DE3031756C2

DE3031756C2 -

Info

Publication number: DE3031756C2
Application number: DE3031756A
Authority: DE
Inventors: Yo Tokio/Tokyo Jp Takiguchi; Hiroshi Yokohama Kanagawa Jp Mishima; Shinjiro Kyoto Jp Yamamoto; Michiya Tokio/Tokyo Jp Terao
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1979-08-23
Filing date: 1980-08-22
Publication date: 1989-11-23
Also published as: FR2463773A1; JPS5632481A; JPH0217555B2; NZ194742A; CH645899A5; AU536200B2; IL60861A0; DE3031756A1; ES8106177A1; BR8005337A; US4346171A; AU6166880A; AU574695B2; MX6259E; SU1011055A3; IT8068315A0; GB2056986B; FR2463773B1; IL60861A; AU3081484A

Description

In der GB-PS 13 90 336 und der DE-OS 23 29 486 ist beschrieben, daß Mikroorganismus des Genus Streptomyces, insbesondere Streptomyces Stamm B-41-146 (Ferm 1438) die antibiotische Substanz B-41 bilden, die in 9 unterschiedliche Bestandteile aufgetrennt werden kann (A₁, A₂, A₃, A₄, B₁, B₂, B₃, C₁ und C₂). Später wurde gefunden, daß vier andere Verbindungen von ähnlicher Struktur durch Züchten desselben Stammes von Streptomyces erhalten werden können. Die Strukturen und Eigenschaften aller 13 Verbindungen sind z. B. in J. Antibiotics, Bd. 29 (3), S. 76-14 bis 76-16 und Bd. 29 (6), S. 76-35 bis 76-42, beschrieben.

In der GB-PS 13 90 336 ist offenbart, daß der Gesamtkomplex der Substanzen B-41 sowie die Einzelsubstanzen insektizide und akarizide Wirkung zeigen. In der US-PS 41 44 352 wurde dann offenbart, daß diese und verwandte Substanzen auch anthelmintische Wirkung besitzen. In der US-PS 41 44 352 werden die B-41-Substanzen als "Milbemycine" bezeichnet. Zur Vereinfachung werden die bekannten Verbindungen im folgenden ebenfalls als "Milbemycine" bezeichnet, obwohl bestimmte unter ihnen Bestandteil der Substanz B-41 sind, die in der GB-PS 13 90 336 beschrieben ist. Verschiedene Milbemycin- Derivate sind in den US-PS 40 93 629 und 41 34 973 beschrieben.

Die 12 Milbemycin-Verbindungen, die bei der Züchtung von Streptomyces B-41-146 erhalten werden, haben die Formeln (I), (II) und (III). Die Milbemycine α _1-10 haben die folgende Struktur:

Hierbei haben die Reste R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ die in der folgenden Tabelle I genannten Bedeutungen, wobei gegebenenfalls auch die in der GB-PS 13 90 336 verwendete B-41- Bezeichung angegeben ist. Von den durch Streptomyces B-41-146 gebildeten 13 bekannten Verbindungen haben die Milbemycine α _1-10 die der erfindungsgemäßen Verbindung B-41D ähnlichste Struktur und die jeweiligen Definitionen der Reste R¹ bis R⁵ für die Verbindung B-41D sind ebenfalls in Tabelle I genannt.

In dieser Tabelle werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
MH bedeutet eine 2-Methylhexanoyloxygruppe der Formel

PC bedeutet eine 2-Pyrrolylcarbonyloxymethylgruppe der Formel

Tabelle 1

Die Milbemycine β₁ und β₂ haben die folgenden Strukturen:

Hierbei bedeutet R⁶ im Falle von Milbemycin β₁ eine Methylgruppe und im Falle von Milbemycin b₂ eine Äthylgruppe. Milbemycin β₁ entspricht der Verbindung B-41A₁ der GB-PS 13 90 336.

Milbemycin β₃ hat die Struktur:

Es wurde nun gefunden, daß durch geeignete Steuerung des Fermentationsverfahrens, mit Hilfe von Streptomyces Stamm B-41-146 (FERM P 1438) eine neue Verbindung mit besserer akarizider und anthelmintischer Wirkung hergestellt werden kann.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung B-41D mit der Formel

durch Züchten von Streptomyces Stamm B-41-146 (FERM P1438 = FERM-BP-1072) in einem geeigneten Kulturmedium und Isolieren der gebildeten Verbindung unter Anwendung von natürlichen oder synthetischen Adsorbenzien, Ionenaustauschern oder Ionenaustausch-Gelfiltern aus dem Kulturmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Züchtung in einem Kulturmedium durchführt, das Sojamehl und Magermilch als Stickstoffquelle enthält.

Die Verbindung B-41D hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften:

(1) Aussehen: Amorphes Pulver oder Kristalle.
(2) Elementar-Analyse (%) für C₃₃H₄₇O₇: ber.: C 71,09, H 8,80, O 20,11;
gef.: C 71,70, H 8,82, O 20,22.
(3) Molekulargewicht: 556.
(4) UV-Absorptionsspektrum: siehe Fig. 1.
Absorptionsmaxima bei 237 nm (Schulter, ε = 29 400) und 243 nm ( ε = 30 500),
(5) IR-Absorptionsspektrum (KBr-Tablette): siehe Fig. 2.
(6) NMR-Spektrum bei 100 MHz in CDCl₃ unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard: siehe Fig. 3.
(7) Löslichkeit: Leicht löslich in Äthylacetat, Aceton, Äthanol und Methanol. Kaum löslich in Wasser.
(8) Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (Kieselgel 60 F₂₅₄; Entwicklung mit Dioxan/Kohlenstofftetrachlorid (Volumenverhältnis 18 : 82):
R_f-Wert = 0,40.

