KR20160125606A

KR20160125606A - 딱정벌레 방제용 살충제 조성물과 방제 방법

Info

Publication number: KR20160125606A
Application number: KR1020150056217A
Authority: KR
Inventors: 김은성; 강문수; 양경형; 김용균
Original assignee: 안동대학교 산학협력단; 주식회사 와이에이코리아
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2016-11-01

Abstract

본 발명은 생물농약 기반의 딱정벌레 방제용 살충제 조성물과 방제 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는, 독소단백질 유전자(Cry3)을 보유하는 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt) 균주와 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타(Photorhabdus temperata subsp. temperata: Ptt) 배양액을 유효성분으로 포함하는 딱정벌레 방제용 살충제 조성물이 제공된다. 두 세균을 혼합한 본 발명의 살충제 조성물은 실내 및 간이포장 실험에서 비티 대비 상승된 효과가 확인되었으며, 특히 배추를 가해하는 좁은가슴잎벌레를 대상으로 약 80% 방제가를 나타냈으며, 배추 어린잎에 약해를 주지 않았다.

Description

딱정벌레 방제용 살충제 조성물과 방제 방법 {Insecticide composition for controlling coleopteran insect pests and the method of controlling them}

본 발명은 딱정벌레 방제용 살충제에 관한 것으로, 특히 생물농약 기반의 딱정벌레 방제용 살충제 조성물과 방제 방법에 관한 것이다.

화학농약의 무분별한 사용은 해충의 약제 저항성을 유발하였고, 이로 인하여 살충제의 사용량 증가로 농가의 경제적 손실 및 환경과 인축 피해를 주었다. 안전농산물 생산을 위한 인축에 피해가 적고 환경에 안전한 농약의 개발이 생물농약을 중심으로 개발되어 왔다. 나비목 해충을 대상으로 살충력이 높은 비티 살충제가 산업적으로 성공한 사례가 되어 현재까지 사용되고 있다(Bravo et al., 2011).

비티 살충제는 그람양성균인 Bacillus thuringiensis 세균을 기반으로 다양한 균주가 이용되었다. 이 세균의 살충 기작은 이 세균이 포자를 형성할 때 포자 주변에 존재하는 독소단백질 결정체(Crystal: Cry)에 의해 기인된다(Crickmore et al., 2014). Cry 단백질은 B. thuringiensis 균주에 따라 다양하여, B. thuringiensis subsp. kurstaki (BtK)와 B. thuringiensis subsp. aizawai (BtA)는 나비목해충을 방제하는 데 적합한 Cry 단백질을 발현하는 반면, B. thuringiensis subsp. israelensis (BtI)와 B. thuringiensis subsp. tenebrionis (BtT)는 각각 파리목과 딱정벌레목 해충을 대상으로 방제가 효과가 높은 Cry 단백질을 발현하게 된다.

Cry 단백질은 대상 해충의 장내에 들어가면, 나비목 해충의 경우 중장의 알칼리 pH 조건에서 용해되어 소화효소(예, 트립신 유사 효소)의 작용에 의해 활성화된 독소단백질로 전환된다. 활성화된 Cry 단백질은 중장막의 aminopeptidase N (APN) 또는 alkaline phosphatase (ALP)의 도움으로 중장막 주변으로 밀집하게 되며, 이때 캐드헤린 막단백질에 의해 N 말단 영역의 첫번째 α helix 영역이 제거되면서 추가 활성화가 진행된다(Bravo et al., 2012). 이 추가 활성화된 Cry 단백질은 서로 올리고머를 형성하면서 중장막에 구멍을 뚫게 된다. 최근 이 과정에 ABC co-transporter의 기능이 관여하며, 이 단백질이 올리고머를 형성한 Cry 단백질에 대한 궁극적 수용체로 작용하여 중장막에 구멍을 형성하는 데 궁극적으로 도움을 주는 것으로 밝혀지고 있다. 이 구멍 형성 과정에 다시 높은 기질 친화도를 갖는 APN과 ALP가 수용체로 작용할 수 있다(Bravo et al., 2005).

비티 농약의 성공적 상업화와 더불어 농업 현장에서는 이 생물농약에 대한 저항성 사례가 나타나기 시작했다. 더욱이 비티 농약의 살충효과는 60-70% 방제 효과를 넘지 못하고 있다(Kwon and Kim, 2007). 또한 이들 미생물농약의 지효성은 농민들의 요구도를 채우지 못하는 이유가 되고 있다. 이를 극복하고 생물농약을 통한 친환경 방제를 이루기 위해 나타난 개념이 통합생물방제(Integrated Biological Control: IBC)이다(Jung and Kim, 2006). 작용점이 상이한 서로 다른 생물제제를 이상적으로 혼합하여 약효를 높이려는 기술을 담고 있다. IBC의 사례로서는 비티 농약과 곤충면역억제 인자와의 혼합 사용에서 찾을 수 있다.

