KR100436026B1

KR100436026B1 - 국내 산림토양으로부터 분리된, 나비목과 파리목에이중독성을 가지는 비티 케이에프알아이 (ｋｆｒｉ)-2균주 및 동 균주를 함유한 미생물 살충제

Info

Publication number: KR100436026B1
Application number: KR10-2001-0013759A
Authority: KR
Inventors: 박지두; 이상길; 신상철; 부경생; 제연호; 노종열; 장진희; 이인희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2001-03-16
Filing date: 2001-03-16
Publication date: 2004-06-14
Also published as: KR20020073867A

Abstract

본 발명은 국내 산림토양으로부터 분리된 신규한 바실러스 투린지엔시스 케 이에프알아이 (KFRI)-2 균주 및 동 균주를 유효성분으로 함유하는 미생물 살충제에 관한 것으로, 상기 구성의 본 발명은 새로운 내독소 단백질 유전자조성을 가지며, 배추좀나방, 파밤나방 및 빨간집모기에 대해서 강독성을 보이고, 배양효율면에서도 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주와 대등한 효과적인 신규한 균주를 개시한다.

Description

국내 산림토양으로부터 분리된, 나비목과 파리목에 이중독성을 가지는 비티 케이에프알아이 (ＫＦＲＩ)-2 균주 및 동 균주를 함유한 미생물 살충제{Bacillus thuringiensis KFRI-2 which is isolated from Korean forest soil and had dual-toxicity to Lepidoptera and Diptera and microbial insecticide containing the same}

본 발명은 국내 산림토양으로부터 분리된, 나비목과 파리목에 이중독성을 가지는 바실러스 투린지엔시스 케 이에프알아이 (KFRI)-2 (이하 '비티 케이(K)-2'라고 약칭함) 균주 및 동 균주를 유효성분으로 함유하는 미생물 살충제에 관한 것이다.

비티 균주는 그람양성 토양세균으로 농작물, 산림 및 위생 해충의 방제에 유용한 미생물 농약으로 잘 알려져 있다. 즉, 성장조건이 악화되면 비티 균주는 내생 포자와 함께 내독소 단백질을 생산하는데, 이 내독소 단백질은 나비목, 파리목 및 딱정벌레목의 곤충에 대해 강력한 독성을 가지므로, 비티 균주는 그 자체가 미생물 살충제로 사용될 수 있다.

비티 균주를 이용한 무공해 미생물 농약제제는 이미 오래전부터 미국 등의 선진국에서 개발되어 상업화되었으며, 우리나라에서도 투리사이드(산도스사, 미국), 센타리(애보트사, 미국) 등이 수입되어 시판되고 있다. 미생물 살충제에 도입된 비티 균주로는 대표적으로 나비목 해충방제에 사용되는 비티 쿠르스타키(kurstaki) 균주가 있으며 현재 가장 많이 등록되어 사용되고 있다. 이외에 아이자와이(aizawai), 덴드로리무스(dendrolimus), 갈레리에(galleriae) 균주등이 나비목방제에 사용되고 있다. 파리목 해충의 경우는 비티 이스라엘렌시스(israelensis) 균주가 대표적이며, 딱정벌레목에는 비티 테네브리오니스(tenebrionis) 균주가 등록되어 사용되고 있다.