Die Verbindung B-41D kann hergestellt werden durch Züchten von Streptomyces B-41-146 (Ferm 1438). Die morphologischen, physiologischen und Züchtungseigenschaften sowie die taxonomischen Daten des Stammes B-41-146 sind in der GB-PS 13 90 336 beschrieben. Der Stamm ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, hinterlegt worden und dort unter der Hinterlegungs-Nr. Ferm 1438 bzw. FERM BP-1072 zugänglich.

Die erfindungsgemäße Herstellung der Verbindung erfolgt durch Züchten von Streptomyces B-41-146 in einem geeigneten Medium und Gewinnen der erhaltenen Verbindung aus der Fermentationsbrühe. Es können beliebige Nährstoffe verwendet werden, die auch bisher zur Züchtung von Mikroorganismen des Genus Streptomyces eingesetzt wurden. Bekanntlich sollten derartige Kulturmedien mindestens eine assimillierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthalten. Geeignete Kohlenstoffquellen sind z. B. Glucose, Saccharose, Stärke, Glycerin, Malzextrakt, Melasse und Sojaöl. Eine besonders bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose, vorzugsweise in einer Menge von bis zu 8% und insbesondere 6 bis 8% G/V des Kulturmediums. Neben Glucose werden vorzugsweises Lactose, Maltose und/oder Getreidestärke (vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 2,0% G/V) als zusätzliche Kohlenstoffquelle verwendet. Um einen konstanten pH-Wert einzuhalten, wird während der Züchtung vorzugsweise extra Glucose zugesetzt. Geeignete Stickstoffquellen sind z. B. Sojamehl, Weizenkeime, Fleischextrakt, Pepton, Frischhefe, Maisquellflüssigkeit, Ammoniumsulft und Ammoniumnitrat, vorausgesetzt, daß als Stickstoffquelle eine Kombination aus Sojamehl und Magermilch vorhanden ist, vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 1,0% G/V Sojamehl und 1,0 bis 2,0% G/V Magermilch. Gegebenenfalls kann dem Kulturmedium eine Aminosäure, z. B. Glycin oder Arginin, zugesetzt werden.

Ferner können gegebenenfalls anorganische Salze, wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Phosphate, oder andere organische oder anorganische Substanzen zugesetzt werden, die das mikrobielle Wachstum und die Bildung der gewünschten Verbindung fördern.

Überraschend gute Ausbeuten an Verbindung B-41D werden bei Verwendung eines Kulturmediums erzielt, das 6 bis 8% G/V Glucose, 0,5 bis 2% G/V Lactose und/oder Maltose und/oder Getreidestärke, 0,5 bis 1,0% G/V Sojamehl und 1,0 bis 2,0 G/V Magermilch enthält.

Obwohl zur Züchtung von Streptomyces B-41-146 beliebige bekannte Methoden angewandt werden können, die sich zur Fermentation anderer biologisch aktiver Substanzen eignen, sind Flüssigkulturen und insbesondere Submerskulturen besonders bevorzugt. Die Züchtung erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, wobei die Temperatur innerhalb eines breiten Bereiches variieren kann, gewöhnlich 22 bis 30°C und vorzugsweise etwa 28°C. Die Bildung der gewünschten Verbindung B-41D erreicht nach 5- bis 10tägiger Züchtung entweder unter Schütteln oder in einem Tank ein Maximum.

Die Bestimmung der Verbindung B-41D in der Kulturbrühe kann auf folgende Weise erfolgen:
Eine bestimmte Menge, z. B. 3 g, der Kulturbrühe wird in ein kleines Teströhrchen eingebracht, mit 10 ml Aceton versetzt, unter Schütteln extrahiert und hierauf zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird mit Aceton auf ein Gesamtvolumen von 10 ml aufgefüllt. Die erhaltene Lösung wird in einer Menge von z. B. 10 bis 20 µl auf eine Silicagelplatte für die Dünnschichtchromatographie (z. B. Kieselgel 60 G₂₅₄ aufgetragen. Hierauf entwickelt man die Platte 4 Stunden mit Dioxan/Kohlenstofftetrachlorid (Volumenverhältnis 18 : 82). Die Probe wird dann mit einem Doppelstrahl-Dünnschichtchromatographie- Scanner bei einer Wellenlänge von 245 nm (Leerprobe bei 380 nm) ausgewertet. Die Absorption wird mit der einer bekannten Standardprobe der Verbindung verglichen, so daß die Menge an Verbindung B-41D errechnet werden kann.

