CN117412793A - 用于农业应用的杀有害生物微细胞及其组合物 - Google Patents
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Abstract
本披露提供了杀有害生物微细胞，包括杀有害生物微细胞的组合物，以及制备杀有害生物微细胞的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月15日提交的美国临时专利申请号63/175,488的优先权，该专利申请的全部内容通过引用并入本文。
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技术领域
本披露涉及杀有害生物微细胞，包括杀有害生物微细胞的组合物，以及制备杀有害生物微细胞的方法。
背景技术
需要能够靶向细胞并递送生物试剂的递送载体；含有这样的递送载体的组合物；以及将所述载体递送至细胞，从而调节包括动物、植物和昆虫细胞、组织和生物体的生物系统的相关方法。特别地，需要既能够作为递送载体又能作为活性成分(例如杀有害生物活性成分)的递送载体。
发明内容
因此，本披露提供了包括杀有害生物微细胞的组合物。杀有害生物微细胞由杀有害生物亲代细菌产生，可以抑制包括昆虫、真菌和线虫的有害生物。杀有害生物微细胞保留亲代细菌的杀有害生物活性并且是可天然降解的。另外，杀有害生物微细胞可用于产生、扩增和递送多种生物活性成分，包括蛋白质毒素和核酸。本披露进一步提供了通过修饰杀有害生物亲代细菌的细胞分配功能来产生杀有害生物微细胞的方法。
本披露的方面包括杀有害生物组合物，其包括液体载剂相；以及分散在该载剂相中的多个杀有害生物微细胞，其中该多个杀有害生物微细胞衍生自多个杀有害生物亲代细菌，该多个杀有害生物亲代细菌包含引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变，并且其中当该组合物应用于植物时，该多个杀有害生物微细胞以足以控制在该植物中或在该植物上的至少一种有害生物的颗粒浓度存在。在该方面的一些实施例中，控制包括以下中的至少一个：当与未用组合物处理的对照植物相比时，植物上的有害生物数量减少，并且当与未用组合物处理的对照植物相比时，对植物的物理损坏减少。在该方面的另外的实施例中，有害生物数量的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少，并且物理损坏的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，多个杀有害生物微细胞的至少一部分进一步包括以下中的至少一种：外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。在该方面的一些实施例中，多个杀有害生物微细胞的部分进一步包括外源表达盒，该外源表达盒被编码以表达该外源杀有害生物蛋白质毒素和该外源杀有害生物核酸中的任一种或两种。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物蛋白质毒素包括Pir毒素或Cry毒素中的至少一种。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或发夹RNA(hpRNA)。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物活性成分选自以下的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、或具有广谱活性的成分。
在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的另外的实施例中，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。
在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，杀有害生物亲代细菌选自以下的组：除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinose)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、发光杆菌(Photorhabdus luminescens)、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)、嗜虫耶尔森氏菌(Yersinia entomophaga)、喜昆虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp.)、萨布茨格色杆菌(Chromobacterium subtsugae)或大肠杆菌(Escherichia coli)。在该方面的另外的实施例中，杀有害生物亲代细菌选自以下的组：枯草芽孢杆菌菌株RTI477、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 6633、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 21332、枯草芽孢杆菌菌株168、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 9943、枯草芽孢杆菌菌株QST713、和枯草芽孢杆菌菌株NCIB 3610，萎缩芽孢杆菌菌株ABI02A DSM 32019、萎缩芽孢杆菌菌株ABI03 DSM32285、萎缩芽孢杆菌菌株ABI05DSM 24918，解淀粉芽孢杆菌菌株RTI301、解淀粉芽孢杆菌FZB24、解淀粉芽孢杆菌FZB42、解淀粉芽孢杆菌BA-1、解淀粉芽孢杆菌LMG 5-29032、解淀粉芽孢杆菌MBI600、解淀粉芽孢杆菌CECT8836、或解淀粉芽孢杆菌M4(S499)。在该方面的一些实施例中，杀有害生物亲代细菌是发光杆菌，并且其中该杀有害生物微细胞包括外源杀有害生物蛋白质毒素Pir。在该方面的一些实施例中，杀有害生物亲代细菌是枯草芽孢杆菌，并且其中杀有害生物微细胞包括外源杀有害生物分子。在该方面的一些实施例中，杀有害生物亲代细菌是经遗传修饰的表达一种或多种外源杀有害生物活性成分的大肠杆菌。