비티 쿠르스타키(kurstaki) 균주는 나비목 특히 배추좀나방에 강한 독성을 보이는 것으로 알려져 있으며, 이외에도 담배나방, 흰불나방등에 높은 독성을 가지고 있어 제제로서의 개발이 활발하게 진행되어 왔으나 파밤나방 및 파리목 해충에 대해서는 독성이 매우 낮은 것으로 보고되어 있으며(Bai C., D. Degheele, S. Jansens and B. Lambert. 1993. Activity of insecticidal crystal proteins and strains ofBacillus thuringiensisagainstSpodopteraexempta (Walker). J. Invertebr. Pathol. 62: 211-215), 실험실과 야외조건에서 저항성이 유발되어 사용상의 제약을 가지고 있다(Ferre, J., B. Escriche, B. Yolanda and V. R. Jeroen. 1995. Biochemistry and genetics of insect resistance toBacillus thuringiensisinsecticidal crystal proteins. FEMS Microbiol. Lett. 132: 1-7). 이러한 저항성 문제와 숙주범위확대의 필요성으로 인해 최근에는 비티 아이자와이(aizawai) 균주가 주로 사용되고 있다(Tanada, Y. and H. K. Kaya. 1993. Insect pathology. pp. 83-146. Academic Press, Inc. CA, USA.). 그러나 비티 아이자와이 균주는 비티 쿠르스타키 균주에 비하여 배양효율이 상당히 떨어져 미생물 살충제로 개발시에 비용이 많이 드는 단점을 가지고 있다. 이러한 문제점 외에 한 균주의 지속적이고 누적된 사용은 저항성 유발의 원인이 되므로 이를 극복하기 위해서는 다양한 특성을 가진 강독성 비티 균주의 분리와 개발이 계속적으로 이루어져야 한다.

현재까지 보고된 비티 내독소 단백질 유전자(cry)는 179개에 이르고 있다.일반적으로 비티는 살충성 내독소 단백질을 만드는 내독소 단백질 유전자를 1개에서 많게는 3-5개의 유전자를 보유하는 것으로 알려져 있다(Aronson, A. I., W. Beckman and P. Dunn. (1986).Bacillus thuringiensisand related insect pathogens. Microbiol. Rev., 50:1-24). 일반적으로 한 비티 균주가 갖는 내독소단백질 유전자의 수 및 종류는 다양한 것으로 알려져 있으며 이들 유전자들은 각기 독성범위 및 발현정도가 달라 비티의 독성범위 및 독성효과를 특정짓는 역할을 하게 된다.

이에 본 발명자들은 기존의 비티 쿠르스타키 균주나 비티 아이자와이 균주와는 다른 특성을 가지는 새로운 강독성 비티 균주를 이용한 미생물 살충제를 개발하기 위해, 우리나라 산림토양으로부터 비티 균주를 계속적으로 분리하여 파밤나방에 대하여 강독성을 보이며 파리목에도 비티 이스라엘렌시스와 대등한 살충력을 가지는 새로운 양독성 비티 균주를 분리하고자 노력한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 국내 산림토양으로부터 분리되고 파밤나방 뿐만 아니라 파리목에도 살충력을 지니는 신규한 비티 케이-2 균주를 제공하는 데 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 비티 케이-2 균주를 이용한 미생물 살충제를 제공하는 데 있다.

도 1(a)는 비티 케이-2 균주의 자가분해 전(A)의 위상차 사진이다.

도 1(b)은 비티 케이-2 균주의 자가분해 후(B)의 위상차 사진이다.

도 2는 비티 케이-2 균주의 내독소단백질 및 포자의 주사전자현미경 사진 (배율: 6,000x)이다.

도 3은 비티 케이-2 균주의 내독소 단백질의 SDS-전기영동 사진이다.

도 4는 비티 케이-2 균주의 플라스미드 패턴을 나타내는 아가로스 겔 전기영동사진이다.

도 5는 비티 케이-2 균주의 내독소 단백질 유전자 조성을 PCR을 통하여 확인한 아가로스 겔 전기영동 사진이다.

도 6은 비티 케이-2 균주의 GYS 배지상에서의 성장을 나타내는 그래프이다.

도 7은 비티 케이-2 균주의 UG 배지상에서의 성장을 나타내는 그래프이다.

상기 목적에 따라 본 발명에서는 국내 산림토양으로부터 분리된 새로운 비티 케이-2 균주가 제공된다.

이하, 국내 산림토양으로부터 분리된 새로운 비티 케이-2 균주를 기존에 보고된 비티 쿠르스타키의 타입 균주(type strain)인 비티 쿠르스타키 에이치디-1 (HD-1)균주, 비티 아이자와이 균주 및 비티 이스라엘렌시스 균주와의 비교를 통하여 상세히 설명한다.