Die Verbindung B-41D läßt sich aus der Kulturbrühe unter Verwendung von natürlichen Adsorbentien (z. B. Aktivkohle, Aluminiumoxid oder Silicagel), synthetischen Adsorbentien (z. B. Diaion HP-20, Adsorbentien (z. B. Avicel® oder Filterpapier), Ionenaustauscherharzen oder Ionenaustauschgelfiltern abtrennen. Am wirksamsten gelingt die Trennung jedoch nach folgender Methode:

Zunächst wird die Fermentationsbrühe unter Verwendung einer Filtrierhilfe (z. B. Diatomeenerde) filtriert, worauf man den Kuchen mit Methanol extrahiert, um die gewünschte Substanz in einer wäßrigen Methanollösung zu lösen. Die wäßrige Methanollösung wird dann mit Wasser versetzt und mit Hexan extrahiert. Durch Abtrennen und Eindampfen der Hexanphase unter vermindertem Druck erhält man eine ölige Substanz, die die gewünschte Verbindung B-41D enthält. Diese ölige Substanz wird auf eine Silicagelsäule (z. B. Wakogel C-200) aufgegeben und mit einem geeigneten Eluiermittel, z. B. Hexan/ Aceton (Volumenverhältnis 95 : 5), eluiert. Die die gewünschte Verbindung enthaltenden Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingedampft, wobei wieder eine ölige Substanz anfällt, die in einer kleinen Menge Methanol gelöst und auf eine Sephadex®LH-20-Säule aufgegeben und mit Methanol eluiert wird. Die die gewünschte Substanz enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen, worauf man das Lösungsmittel abtrennt und den Rückstand in einer kleinen Menge Methanol löst. Nach Zugabe von Wasser läßt man das Gemisch bei Raumtemperatur stehen. Die Verbindung B-41D wird in Form eines Schaums erhalten, der beim Zerbrechen ein amorphes Pulver ergibt. Durch Umkristallisieren aus Hexan/Äthylacetat (Volumenverhältnis 20 : 1) entstehen kleine Nadeln der Verbindung B-41D, F. 186 bis 188°C.

Obwohl die Verbindung B-41D z. B. auf die vorstehende Weise abgetrennt und gereinigt werden kann, ist es auch möglich, das Reinigungsverfahren in einem beliebigen Stadium zu unterbrechen und das Rohprodukt, das ein Gemisch von Milbemycinen sowie die Verbindung B-41D enthält, zu verwenden. Wenn ein Gemisch aus zwei oder mehreren dieser Verbindungen ohne vollständige Trennung verwendet wird, ist es ausreichend, die Reinigung soweit zu treiben, daß bei einer Konzentration von 5 ppm ein 100prozentiger akarizider Effekt erzielt wird. Der Gehalt der Verbindung B-41D in dem Rohgemisch beträgt in diesem Fall vorzugsweise mindestens 25 Gewichtsprozent, insbesondere mindestens etwa 50 Gewichtsprozent. Der Rest sind Verunreinigungen aus der Brühe und andere Milbemycine.

Die erfindungsgemäß hergestellte Verbindung besitzt überlegene akarizide Wirkung gegen ausgeschlüpfte Tiere und Eier von Milben, wie der doppelt gefleckten Blattspinnmilbe (Tetranychus urticae), der europäischen Rotmilbe (Panonychus ulmi), der Citrus- Rotmilbe (Panonychus citri) und der Rost-Gallmilbe (z. B. der Genera Aculops oder Aculus), die Obst-, Gemüse- und Blumenschädlinge darstellen. Sie ist ferner wirksam gegen Milben der Genera Ixodidae, Dermanyssidae und Sarcoptidae, die Tierschädlinge darstellen. Ferner ist die Verbindung hochwirksam gegen Ektoparasiten, wie Oestrus, Lucilia, Hypoderma, Gasterophilus, Flöhe und Läuse, sowie Haushaltsinsekten, z. B. Schaben oder Fliegen, und andere Schadinsekten des Gartenbaus und der Landwirtschaft, wie Blattläuse und Insektenlarven der Gattung Lepidoptera. Sie ist außerdem wirksam gegen Nematoden, z. B. des Genus Meloidogyne, und Knollenmilben, z. B. des Genus Rhizoglyphus, die im Erdboden gefunden werden.

Zur Verwendung in akariziden oder insektiziden Präparaten wird die Verbindung vorzugsweise mit einem Träger verdünnt, um z. B. Pulver, Grobpulver, Granulate, Feingranulate, Spritzpulver, Emulsionskonzentrate oder Öle herzustellen. Für diese Präparate eignen sich z. B. synthetische oder natürliche, organische oder anorganische Träger, die üblicherweise Insektiziden oder Akariziden zugesetzt werden, um den Zugang des Wirkstoffs zu dem zu behandelnden Objekt (z. B. Pflanze, Milbe oder Schadinsekt) oder die Lagerung, den Transport oder die Handhabung des Wirkstoffs zu erleichtern.

Beispiele für geeignete feste Träger sind anorganische Substanzen, wie Ton, Talkum, Diatomeenerde, Kaolin, Bentonit, Calciumcarbonat oder synthetisches Calciumsilikat, natürliche oder synthetische Harze, z. B. Cumaronharze, Alkydharze und Polyvinylchloride, Wachse, wie Carnaubawachs und Paraffinwachs, Nußschalen, z. B. Walnußschalen, oder Sojamehl. Beispiele für geeignete flüssige Träger sind Wasser, Alkohole, wie Äthanol oder Isopropanol, Glykole, wie Äthylenglykol, Glykoläther, z. B. Äthylenglykolmonophenyläther oder Diäthylenglykolmonoäthyläther, Ketone, wie Aceton, Methylisobutylketon, Cyclohexanon, Acetophenon oder Isophoron, Äther, wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, Xylol oder Methylnaphthalin, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Trichloräthylen und Kohlenstofftetrachlorid, sowie nieder-, mittel- und hochsiedende Petroleumfraktionen, die Kerosin, Leichtöle oder aromatische Kohlenwasserstoffe enthalten.

