CN105219773B

CN105219773B - 嵌合启动子及其用途

Info

Publication number: CN105219773B
Application number: CN201510587552.1A
Authority: CN
Inventors: 庞洁; 张成伟; 王登元; 刘海利; 吴业春
Original assignee: Beijing Dbn Biotech Co Ltd; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2013-12-25
Publication date: 2017-09-26
Anticipated expiration: 2033-12-25
Also published as: CN103740715B; CN105219773A; CN103740715A

Abstract

本发明涉及一种嵌合启动子及其用途，所述嵌合启动子包括至少一个花叶病毒启动子的顺式元件，所述花叶病毒启动子的顺式元件有效连接至少一个Tsf1启动子的顺式元件。本发明嵌合启动子有利于除草剂耐性蛋白质的表达，尤其是草甘膦耐性蛋白质，且显著增强了转基因大豆植物对除草剂的耐受性。

Description

嵌合启动子及其用途

本申请为中国专利申请201310724357.X的分案申请，发明名称：嵌合启动子及其用途，申请日：2013年12月25日。

技术领域

本发明涉及一种嵌合启动子及其用途，特别是涉及一种花叶病毒启动子的顺式元件有效连接Tsf1启动子的顺式元件的嵌合启动子及其用途。

背景技术

植物遗传工程的最新进展为改善植物性状的工程打开了新的大门，如植物抗病性、昆虫抗性、除草剂耐受性、提高产量、改善植物可食用部分的营养质量和增强从植物中获得的终端消费产品的保质期或稳定性。因此，具有分子功能的目的基因可以被适当的整合入植物的基因组以传递不同或者改善性状或质量。新整合基因的编码序列在植物细胞中表达以显示目标新性状。重要的是适当的调控信号必须以合适的结构存在才能在植物细胞中获得新插入基因的编码序列的表达。这些调控信号典型地包括启动子区域、5’非翻译引导序列和3’转录终止子/聚腺苷酸化序列。

为产生转基因植物，将包括异源基因序列的构建体引入植物细胞，所述异源基因序列当在植物中表达时赋予所需表型。所述构建体还包括有效连接所述异源基因序列的植物启动子，该植物启动子通常在一般情况下不与所述异源基因连接。将所述构建体引入植物细胞，产生转化植物细胞，然后将所述转化植物细胞再生为转基因植物。所述启动子控制该启动子有效连接的所引入DNA序列的表达，并因此影响所述DNA序列所赋予的所需特性。

利用多种启动子定制基因表达可能是有利的，以便一个基因或多个基因在植物生长和发育的恰当时间、在所述植物中的最佳位点并且以产生所需效应所需的量有效转录。例如，基因产物的组成型表达在植物的一个位点可能是有利的，但在该植物的另一部分就不是那么有利了。在其他情况下，在植物某个发育阶段或在应答某些环境或化学刺激时产生基因产物可能是有利的。遗传改良种质的商业化发展也已经前进到将多种性状引入作物的阶段，该方法常常被称为基因堆积方法。在该方法中，可以将赋予不同目的性状的多种基因引入植物。当将多种基因引入植物时，重要的是调整或控制每个基因以获得最佳表达，并且使得调控元件多样化，以降低基因沉默的可能性。考虑上述原因，在植物生物工程技术中基因表达的最佳控制和调控元件多样化显然是重要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种嵌合启动子及其用途，即花叶病毒启动子的顺式元件有效连接Tsf1启动子的顺式元件的嵌合启动子，有利于除草剂耐性蛋白质的表达，尤其是草甘膦耐性蛋白质，显著地增强了转基因大豆植物对除草剂的耐受性。