在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，组合物作为叶面处理、注射处理、出苗前处理、和出苗后处理中的至少一种应用于植物。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，将组合物配制为以下中的至少一种：即用型(RTU)配制品、悬浮液浓缩物、罐混合物、气溶胶、种子处理、根浸渍、土壤处理、灌溉配制品、喷洒配制品、和浸透处理。在该方面的一些实施例中，将组合物配制为种子处理。在该方面的另外的实施例中，组合物以约1x 102至约1x 109颗粒/种子的比率应用，并且其中比率根据种子大小来确定。在该方面的另外的实施例中，组合物以约1x 104颗粒/种子的比率应用。在该方面的其他实施例中，将组合物配制为根浸渍。在该方面的另外的实施例中，组合物以约1x 103至约1x 108颗粒/植物根系的比率应用。该方面的另外的实施例可以与前述实施例中任一项组合，进一步包括农用化学表面活性剂，其中该农用化学表面活性剂改善以下特征中的至少一种：喷雾性、铺展性、和可注射性。在该方面的另外的实施例中，液体载剂相是水性或油性的。
该方面的其他实施例可以与前述实施例中任一项组合，进一步包括以下中的至少一种：分散在该载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物蛋白质毒素包括Pir毒素或Cry毒素。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或其前体、发夹RNA(hpRNA)或其前体、或者微RNA(miRNA)或其前体。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物活性成分选自以下的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、或具有广谱活性的成分。在该方面的另外的实施例中，将组合物配制为种子处理。在该方面的一些实施例中，分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分以每100kg的种子约1g至约10g的量存在。在该方面的一些实施例中，分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分以约1x 104颗粒/种子的量存在。在该方面的另外的实施例中，将组合物配制为根浸渍。在该方面的一些实施例中，分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分以约25mg至约200mg活性成分/L存在。在该方面的一些实施例中，分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分以约1x 103至约1x 103颗粒/植物根系的量存在。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，微细胞颗粒浓度的范围为约1x 102至约8x 1014。在该方面的一些实施例中，微细胞的杀有害生物活性以及外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向相同的有害生物。在该方面的其他实施例中，微细胞的杀有害生物活性以及外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。在该方面的一些实施例中，其可以与具有分散在载剂相中的外源组分的前述实施例中任一项组合，外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性以及分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向相同的有害生物。在该方面的一些实施例中，其可以与具有分散在载剂相中的外源组分的前述实施例中任一项组合，外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性以及分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。
在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，至少一种有害生物选自以下的组：小菜蛾(Diamondback moth)(DBM)、红粉甲虫(Red flour beetle)(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle)(CPB)、地中海粉斑螟(Mediterraneanflour moth)、秋粘虫(Fall armyworm)(FAW)、亚洲斑点螟蛉(Asian spotted bollworm)、鳞翅目物种(Lepidoptera spp.)、鞘翅目物种(Coleoptera spp.)、双翅目物种(Dipteraspp.)、疫霉属物种(Phytophthora spp.)、蜜环菌属物种(Armillaria spp.)、炭疽菌属物种(Colletotrichum spp.)、葡萄孢属物种(Botrytis spp.)、和尾孢属物种(Cercosporaspp.)。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，杀有害生物微细胞保持稳定并且保留杀有害生物活性至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或至少13个月。
本披露的另外的方面包括制备杀有害生物微细胞的方法，这些方法包括以下步骤：(a)提供杀有害生物亲代细菌，该杀有害生物亲代细菌包括引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变；(b)使该杀有害生物亲代细菌在允许形成杀有害生物微细胞的条件下生长；以及(c)使用离心、切向流过滤(TFF)、或TFF和离心将杀有害生物微细胞纯化。在该方面的一些实施例中，步骤(c)产生约1010个杀有害生物微细胞/升、约1011个杀有害生物微细胞/升、约1012个杀有害生物微细胞/升、约1013个杀有害生物微细胞/升、约1014个杀有害生物微细胞/升、约1015个杀有害生物微细胞/升、约1016个杀有害生物微细胞/升、或约1017个杀有害生物微细胞/升。该方面的一些实施例可以与前述实施例中任一项组合，进一步包括步骤(d)使这些杀有害生物微细胞干燥以产生贮存稳定的杀有害生物微细胞组合物。在该方面的一些实施例中，贮存稳定的杀有害生物微细胞组合物保留杀有害生物活性至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或至少13个月。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的另外的实施例中，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。
本披露的另外的方面包括产生杀有害生物微细胞的亲代细菌，其中(i)杀有害生物亲代细菌包括修饰亲代细菌的细胞分配功能的遗传突变；并且(ii)杀有害生物亲代细菌展现出商业相关的杀有害生物活性，其中对至少一种植物有害生物的LD50少于100mg/kg。在该方面的其他实施例中，修饰亲代细菌的细胞分配功能包括修饰以下中的至少一种的水平或活性：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。