Die Verbindung B-41D kann auch als Aerosol formuliert werden, wobei der Träger ein Treibmittel ist. Geeignete Treibmittel sind z. B. gasförmige Fluorkohlenstoffe (z. B. Freone), verflüssigtes Erdgas, Dimethyläther und monomeres Vinylchlorid.

Gegebenenfalls können die Präparate auch ionische oder nicht-ionische Tenside enthalten, um den Wirkstoff zu emulgieren, zu dispergieren, zu benetzen oder zu verteilen. Beispiele für geeignete anionische Tenside sind die Natrium- und Calciumsalze von Ligninsulfonsäure, die Natrium- und Kaliumsalze von Ölsäure, das Natriumsalz von Laurylsulfonsäure und die Natrium- und Calciumsalze von Dodecylbenzolsulfonsäure. Beispiele für geeignete kationische Tenside sind höhere aliphatische Amine und deren Kondensate mit Äthylenoxid. Beispiele für geeignete nichtionogene Tenside sind Fettsäureglyceride, Fettsäuresaccharoseester, Kondensate von Äthylenoxid mit höheren aliphatischen Alkoholen, Kondensate von Äthylenoxid mit höheren Fettsäuren, Kondensate von Äthylenoxid mit Alkylphenolen oder Alkylnaphtholen und Copolymere von Äthylenoxid mit Propylenoxid.

Die akariziden oder insektiziden Präparate können alternativ oder zusätzlich ein Schutzkolloid, wie Gelatine, Gummi-arabicum, Casein, Polyvinylalkohol oder Carboxymethylcellulose, oder ein thixotropes Mittel, wie Natriumpolyphosphat oder Bentonit, enthalten. Außerdem können die Präparate andere Verbindungen mit akarizider Aktivität enthalten, z. B. 2-(1-Methylpropyl)-4,6-dinitrophenyl- β,β-dimethylacrylat, Di-(p-chlorphenyl)-cylclopropylcarbinyl, N′-(4-Chlor-2-methylphenyl)-N,N-dimethylformamidin, 2,4,4′,5-Tetrachlordiphenylsulfon, 1,1-Bis-(p-chlorphenyl)- 2,2,2-trichloräthanol, 2-sek.-Butylphenyl-N-methylcarbamat, m-Tolyl-N-methylcarbamat oder Mineralöl, um die Aktivität der Präparate zu erhöhen und in einigen Fällen einen synergistischen Effekt zu bewirken.

Die Verbindung kann selbstverständlich auch im Gemisch mit anderen Fungiziden, Herbiziden, Pflanzenwachstumsreglern, Lockstoffen oder Düngemitteln angewandt werden.

Die Verbindung B-41D ist auch bei der Bekämpfung von Menschen- und Tierparasiten hoch wirksam. Unter "Parasitismus" werden gewöhnlich Krankheiten verstanden, die im befallenen Tierorganismus durch Metazoen verursacht werden, die allgemein als Helminthes bekannt sind. Die Parasiten können Vieh, Geflügel und Haustiere, z. B. Schweine, Schafe, Ziegen, Kühe, Pferde, Hunde, Katzen und Hühner, epidemieartig befallen und große wirtschaftliche Schäden anrichten. Unter den Helminthes kann sich insbesondere eine als Nematoden bekannte Gruppe von Parasiten unter verschiedenen Tieren ausbreiten und oft ernsthafte Infektionen verursachen. Typische Nematoden die Tierinfektionen verursachen, sind die folgenden:
Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Anclystoma, Uncinaria, Toxascaris, Parascaris und Strongyloides.

Einige Parasiten der Genea Nematodirus, Cooperia und Oesophagostomum greifen die Eingeweide an, während Parasiten der Genea Hemonchus und Ostertagia den Magen angreifen und Parasiten des Genus Dictyocaulus in der Lunge gefunden werden. Parasiten der Familie Filariidae oder Setariidae werden im Herzen, in den Blutgefäßen sowie in Gewegen und Organen, z. B. den Subkutangeweben und lymphatischen Gefäßen, gefunden.

Die Verbindung B-41D zeigt ein breites Wirkungsspektrum gegen zahlreiche Endoparasiten bei verschiedenen Tieren und ist z. B. wirksam gegen Parasiten der Genera Dirofilaria beim Hund, Nematospiroides, Syphacia und Aspiculuris bei Rhodentien.

Die Verbindung B-41D ist auch gegen verschiedene Parasiten wirksam, die beim Menschen Infektionen verursachen. Typische Parasiten, die sich im menschlichen Verdauungstrakt finden, sind Parasiten der Genera Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongylodes, Trichinella, Capillaria, Trichuris und Enterobius.