为实现上述目的，本发明提供了一种嵌合启动子，包括至少一个花叶病毒启动子的顺式元件，所述花叶病毒启动子的顺式元件有效连接至少一个Tsf1启动子的顺式元件。

进一步地，所述花叶病毒启动子为花椰菜花叶病毒启动子、玄参花叶病毒启动子、花生萎黄病条纹花叶病毒启动子、木薯叶脉花叶病毒启动子或紫茉莉花叶病毒启动子。。

更进一步地，所述花叶病毒启动子的顺式元件为花叶病毒启动子的顺式增强子元件。

在上述技术方案的基础上，所述Tsf1启动子为拟南芥Tsf1启动子或油菜Tsf1启动子。

优选地，所述拟南芥Tsf1启动子的序列如SEQ ID NO:1所示，所述油菜Tsf1启动子的序列如SEQ ID NO:2所示。

所述嵌合启动子为FMV:BrTsf1、MMV:AtTsf1、PCISV:AtTsf1、CsVMV:AtTsf1或CaMV:BrTsf1。

优选地，所述嵌合启动子的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:6所示。

为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包括所述嵌合启动子和结构DNA序列，所述结构DNA序列有效连接所述嵌合启动子。

进一步地，所述结构DNA序列编码除草剂耐性蛋白质或昆虫抗性蛋白质。

更进一步地，所述结构DNA序列编码草甘膦耐性蛋白质。

优选地，所述草甘膦耐性蛋白质为5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。

所述结构DNA序列编码赋予植物除草剂耐性蛋白质，所述除草剂耐性蛋白质包括但不限于草甘膦耐性蛋白质，如单独的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，或者其与一种或多种草甘膦降解蛋白质的组合。

在上述技术方案的基础上，所述草甘膦耐性蛋白质与叶绿体转运肽有效连接。

所述草甘膦耐性蛋白质与转录终止子有效连接。

优选地，所述表达盒包括与EPSPS的结构DNA序列有效连接的FMV:BrTsf1，所述EPSPS的结构DNA序列与拟南芥属叶绿体转运肽CTP2和E9终止子有效连接。

所述表达盒包括与EPSPS的结构DNA序列有效连接的MMV:AtTsf1，所述EPSPS的结构DNA序列与拟南芥属叶绿体转运肽CTP2和E9终止子有效连接。

所述表达盒包括与EPSPS的结构DNA序列有效连接的PCISV:AtTsf1，所述EPSPS的结构DNA序列与拟南芥属叶绿体转运肽CTP2和E9终止子有效连接。

所述表达盒包括与EPSPS的结构DNA序列有效连接的CsVMV:AtTsf1，所述EPSPS的结构DNA序列与拟南芥属叶绿体转运肽CTP2和E9终止子有效连接。

为实现上述目的，本发明还提供了一种DNA构建体，包括至少一个所述表达盒。

为实现上述目的，本发明还提供了一种在植物中表达结构DNA序列的方法，包括将所述DNA构建体引入植物细胞。

为实现上述目的，本发明还提供了一种控制杂草的方法，包括将所述DNA构建体导入植物，施用足量草甘膦以控制杂草而不损害所述植物。

进一步地，所述足量草甘膦为不高于每公顷10080克的草甘膦。

为实现上述目的，本发明还提供了一种所述嵌合启动子或所述DNA构建体在构建转基因植物中的用途。

本发明中术语“核酸(序列)”或“多核苷酸(序列)”指基因组来源或合成来源的单链或双链DNA或RNA，即分别是从5’(上游)端读到3’(下游)端的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的聚合物。核酸可以代表有义链或互补(反义)链。

“天然的”指天然出现的(“野生型”)核酸序列。

“异源的”序列指源自外来来源或物种的序列，或者当来自同一来源时指由其原始形式受到修饰的序列。

“分离的”核酸序列是与所述核酸天然出现的生物细胞中其通常结合的其它核酸序列(即其它染色体DNA或染色体外DNA)基本分离或纯化出来的。该术语包括经过生物化学纯化以便基本去除污染的核酸和其它细胞成份的核酸。该术语还包括重组核酸和化学合成的核酸。

“基本纯化的”指与其天然状态通常结合的其它分子分离开来的分子。更优选基本纯化的分子是在制备物中主要存在的种类。基本纯化的分子可以不含有天然混合物中存在的60％、优选75％、更优选90％其它分子(不包括溶剂)。术语“基本纯化的”并不包括以天然状态存在的分子。

假如两种核酸序列的布置使得第一种核酸序列影响第二种核酸序列的功能，那么所述第一种核酸序列就与所述第二种核酸序列“有效连接”。优选这两种序列是单一连续核酸分子的组成部分，或者更优选是临近的。例如，假如一种启动子调节或介导一种基因在细胞中的转录，那么所述启动子就与所述基因有效连接。