<실시예 1> 비티 케이-2 균주의 분리

대한민국 서울대학교 연습림(수원)으로 부터 채취한 토양시료 1g을 멸균 증류수 10㎖에 넣고 2분 동안 강하게 교반한 후, 65℃에서 30분 동안 중탕하고 10^-3로 희석하였다. 희석액 300㎕를 영양 평판배지(Nutrient agar)위에 도말한 후 27℃에서 5일간 배양하였다. 생성된 콜로니들은 선발하여 세포가 간상형이고 포자모양이 난형이며, 내독소 단백질을 형성하는 콜로니를 비티 균주로 선발하였다.

선발된 비티 균주는 편모 항원성에 따라 동정하고 비티 케이-2 균주로 명명하고, 한국과학기술원 부설 생명공학연구원 유전자은행에 2001년 2월 22일자 기탁번호 제 KCTC 18076P호로 기탁하였다.

<실시예 2> 비티 케이-2 균주의 편모항원성 검정

실시예 1에 의해 선발된 비티 케이-2 균주를 일차적으로 분류하기 위해, 33개 비티 편모항체에 대한 편모항원성을 공지의 오바의 방법(Ohba & Aizawa,J. Invertebr. Pathol., 32, 303-309, (1978))에 따라 검정하였다.

즉, 비티 케이-2 균주를 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물 및 1% 염화나트륨)에 접종하고 30℃, 100 rpm으로 12일 동안 배양한 후, 이 배양액에 100배 희석한 비티 편모항체 희석액을 동량으로 가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 응집 반응 여부를 조사하였으며 그 결과는 하기 표 1과 같다.

<표 1> 비티편모항체에 대한 편모항원성 검정결과

편모 항원성	아종	응집 반응
1	투린지엔시스(thuringiensis)	-
2	피니티무스(finitimus)	-
3a	알레스티(alesti)	-
3a3b	쿠르스타키(kurstaki)	+
4a4b	소토(sotto)	-
4a4c	케냐(kenyae)	-
5a5b	갈레리에(galleriae)	-
6	엔토모시두스(entomocidus)	-
7	아이자와(aizawai)	-
8a8b	모리소니(morrisoni)	-
8a8c	오스트리니에(ostriniae)	-
8a8d	니거리엔시스(nigeriensis)	-
9	톨워티(tolworthi)	-
10	담스타디엔시스(darmstadiensis)	-
11a11b	토우마노피(toumanoffi)	-
11a11c	규수엔시스(kyushuensis)	-
12	톰프소니(thompsoni)	-
13	파키스타니(pakistani)	-
14	이스라엘렌시스(israelensis)	-
15	다코타(dakota)	-
16	인디아나(indiana)	-
17	토호구엔시스(tohokuensis)	-
18	쿠마모토엔시스(kumamotoensis)	-
19	토키지엔시스(tochigiensis)	-
20a20b	윤나넨시스(yunnanensis)	-
20a20c	폰디케리엔시스(pondicheriensis)	-
21	콜메리(colmeri)	-
22	산도지엔시스(shandogiensis)	-
23	자포넨시스(japonensis)	-
24	네오레오넨시스(neoleonensis)	-
25	코레아넨시스(coreanensis)	-
26	실로(silo)	-
27	멕시카넨시스(mexicanensis)	-

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 비티 케이-2 균주는 비티 쿠르스타키 균주와 동일한 편모응집반응을 갖는 것으로 나타났다.