Andere medizinisch bedeutsame Parasiten, die sich im Blut, in Geweben oder in Organen außer dem Verdauungstrakt finden, gehören zu den Genera Wuchereria, Brugia, Onchocerca und Loa der Familie Filariidae, Dracunculus der Familie Drachunculidae sowie Stronglydodies und Trichinella, die insofern außergewöhnlich sind, als sie normalerweise ektoparasitär auftreten, oft jedoch endoparasitär im Verdauungstrakt vorkommen.

Wenn die Verbindung B-41D als Parasitzid für Mensch und Tier verwendet werden soll, verabreicht man sie vorzugsweises oral als Trank oder Kapsel. Sie kann als wäßrige Lösung oder Lösung in einem anderen geeigneten nicht-toxischen Lösungsmittel, aber auch als Suspension oder Dispersion, die ein Suspendiermittel und ein Netzmittel, z. B. Bentonit, oder andere Bestandteile enthält, formuliert werden. Der Trank enthält im allgemeinen auch ein Antischaummittel. Vorzugsweise enthält der Trank den Wirkstoff in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gewichtsprozent, insbesondere 0,1 bis 0,01 Gewichtsprozent.

Die Verbindung B-41D kann auch als Dosierungseinheit verabreicht werden, z. B. in Form von trockenen festen Kapseln, Pillen oder Tabletten, die eine bestimmte Wirkstoffmenge enthalten. Diese Formulierungen werden durch homogenes Vermischen des Wirkstoffs mit einem oder mehreren feinpulverigen Materialien, z. B. Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Zerfallsbeschleunigern oder Bindemitteln, wie Stärke, Lactose, Talkum, Magnesiumstearat oder Pflanzengummi, hergestellt. Das Gewicht und der Gehalt des Wirkstoffs in diesen Dosierungseinheiten kann weit variieren, je nach der Art des zu behandelnden Tiers, des Infektionsgrades, der Parasitenart und dem Körpergewicht des Tieres.

Die Verbindung B-41D kann Tieren dadurch verabreicht werden, daß man sie im Futter gleichmäßig verteilt oder aber man verwendet sie als Überzug oder in Form von Pellets. Um eine zufriedenstellende antiparasitäre Wirkung zu erzielen, enthält das Fertigfutter vorzugsweise 0,0001 bis 0,02 Gewichtsprozent Wirkstoff.

Die Verbindung B-41D kann auch in einem flüssigen Träger gelöst oder dispergiert und parenteral durch Injektion in den Vormagen, die Muskeln, die Lunge oder unter die Haut verabfolgt werden. Für die parenterale Verabfolgung bevorzugte Träger sind Pflanzenöle, z. B. Erdnußöl oder Baumwollöl. Für die parenterale Applikation verwendet man den Wirkstoff vorzugsweise in einer Menge von 0,05 bis 50 Gewichtsprozent der Formulierung.

Eine topische Anwendung der Verbindung B-41D ist ebenfalls möglich, wobei man den Wirkstoff vorzugsweise mit einem geeigneten Träger vermischt, z. B. Dimethylsulfoxid oder einem Kohlenwasserstofflösungsmittel. Die erhaltene Formulierung kann direkt auf die Außenhaut von Tieren aufgebracht werden, z. B. durch Sprühen.

Die optimale Menge der Verbindung B-41D richtet sich nach der Art des zu behandelnden Tieres, der Art der parasitären Infektion und dem Infektionsgrad, beträgt jedoch vorzugsweise 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht des Tieres und insbesondere im Falle der oralen Verabreichung 0,1 bis 50 mg/kg. Die Verbindung kann als Einzeldosis oder in Teildosen verabreicht werden, wobei er normalerweise ausreicht, das Tier nur relativ kurze Zeit zu behandeln, z. B. 1 bis 5 Tage.

Die Beispiele erläutern die Erfindung, wobei in den Beispielen 1 und 2 die Herstellung der Verbindung B-41D, in den Beispielen 3 bis 6 akarizide Mittel, in den Beispielen 7 bis 9 deren akarizide Aktivität und in den Beispielen 10 bis 14 deren anthelmintische Aktivität beschrieben sind.

Beispiel 1 Herstellung der Verbindung B-41D

600 ml eines Vorkulturmediums, das 2% G/V Glucose, 1% G/V Sojamehl, 0,5% G/V Maisquellflüssigkeit und 0,2% Natriumchlorid enthält, werden in einen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben eingebracht. Das Medium wird mit einer Öse voll Sporen von Streptomyces B-41-146 beimpft und dann 48 Stunden bei 27°C bebrütet. Hierauf wird der Inhalt von zwei derartigen 2 Liter-Erlenmeyer-Kolben in einen 30 Liter fassenden Fermenter überführt, der bereits 20 Liter eines gründlich sterilisierten Kulturmediums enthält, das 4% G/V Glucose, 1% G/V Sojamehl, 0,5% G/V Maisstärke, 1% G/V Magermilch, 0,2% G/V Maiswasser und 0,3% Natriumchlorid enthält. Der pH-Wert des Mediums beträgt vor der Sterilisation 7,2 bis 7,5. Die Kultur wird dann 10 Tage bei 28°C unter einem Innendruck von 0,5 bar inkubiert.