“重组”核酸是通过人工组合两种在其它情况下是分离的序列区段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸区段。进行核酸操作的技术是众所周知的。

“转基因”指已经引入外源核酸(如重组构建体)的细胞、组织、器官或生物。所引入的核酸最好整合入受体细胞、组织、器官或生物的基因组DNA，以便所引入的核酸通过随后的后代遗传。“转基因”细胞或生物还包括所述细胞或生物的后代，以及由使用所述“转基因”植物作为杂交亲本的育种程序产生、并表现由于重组构建体或构建体的存在而引起的表型改变的后代。

本发明中术语“基因”指染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成DNA或其它编码肽、多肽、蛋白或RNA分子的DNA、以及在编码序列两侧参与表达调节的区。一些基因可以转录成为mRNA并翻译成为多肽(结构基因)；而其它基因可以转录成为mRNA(如rRNA、tRNA)；其它类型基因作为表达调节物起作用(调节基因)。

基因“表达”指基因转录产生对应mRNA并且该mRNA翻译产生对应基因产物，即肽、多肽或蛋白。调节元件控制或调整基因表达，所述调节元件包括5’调节元件如启动子。

本发明中术语“重组DNA构建体”、“DNA构建体”、“重组构建体”、“表达构建体”或“表达盒”指来自任何来源、能够整合入基因组或自主复制的任何因子如质粒、粘粒、病毒、BAC(细菌人工染色体)、自主复制型序列、噬菌体、或者线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列，包括其中一种或多种DNA序列使用众所周知的重组DNA技术以功能性可操作方式连接的DNA分子。

“同源性”指核酸序列或氨基酸序列分别按照核苷酸或氨基酸位置同一性百分率而言的相似性水平(即序列相似性或同一性)。同源性也指在不同核酸或蛋白之间相似功能特性的概念。

本发明中术语“启动子”是指DNA调节区，通常含有能够引导RNA聚合酶II在特定编码序列的适合转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。启动子可另外含有其它的识别序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，称作上游启动子元件，它们影响转录起始速率。“植物启动子”是在植物细胞中有功能的天然或非天然启动子。当所述启动子与异源DNA序列融合时，所述启动子通常引起所融合的序列以类似于所述启动子正常连接的基因序列的转录方式进行转录。可以加入包括调节序列的启动子片段(例如融合到具有其自身的部分或完全调节序列的活性启动子的5’端，或插入其中)。

启动子通常包含多个独立的“顺式作用转录调节元件”或简称“顺式元件”，每个顺式元件赋予对基因表达总体控制的不同方面。“顺式元件”结合调节转录的反式作用蛋白因子。一些顺式元件结合不止一种因子，而反式作用转录因子可以与不止一个顺式元件以不同亲和性相互作用。本发明的启动子序列可以包含赋予或调节基因表达的“顺式元件”。

植物启动子也可以包括通过操作已知启动子以获得合成、嵌合或杂种启动子而产生的启动子。这样的启动子也可以结合来自一个或多个启动子的顺式元件，例如通过在具有其自身部分或完全调节序列的活性启动子上添加异源调节序列；也可以通过在无活性的截短启动子的5’上游区添加异源调节序列，发展出嵌合启动子，所述无活性的截短启动子即仅包括核心TATA并任选包括CCAAT元件的启动子。

依照本发明的嵌合或杂种启动子可以包括至少一种已知的顺式元件，如由各种环境因子如光、热或胁迫调节的元件；由病原体或化学药品等调节或诱导的元件。根据所述条件，这类元件可以或者正调节或者负调节基因的表达。顺式元件的例子包括但不限于氧效应元件、光调节元件、响应茉莉酮酸甲酯处理的顺式元件、水杨酸效应元件、热激反应元件、响应创伤和非生物性胁迫的元件、冷效应元件以及干旱效应元件。本发明中所公开序列的顺式元件可以赋予特定的特异性，例如赋予有效连接的DNA序列在某些组织中的增强表达。