Photorhabdus temperata subsp. temperata (Ptt)는 그람음성세균으로 곤충병원선충인 Heterorhabditis megidis의 공생균으로 작용한다(Kaya and Gaugler, 1993; Kang et al., 2005). 이 선충은 대상 곤충의 혈강으로 침입할 수 있고, 이 혈강에서 Ptt 세균을 분비하게 된다. 분비된 세균은 면역억제인자를 곤충 혈강으로 분비하며 자신과 기주 선충을 곤충의 면역 반응으로 부터 보호받게 하고 자신의 증식을 도모하게 된다. 증식 과정에서 분해된 유기물과 함께 세균을 섭취한 선충은 발육하여 차세대를 형성하여 세균과 선충의 공생관계를 이루게 된다.

Ptt와 관련하여 최소 네 종류의 면역억제물질이 화학적으로 동정되었다(Seo et al., 2012). 이들 물질의 공통된 특징은 곤충면역중개 물질인 아이코사노이드 생합성을 시작시키는 인지질분해효소인 phospholipase A₂의 활성을 억제하는 것으로 판명되었다(Kim et al, 2005). 이 물질은 세균 배양액에 존재하며, 이 세균 배양액과 비티 농약의 혼합액은 나비목 해충의 방제효과를 크게 향상시켰다. 즉, 비티의 Cry 독소단백질에 의해 대상 곤충이 중장세포층이 허물어지면서 이를 통해 Ptt 면역억제물질이 혈강으로 침입할 수 있게 되어 살충효과를 높인 것으로 해석되었다.

Bravo, A., S. S. Gill and M. Soberㆃn (2005) Bacillus thuringiensis mechanisms and use, In Comprehensive molecular insect science; Gilbert, L. I., K. Iatrou and S. S. Gill, Eds.; Elsevier; New York, pp. 175-206. Bravo, A., S. Likitvivatanavong, S. S. Gill and M. Soberㆃn (2011) Bacillus thuringiensis: a story of a successful bioinsecticide. Insect Biochem. Mol. Biol. 41:423-431. Bravo, A., I. Gㆃmez, H. Porta, B. I. Garcia-Gㆃmez, C. Rodriguez-Almazan, L. Pardo and M. Soberㆃn (2012) Evolution of Bacillus thuringiensis Cry toxins insecticidal activity. Microbial Biotechnol. 6:17-26. Crickmore, N., J. Baum, A. Bravo, D. Lereclus, K. Narva, K, Sampson, E. Schnepf, M. Sun and D. R. Zeigler (2014) 'Bacillus thuringiensis toxin nomenclature'. http://www.btnomenclature.info. Jung, S. and Y. Kim (2006) Synergistic effect of entomopathogenic bacteria (Xenorhabdus sp. and Photorhabdus temperata ssp. temperata) on the pathogenicity of Bacillus thuringiensis ssp. aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae). Environ. Entomol. 35:1584-1589. Kang, S., S. Han and Y. Kim (2005) Identification and pathogenic characteristics of two Korean isolates of Heterohabditis megidis. J. Asia-Pac. Entomol. 8:411-418. Kaya, H. K. and R. Gaugler (1993) Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38:181-206. Kim, Y., D. Ji, S. Cho and Y. Park (2005) Two groups of entomopathogenic bacteria, Photorhabdus and Xenorhabdus, share an inhibitory action against phospholipase A2 to induce host immunodepression. J. Invertebr. Physiol. 89:258-264. Kwon, S. and Y. Kim (2007) Immunosuppressive action of pyriproxyfen, a juvenile hormone analog, enhances pathogenicity of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki against diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Yponomeutidae). Biol. Control 42:72-76. Seo, S., S. Lee, Y. Hong and Y. Kim (2012) Phospholipase A2 inhibitors synthesized by two entomopathogenic bacteria, Xenorhabdus nematophila and Photorhabdus temperata subsp. temperata. Appl. Environ. Entomol. 78:3816-3823.

본 발명은 IBC(통합생물방제) 기술에 입각하여 배추를 가해하는 딱정벌레를 방제할 효과적인 살충제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 본 발명에서는, 먼저 딱정벌레에 적용이 가능한 B. thuringiensis 균주를 선발하고, 또한 Ptt의 살충효과 및 면역억제 효과를 검증하였다. 최종적으로 두 세균을 혼합한 미생물혼합제를 개발하였고, 이를 실내 및 간이포장 실험을 수행하여 그 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서는,

서열번호 3의 독소단백질 유전자(Cry3)을 보유하는 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt) 균주와 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타(Photorhabdus temperata subsp. temperata: Ptt) 배양액을 유효성분으로 포함하는 딱정벌레 방제용 살충제 조성물이 제공된다.

상기 바실러스 튜린지엔시스 균주는, 특히 바실러스 튜린지엔시스 ssp. 테네브리오니스(B. thuringiensis subsp. tenebrionis: BtT)를 포함한다.