本披露的又另一方面包括控制有害生物的方法，这些方法包括：将如前述实施例中任一项所述的杀有害生物组合物应用于植物或待种植的区域。在该方面的一些实施例中，应用包括以下中的至少一个：注射应用、叶面应用、出苗前应用、或出苗后应用。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，控制包括以下中的至少一个：当与未用组合物处理的对照植物相比时，植物上的有害生物数量减少，并且当与未用组合物处理的对照植物相比时，对植物的物理损坏减少。在该方面的另外的实施例中，有害生物数量的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少，并且物理损坏的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，将组合物配制为以下中的至少一种：即用型(RTU)配制品、悬浮液浓缩物、罐混合物、气溶胶、种子处理、根浸渍、土壤处理、灌溉配制品、喷洒配制品、或浸透处理。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，有害生物选自以下的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、或尾孢属物种。
本披露的仍另一方面包括可湿性粉剂，其包括：衍生自多个杀有害生物亲代细菌的多个干燥的杀有害生物微细胞，该多个杀有害生物亲代细菌包括引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变，其中将该可湿性粉剂配置为在水性载剂中分散以产生杀有害生物组合物，用于当组合物应用于植物时控制在该植物中或在该植物上的至少一种有害生物。该方面的一些实施例进一步包括农用化学可接受的固体载剂组分，其包括以下中的至少一种：粘土组分、高岭土组分、滑石组分、白垩组分、方解石组分、石英组分、浮石组分、硅藻土组分、蛭石组分、硅酸盐组分、二氧化硅组分、二氧化硅粉剂组分、铝组分、硫酸铵组分、磷酸铵组分、碳酸钙组分、尿素组分、糖组分、淀粉组分、锯末组分、研磨的椰子壳组分、研磨的玉米芯组分、以及研磨的烟草秆组分。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，水性载剂包括水。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，控制包括以下中的至少一个：当与未用组合物处理的对照植物相比时，植物上的有害生物数量减少，并且当与未用组合物处理的对照植物相比时，对植物的物理损坏减少。在该方面的另外的实施例中，有害生物数量的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少，并且物理损坏的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，至少一种有害生物选自以下的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、或尾孢属物种。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，修饰亲代细菌的细胞分配功能包括修饰以下中的至少一种：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的另外的实施例中，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。
本披露的另外的方面包括可种植的组合物，其包括：种子；以及覆盖该种子的涂层，其中该涂层包括衍生自多个杀有害生物亲代细菌的多个杀有害生物微细胞，该多个杀有害生物亲代细菌包括引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个突变，并且其中该多个杀有害生物微细胞以足以对摄食该种子或由此产生的幼苗的至少一种有害生物产生杀有害生物活性的颗粒浓度存在。在该方面的一些实施例中，亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的另外的实施例中，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，杀有害生物亲代细菌选自以下的组：除虫链霉菌、刺糖多孢菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、双酶梭菌、日本金龟子芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、发光杆菌、嗜线虫致病杆菌、嗜虫沙雷氏菌、嗜虫耶尔森氏菌、喜昆虫假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属物种、萨布茨格色杆菌或大肠杆菌。在该方面的另外的实施例中，杀有害生物亲代细菌选自以下的组：枯草芽孢杆菌菌株RTI477、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 6633、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 21332、枯草芽孢杆菌菌株168、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 9943、枯草芽孢杆菌菌株QST713、和枯草芽孢杆菌菌株NCIB 3610，萎缩芽孢杆菌菌株ABI02A DSM32019、萎缩芽孢杆菌菌株ABI03 DSM 32285、萎缩芽孢杆菌菌株ABI05 DSM 24918，解淀粉芽孢杆菌菌株RTI301、解淀粉芽孢杆菌FZB24、解淀粉芽孢杆菌FZB42、解淀粉芽孢杆菌BA-1、解淀粉芽孢杆菌LMG 5-29032、解淀粉芽孢杆菌MBI600、解淀粉芽孢杆菌CECT8836、或解淀粉芽孢杆菌M4(S499)。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，涂层包括约1x 102至约1x 109颗粒/种子的颗粒浓度，并且其中该浓度根据种子大小来确定。在该方面的另外的实施例中，颗粒浓度包括约1x 104颗粒/种子。)。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，至少一种有害生物选自以下的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、或尾孢属物种。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，种子来自选自以下的组的植物：大豆、草莓、黑醋栗、白醋栗、红醋栗、蓝莓、覆盆子、番茄、胡椒、辣椒、马铃薯、茄子、黄瓜、莴苣、菊苣、芸苔属、玉米、小麦、稻、低芥酸菜籽、甜瓜、羽衣甘蓝、胡萝卜、或豆科植物。