启动子元件可以加性作用或协同作用影响启动子活性。可以串联排列来自不同5’调节区的启动子元件，获得具有不同活性范围或不同表达分布型的启动子。因此，来自异源来源的启动子元件组合或者相似元件或相同元件的重复可能赋予有效连接的可转录序列的更高水平表达。例如，可以形成一种启动子元件的多聚体，以增加由该启动子元件所实现模式的特异性表达的水平。

对于许多农学性状，需要在多种组织中转录一个或多个目的基因以赋予所需的特征。需要获得调节有效连接的基因在选定靶组织中转录的合适启动子，因为可能不希望在所有组织中表达基因，而是仅在某些组织中表达基因。例如，假如人们希望选择性表达靶基因以表达除草剂耐性基因，人们可能希望在营养性组织和生殖组织中表达所述除草剂耐性基因。本发明的启动子序列可以用于在多种组织中调节基因表达，所述组织包括但不限于快速生长的分生组织、雄性生殖组织(如花粉、花药和花丝)、雌性生殖组织(如柱头、花柱和子房)、叶、萼片和花瓣。因此，本发明的启动子可用于表达除草剂耐性基因，例如当在植物发育的多种组织和阶段需要耐性时表达。本发明的启动子序列可用于调节任何靶基因的转录，所述靶基因包括但不限于控制下列性状的基因：育性、产量、抗虫性、真菌耐性、除草剂耐性或任何所需性状，尤其优选的基因包括除草剂耐性基因或抗虫性基因。

当需要在多种组织中表达除草剂耐性基因时，本发明的启动子尤其可用于调节除草剂耐性基因的表达。例如所述除草剂耐性基因可以赋予对除草剂草甘膦的耐性。合适的草甘膦耐性基因的例子包括但不限于草甘膦抗性EPSPS基因或降解草甘膦的基因产物如草甘膦氧化还原酶和膦酸N-乙酰转移酶。对于任何植物生物工程策略而言，获得5’调节元件的广泛选择是重要的，以便获得对于所需的表达分布型最为有效的合适调节元件。

在杂交技术中，己知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，与来自被选生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段(如基因组文库或cDNA文库)群体中存在的其它对应核苷酸序列选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探测的基团如³²P或其它任何可探测标记物标记。因此，例如，通过标记根据本发明序列的合成寡核苷酸可以制备杂交探针。

序列的杂交可在严格条件下进行。所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在pH7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，典型地大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10至50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低度严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％至1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4至12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，T_m可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的方程估算：T_m＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。T_m是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需T_m降低大约1℃；因此，T_m杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，T_m可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(T_m)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(T_m)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(T_m)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(T_m)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的T_m，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格程度的变化而变化。如果所需的错配程度使T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York)。见Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

表达盒可另外含有可选择的标记基因。一般地，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。所述选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。所述选择性标记基因包括但不限于，编码抗生素抗性的基因(如编码新霉素磷酸转移酶II(NPT))和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-D)。

在表达盒制备中，可以操控不同的DNA片段以提供适当方向的DNA序列，并在适合的时候提供适当的阅读框。所以，可应用接受子或连接子结合DNA片段，或可进行其它操控以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，如转变和转换。

本领域公知的，另外的序列修饰可提高细胞宿主中的基因表达水平。这些包括但不限于，去除编码假性聚腺苷信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子的重复序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表达的序列。序列的G-C含量可调节到指定宿主细胞的平均水平，引用宿主细胞中己知的基因表达水平进行计算。可能地，修饰序列以避免预测的发夹式mRNA二级结构。

在表达盒或DNA构建体中，表达盒可另外含有5’前导序列。所述前导序列可以起改进转录效率的作用。所述前导序列为本领域已知的，包括但不限于，细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)；马铃薯病毒组前导序列，例如烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列、玉米矮小花叶病毒(MDMV)前导序列和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)；来自紫花苜蓿花叶病毒包被蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列；烟草花叶病毒(TMV)前导序列；和玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)前导序列。还可以使用其它己知的改进转录效率的元件，例如内含子等。

转化方案以及将核苷酸序列导入植物的方案依定向转化的植物或植物细胞类型而异，即单子叶植物或双子叶植物。将核苷酸序列导入植物细胞并随后插入植物基因组中的适合方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。