상기 Bt와 Ptt는, Bt 10¹⁰ spores/mL 배양액을 기준으로 상기 Ptt는 48시간 배양액을 기준으로, 1:7~9의 부피비로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 딱정벌레 방제용 살충제 조성물은, 바람직하게는 전착제와 에탄올을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, Bt 8~12부피%, Ptt 70~85부피%, 에탄올 5~15부피% 및 전착제 0.1~5부피%를 포함할 수 있다. 상기 전착제로는 농업분야에 이용 가능한 공지의 전착제가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서는,

바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)의 독소단백질 유전자(Cry)를 증폭시키기 위한 프라이머쌍이 제공된다. 구체적으로, 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)의 독소단백질 유전자(Cry1Ca: 서열번호 1)를 증폭시키기 위한 프라이머쌍으로서, 서열 번호 5와 6의 염기서열을 갖는 프라이머쌍이 제공된다. 또한, 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)의 독소단백질 유전자(Cry1Ac: 서열번호 2)를 증폭시키기 위한 프라이머쌍으로서, 서열 번호 7과 8의 염기서열을 갖는 프라이머쌍이 제공된다. 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)의 독소단백질 유전자(Cry3: 서열번호 3)를 증폭시키기 위한 프라이머쌍으로서, 서열 번호 9과 10의 염기서열을 갖는 프라이머쌍이 제공된다. 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)의 독소단백질 유전자(Cry4: 서열번호 4)를 증폭시키기 위한 프라이머쌍으로서, 서열 번호 11과 12의 염기서열을 갖는 프라이머쌍이 제공된다.

또한, 본 발명에서는,

딱정벌레의 유충과 성충 모두를 방제하기 위하여, 서열번호 3의 독소단백질 유전자(Cry3)을 보유하는 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt) 균주와 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타(Photorhabdus temperata subsp. temperata: Ptt) 배양액을 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 딱정벌레 방제 방법이 제공된다.

본 발명에서는, 딱정벌레의 유충과 성충 모두를 방제할 수 있는, 서열번호 3의 독소단백질 유전자(Cry3)을 보유하는 B. thuringiensis 균주를 선발하고, 딱정벌레에 대한 살충효과 및 면역억제 효과가 있는 Ptt와 조합하여 딱정벌레를 방제할 수 있는 효과적인 생물농약 기반의 살충제 조성물과 방제 방법을 제공한다. 두 세균을 혼합한 미생물혼합제인 본 발명의 살충제 조성물은 실내 및 간이포장 실험에서 비티 대비 상승된 효과가 확인되었으며, 특히 배추를 가해하는 좁은가슴잎벌레를 대상으로 약 80% 방제가를 나타냈으며, 배추 어린잎에 약해를 주지 않았다.

도 1은 좁은가슴잎벌레 유충에 대한 두 곤충면역억제 세균의 살충력을 비교한 결과이다. 두 세균은 Ptt (Photorhabdus temperata subsp temperata ANU101)와 Xn (Xehornhabdus nematophila ANU101)를 이용하였다. 각 농도로 유충의 혈강에 주입하였으며 살충효과는 처리후 3일차(days after treatment: DAT)에 조사하였다. 각 처리는 10 마리씩 3반복으로 실시되었다. 'NS'는 0.05 유의수준에서 평균간 차이가 나타나지 않았음을 의미한다.
도 2는 좁은가슴잎벌레에 대한 Ptt 배양액의 면역억제 효과를 실험한 결과이다. TSB에서 48 시간 배양된 Ptt 배양액을 원심분리하여 세균을 제거하고 다시 0.22 ㎛ 여과지를 통해 배양액에 존재하는 잉여 세균을 제거했다. 항생제(ampicillin) 저항성 대장균을 좁은가슴잎벌레 개체 당 150 CFU의 밀도로 주입하였다. Ptt처리구는 3 ㎕ 배양액을 대장균과 함께 주입하였으며, 대조구는 Ptt 배양액 대신에 멸균수를 대장균과 함께 주입하였다. 각 처리는 3반복으로 실시되었다.
도 3은 Bacillus thuringiensis (Bt) 세균이 생산하는 Cry 독소 단백질의 염기서열 비교 및 특이적 Cry 판명 PCR 프라이머 개발을 보여주는 염기서열 비교도이다.
도 4는 네 종류의 Bacillus thuringiensis (Bt) 세균이 함유하는 Cry 단백질 다양성을 비교한 결과이다. 분석된 Bt 세균은 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (BtT), B. thuringiensis subsp. aizawai (BtA), B. thuringiensis subsp. kurstaki (BtK) 그리고 B. thuringiensis subsp. israelensis (BtI)를 이용하였다.
도 5a 및 5b는 각각 좁은가슴잎벌레 유충과 성충에 대한 네 종류 Bt 세균의 살충력을 비교한 결과이다. 네 Bt 세균은 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (BtT), B. thuringiensis subsp. aizawai (BtA), B. thuringiensis subsp. kurstaki (BtK) 그리고 B. thuringiensis subsp. israelensis (BtI)를 이용하였다. 생물검정은 잎침지법을 이용하였다. 배추를 이들 세균이 10⁶ 포자수/mL의 농도로 포함된 처리 약제에 담군 후 말려 유충과 성충에 먹이로 제공하였다. 살충효과는 처리 후 6일차(days after treatment: DAT)에 조사하였다. 각 처리는 10 마리씩 3반복으로 실시되었다. 막대 위에 포기된 서로 다른 영문자는 0.05 유의수준에서 평균간 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 6은 Ptt 배양액 첨가에 따른 BtT 방제효과 변화를 분석한 결과이다. 모든 처리는 BtT를 10⁶ 포자수/mL로 고정하였다. 이들 BtT 처리액에는 다양한 Ptt 배양액 농도가 함유되었다. 살충효과는 처리 후 6일차(days after treatment: DAT)에 조사하였다. 각 처리는 10 마리씩 3반복으로 실시되었다. 막대 위에 포기된 서로 다른 영문자는 0.05 유의수준에서 평균간 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 7은 유묘 배추에 대한 콜킬의 약해를 조사한 결과이다.