<실시예 3> 비티 케이-2 균주의 내독소 단백질의 관찰

실시예 1에서 분리된 비티 케이-2 균주를 포자형성이 이루어진 배양액에서내독소 단백질의 크기와 형태를 위상차현미경과 주사전자현미경으로 관찰하였다. 비티 케이-2 균주의 단일 콜로니를 100㎖의 GYS배지(0.1% 글루코스, 0.2% 효모추출물, 0.05% 인산제일칼륨, 0.2% 황산암모니움, 0.002% 황산마그네슘, 0.005% 황산망간, 0.008% 염화칼슘; Nickerson et al.,Appl. Environ. Microbiol., 28, 124-128 (1974))에 접종하여 30℃, 150rpm에서 진탕배양하여 시료로 사용하였다. 멸균된 증류수로 현탁한 시료를 slide glass 위에 떨어뜨린 후 cover glass를 덮고 emulsion oil상에서 위상차현미경 (Nikon Optiphot-2) 1,000배의 배율로 관찰하였다.

주사전자현미경(Phillips SEM 515) 관찰은 비티 케이-2 균주의 GYS배지상에서 5일 배양한 후 침전하여 시료로 사용하였다. 배양 침전물은 0.01% 트리톤 엑스-100 (Triton X-100)을 포함하는 1M 염화나트륨 용액으로 3회 세척한 다음 초음파 교반기를 사용하여 교반한 후, 67%, 72%, 79%, 87% 농도의 수크로스 불연속 밀도 구배에 가하고 4℃, 80,000 x g에서 14시간 동안 초원심분리하였다. 79%와 87% 설탕 농도에서 생성되는 내독소 단백질 결정체층만을 회수하고 3차 멸균 증류수로 3회 이상 세척하여 설탕을 완전히 제거하였다. 이 단백질 결정체를 냉동 건조시킨 다음 알루미늄 원반 시료대위에 올려놓고 자연건조시켰다. 건조된 단백질 결정체는 탄소와 금으로 씌우고 관찰하였다(배율: 6,000x).

그 결과는 도 1 (위상차현미경 사진), 도2 (주사전자현미경 사진)와 같으며, 도 1(a)의 A는 자가분해(autolysis) 전, 도 1(b)의 B는 자가분해 후의 사진이다. 도 1과 도 2에서 S는 포자를, C는 내독소 단백질을 나타낸다. 비티 케이-2 균주 유래의 내독소 단백질은 윤곽이 뚜렷한 이중 피라미드형의 결정체임을 알 수 있으며이는 나비목에 독성을 갖는 내독소 단백질의 전형적인 형태로써 이전의 보고들과 일치한다.

<실시예 4> 비티 케이-2 균주의 내독소 단백질 전기영동 분석

실시예 3에서 순수분리된 내독소 단백질 결정체의 전기영동 (SDS-PAGE)은 램리의 방법(Laemmli,Nature, 227, 680-685 (1970))에 따라 다음과 같이 실시하였다.

준비된 시료 일정량에 5배 시료 완충용액 (1M Tris-HCl(pH 6.8) 0.6 ㎖, 50% 글리세롤 5 ㎖, 10% SDS 2 ㎖, 2-머캅토에탄올 0.5 ㎖, 1% 브로모페놀 블루 1 ㎖, 중류수 0.9 ㎖)을 가하고 100℃ 물에서 5분 동안 가열한 후 상온에서 잠시 정치시키고 원심분리하여 상등액을 회수한 다음, 10% SDS-전기영동을 실시하였다.

그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 제 M열은 단백질 표준 분자량 표지이고, 제 AIZ 열은 비티 아이자와이 균주의 내독소 단백질이며, 제 KUR 열은 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 내독소 단백질이며, 제 K2 열은 비티 케이-2 균주 유래의 내독소 단백질이며 화살표는 단백질 표준 분자량 표지의 분자량을 나타낸다. 도 3에서 보는 바와 같이, 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주가 나타내는 약 130 kDa과 65 kDa의 밴드는 각각cry1과cry2type의 내독소 단백질로서(Jaoua S., N. Zouari, S. Tounsi and R. Ellouz. 1996. Study of the δ-endotoxins produced by three recently isolated strains ofBacillus thuringiensis.. FEMS Microbiol. Lett. 145: 349-354), 비티 케이-2 균주에서는 65 kDa의cry2type의 단백질은 없으며, 130 kDa의cry1type만이 보여 쿠르스타키 에이치디-1 균주와는 다른 패턴을 보였으며, 오히려 비티 아이자와이 균주의 내독소 단백질 구성과 유사함을 알 수 있었다.