本披露的另外的方面包括杀有害生物组合物，其包括：杀有害生物微细胞，其中该杀有害生物微细胞衍生自杀有害生物亲代细菌，该杀有害生物亲代细菌包括引起选自以下的组的一个或多个细胞分配功能因子的水平或活性中的修饰的至少一个遗传突变：minC多肽、minD多肽、minE多肽、ftsZ多肽、ftsA多肽、parA多肽、parB多肽、DivIVA多肽、或其组合。在该方面的一些实施例中，杀有害生物微细胞包括以下中的至少一种：外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。在该方面的一些实施例中，杀有害生物微细胞进一步包括外源表达盒，该外源表达盒被编码以表达该外源杀有害生物蛋白质毒素和该外源杀有害生物核酸中的任一种或两种。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物蛋白质毒素包括Pir毒素或Cry毒素中的至少一种。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或发夹RNA(hpRNA)。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物活性成分选自以下的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、或具有广谱活性的成分。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，微细胞的杀有害生物活性以及外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向相同的有害生物。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，微细胞的杀有害生物活性以及外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，至少一种有害生物选自以下的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、或尾孢属物种。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，杀有害生物微细胞保持稳定并且保留杀有害生物活性至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或至少13个月。
本发明的这些和其他方面在以下本发明的描述中更详细地阐述。
附图说明
通过参考以下结合附图给出的描述可以理解本申请。
图1描绘了显示将发光杆菌ftsZ基因成功插入到表达载体中的测序图。引物oLK015从左侧读取，引物oAF086从右侧读取(引物序列在表1中)。
图2描绘了显示在不同培养基中测试发光杆菌在48小时时间段内生长的OD600值的图。
图3A-3C示出了表征由发光杆菌产生的杀有害生物微细胞的测定。图3A是微细胞分离前(左侧，“亲代细菌”)和分离后(右侧，“ADAS颗粒”)，产生发光杆菌菌株的微细胞的培养物的相差显微镜图像。亲代细菌细胞由左侧箭头表示，而微细胞由右侧箭头表示。图3B是通过用Spectradyne nCS1计数测量的发光杆菌菌株TT01(黄色)和发光杆菌菌株Kleinni(灰色)的粒度分布和浓度的图。图3C示出了胞质伴侣蛋白GroEL的蛋白质印迹的图像。分离的微细胞含有GroEL。
图4A-4C示出了LD50测定的结果，其中用含有由发光杆菌产生的微细胞的杀有害生物组合物处理小菜蛾(Plutella xylostella)(小菜蛾(Diamondback Moth)；DBM)。图4A示出了人工饲料LD50测定的结果，其中DBM幼虫摄食一系列浓度的衍生自发光杆菌菌株TT01的微细胞颗粒。图4B示出了人工饲料LD50测定的结果，其中DBM幼虫摄食一系列浓度的衍生自发光杆菌菌株Kleinni的微细胞颗粒。在图4A-4B中，在摄食后3天记录死亡率。图4C示出了叶圆盘测定LD50测定的结果，其中DBM幼虫摄食一系列浓度的衍生自发光杆菌菌株TT01或Kleinii的微细胞颗粒，并且3天后记录死亡率。
图5A-5B示出了比较由发光杆菌产生的微细胞对小菜蛾(DBM)、草地贪夜蛾(FAW)、甜菜夜蛾(BAW)和欧洲玉蜀黍螟(ECB)的影响的昆虫死亡率测定的结果。图5A示出了用衍生自发光杆菌菌株TT01的微细胞的死亡率测定。图5B示出了用衍生自发光杆菌菌株Kleinii的微细胞的死亡率测定。
具体实施方式
以下描述阐述了示例性方法、参数等。然而，应当认识到，这样的描述并非旨在限制本披露内容的范围，而是被提供作为对示例性实施例的描述。
杀有害生物组合物及其配制品
本披露的方面包括杀有害生物组合物，其包括液体载剂相；以及分散在该载剂相中的多个杀有害生物微细胞，其中该多个杀有害生物微细胞衍生自多个杀有害生物亲代细菌，该多个杀有害生物亲代细菌包含引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变，并且其中当该组合物应用于植物时，该多个杀有害生物微细胞以足以控制在该植物中或在该植物上的至少一种有害生物的颗粒浓度存在。在该方面的一些实施例中，控制包括以下中的至少一个：当与未用组合物处理的对照植物相比时，植物上的有害生物数量减少，并且当与未用组合物处理的对照植物相比时，对植物的物理损坏减少。在该方面的一些实施例中，物理损坏包括摄食损坏和钻蛀损坏。物理损坏可以表现为多种植物表型，包括但不限于嚼碎过的或参差不齐的叶、缺失的叶、叶中的洞、茎孔、叶变形、叶变色、叶斑、枯萎、生长迟缓、环绕或枯死的茎、发黄、断裂损坏或根损坏。在该方面的另外的实施例中，有害生物数量的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少35％减少、至少40％减少、至少45％减少、至少50％减少、至少55％减少、至少60％减少、至少65％减少、至少70％减少、至少75％减少、或至少80％减少，并且物理损坏的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少35％减少、至少40％减少、至少45％减少、至少50％减少、至少55％减少、至少60％减少、至少65％减少、至少70％减少、至少75％减少、或至少80％减少。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，多个杀有害生物微细胞的至少一部分进一步包括以下中的至少一种：外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。