본 발명은 딱정벌레 해충을 방제할 목적으로 새롭게 개발된 생물농약이다. 본 발명의 딱정벌레 방제용 살충제 조성물은 기존의 비티(Bacillus thuringiensis)를 기반으로 하는 미생물제제에 면역능력을 낮추는 새로운 미생물배양액을 혼합하여 살충력을 높이는 제형으로 개발되었다. Bt 세균으로는, 바람직하게는 B. thuringiensis subsp. tenebrionis (BtT)를 선발하였다. 선발된 BtT의 살충력은 60%를 넘지 못했다. Photorhabdus temperata subsp. temperata (Ptt)의 배양액은 딱정벌레의 면역을 낮추는 효과를 보였다. 본 발명에서는 본 발명의 살충제 조성물을 "콜킬"로 명명하였다. 콜킬은 배추를 가해하는 좁은가슴잎벌레를 대상으로 약 80% 방제가를 기록하였으며, 또한 배추 어린잎에 약해를 주지 않았다.

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

재료 및 방법

1. 좁은가슴잎벌레 사육

본 실험에 사용된 좁은가슴잎벌레(Phaedon brassicae)는 온도 25 ± 1℃, 광조건 16:8 (L:D) h, 상대습도 60 ± 10% 사육실에서 누대 사육하였다. 유충의 경우 배추를 먹이로 제공하였고, 성충의 경우 10% 설탕물과 배추를 함께 먹이로 제공하여 사육하였다. 생물검정에 사용된 유충은 4-5령 유충(부화 후 7-10일 경과 개체)을 이용하였고, 성충은 우화 10-20일 된 개체를 이용하였다.

2. 곤충병원세균 균주 배양

곤충병원세균(Xenorhabdus nematophila ANU101, Photorhadus temperata temperata ANU101)은 기주 선충에서 분리된 후 동결보관중인 것을 이용하였다(Jung and Kim, 2006). 이들 균주는 tryptic soy broth (TSB, MBcell, Seoul, Korea) 배지를 이용하여 28℃에서 16 시간 배양 후, 글리세롤이 30%가 되도록 첨가하여 보관용 균주를 만들었다. 이 보관 균주는 반복되는 세균 배양의 원시료로 이용되어 계대배양에 따른 세균 변이 가능성을 줄였다. 이 균주를 28℃에서 48 시간 동안 200 rpm에서 배양하여 균주를 얻었다.

네 종류의 비티 균주(BtK, BtA, BtK, BtT)가 본 발명에 비교 분석되었는데, 사용된 균주는 외국에서 분양받은 후 보관 중인 것을 이용하였다. 이들 각 비티 균주를 TSB 평면 배지에 세균을 도말하고 28℃에서 16 시간 배양하였다. 평면배지에서 배양된 세균에서 단일 콜로니를 얻고 이를 TSB 액체 배지를 이용하여 28℃에서 48 시간 동안 200 rpm에서 배양한 후, 다시 48시간 동안 4℃ 저온고에 보관하여 세균의 포자 형성을 유도하였다.

3. Ptt 세균 혈강 독성 분석

Ptt와 X. nematophila 세균의 혈강 독성을 좁은가슴잎벌레 유충을 대상으로 비교하였다. 각 유충에 서로 다른 세균 밀도(0-10⁷ CFU)로 각각 혈강에 주입했다. 혈강 주입은 모세관 주사기를 이용하여 1 μL씩 미량주사하였다. 각 세균 농도로 10 마리씩 처리한 후 3일째 사망율을 조사하였다.

4. Ptt 배양액의 면역억제 활성

앞에서 기술한 방법대로 Ptt 세균을 48 시간 배양하고, 8,000 rpm에서 30분 원심분리 한 후 배양액 상등액을 얻었다. 배양액 상등액은 0.22 μm 막여과지를 이용하여 배양액에 존재하는 잉여 세균을 제거하고 순수 배양액만 분리하였다. 이렇게 분리된 배양액을 재조합 대장균과 혼합하여 좁은가슴잎벌레 유충 혈강에 주입하였다. 재조합 대장균은 ampicillin 저항성 유전자를 갖는 pCR2.1 벡터에 형질전환된 것을 이용하였다. 세균의 혈강 주입은 앞에서 긱술한 미량주사기법을 이용하였다. 각 유충에 주입된 세균의 농도는 4.8 x 10⁴ CFU 였다. 처리 후 시간별로 혈림프를 수거하여 ampicillin (0.13mM)이 함유된 Luria-Bertani 배지에 도말하고 37℃에서 15 시간 배양하였다. 이후 형성된 균총수를 계수하여 개체 당 CFU 수로 환산하였다.

5. 살충제 조성물("콜킬") 제조

살충제 조성물 '콜킬'은 Bt (10¹⁰ 7.28/mL) 25 ㎖, Ptt 배양액 195 ㎖, 100% 에탄올 25 ㎖ 그리고 전착제(Koremul-DH-5006, 한농화성, 군산, 한국) 5 ㎖을 섞어 총 250 ㎖의 액제로 조제하였다.