<실시예 5> 비티 케이-2 균주의 플라스미드 분석

비티 케이-2 균주의 플라스미드 DNA를 개량된 알칼리 용해방법(Birnboim et al.,Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979))에 따라 분리하였다. 즉, 비티 케이-2 균주를 LB 배지 50 ㎖에 접종하고 27℃에서 12시간 동안 배양한 후 이 배양액 2.5 ㎖를 SPY배지(0.2% 황산암모니움, 1.4% 인산제일칼륨, 0.6% 인산제이칼륨, 0.1% 구연산 나트륨, 0.2% 황산마그네슘, 0.1% 효모추출물 및 0.1% 포도당) 250 ㎖에 다시 접종하고 27℃에서 600 nm에서의 흡광도 값이 0.7이 될 때까지 배양하였다. 배양액을 5,000 x g에서 5분간 원심분리하여 균체를 수확하고, 여기에 용액 I (50 mM 글루코오스, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA) 10 ㎖를 가하고 볼텍스믹서(vortex mixer)를 사용하여 교반하였다. 여기에 라이소자임(lysozyme)을 최종 농도 50 ㎎/㎖로 가하고 혼합한 후 실온에서 20분간 정치하였다. 사용 전에 제조한 용액 II(0.2 N 수산화나트륨, 1% SDS) 20㎖을 첨가해서 용액을 균질화시킨 다음 얼음 속에 10분간 정치하였다. 여기에 용액 III(5M 초산 칼륨 60㎖, 빙초산 11.5㎖, 멸균증류수 28.5㎖) 15㎖을 가하고 천천히 혼합하고, 10분간 정치한 다음 상온에서 10,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액에 2배 부피의 99% 에탄올을 가하고 -70℃에서 20분간 정치시킨 뒤, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 침전물을 얻고, 건조시켰다.

건조된 침전물에 TE 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) 8㎖을 가하고 잘 녹인 후, RNase A를 최종 농도 10㎍/㎖로 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액은 페놀 용액을 처리하여 단백질을 제거하고, 상등액에 클로로포름(chloroform)과 아이소아밀알콜(isoamylalcohol)이 24:1로 혼합된 용액을 동량으로 처리하고 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상등액에 두배 부피의 99% 에탄올을 가하고 -70℃에 20분간 정치한 후, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 침전물을 70% 에탄올로 3회 세척한 후 건조시켰다. 침전물에 TE 완충액 100㎕을 가하고 잘 녹인 후, 260nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 순수도와 농도를 측정하였다.

0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하여 플라스미드 DNA 패턴을 확인한 결과는 도 4과 같다. 제 M 열은 람다(lambda) DNA를HindIII 효소로 절단한 DNA 마커이고, 제 KUR열은 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주, 제 AIZ열은 비티 아이자와이 균주, 제 K2열은 비티 케이-2 균주 유래의 플라스미드 DNA 패턴이다. 도 4에서 보는 바와 같이, 비티 케이-2 균주의 플라스미드 패턴은 실시예 2에서 본 발명의 균주와 편모응집반응을 보이는 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주와는 차이를 보이며, 오히려 비티 아이자와이 균주와 플라스미드 DNA 구성상에서 상당히 유사함을 보였다.

<실시예 6> 비티 케이-2 균주의 살충효과

비티 케이-2 균주의 살충성을 나비목 해충인 배추좀나방과 파밤나방 및 파리목 해충인 빨간집모기에 대해 조사하였다.