已经转化的细胞可按照常规的方式生长成植物。这些植物被培育，用相同的转化株或不同的转化株授粉，得到的杂交体表达所需的被鉴定的表现型特征。可培育二代或多代以保证稳定地保持和遗传所需表现型特征的表达，然后收获可保证得到所需表现型特征表达的种子。

分析转化植物中目的基因的存在以及本发明启动子序列赋予的表达水平和/或分布型。本领域内的技术人员知道可用于分析转化植物的多种方法。使用多种方法评价基因表达，并确定所引入的基因是否整合、是否正常起作用以及是否如所预期地遗传。对于本发明，可以通过测定启动子有效连接的基因的表达水平评价所述启动子。使用报告基因、通过瞬时测定方法可以获得更确定性的启动子评价。植物分析方法包括但不限于DNA印迹分析或RNA印迹分析、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、田间评价和免疫诊断学测定。

本发明的方法包括但不限于PCR技术、分离基因组DNA、构建表达构建体、瞬时测定和植物转化方法，这些方法是本领域内技术人员众所周知的，并使用标准技术或其修改形式执行。

本发明提供了一种嵌合启动子及其用途，本发明嵌合启动子采用eFMV:prBrTsf1、eMMV:prAtTsf1、ePCISV:prAtTsf1和eCsVMV:prAtTsf1，有利于除草剂耐性蛋白质的表达，尤其是草甘膦耐性蛋白质；且具有影响结构DNA序列(EPSPS基因)在植物中表达水平的效果，特别是显著地增强了转基因大豆植物对除草剂的耐受性。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明嵌合启动子及其用途的重组表达载体DBN100040示意图；

图2为本发明嵌合启动子及其用途的重组表达载体DBN100052示意图；

图3为本发明嵌合启动子及其用途的重组表达载体DBN100051示意图；

图4为本发明嵌合启动子及其用途的重组表达载体DBN100039示意图；

图5为本发明嵌合启动子及其用途的重组表达载体DBN100036示意图；

图6为本发明嵌合启动子及其用途的转基因玉米植株除草剂抗性效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明嵌合启动子及其用途的技术方案。

第一实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有嵌合启动子的重组表达载体

利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，重组表达载体DBN100040(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))如图1所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；eFMV：玄参花叶病毒的34S增强子；prBrTsf1：油菜真核延长因子基因1α(Tsf1)启动子(SEQ ID NO:2；eFMV:prBrTsf1(SEQ ID NO:3))；CTP2：拟南芥属EPSPS的叶绿体转运肽(SEQ ID NO:8)；EPSPS：5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID NO:9)；E9：豌豆RbcS基因的终止子(SEQ ID NO:10)；prCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQID NO:11)；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:12)；tCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:13)；LB：左边界)。

按照上述构建重组表达载体DBN100040的方法，构建重组表达载体DBN100052(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))如图2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；eMMV：紫茉莉花叶病毒的增强子；prAtTsf1：拟南芥真核延长因子基因1α(Tsf1)启动子(SEQID NO:1；eMMV:prAtTsf1(SEQ ID NO:4))；CTP2：拟南芥属EPSPS的叶绿体转运肽(SEQ IDNO:8)；EPSPS：5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID NO:9)；E9：豌豆RbcS基因的终止子(SEQ ID NO:10)；prCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:11)；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:12)；tCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:13)；LB：左边界)。

按照上述构建重组表达载体DBN100040的方法，构建重组表达载体DBN100051(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))如图3所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；ePCISV：花生萎黄病条纹花叶病毒的增强子；prBrTsf1：油菜真核延长因子基因1α(Tsf1)启动子(SEQ ID NO:2；ePCISV:prAtTsf1(SEQ ID NO:5))；CTP2：拟南芥属EPSPS的叶绿体转运肽(SEQ ID NO:8)；EPSPS：5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID NO:9)；E9：豌豆RbcS基因的终止子(SEQ ID NO:10)；prCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:11)；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:12)；tCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:13)；LB：左边界)。