在该方面的一些实施例中，多个杀有害生物微细胞的部分进一步包括外源表达盒，该外源表达盒被编码以表达该外源杀有害生物蛋白质毒素和该外源杀有害生物核酸中的任一种或两种。外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分在微细胞内或者与微细胞膜附接。如本文所用，术语“外源”包括通过外源质粒表达的天然蛋白质。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物蛋白质毒素包括Pir毒素或Cry毒素中的至少一种。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或发夹RNA(hpRNA)。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物活性成分选自以下的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、或具有广谱活性的成分。具有选择性除草活性的成分可以靶向寄生虫性植物，例如列当属植物(broomrape)(列当属物种(Orobanche spp.))。
在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的另外的实施例中，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。修饰可以包括过表达或表达不足(例如，突变、缺失等)。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括ftsZ多肽的过表达。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括minC多肽、minD多肽、和minE多肽的表达不足。
在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，杀有害生物亲代细菌选自以下的组：除虫链霉菌、刺糖多孢菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、双酶梭菌、日本金龟子芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、发光杆菌、嗜线虫致病杆菌、嗜虫沙雷氏菌、嗜虫耶尔森氏菌、喜昆虫假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属物种、萨布茨格色杆菌或大肠杆菌。在该方面的另外的实施例中，杀有害生物亲代细菌选自以下的组：枯草芽孢杆菌菌株RTI477、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 6633、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 21332、枯草芽孢杆菌菌株168、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 9943、枯草芽孢杆菌菌株QST713、和枯草芽孢杆菌菌株NCIB 3610，萎缩芽孢杆菌菌株ABI02A DSM 32019、萎缩芽孢杆菌菌株ABI03 DSM 32285、萎缩芽孢杆菌菌株ABI05 DSM 24918，解淀粉芽孢杆菌菌株RTI301、解淀粉芽孢杆菌FZB24、解淀粉芽孢杆菌FZB42、解淀粉芽孢杆菌BA-1、解淀粉芽孢杆菌LMG 5-29032、解淀粉芽孢杆菌MBI600、解淀粉芽孢杆菌CECT8836、或解淀粉芽孢杆菌M4(S499)。在该方面的一些实施例中，杀有害生物亲代细菌是发光杆菌，并且其中该杀有害生物微细胞包括外源杀有害生物蛋白质毒素Pir。在该方面的一些实施例中，杀有害生物亲代细菌是枯草芽孢杆菌，并且其中杀有害生物微细胞包括外源杀有害生物分子。在该方面的一些实施例中，杀有害生物亲代细菌是经遗传修饰的表达一种或多种外源杀有害生物活性成分的大肠杆菌。
在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，组合物作为叶面处理、注射处理、出苗前处理、和出苗后处理中的至少一种应用于植物。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，将组合物配制为以下中的至少一种：即用型(RTU)配制品、悬浮液浓缩物(例如，液体可流动配制品)、罐混合物、气溶胶、种子处理、根浸渍、土壤处理、灌溉配制品、喷洒配制品、和浸透处理。在该方面的另外的实施例中，组合物配制为干燥的可流动配制品(例如，水可分散的颗粒)、可溶性粉剂配制品、微囊化配制品、或可乳化浓缩物配制品。在该方面的一些实施例中，将组合物配制为种子处理。在该方面的另外的实施例中，组合物以约1x 102至约1x 109颗粒/种子的比率应用，并且其中比率根据种子大小来确定。在该方面的另外的实施例中，组合物以约1x 104颗粒/种子的比率应用。在该方面的其他实施例中，将组合物配制为根浸渍。在该方面的另外的实施例中，组合物以约1x 103至约1x 108颗粒/植物根系的比率应用。该方面的另外的实施例可以与前述实施例中任一项组合，进一步包括农用化学表面活性剂，其中该农用化学表面活性剂改善以下特征中的至少一种：喷雾性、铺展性、和可注射性。在该方面的另外的实施例中，液体载剂相是水性或油性的。
该方面的其他实施例可以与前述实施例中任一项组合，进一步包括以下中的至少一种：分散在该载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分呈载剂相，并且不在微细胞中或不与微细胞膜附接。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物蛋白质毒素包括Pir毒素或Cry毒素。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或其前体、发夹RNA(hpRNA)或其前体、或者微RNA(miRNA)或其前体。可以在转基因植物中表达的重组miRNA前体，以及miRNA前体的设计(例如，以产生用于切割特定序列的成熟miRNA)披露在美国专利号7,786,350和美国专利号8,410,334中。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物活性成分选自以下的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、或具有广谱活性的成分。具有选择性除草活性的成分可以靶向寄生虫性植物，例如列当属植物(broomrape)(列当属物种(Orobanche spp.))。在该方面的另外的实施例中，将组合物配制为种子处理。在该方面的一些实施例中，分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分以每100kg的种子约1g至约10g的量存在。