비티 케이-2 균주의 살충력 검정을 위해 이 균주를 GYS 배지에 접종하여 포자와 내독소 단백질이 형성되고 자가분해 (autolysis)될 때까지 30℃에서 5일간 배양하였다. 배양액을 수거한 후 포자의 농도가 여러 농도 구간으로 희석하고, 이 접종원을 인공사료(1 cm × 1 cm × 0.5 cm)에 첨가하였다. 나비목 곤충인 배추좀나방(Plutella xylostella)과 파밤나방(Spodoptera exigua) 유충 20 마리를 각 처리구에 3반복으로 첨가하고 25℃에서 사육하면서 48시간과 72시간 동안의 치사율을 각각 조사하여 반수치사농도(LC₅₀)을 구하였다. 대조구로는 동일 농도의 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주과 비티 아이자와이 균주 배양액 및 무처리구를 함께 검정하였다.

파리목 해충인 빨간집모기에 대한 살충력 검정은 10㎖의 멸균증류수에 여러 농도 구간으로 접종원을 희석하여 6 well microtiter plate에 담고 빨간집모기 2령충 20마리를 넣어 72시간 동안 치사율을 조사하여 반수치사농도(LC₅₀)를 구하였다. 대조구로는 동일 농도의 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주과 비티 이스라엘렌시스 균주 배양액 및 무처리구를 함께 검정하였으며 그 결과는 하기 표 2와 같다.

<표 2> 살충력 검정결과

LC₅₀
나비목	비티 케이-2	비티 쿠르스타키	비티 아이자와이
배추좀나방¹	14.8	2.32	136.5
파밤나방²	10.7	131.2	15.1
파리목	비티 케이-2	비티 쿠르스타키	비티 이스라엘렌시스
빨간집모기³	3.2	9.3 X 10³	2.7

Unit: 1, X 10³CFU/cm²; 2, X 10⁷CFU/cm²; 3, X 10⁹CFU/ml

배추좀나방에 대한 검정 결과 비티 케이-2 균주의 LC₅₀값은 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주보다는 약 6배 정도 높았으나 비티 아이자와이 균주보다는 약 10배 낮았다. 같은 농도에서 파밤나방에 대한 LC₅₀값의 경우는 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주보다 약 10배 이상 낮았으며, 비티 아이자와이 균주보다도 다소 낮은 높은 살충효과를 보였다.

빨간집모기에 대한 생물검정에서도 파리목 해충에 강독성인 것으로 알려져 있는 비티 이스라엘렌시스 균주와 대등한 효과를 보였으며, 비티 쿠르스타키 균주와는 현격한 차이를 나타내었다.

이는 비티 케이-2 균주가 파밤나방에 살충효과가 떨어지는 것으로 알려져 있는 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 숙주범위가 넓혀진 효과와 유사하며, 파밤나방 및 빨간집모기에 있어서도 기존의 강독성 비티 균주와 대등한 수준의 높은 독성을 가지는 유용한 균주임을 알 수 있었다.

<실시예 7> 비티 케이-2 균주의 내독소 단백질 유전자 조성 확인

비티 케이-2 균주내에 존재하는 비티 내독소 단백질 유전자 조성을 확인하고자 PCR을 이용하여 확인하였다. PCR 방법은 현재 가장 손쉽게 사용하는 비티 균주내에 독성을 결정하는 내독소 유전자를 확인하는 방법으로 실시방법은 다음과 같다.