6. Cry toxin 확인

본 발명에 이용된 4종의 B. thuringiensis가 발현하는 특이적 독소 독소를 확인하기 위하여 각 독소(Cry1Ca, Cry1Ac, Cry3, Cry4)별 프라이머를 제작하였다. 네 종류의 Crt 독소단백질 유전자는 NCBI의 GenBank에서 Cry1Ca는 AF362020, Cry1Ac는 EU447666, Cry3는 AJ37900 그리고 Cry4는 FJ770572의 accession number를 이용하여 얻었으며, 각각 서열번호 1 내지 4와 같다. Cry1Ca의 forward primer는 5'-GCCAGTTGGTCAACTAAGGGAAG-3'(서열번호 5), reverse primer는 5'-CCGTACCTCTTCCTCGATACGTAAA-3'(서열번호 6)이며, Cry1Ac forward primer는 5'-GATATCGTTGCTCTGTTCCCGAA-3'(서열번호 7), reverse primer는 5'-CACGTTGTTATTCTGTGGCGGT-3'(서열번호 8), Cry3의 forward primer는 5'-CCTTTAGCGGAAACTCCAAATC-3'(서열번호 9), reverse primer는 5'-TGAACTCAATGCACTCACATAATC-3'(서열번호 10)이며, Cry4의 forward primer는 5'-CCTATGCACAAGCTGCAAATC-3'(서열번호 11), reverse primer는 5'-CGTTGACATCCCTTCTACAGTC-3'(서열번호 12)이다. PCR 반응용액은 25 ㎕로서 진올 제품(서울, 한국)의 PCR 반응용액을 이용하였다. 각 PCR 반응용액은 1 ㎕ Bt gDNA, 2.5 ㎕ 10x 완충용액, 2 ㎕ dNTP, 1 ㎕ forward primer, 1 ㎕ reverse primer 그리고 0.5 ㎕의 Taq polymerase로 구성되었다. PCR 기계는 Biorad 회사의 MyCycler^TMpersonal Themal Cycler 모델을 이용하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분 변성처리 이후 35 회 증폭반응이 진행되었다. 각 증폭 반응은 94℃ 변성 30 초, 52℃ 프라이머 결합 30초, 72℃ 사슬연장 1분으로 구성되었다. 모든 증폭반응 후 72℃에서 10분간 잉여 사슬연장 반응을 실시하였다. 이후 4℃에 증폭물을 보관시켰다. PCR 증폭물은 1% 아가로오즈 젤을 이용하여 분리하였다. 전기영동 조건은 1X TAE 완충용액, 150 V 전압으로 25 분간 실시되었다. 분리된 PCR 증폭물은 ethidium bromide를 이용하여 염색된 후 관찰하였다.

7. 비티 genomic DNA 추출

비티세균의 게놈 DNA를 추출 하기위해 저온처리 된 각각의 비티를 2ml씩 e-tube에 수거한 뒤 13000rpm에서 5분간 원심분리 후 pellet을 얻었다. 얻은 pellet은 500㎕의 extraction buffer (10mM Tris (pH 8.0), EDTA (pH 8.0), 20㎕/ml RNase A, 0.5% SDS)로 녹였다. 그리고 10㎕ 의 100㎍/ml 농도의 proteinase K로 깨진 효소들을 제거했으며, 50℃ wise bath에 10분간 반응시켰다. 그 다음 225㎕의 PCI (Phenol:Chloroform:Isopropylalcohol = 25:24:1 (v))를 넣은 후 14000rpm에서 2분간 원심분리 시켰다. 그 후 상등액을 새로운 e-tube에 옮긴 후 500㎕ 의 CI (Chloroform:Isopropylalcohol = 24:1 (v))을 넣은 후 당 단백질을 제거하여 주었다. 그 후 다시 1400rpm에서 2분간 원심분리 하여 상등액을 새로운 tube에 담아주었고, 40㎕의 10M ammonium acetate 와 800㎕의 100% Ethanol을 넣은 후 얼음에서 10분간 반응시킨 후 14000rpm에서 3분간 원심분리 후 DNA를 수거하였다. 수거한 DNA는 70% Ethanol로 세척 한 후 50㎕의 증류수로 녹여졌다.

8. 생물검정

약제처리는 잎침지법으로 2 x 2 cm² (가로 x 세로) 크기의 배추잎을 약제 처리용액에 약 20 분간 침지한 후 여과지 위에서 4-5 분간 과잉 약액을 제거시켰다. 이를 새로운 여과지가 깔려있는 직경 8.5 ㎝의 사육용기에 놓고 좁은가슴잎벌레 유충과 성충을 접종하였다. 곤충은 사육용기에 각 10 마리씩 접종하였으며, 사육용기가 실험단위로 3 반복 처리하였다. 이때, 무처리구는 멸균수에 침지한 배추잎을 이용하였고, 대조구는 디노테퓨란ㆍ스피네토란 입상수화제(격파, 동부팜한농, 서울, 한국)를 사용하였으며 권장농도를 시험에 사용하였다. 유충과 성충의 살충 유무는 24 시간 간격으로 조사되었고, 이때 치사 곤충은 외부 자극에 대해 능동적 반응 움직임이 없는 개체로 규정하였다.