Anschließend werden 20 Liter der Kulturbrühe durch Zugabe von Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt, worauf man 1 kg Celite-Filtrierhilfe zugibt und das Gemisch unter Druck filtriert. Hierbei erhält man etwa 3 kg eines Kuchens, der mit 15 Liter Methanol extrahiert wird. Die durch Abfiltrieren erhaltenen 15 Liter Methanollösung werden mit 5 Liter Wasser verdünnt und mit 20 Liter Hexan extrahiert. Die Hexanlösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf einem bei 40 bis 45°C gehaltenen Wasserbad eingedampft, wobei 22 g einer öligen Substanz erhalten werden.

Die ölige Substanz wird in 30 ml Hexan gelöst und auf einer Säule adsorbiert, die 2 kg mit Hexan äquilibriertes Silicagel enthält. Die Säule wird mit Hexan/Aceton (Volumenverhältnis 95 : 5) eluiert, wobei 2 Liter einer Fraktion erhalten werden, die die gewünschte Verbindung erhält. Diese ergibt beim Konzentrieren unter vermindertem Druck auf einem bei 40 bis 45°C gehaltenen Wasserbad 550 mg einer öligen Substanz. Man löst diese Substanz in 1 ml Methanol und gibt die Lösung auf eine Säule auf, die 200 ml Sephadex® LH-20 enthält, das mit Methanol äquilibriert worden ist. Durch Eluieren der Säule mit Methanol erhält man 65 ml einer Fraktion, die die gewünschte Verbindung enthält. Die Fraktion wird unter vermindertem Druck bei 45°C eingedampft und der erhaltene Rückstand wird in 2 ml Methanol gelöst. Man verdünnt die Methanollösung mit 2 ml Wasser, läßt das Gemisch bei Raumtemperatur stehen und erhält so 110 mg der Verbindung B-41D in Form eines amorphen Pulvers mit den vorstehend genannten Eigenschaften.

Beispiel 2 Herstellung der Verbindung B-41D

Ein 2-Liter-Kolben, der 600 ml eines Vorkulturmediums enthält, das 1% G/V Saccharose, 0,35 G/V Polypepton und 0,05% G/V Dikaliumorthophosphat enthält, wird mit einer Öse voll Sporen von Streptomyces B-41-146 beimpft, worauf man den Mikroorganismus 48 Stunden bei 27°C züchtet. Der Inhalt von drei derartigen Kolben wird in einen 600 Liter-Fermentationstank überführt, der vorher mit 300 Liter eines gründlich sterilisierten Kulturmediums beschickt wurde, das 8% G/V Glucose, 1% G/V Sojamehl, 0,5% G/V Maisstärke, 1% G/V Magermilch, 0,2% G/V Maiswasser, 0,3% G/V Natriumchlorid und 0,05% G/V Calciumcarbonat enthält. Der pH-Wert des Mediums wird bei 7,2 bis 7,5 gehalten. Die Züchtung erfolgt 12 Tage bei 28°C unter Rühren mit 150 bis 200 U/min und einem Innendruck von 0,5 bis 1 bar.

Nach Ablauf dieser Zeit beträgt die Menge der Verbindung B-41D in dem Medium 180 µl/ml. 300 Liter des erhaltenen Kulturmediums werden durch Zugabe von Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt, worauf man 15 kg Celite-Filterhilfe zusetzt und das Gemisch unter Druck filtriert. Der erhaltene Kuchen (40 kg) wird mit 200 Liter Methanol extrahiert und filtriert. Der Methanolextrakt wird mit 150 Liter Wasser versetzt, worauf man das erhaltene Gemisch zweimal mit je 250 Liter Hexan extrahiert. Die Hexanlösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck in einem bei 40 bis 45°C gehaltenen Wasserbad eingedampft, wobei 350 g eines Öls erhalten werden.

Dieses Öl wird in 400 ml Hexan gelöst und auf einer Säule adsorbiert, die 3 kg vorher mit Hexan äquilibiertes Silicagel enthält. Durch Elution der Säule mit Hexan/Aceton (Volumenverhältnis 95 : 5) werden 8 Liter einer Fraktion erhalten, die die gewünschte Verbindung enthält. Diese Fraktion wird unter vermindertem Druck über einem bei 40 bis 45°C gehaltenen Wasserbad eingedampft, wobei 33 g Rohkristalle erhalten werden, die man aus Hexan/Äthylacetat (Volumenverhältnis 20 : 1) umkristallisiert. Hierbei erhält man 17,4 g der Verbindung B-41D in Form von farblosen Nadeln, F. 186 bis 188°C, mit den vorstehend genannten Eigenschaften.

Beispiel 3 Pulver

10 Gewichtsteile der Verbindung B-41D in Form eines amorphen Pulvers werden mit 5 Teilen Weißkohle homogen vermischt. Das erhaltene Gemisch wird dann mit 50 Gewichtsteilen Talk und 35 Gewichtsteilen Ton versetzt, homogen vermischt, dreimal in einer Schlagmühle pulverisiert und nochmals zu einem Pulver homogen vermischt.

Beispiel 4 Spritzpulver

40 Gewichtsteile der Verbindung B-41D in Form eines amorphen Pulvers werden mit 20 Gewichtsteilen Weißkohle vermischt. Hierauf gibt man 5 Gewichtsteile Natriumdodecylbenzolsulfonat, 2 Gewichtsteile Polyvinylalkohol und 33 Gewichtsteile Ton zu und vermischt homogen. Das Gemisch wird dann dreimal mit einer Schlagmühle pulverisiert und nochmals homogen zu einem Spritzpulver vermischt.