PCR을 통해 비티가 보유하고 있는 내독소 단백질 유전자형을 결정하기 위해 지금까지 밝혀진cryI, II, III, IV, V에 이르는 모든 유전자형의 프라이머 (primer)들을 제작하여 실험에 사용하였다(표 3). 각 프라이머들은 해당 유전자의 보존 영역(conserved region)으로 다른 유전자와 구별되는 영역을 선택해서 제작되었다. PCR을 위한 시료 준비는 비티균주를 영양평판배지에 접종한 후 30℃, 12 - 18시간 동안 배양하여 생성된 세포를 100㎕의 멸균된 증류수가 들어 있는 1.5㎖ 에펜도르프 튜브에 옮기고 10분간 끓여서 세포를 방출시켰다. 그 후 10,000rpm에서 10초간 원심분리하여 얻어진 상층액을 새로운 튜브에 옮겨서 PCR 시료로 4℃에 보관하면서 사용하였다. PCR Mix는 바이오니아사(Bioneer Co. Korea)의 PreMix-Top^TM을 사용하였으며 각 프라이머를 0.1 μM, Template를 넣은 다음, 멸균증류수로 전체부피를 20 ㎕로 맞추었다. 시료의 증발을 방지하기 위해서 미네랄 오일을 한 방울 떨어뜨리고 DNA Thermal Cycler로 denaturation을 94℃에서 1분간, annealing은 각 프라이머의 annealing 온도에 따라 1분간 그리고 extension은 72℃에서 1분간씩 35회 반복조건을 설정하여 이루어졌다. 그 결과는 도 5와 같다.

<표 3>

내독소단백질 유전자 (cry)	프라이머	PCR산물크기(bp)
cry1Aa	5'GAGCCAAGCGACTGGAGCAGTTTACACC	782
cry1Ab	5'TCGAATTGAATTTGTTCC	238
cry1Ac	5'GTCCAACCTTATGAGTCACCTGGGCTTC	550
cry1B	5'GTCCAACCTTATGAGTCACCTGGGCTTC	902
cry1C	5'CAACCCTATTTGGTGCAGGTTC	288
cry1D	5'GGTACATTTAGATGTTCACAGCCAC	465
cry1E	5'CTTAGGGATAAATGTAAGTACAG	961
cry1F	5'CCGGTGACCCATTAACATTCCAATC	383
cry13'	5'ATCACTGAGTCGCTTCGCATCTTTGACTTTCTC	-
cry1G52'	5'ATATGGAGTGAATAGGGGG	235
cry1G32'	5'TGAACGGCGATTACATGC
cry25'	5'CAGATACCCTTGCTGGTGTAA	1073
cry23'	5'ATAGGCCCGTGCTCCACCAGG
cry3ABD5'	5'CCGAACAATCGAAGTGAA	-
cry3A3'	5'ATAGATGGTCCTACTT	1964
cry3B3'	5'ATTGTTGAACGGCAACAA	1359
cry3D3'	5'ATTGTTGACGGCAACAA	1135
cry3C5'	5'CCTGAAAATTGCAGGCC	1074
cry3uni3'	5'AATTGATCAATAGAATC
cry4A5'	5'CGAGGTGAATTTGCTCC	1032
cry4A3'	5'ATGGCTTGTTTCGCTACATC
cry4B5'	5'GGTGCTTCCTATTCTTTGGC	2610
cry4B3'	5'TGACCAGGTCCCTTGATTAC
cry4B5'	5'GGTGCTTCCTATTCTTTGGC	1393
cry4B3'	5'TGACCAGGTCCCTTGATTAC
cry4C5'	5'ATGAATCCDATATCAAAATAAG	2040
cry4C3'	5'AAGAACTTTGTTTTAATTAAC
cry4D5'	5'ATGGAGATAGTTCTTTAGAT	1932
cry4D3'	5'CTACTTTAGTAACGGATT
cry55'	5'ATGAAACTAAAGAATCAA	2174
cry53'	5'GGTAGATTTTAATTCTAC