10. 간이포장실험

배추가 재배된 포트에 좁은가슴잎벌레 유충과 성충을 접종하였다. 각 배추 포기가 반복으로 30 마리 이상의 밀도를 나타냈다. 콜킬은 1,000 배 희석액을 이용하였으며, 대조 약제 디노테퓨란ㆍ스피네토란 입상수화제는 추천농도인 1,000 배 희석액을 사용하였다. 무처리는 물만 살포하였다. 생존수는 처리 후 3, 7일에 조사하였다. 방제가는 무처리구 대비 평균생존율 저하로 산출하였다.

11. 약해분석

어린 배추를 이용하여 콜킬의 약해를 조사하였다. 콜킬을 1,000 배 (기준량)와 500 배(배량)로 희석한 후 배추잎에 살포하였다. 각 처리는 3 반복으로 시행하였다. 약해 조사는 처리 후 3, 5, 7일에 실시되었으며 달관조사로 이뤄졌다. 달관조사는 0-5의 수준으로 평가하였다. 0은 약해가 없는 것이며 숫자가 증가할수록 약해정도가 심한 것으로 나타냈다.

12. 통계처리

모든 살충효과 시험 결과는 백분율 자료로서 arsine 변환 후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA분석 및 처리 평균간 비교를 실시하였다. 반수치사시간(median lethal time: LT₅₀)은 PROBIT 분석법(Raymond, 1985)를 이용하여 산출하였다.

결과

1. 콜킬 제조를 위한 면역억제물질 분비 세균 균주 선발

콜킬의 발명을 위해서는 곤충면역 억제물질 분비를 하는 세균 균주와 다양한 Bt 균주 가운데 딱정벌레 적용 균주를 선발할 필요가 있었다. 먼저 곤충면역억제 균주는 Ptt와 Xn를 비교하여 Ptt 균주를 선발하였다. 도 1은 좁은가슴잎벌레 유충에 대한 두 곤충면역억제 세균의 살충력 비교한 결과로, 두 세균은 Ptt (Photorhabdus temperata subsp temperata ANU101)와 Xn (Xenorhabdus nematophila ANU101)를 이용하였다. 서로 다른 농도의 세균 밀도로 혈강에 주입한 결과 두 세균은 모두 좁은가슴잎벌레 유충에 대해 살충력을 나타냈다. 그러나 농도에 따른 두 세균의 살충력 차이는 나타나지 않아 보였다.

표 1은 좁은가슴잎벌레에 대한 두 세균의 중앙치사농도를 나타낸 것이다. 표 1과 같이, 중앙치사농도는 Ptt 세균이 Xn 세균에 비해 다소 낮은 수치를 보여 통계적으로 차이는 인정되지 않았으나, Ptt가 Xn에 비해 우세한 살충력을 보인 것으로 판명되어 이 세균을 콜킬 제조에 선발하였다.

[표 1]

좁은가슴잎벌레에 대한 Ptt 배양액의 면역억제 효과를 규명하였으며, 결과는 도 2와 같다. 이를 위해 항생제 ampicillin에 저항성 유전자를 지닌 재조합 대장균을 대상 곤충 혈강에 주입하고, 처리 후 시간별 체내에 존재하는 대장균 밀도 감소를 추적하였다. 대조구의 경우 처리 후 24 시간 이후 주입한 세균 밀도의 뚜렷한 감소를 나타냈다. 이에 반해 Ptt 처리구는 주입된 세균의 밀도 감소가 뚜렷하게 지연되는 효과를 나타냈다. 이는 Ptt 배양액에 좁은가슴잎벌레의 면역을 억제하는 물질이 포함되어 있음을 의미했다.

2. 콜킬 제조를 위한 Bt 세균 균주 선발

Bt 선발을 위해 네 종류의 서로 다른 균주를 좁은가슴잎벌레 방제를 위해 비교 선발하였다. 우선 이들 Bt들의 Cry 독소단백질의 다양성을 규명하려 하였다. 각 독소단백질 유전자를 판명하는 특이적 프라이머를 이들 유전자를 비교하여 특이적 유전자 서열을 바탕으로 개발하였다(도 3). 이에 따라 결정된 프라이머 서열은 아래 표 2와 같다.

[표 2]

또한, 특이적 PCR 프라이머를 이용하여 본 발명에 이용된 네 Bt 균주의 Cry 독소단백질의 다양성을 비교한 결과는 도 4와 같다. 네 Bt 균주는 상이한 Cry 독소단백질 유전자를 보유하였다. BtA는 Cry1C, BtK는 Cry1C와 Cry1A, BtT는 Cry3를 주요 독소단백질로 나타냈다. 반면에 BtI는 분석대상 독소단백질을 갖고 있지 않은 것으로 나타났다.