在该方面的一些实施例中，分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分以约1x 104颗粒/种子的量存在。在该方面的另外的实施例中，将组合物配制为根浸渍。在该方面的一些实施例中，分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分以约25mg至约200mg活性成分/L存在。在该方面的一些实施例中，分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分以约1x 103至约1x 103颗粒/植物根系的量存在。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，微细胞颗粒浓度的范围为1x 102至约8x 1014。在该方面的一些实施例中，微细胞的杀有害生物活性以及外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分(例如，在微细胞中或与微细胞膜附接)的杀有害生物活性靶向相同的有害生物。在该方面的其他实施例中，微细胞的杀有害生物活性以及外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分(例如，在微细胞中或与微细胞膜附接)的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。在该方面的一些实施例中，其可以与具有分散在载剂相中的外源组分的前述实施例中任一项组合，外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分(例如，在微细胞中或与微细胞膜附接)的杀有害生物活性以及分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向相同的有害生物。在该方面的其他实施例中，其可以与具有分散在载剂相中的外源组分的前述实施例中任一项组合，外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分(例如，在微细胞中或与微细胞膜附接)的杀有害生物活性以及分散在载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。
在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，至少一种有害生物选自以下的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、和尾孢属物种。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，杀有害生物微细胞保持稳定并且保留杀有害生物活性至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或至少13个月。
本披露的仍另一方面包括可湿性粉剂，其包括：衍生自多个杀有害生物亲代细菌的多个干燥的杀有害生物微细胞，该多个杀有害生物亲代细菌包括引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变，其中将该可湿性粉剂配置为在水性载剂中分散以产生杀有害生物组合物，用于当组合物应用于植物时控制在该植物中或在该植物上的至少一种有害生物。该方面的一些实施例进一步包括农用化学可接受的固体载剂组分，其包括以下中的至少一种：粘土组分、高岭土组分、滑石组分、白垩组分、方解石组分、石英组分、浮石组分、硅藻土组分、蛭石组分、硅酸盐组分、二氧化硅组分、二氧化硅粉剂组分、铝组分、硫酸铵组分、磷酸铵组分、碳酸钙组分、尿素组分、糖组分、淀粉组分、锯末组分、研磨的椰子壳组分、研磨的玉米芯组分、以及研磨的烟草秆组分。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，水性载剂包括水。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，控制包括以下中的至少一个：当与未用组合物处理的对照植物相比时，植物上的有害生物数量减少，并且当与未用组合物处理的对照植物相比时，对植物的物理损坏减少。在该方面的一些实施例中，物理损坏包括摄食损坏和钻蛀损坏。物理损坏可以表现为多种植物表型，包括但不限于嚼碎过的或参差不齐的叶、缺失的叶、叶中的洞、茎孔、叶变形、叶变色、叶斑、枯萎、生长迟缓、环绕或枯死的茎、发黄、断裂损坏或根损坏。在该方面的另外的实施例中，有害生物数量的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少35％减少、至少40％减少、至少45％减少、至少50％减少、至少55％减少、至少60％减少、至少65％减少、至少70％减少、至少75％减少、或至少80％减少，并且物理损坏的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少35％减少、至少40％减少、至少45％减少、至少50％减少、至少55％减少、至少60％减少、至少65％减少、至少70％减少、至少75％减少、或至少80％减少。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，至少一种有害生物选自以下的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、或尾孢属物种。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，修饰亲代细菌的细胞分配功能包括修饰以下中的至少一种：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的另外的实施例中，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。修饰可以包括过表达或表达不足(例如，突变、缺失等)。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括ftsZ多肽的过表达。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括minC多肽、minD多肽、和minE多肽的表达不足。