Beispiel 5 Emulsionskonzentrat

3 Gewichtsteile der Verbindung B-41D in Form eines amorphen Pulvers, 7 Gewichtsteile Polyoxyäthylenphenyläther, 3 Gewichtsteile Calciumdodecylbenzolsulfonat und 87 Gewichtsteile Xylol werden vermischt und zu einer Lösung filtriert, die als Emulsionskonzentrat verwendet werden kann.

Beispiel 6 Ölpräparat

10 Gewichtsteile der Verbindung B-41D in Form eines amorphen Pulvers werden in 10 Gewichtsteilen Xylol gelöst und dann mit 80 Gewichtsteilen Maschinenöl versetzt. Durch Filtrieren des Gemisches erhält man ein Ölpräparat.

Beispiel 7 Akarizide Wirkung gegen die doppelt gefleckte Blattspinnmilbe (Tetranychus urticae)

Ein 3gewichtsprozentiges Emulsionskonzentrat wird gemäß Beispiel 5 hergestellt und mit Wasser auf die in Tabelle II genannte Wirkstoffkonzentration verdünnt. Langbohnenblätter, die weibliche Exemplare von Tetranychus urticae aufweisen, werden mit einem Mizuho-Sprühgerät mit der Testlösung in einer Menge von 5 cm³ pro 2 Blätter besprüht. Die Blätter werden dann an der Luft getrocknet und 72 Stunden bei 25°C in einem thermostatisierten Raum stehengelassen, worauf man die Mortalität der Milben berechnet. Die Anzahl der Milben pro Blatt beträgt 30 bis 35 und es werden zwei Blätter pro Test verwendet.

Der Versuch wird unter Verwendung der Verbindung B-41D sowie der Milbemycine α₁ und α₃ (B-41A₃ und A₄ aus der GB-PS 13 90 336) und des bekannten Landwirtschafts-Akarizids Kelthan® (Präparat auf Basis von 1,1-Bis-(chlorphenyl)- Kelthan® (Präparat auf Basis von 1,1-Bis-(chlorphenyl)- 2,2,2-trichloräthanol) als Vergleichsverbindungen durchgeführt. Die als prozentuale Mortalität der ausgewachsenen Milben ausgedrückten Ergebnisse sind in Tabelle II genannt.

Tabelle II

Beispiel 8 Akarizide Wirkung gegen Eier der doppelt gefleckten Blattspinnmilbe (Tetranychus urticae)

In diesem Test werden 1 Tag alte Eier von Tetranychus urticae verwendet, die vorher auf Langbohnenblättern abgelegt worden sind. Die Blätter werden mit der erfindungsgemäßen Verbindung behandelt. Pro Blatt sind etwa 100 Eier vorhanden. 2 Wochen nach der Behandlung wird die Anzahl von Eier gezählt, aus denen keine Milben ausgeschlüpft sind. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Gesamtzahl von Eiern in Tabelle III genannt.

Tabelle III

Beispiel 9 Akarizide Wirkung gegen Citrus-Rotmilben (Panonychus citri)

Das Verfahren von Beispiel 7 wird wiederholt, jedoch verwendet man Maulbeerblätter, die weibliche Exemplare der Citrus-Rotmilbe tragen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV genannt.

Tabelle IV

Zusätzlich zu den in Tabelle IV genannten Ergebnissen wird eine Emulsion von Kelthan® mit einer Konzentration von 30 ppm geprüft, jedoch beträgt die Mortalität selbst bei dieser Konzentration nur 93%. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Verbindung B-41D wesentlich höhere akarizide Aktivität als die Milbemycine α₁ und α₃ aufweist, die wiederum wesentlich besser als das bekannte Akarizid Kelthan® sind.

Beispiel 10 Anthelminthische Aktivität gegen Nematospiroides dubus

Vier Wochen alte männliche Mäuse des Stammes RFVL mit einem Körpergewicht von etwa 18 bis 22 g werden oral mit Nematospiroides dubius infiziert. Die Mäuse werden dann in Gruppen von je 5 Tieren geteilt und 7 Tage nach der Infektion mit Futter gefüttert, das die in Tabelle V genannte Menge der Testverbindung enthält, worauf man ihnen unbehandeltes Futter verabreicht. 14 Tage nach der Infektion werden die Tiere getötet und die Anzahl von Parasiten im Dünndarm wird gezählt und mit einer Kontrollgruppe verglichen, die auf ähnliche Weise infiziert, jedoch nicht behandelt wurde. Die als anthelmintische Aktivität ausgedrückten Ergebnisse sind in Tabelle V genannt.

Tabelle V

Die Ergebnisse von Tabelle V zeigen, daß die Verbindung B-41D eine um etwa zwei Größenordnungen größere anthelmintische Wirkung als die eingesetzten Milbemycin-Gemische besitzt.