按照上述构建重组表达载体DBN100040的方法，构建重组表达载体DBN100039(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))如图4所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；eCsVMV：木薯叶脉花叶病毒的增强子；prAtTsf1：拟南芥真核延长因子基因1α(Tsf1)启动子(SEQ ID NO:1；eCsVMV:prAtTsf1(SEQ ID NO:6))；CTP2：拟南芥属EPSPS的叶绿体转运肽(SEQ ID NO:8)；EPSPS：5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID NO:9)；E9：豌豆RbcS基因的终止子(SEQ ID NO:10)；prCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:11)；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:12)；tCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:13)；LB：左边界)。

2、构建重组表达载体DBN100036(正对照)

按照上述构建重组表达载体DBN100040的方法，构建重组表达载体DBN100036(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))如图5所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；eFMV：玄参花叶病毒的34S增强子；prAtTsf1：拟南芥真核延长因子基因1α(Tsf1)启动子(SEQ ID NO:1；eFMV:prAtTsf1(SEQ ID NO:7))；CTP2：拟南芥属EPSPS的叶绿体转运肽(SEQID NO:8)；EPSPS：5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID NO:9)；E9：豌豆RbcS基因的终止子(SEQ ID NO:10)；prCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:11)；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:12)；tCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:13)；LB：左边界)。

3、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体DBN100040、DBN100052、DBN100051、DBN100039和DBN100036用液氮法转化到农杆菌EHA101中，其转化条件为：100μL农杆菌EHA101、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌EHA101接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，酶切验证结果表明重组表达载体DBN100040、DBN100052、DBN100051、DBN100039和DBN100036结构完全正确。

第二实施例、转基因大豆植株的获得及验证

1、获得转基因大豆植株

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的大豆品种中黄13的子叶节组织与第一实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第一实施例中1和2构建的重组表达载体DBN100040、DBN100052、DBN100051、DBN100039和DBN100036中的T-DNA(包括eFMV:prBrTsf1核苷酸序列、eMMV:prAtTsf1核苷酸序列、ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列、eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列、eFMV:prAtTsf1核苷酸序列、CTP2核苷酸序列、EPSPS基因、E9终止子序列、prCaMV35S启动子序列、PAT基因和tCaMV35S终止子序列)转入到大豆染色体组中，获得了转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株；同时以野生型大豆植株作为对照。

对于农杆菌介导的大豆转化，简要地，将成熟的大豆种子在大豆萌发培养基(B5盐3.1g/L，B5维他命，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，pH5.6)中进行萌发，将种子接种于萌发培养基上，按以下条件培养：温度25±1℃；光周期(光/暗)为16/8h。萌发4-6天后取鲜绿的子叶节处膨大的大豆无菌苗，在子叶节下3-4毫米处切去下胚轴，纵向切开子叶，去顶芽、侧芽和种子根。用解剖刀的刀背在子叶节处进行创伤，用农杆菌悬浮液接触创伤过的子叶节组织，其中农杆菌能够将所述嵌合启动子序列传递至创伤过的子叶节组织(步骤1：侵染步骤)在此步骤中，子叶节组织优选地浸入农杆菌悬浮液(OD₆₆₀＝0.5-0.8，侵染培养基(MS盐2.15g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2-吗啉乙磺酸(MES)4g/L、玉米素(ZT)2mg/L，pH5.3)中以启动接种。子叶节组织与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，子叶节组织在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2-吗啉乙磺酸(MES)4g/L、玉米素2mg/L、琼脂8g/L，pH5.6)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、玉米素(ZT)2mg/L、琼脂8g/L，头孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸100mg/L，pH5.6)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，子叶节再生的组织块在含选择剂(草丁膦)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有选择剂的筛选固体培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、琼脂8g/L，头孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸100mg/L，草丁膦6mg/L，pH5.6)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，转化的细胞再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的子叶节再生的组织块在固体培养基(B5分化培养基和B5生根培养基)上培养以再生植物。

筛选得到的抗性组织块转移到所述B5分化培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、玉米素(ZT)1mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素1mg/L、生长素1mg/L、草丁膦6mg/L，pH5.6)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述B5生根培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、吲哚-3-丁酸(IBA)1mg/L)，在生根培养上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于26℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。

2、用TaqMan验证转基因大豆植株

分别取转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测EPSPS基因的拷贝数。同时以野生型大豆植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测EPSPS基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和野生型大豆植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型大豆植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测EPSPS基因：

