange extemporané.
- 29. Procédé l'une des revendications 23 à 25, caractérisé en ce que les deux herbicides sontappliqués successivement.
- 30. Procédé selon l'une des revendications 23 à 29, caractérisé en ce que l'herbicideinhibiteur de 1'HPPD est l'isoxaflutole.
- 31. Procédé selon l'une des revendications 23 à 29, caractérisé en ce que l'herbicideinhibiteur de l'HPPD est la sulcotrione.
- 32. Procédé selon l'une des revendications 23 à 31, caractérisé en ce que l'herbicideappartient à la famille des dihydrogènohydroxybenzonitriles.
- 33. Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce que l'herbicide est le bromoxynil.
- 34. Procédé selon l'une des revendications 23 à 33, caractérisé en ce que ltherbicideinhibiteur de l'EPSPS est le glyphosate.
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