本披露的另外的方面包括可种植的组合物，其包括：种子；以及覆盖该种子的涂层，其中该涂层包括衍生自多个杀有害生物亲代细菌的多个杀有害生物微细胞，该多个杀有害生物亲代细菌包括引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个突变，并且其中该多个杀有害生物微细胞以足以对摄食该种子或由此产生的幼苗的至少一种有害生物产生杀有害生物活性的颗粒浓度存在。在该方面的一些实施例中，亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的另外的实施例中，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。修饰可以包括过表达或表达不足(例如，突变、缺失等)。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括ftsZ多肽的过表达。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括minC多肽、minD多肽、和minE多肽的表达不足。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，杀有害生物亲代细菌选自以下的组：除虫链霉菌、刺糖多孢菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、双酶梭菌、日本金龟子芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、发光杆菌、嗜线虫致病杆菌、嗜虫沙雷氏菌、嗜虫耶尔森氏菌、喜昆虫假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属物种、萨布茨格色杆菌或大肠杆菌。在该方面的另外的实施例中，杀有害生物亲代细菌选自以下的组：枯草芽孢杆菌菌株RTI477、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 6633、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 21332、枯草芽孢杆菌菌株168、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 9943、枯草芽孢杆菌菌株QST713、和枯草芽孢杆菌菌株NCIB 3610，萎缩芽孢杆菌菌株ABI02A DSM 32019、萎缩芽孢杆菌菌株ABI03 DSM 32285、萎缩芽孢杆菌菌株ABI05 DSM 24918，解淀粉芽孢杆菌菌株RTI301、解淀粉芽孢杆菌FZB24、解淀粉芽孢杆菌FZB42、解淀粉芽孢杆菌BA-1、解淀粉芽孢杆菌LMG 5-29032、解淀粉芽孢杆菌MBI600、解淀粉芽孢杆菌CECT8836、或解淀粉芽孢杆菌M4(S499)。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，涂层包括约1x 102至约1x 109颗粒/种子的颗粒浓度，并且其中该浓度根据种子大小来确定。在该方面的另外的实施例中，颗粒浓度包括约1x 104颗粒/种子。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，至少一种有害生物选自以下的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、或尾孢属物种。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，种子来自选自以下的组的植物：大豆、草莓、黑醋栗、白醋栗、红醋栗、蓝莓、覆盆子、番茄、胡椒、辣椒、马铃薯、茄子、黄瓜、莴苣、菊苣、芸苔属、玉米、小麦、稻、低芥酸菜籽、甜瓜、羽衣甘蓝、胡萝卜、或豆科植物。
本披露的另外的方面包括杀有害生物组合物，其包括：杀有害生物微细胞，其中该杀有害生物微细胞衍生自杀有害生物亲代细菌，该杀有害生物亲代细菌包括引起选自以下的组的一个或多个细胞分配功能因子的水平或活性中的修饰的至少一个遗传突变：minC多肽、minD多肽、minE多肽、ftsZ多肽、ftsA多肽、parA多肽、parB多肽、DivIVA多肽、或其组合。修饰可以包括过表达或表达不足(例如，突变、缺失等)。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括ftsZ多肽的过表达。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括minC多肽、minD多肽、和minE多肽的表达不足。在该方面的一些实施例中，杀有害生物微细胞包括以下中的至少一种：外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。在该方面的一些实施例中，杀有害生物微细胞进一步包括外源表达盒，该外源表达盒被编码以表达该外源杀有害生物蛋白质毒素和该外源杀有害生物核酸中的任一种或两种。外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分在微细胞内或者与微细胞膜附接。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物蛋白质毒素包括Pir毒素或Cry毒素中的至少一种。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或发夹RNA(hpRNA)。在该方面的一些实施例中，外源杀有害生物活性成分选自以下的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、或具有广谱活性的成分。具有选择性除草活性的成分可以靶向寄生虫性植物，例如列当属植物(broomrape)(列当属物种(Orobanche spp.))。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，微细胞的杀有害生物活性以及外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向相同的有害生物。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，微细胞的杀有害生物活性以及外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸或外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，至少一种有害生物选自以下的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、或尾孢属物种。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，杀有害生物微细胞保持稳定并且保留杀有害生物活性至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或至少13个月。
有效量可以通过颗粒的数量，优选地杀有害生物亲代细菌或杀有害生物微细胞的活性颗粒的数量来测量。亲代细菌的活性颗粒的数量可以通过评估菌落形成单位(cfu)来测量。微细胞的活性颗粒的数量可以使用流式细胞术等技术通过计数微细胞囊泡的数量来测量。