Bt 선발을 위해 네 종류의 서로 다른 균주를 잎침지법으로 유충과 성충에 대해서 살충력을 비교하였으며, 그 결과는 도 5a 및 5b와 같다. 네 Bt 균주는 좁은가슴잎벌레 유충과 성충 모두에게 살충력을 발휘하였다. 그러나 이들 균주들 사이에는 살충력에 차이를 나타냈다. 성충의 경우는 BtI를 제외하고 세 균주 모두 동일한 방제 효과를 나타냈으나, 유충은 이 세균 균주 사이에서도 차이를 나타내, BtT 가장 높은 유충 살충력을 보였다. 이러한 결과로부터 BtT가 이들 네 Bt 균주 가운데 좁은가슴잎벌레의 섭식 발육시기인 유충과 성충 모두에 대해서 효과적 방제를 위해 가장 살충력이 높은 균주로 판명되었다.

3. Ptt 배양액 첨가에 따른 BtT 살충력 제고 효과

선발된 BtT는 좁은가슴잎벌레의 방제에 최대 살충력이 약 60%를 나타내면서 방제 효과의 한계를 나타냈다. 이에 면역억제효과를 지닌 Ptt 배양액을 BtT에 추가하여 방제 효율 변화를 분석했으며, 그 결과는 도 6과 같다. Ptt 배양액을 서로 다른 농도로 고정된 BtT 농도에 추가한 결과 Ptt 배양액 농도가 증가할수록 좁은가슴잎벌레에 대한 방제 효율이 증가하여 최대 약 80%의 살충율을 나타냈다.

Ptt 배양액 첨가는 방제가 제고는 물론이고 살충 속도를 크게 증가시켰다. 표 3은 Ptt 배양액 첨가에 따른 BtT 살충 속도 변화를 분석한 결과이다. Ptt 배양액 처리 농도별로 중앙치사시간(LT₅₀)을 분석한 결과 Ptt 배양액 첨가는 최대 약 38 시간 이상 살충속도를 빠르게 유도하는 것을 확인하였다.

[표 3]

4. 콜킬 제조와 생물검정

이상의 결과는 좁은가슴잎벌레를 방제하는 데 Bt 균주로서 BtT와 면역억제 균주로서 Ptt가 최상의 조합으로 제시하였다. 이에 따라 최대 살충력을 주는 살포액의 최소 농도가 10⁶ 포자수/mL인 것을 감안하여 Bt 균주의 혼합비율을 결정하였고, 장기보관제인 에타놀을 10% 첨가하고, 전착제를 2%로 제한시킨 조건에서 나머지 78% 액상은 Ptt 배양액을 채우도록 제조하였다. 조성물의 성분비는 아래 표 4와 같다.

[표 4]

조제된 콜킬을 1,000 배 희석하여 대조약제들과 함께 좁은가슴잎벌레의 유충과 성충을 대상으로 잎침지법으로 방제효과를 분석하였으며, 그 결과는 아래 표 5와 같다. 이러한 결과 유충과 성충 모두에서 콜킬은 비티 단독 처리에 비해 높은 방제 효율을 나타냈다. 콜킬의 방제 효과는 75-80%의 방제효과를 나타냈다. 이러한 결과는 좁은가슴잎벌레 방제를 위해 등록된 상용 화학 살충제의 방제 효율에 비해서는 낮은 것이나, 생물농약으로서는 높은 방제효과이다.

[표 5]

¹ 'BtT' represents a spray with Bacillus thurigniensis subsp. tenebrinis (10⁶ spores/mL). Preparation of 'Col-kill' was described in Materials and method. 'DF' represents a commercial insecticide of dinotefuran+spinetoram (SG, Dongbu Farm Hannong, Seoul, Korea) and was sprayed as a recommended concentration.

콜킬의 방제효과를 간이 포장 시험에서 진행하였으며, 그 결과는 아래 표 6 및 7과 같다. 시험곤충은 좁은가슴잎벌레 유충을 이용하였고, 기주는 배추를 대상으로 하였다. 각 처리는 유충이 30 마리씩 포함되었고, 이를 3 반복하여 방제효과를 산출하였다. 콜킬의 방제효과는 3일차 및 7일차 결과 모두 비티 단독처리에 비해 높았다. 그러나 화학농약은 7일차에서 94.7%의 높은 방제효과를 보인 반면 콜킬은 77.2%의 방제 효과에 그쳤다.

[표 6]

[표 7]

또한, 배추에 대한 콜킬의 약해가 분석되었으며, 아래 표 8과 같은 조건으로 분석되었으며, 결과는 도 7과 같다. 어린 유묘 배추에 대한 콜킬의 기준량(1,000 배) 및 배량(500 배)에 대해서 약해는 나타나지 않았다.

[표 8]