도 5는 제 M 열은 100 bp DNA 래더이고, 제 KUR 열은 쿠르스타키 에이치디-1 균주, 제 AIZ 열은 아이자와이 균주, 제 K2 열은 비티 케이-2 균주의 내독소단백질 조성이다. 도 5에서 보는 바와 같이 위의 PCR 방법을 통하여 대조균주인 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주는 보고된 바와 같이cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac그리고cry2A유전자를 가지는 반면(Kronstad, J. W., H. E. Schnepf and H. R. Whiteley. 1983. Diversity of locations forBacillus thuringiensiscrystal protein genes. J. Bacteriol. 154: 419-428), 비티 케이-2 균주가cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D에 해당하는 4개의 유전자를 포함하고 있어 쿠르스타키 균주보다는 아이자와이 균주에 유사함을 확인할 수 있었다. 비티 케이-2 균주의 유전자 조성은 기존에 보고되어 있는 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 유전자 조성과는 다르게 아이자와이 유래 내독소단백질 유전자인cryIC와cryID유전자가 새롭게 나타난 경우로 기존의 비티 쿠르스타키 균주들에서는 볼 수 없는 새로운 형태의 조성임을 확인하였다. 이러한 유전자형을 가진 비티 케이-2 균주는 배추좀나방 및 파밤나방을 비롯하여 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 독성범위인 양배추은무늬밤나방, 담배나방, 흰점도둑나방, 배추흰나비, 박각시, 짚시나방, 누에나방, 흰불나방 등의 나비목 다수의 곤충과 파리목의 빨간 집모기를 비롯한 다른 집모기류에도 효과를 가짐을 예상할 수 있었다. 그외에cry1C와cry1D유전자의 경우는 파밤나방을 비롯한 담배거세미나방등에 효과가 탁월한 것으로 보고되어 있으므로 비티 케이-2 균주는 난방제 해충인 밤나방류 (Spodopteraspp.)에 대해서도 독성을 가짐을 예상할 수 있다.

<실시예 8> 비티 케이-2 균주의 배양 특성

비티 케이-2 균주의 대량 배양시 특성을 알아보기 위하여, 비티 내독소단백질 생산을 위한 일반배지인 GYS 배지와 UG 배지(0.75% 박토펩톤, 0.68% 인산제일칼륨, 0.0123% 황산마그네슘, 0.00017% 황산망간, 0.0014% 황산아연, 0.002% 황화철,0.003% 황산, 0.0147% 염화칼슘)에서 비티 케이-2 균주와 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주를 배양하면서, 매일 일정액의 배양액을 채취하여 OD₆₀₀값과 배양액의 pH를 측정하여 배양효율을 비교하였다.

그 결과는 도 6 및 도 7과 같다. 도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이, 비티 케이-2 균주는 대량배양시 포자형성율이 뛰어난 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주와 대등한 성장을 나타내었다.

위와 같이 배양된 비티 케이-2 균주와 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 배양후 산물의 포자농도를 비교하여 배양효율을 확인하였으며 그 결과는 하기 표 4와 같다.

<표 4>

배양농도 (Unit: X 10⁹CFU/ml)
비티 균주	GYS	UG
비티 케이-2	2.2	3.27
비티 쿠르스타키	1.8	3.2

GYS와 UG 배지상에서 모두 비티 쿠르스타키 균주와 대등한 포자생산능력을 보여 배양효율이 우수한 것이 입증되었으며, 비티 케이-2 균주가 비티 아이자와이 균주에 비해 효율적인 배양이 가능함을 나타내어 대량배양에 있어서도 효율적인 포자 및 내독소 단백질의 생산이 가능할 것으로 예상된다.

본 발명에 따른 비티 케이-2 균주는 아직 보고된 바가 없는 새로운 내독소단백질 유전자 조성을 갖는 균주로, 배추좀나방, 파밤나방 및 빨간집모기에 대해서 강독성을 보이며, 배양효율면에서도 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주와 대등한 효과적인 균주로 생각된다. 이러한 특징은 비티 케이-2 균주가 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주와 비티 아이자와이 균주의 장점을 함께 가지는 새로운 균주로 미생물 살충제로서의 이용가능성이 크다고 하겠다.

Claims

국내 산림토양으로부터 분리된 것으로, 파밤나방을 포함한 나비목과 파리목에 이중독성을 가지며, 배양특성 및 살충효과가 우수한 비티 케이(K)-2 균주(KCTC 18076P)
나비목과 파리목에 이중독성을 가지는 비티 케이(K)-2 균주(KCTC 18076P)를 유효성분으로 함유하는 미생물 살충제