引物1：TTGGTGCTAACCTTACCGTTGAG如序列表中SEQ ID NO:14所示；

引物2：GCTTACCACGACCTTCAAGACG如序列表中SEQ ID NO:15所示；

探针1：CTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATC如序列表中SEQ ID NO:16所示；

PCR反应体系为：

所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度的探针50μl和860μl 1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。

PCR反应条件为：

利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。

实验结果表明，EPSPS基因均己整合到所检测的大豆植株的染色体组中，而且转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株均获得了含有单拷贝EPSPS基因的转基因大豆植株。

第三实施例、转基因大豆植株的除草剂耐性效果检测

1、EPSPS蛋白的含量检测

本实验中涉及的溶液如下：

萃取缓冲液：8g/L NaCl，0.2g/L KH₂PO₄，2.9g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g/L KCl，5.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

洗涤缓冲液PBST：8g/L NaCl，0.2g/L KH₂PO₄，2.9g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g/LKCl，0.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

终止液：1M HCl。

分别取3mg转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株的叶片(幼苗期)、根(开花期)、茎(开花期)和花(开花期)作为样品，液氮研磨后加入800μl所述萃取缓冲液，4000rpm的转速下离心10min，取上清液用所述萃取缓冲液稀释40倍，取80μl稀释后的上清液用于ELISA检测。用ELISA(酶联免疫吸附测定法)试剂盒(ENVIRLOGIX公司，EPSPS试剂盒)对样品中EPSPS蛋白的表达量占样品鲜重的比例进行检测分析，具体方法参考其产品说明书。

同时以野生型大豆植株(CK)和经Taqman鉴定为非转基因的大豆植株(NGM)作为对照，按照上述方法进行检测分析。每类植株选3个株系，从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。

转基因大豆植株的EPSPS蛋白含量的实验结果如表1所示。分别测得转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、野生型大豆植株(CK)和经Taqman鉴定为非转基因的大豆植株(NGM)的叶片中ELISA平均值(ng/g)分别为216.9、151.6、110.3、129.2、96.7、0.10和0.08；转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、野生型大豆植株(CK)和经Taqman鉴定为非转基因的大豆植株(NGM)的根中ELISA平均值(ng/g)分别为202.3、171.4、123.5、100.3、93.2、0.15和0.13；转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、野生型大豆植株(CK)和经Taqman鉴定为非转基因的大豆植株(NGM)的茎中ELISA平均值(ng/g)分别为177.4、164.8、88.8、66.4、74.3、0和0.11；转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、野生型大豆植株(CK)和经Taqman鉴定为非转基因的大豆植株(NGM)的花中ELISA平均值(ng/g)分别为153.9、141.2、80.7、94.0、79.4、0和0.04。

表1、转基因大豆植株的EPSPS蛋白含量的实验结果

上述结果还表明，转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株的叶片、根、茎和花中ELISA平均值(ng/g)显著高于转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株；转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株的叶片、根、茎和花中ELISA平均值(ng/g)与转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株的叶片、根、茎和花中ELISA平均值(ng/g)相当，在叶片和根中仍高于转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株。这一结果表明嵌合启动子均普遍有利于除草剂耐性蛋白质的表达，如叶片、根、茎和花中；其中除草剂耐性蛋白质尤其是草甘膦耐性蛋白质，如EPSPS。

2、转基因大豆植株的除草剂抗性效果检测

分别取转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株(幼苗期)，并用4×草甘膦(3360g ae/ha，4倍大田浓度)和空白溶剂(水)喷施。喷施7天后观察植株的发育情况。同时以野生型大豆植株(CK)和经Taqman鉴定为非转基因的大豆植株(NGM)作为对照，按照上述方法进行检测分析。每类植株选3个株系，从每个株系选3株进行测试，每株选取40粒种子。结果如图6所示。