<110> andong national university industry-Academic cooperation Foundation YA Korea Co. Ltd. <120> Insecticide composition for controlling coleopteran insect pests and the method of controlling them <130> KP2875 <160> 12 <170> KoPatentIn <210> 1 <211> 446 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 1 gccagttggt caactaacaa gggaagttta tacggaccca ttaattaatt ttaatccaca 60 gttacagtct gtagctcaat tacctacttt taacgttatg gagagcagcg caattagaaa 120 tcctcattta tttgatatat tgaataatct tacaatcttt acggattggt ttagtgttgg 180 acgcaatttt tattggggag gacatcgagt aatatctagc cttataggag gtggtaacat 240 aacatctcct atatatggaa gagaggcgaa ccaggagcct ccaagatcct ttacttttaa 300 tggaccggta tttaggactt tatcaaatcc tactttacga ttattacagc aaccttggcc 360 agcgccacca tttaatttac gtggtgttga aggagtagaa ttttctacac ctacaaatag 420 ctttacgtat cgaggaagag gtacgg 446 <210> 2 <211> 537 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 2 gatatcgttg ctctgttccc gaattatgat agtagaagat atccaattcg aacagtttcc 60 caattaacaa gagaaattta tacaaaccca gtattagaaa attttgatgg tagttttcga 120 ggctcggctc agggcataga aagaagtatt aggagtccac atttgatgga tatacttaac 180 agtataacca tctatacgga tgctcatagg ggttattatt attggtcagg gcatcaaata 240 atggcttctc ctgtcggttt ttcggggcca gaattcacgt ttccgctata tggaaccatg 300 ggaaatgcag ctccacaaca acgtattgtt gctcaactag gtcagggcgt gtatagaaca 360 ttatcgtcca ctttatatag aagacctttt aatataggga taaataatca acaactatct 420 gttcttgacg ggacagaatt tgcttatgga acctcctcaa atttgccatc cgctgtatac 480 agaaaaagcg gaacggtaga ttcgctggat gaaataccgc cacagaataa caacgtg 537 <210> 3 <211> 366 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 3 cctttagcgg aaactccaaa tccaacacta gaagatttaa attataaaga gtttttaaga 60 atgactgcag ataataatac ggaagcacta gatagctcta caacaaaaga tgtcattcaa 120 aaaggcattt ccgtagtagg tgatctccta ggcgtagtag gtttcccgtt tggtggagcg 180 cttgtttcgt tttatacaaa ctttttaaat actatttggc caagtgaaga cccgtggaag 240 gcttttatgg aacaagtaga agcattgatg gatcagaaaa tagctgatta tgcaaaaaat 300 aaagctcttg cagagttaca gggccttcaa aataatgtcg aagattatgt gagtgcattg 360 agttca 366 <210> 4 <211> 374 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 4 cctatgcaca agctgcaaat cttcatttaa aaatattaag agatattttg atacatggag 60 aagatttaca aataataagc actgctgatc gtcaattcta tagggataaa ctatttggtg 120 gtctaaaaaa ttatactaat tattgtgtag atcagtataa tgcaggttta aaccagataa 180 aagaggctgg tactagtgct gcaaattggc tgagatttca cagatttcgc agggaaatga 240 cattgtcggt attagattta attgcattat ttccaactta tgatattgat agctatgatt 300 taccagtaaa cgtggaatta tctagaataa tttatacaga tccagtaggt tggactgtag 360 aagggatgtc aacg 374 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gccagttggt caactaaggg aag 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccgtacctct tcctcgatac gtaaa 25 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atatcgttgc tctgttcccg aa 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cacgttgtta ttctgtggcg gt 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cctttagcgg aaactccaaa tc 22 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgaactcaat gcactcacat aatc 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cctatgcaca agctgcaaat c 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cgttgacatc ccttctacag tc 22

Claims

서열번호 3의 독소단백질 유전자(Cry3)을 보유하는 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt) 균주와 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타(Photorhabdus temperata subsp. temperata: Ptt) 배양액을 유효성분으로 포함하는 딱정벌레 방제용 살충제 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 바실러스 튜린지엔시스 균주는 바실러스 튜린지엔시스 ssp. 테네브리오니스(B. thuringiensis subsp. tenebrionis: BtT)인 것을 특징으로 하는 딱정벌레 방제용 살충제 조성물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 Bt는 10¹⁰ spores/mL 배양액을 기준으로 상기 Ptt는 48시간 배양액을 기준으로, 상기 Bt 대 Ptt가 1:7~9의 부피비로 포함되는 것을 특징으로 하는 딱정벌레 방제용 살충제 조성물.
청구항 3에 있어서, 전착제와 에탄올을 더 포함하는 딱정벌레 방제용 살충제 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 Bt 8~12부피%, Ptt 70~85부피%, 에탄올 5~15부피% 및 전착제 0.1~5부피%를 포함하는 것을 특징으로 하는 딱정벌레 방제용 살충제 조성물.
바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)의 독소단백질 유전자(Cry1Ca: 서열번호 1)를 증폭시키기 위한 프라이머쌍으로서, 서열 번호 5와 6의 염기서열을 갖는 프라이머쌍.
바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)의 독소단백질 유전자(Cry1Ac: 서열번호 2)를 증폭시키기 위한 프라이머쌍으로서, 서열 번호 7과 8의 염기서열을 갖는 프라이머쌍.
바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)의 독소단백질 유전자(Cry3: 서열번호 3)를 증폭시키기 위한 프라이머쌍으로서, 서열 번호 9과 10의 염기서열을 갖는 프라이머쌍.
바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)의 독소단백질 유전자(Cry4: 서열번호 4)를 증폭시키기 위한 프라이머쌍으로서, 서열 번호 11과 12의 염기서열을 갖는 프라이머쌍.
딱정벌레의 유충과 성충 모두를 방제하기 위하여, 서열번호 3의 독소단백질 유전자(Cry3)을 보유하는 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt) 균주와 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타(Photorhabdus temperata subsp. temperata: Ptt) 배양액을 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 딱정벌레 방제 방법.