Beispiel 11 Anthelmintische Wirkung gegen Toxocara cati

In diesem Test werden 18 junge Katzen (drei männliche und 15 weibliche) mit einem Körpergewicht von 1,6 bis 3,0 kg verwendet, die auf natürlichem Wege mit Toxocara cati infiziert sind. Jeder der Katzen wird oral eine Einzeldosis der Verbindung B-41D verabreicht, die in Olivenöl in folgender Menge dispergiert ist: 2 Katzen werden 5 mg/kg Körpergewicht der Verbindung verabreicht, 3 Katzen 2,5 mg/kg, 2 Katzen 1 mg/kg, 3 Katzen 0,5 mg/kg, 3 Katzen 0,25 mg/kg, 2 Katzen 0,1 mg/kg und 3 Katzen 0,05 mg/kg. Vor der Behandlung beträgt der EPG-Wert (Anzahl von Eiern pro g Faeces) 150 bis 16 250. Eine Woche nach der Behandlung beträgt der EPG-Wert bei allen Katzen 0 und die Gesamtzahl der während der Woche ausgeschiedenen Würmer beträgt 2 bis 40. Eine Autopsie zeigt, daß alle Katzen vollständig wurmfrei sind.

Beispiel 12 Anthelmintische Wirkung gegen Toxocara canis

In diesem Test werden 13 junge Hunde (3 männliche und 10 weibliche) mit einem Körpergewicht von 1,2 bis 13,7 kg verwendet, die auf natürliche Weise mit Toxocara canis infiziert sind. Jedem Hund wird oral eine Einzeldosis der Verbindung B-41D verabreicht, die in Olivenöl in folgenden Mengen dispergiert ist: einem Hund wird eine Dosis von 5 mg/kg Körpergewicht verabreicht, 2 Hunden 0,25 mg/kg, 4 Hunden 0,1 mg/kg, 3 Hunden 0,05 mg/kg, 2 Hunden 0,025 mg/kg und einem Hund 0,01 mg/kg. Vor der Behandlung beträgt der EPG- Wert 100 bis 18 400. Eine Woche nach der Behandlung beträgt der EPG-Wert bei allen Hunden 0 und die Gesamtzahl der während der Woche ausgeschiedenen Würmer beträgt 2 bis 36 pro Hund. Eine Autopsie zeigt, daß alle Hunde vollständig wurmfrei sind.

Beispiel 13 Anthelmintische Wirkung gegen Trichuris vulpis

In diesem Test werden 5 Hunde (2 weibliche und 3 männliche) mit einem Körpergewicht 6,2 bis 11,5 kg und einem Alter von 2 oder 3 Jahren verwendet. Jedem Tier wird eine Einzeldosis von 1 bzw. 5 mg/kg Körpergewicht der Verbindung B-41D in Form von Gelatinekapseln oral verabreicht. Die Hunde sind auf natürliche Weise mit Trichuris vulpis infiziert. Vor der Behandlung beträgt der EPG-Wert 100 bis 3500. Eine Woche nach der Behandlung beträgt der EPG-Wert 0 bis 200 und die Gesamtzahl der während dieser Woche ausgeschiedenen Würmer beträgt 8 bis 451. Bei der Autopsie werden 0 bis 33 Würmer gezählt, was einer prozentualen Verringerung von 92 bis 100% entspricht. Bekanntlich sind Infektionen durch Trichuris vulpis im Blinddarm nur sehr schwer zu bekämpfen, so daß die mit einer einzigen und relativ milden Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung erzielte hohe Beseitigung eine äußerst wirksame und wertvolle Aktivität gegen diesen Parasiten anzeigt.

Beispiel 14 Anthelmintische Wirkung gegen Ancyclostoma canium

In diesem Test werden 5 Hunde (2 weibliche und 3 männliche) mit einem Körpergewicht von 7,0 bis 11,5 kg und einem Alter von 2 bzw. 3 Jahren verwendet. Alle Hunde sind auf natürliche Weise mit Ancylostoma canium infiziert. Jedem Hund wird oral eine Einzeldosis der Verbindung B-41D in Form einer Gelatinekapsel in folgenden Mengen verabreicht: 2 Hunde erhalten 0,5 mg/kg Körpergewicht, 2 Hunde 1 mg/kg und 1 Hund 5 mg/kg. Vor der Behandlung beträgt der EPG-Wert bei allen Hunden 0 und die Gesamtzahl der während dieser Woche ausgeschiedenen Würmer beträgt 4 bis 82 pro Hund. Bei der Autopsie zeigt sich, daß alle Hunde vollständig wurmfrei sind.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung der Verbindung B-41D mit der Formel durch Züchten von Streptomyces Stamm B-41-146 (FERM P1438 = FERM-BP-1072) in einem geeigneten Kulturmedium und Isolieren der gebildeten Verbindung unter Anwendung von natürlichen oder synthetischen Adsorbenzien, Ionenaustauschern oder Ionenaustausch-Gelfiltern aus dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem Kulturmedium durchführt, das Sojamehl und Magermilch als Stickstoffquelle enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Sojamehl in einer Menge von 0,5 bis 1% G/V und die Magermilch in einer Menge von 1 bis 2% G/V des Kulturmediums vorhanden sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium Glucose als Kohlenstoffquelle enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucose in einer Menge von bis zu 8% G/V, vorzugsweise von 6 bis 8% G/V vorhanden ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium außerdem 0,5 bis 2% G/V Lactose, Maltose und/oder Getreidestärke enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von 22 bis 30°C durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur etwa 28°C beträgt.