图6的结果表明：在喷施空白溶剂(水)7天后，转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、野生型大豆植株(CK)和经Taqman鉴定为非转基因的大豆植株(NGM)之间无明显差异；在喷施4×草甘膦7天后，除了野生型大豆植株(CK)和经Taqman鉴定为非转基因的大豆植株(NGM)均已死亡外，转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株均存在正常生长的植株，且转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株的数量要显著多于转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株；与转入eFMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株相比，转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株的生长比较旺盛，转入eFMV:prBrTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入eMMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株、转入ePCISV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株和转入eCsVMV:prAtTsf1核苷酸序列的大豆植株的叶片基本上均呈绿色。这一结果表明嵌合启动子具有影响结构DNA序列(EPSPS基因)在植物中表达水平的效果，特别是显著地增强了转基因大豆植物对除草剂的耐受性，特别是草甘膦；同时本发明嵌合启动子ePCISV:prAtTsf1和eCsVMV:prAtTsf1可用于替换现有技术嵌合启动子eFMV:prAtTsf1以用于生产。

综上所述，本发明嵌合启动子有利于除草剂耐性蛋白质的表达，尤其是草甘膦耐性蛋白质；且具有影响结构DNA序列(EPSPS基因)在植物中表达水平的效果，特别是显著地增强了转基因大豆植物对除草剂的耐受性。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种嵌合启动子，其特征在于，包括至少一个花叶病毒启动子的顺式元件，所述花叶病毒启动子的顺式元件有效连接至少一个Tsf1启动子的顺式元件；所述Tsf1启动子为拟南芥Tsf1启动子，所述花叶病毒启动子为花生萎黄病条纹花叶病毒启动子、木薯叶脉花叶病毒启动子或紫茉莉花叶病毒启动子。

2.根据权利要求1所述嵌合启动子，其特征在于，所述花叶病毒启动子的顺式元件为花叶病毒启动子的顺式增强子元件。

3.根据权利要求1或2所述嵌合启动子，其特征在于，所述拟南芥Tsf1启动子的序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求1所述嵌合启动子，其特征在于，所述嵌合启动子为MMV:AtTsf1、PCISV:AtTsf1或CsVMV:AtTsf1。

5.根据权利要求4所述嵌合启动子，其特征在于，所述嵌合启动子的序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

6.一种表达盒，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述嵌合启动子和结构DNA序列，所述结构DNA序列有效连接所述嵌合启动子。

7.根据权利要求6所述表达盒，其特征在于，所述结构DNA序列编码除草剂耐性蛋白质或昆虫抗性蛋白质。

8.根据权利要求7所述表达盒，其特征在于，所述结构DNA序列编码草甘膦耐性蛋白质。

9.根据权利要求8所述表达盒，其特征在于，所述草甘膦耐性蛋白质为5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。

10.根据权利要求8所述表达盒，其特征在于，所述草甘膦耐性蛋白质与叶绿体转运肽有效连接。

11.根据权利要求8所述表达盒，其特征在于，所述草甘膦耐性蛋白质与转录终止子有效连接。

12.根据权利要求6-11任一项所述表达盒，其特征在于，所述表达盒包括与EPSPS的结构DNA序列有效连接的MMV:AtTsf1，所述EPSPS的结构DNA序列与拟南芥属叶绿体转运肽CTP2和E9终止子有效连接。

13.根据权利要求6-11任一项所述表达盒，其特征在于，所述表达盒包括与EPSPS的结构DNA序列有效连接的PCISV:AtTsf1，所述EPSPS的结构DNA序列与拟南芥属叶绿体转运肽CTP2和E9终止子有效连接。

14.根据权利要求6-11任一项所述表达盒，其特征在于，所述表达盒包括与EPSPS的结构DNA序列有效连接的CsVMV:AtTsf1，所述EPSPS的结构DNA序列与拟南芥属叶绿体转运肽CTP2和E9终止子有效连接。

15.一种DNA构建体，其特征在于，包括至少一个权利要求8-14任一项所述表达盒。

16.一种在植物中表达结构DNA序列的方法，其特征在于，包括将权利要求15所述DNA构建体引入植物细胞。

17.一种控制杂草的方法，其特征在于，包括将权利要求15所述DNA构建体导入植物，施用足量草甘膦以控制杂草而不损害所述植物。

18.根据权利要求17所述控制杂草的方法，其特征在于，所述足量草甘膦为不高于每公顷10080克的草甘膦。

19.一种权利要求1所述嵌合启动子或权利要求15所述DNA构建体在构建转基因植物中的用途。