当用作种子处理时，本披露的组合物以约1x 102至约1x 109颗粒/种子的比率应用，这取决于种子的大小。在一些实施例中，应用比率是1x 104至约1x 107颗粒/种子。在一些实施例中，应用比率是约1x 102至约1x 108、约1x 102至约1x 107、约1x 102至约1x 106、约1x 102至约1x 105、约1x 102至约1x 104、约1x 102至约1x 103、约1x 103至约1x 105、或优选地约1x 104颗粒/种子。当所述组合物与至少一种另外的活性成分(“ai”)组合或一起使用时，至少一种另外的活性成分可以以如下量存在：每100kg的种子约0.001至约1000克、约0.01至约500克、约0.1至约300克、约1至约100克、约1至约50克、约1至约25克、以及优选地约1至约10克，和/或约1x 102至约1x 108、约1x 102至约1x 107、约1x 102至约1x 106、约1x102至约1x 105、约1x 102至约1x 104、约1x 102至约1x 103、约1x 103至约1x 105、或优选地约1x 104颗粒/种子。
本发明的组合物还可以以约1x 103至约1x 108颗粒/植物根系的比率作为根浸渍应用。当所述组合物与至少一种另外的活性成分组合或一起使用时，至少一个另外的活性可以以如下量存在：约0.001至约1000mg、约0.01至约500、约0.1至约400、约1至约300、约10至约250、以及优选地约25至约200mg ai/L，和/或约1x 103至约1x 108颗粒/植物根系。
当作为土壤处理时，本披露的组合物可以作为土壤表面浸透、灌入、注射和/或犁沟内应用或通过与灌溉水的混合物应用。可以在种植时、在播种期间或在播种后、或在移植后以及在植物生长的任何阶段应用的浸透土壤处理的应用的比率是约4x 107至约8x 1014、约4x 109至约8x 1013、约4x 1011至约8x 1012、约2x 1012至约6x 1013、约2x 1012至约3x1013、或约4x 1013至约2x 1014颗粒/英亩(1.6x 107-3.2x 1014、1.6x 109-3.2x 1013、1.6x1011-3.2x 1012、8x 1011-2.4x 1013、8x 1011-1.2x 1013或1.6x 1013-8x 1013颗粒/公顷)。在一些实施例中，应用的比率是约1x 1012至约6x1012或约1x 1013至约6x 1013颗粒/英亩(4x1011-2.4x 1012或4x 1012-2.4x 1013颗粒/公顷)。在种植时应用的犁沟内处理的应用的比率是每1000行英尺约2.5x 1010至约5x 1011颗粒(每100行米8.3x 109-1.7x 1011颗粒)。在一些实施例中，应用的比率是每1000行英尺约6x 1010至约3x 1012、约6x 1010至约4x 1011、约6x 1011至约3x 1012、或约6x 1011至约4x 1012颗粒(每100行米2x 1010-1012、20x 1010-1.3x1011、2x1011-1012或2x 1011-1.3x 1012颗粒)。当灌入或注射至土壤中时，应用的比率是约4x107至约8x 1014、约4x 1013至约2x 1014、约4x 108至约8x 1013、约4x 109至约8x1012、约2x1010至约6x 1011、约4x 107至约8x 1013、约4x 107至约8x 1012、约4x107至约8x 1011、约4x107至约8x 1010、约4x 107至约8x 109、或约4x 107至约8x 108颗粒/英亩(1.6x 107-3.2x1014、1.6x 1013-8x 1013、1.6x 108-3.2x 1013、1.6x 109-3.2x 1012、8x 109-2.4x 1011、1.6x107-3.2x 1013、1.6x 107-3.2x 1012、1.6x 107-3.2x 1011、1.6x 107-3.2x 1010、1.6x 107-3.2x 109、1.6x 107-3.2x 108颗粒/公顷)。
本领域的技术人员将了解如何调整撒播处理(其中应用比率较低但更频繁)与其他不太常见的土壤处理的比率。当所述组合物与至少一种另外的活性成分组合或一起使用时，至少一个另外的活性可以以如下量存在：约10至约1,000、约10至约750、约10至约500、约25至约500、约25至约250、以及优选地约50至约200g的活性成分/公顷(ai/ha)，和/或约4x 107至约8x 1014、约4x 1013至约2x 1014、约4x 108至约8x 1013、约4x 109至约8x 1012、约2x 1010至约6x 1011、约4x 107至约8x 1013、约4x 107至约8x 1012、约4x 107至约8x 1011、约4x 107至约8x 1010、约4x 107至约8x 109、或约4x 107至约8x 108颗粒/英亩(1.6x 107-3.2x1014、1.6x1013-8x 1013、1.6x 108-3.2x 1013、1.6x 109-3.2x 1012、8x 109-2.4x 1011、1.6x107-3.2x 1013、1.6x 107-3.2x 10121.6x 107-3.2x 1011、1.6x 107-3.2x 1010、1.6x 107-3.2x 109、1.6x 107-3.2x 108颗粒/公顷)。
本披露的组合物可以在种植前或在种子发芽前引入土壤中。本披露的组合物还可以引入至植物的基因座中、与植物根接触的土壤中、在植物基部的土壤中、或在植物基部周围的土壤中(例如，在植物基部周围或以下约5cm、约10cm、约15cm、约20cm、约25cm、约30cm、约35cm、约40cm、约45cm、约50cm、约55cm、约60cm、约65cm、约70cm、约75cm、约80cm、约85cm、约90cm、约95cm、约100cm、或更长的距离内)。组合物可以通过利用多种技术来应用，包括但不限于滴灌、喷洒、土壤注射或土壤浸透。组合物还可以在移植到不同植物基因座前应用于幼苗盘的土壤和/或植物中或者应用于幼苗中。当包括作为土壤浸透处理应用于与植物根接触的土壤、植物基部或植物基部周围特定距离内的土壤时，组合物可以作为单次应用或作为多次应用来应用。组合物(包括具有至少一个另外的活性成分的那些)可以以上文所示的浸透处理的比率应用或者以如下比率应用：每克的土壤约1x 105至约1x 108颗粒、每克的土壤1x 105至约1x 107颗粒、每克的土壤1x 105至约1x 106颗粒、每克的土壤7x 105至约1x107颗粒、每克的土壤1x 106至约5x 106颗粒、或每克的土壤1x 105至约3x 106颗粒，和/或约4x 107至约8x 1014、约4x 108至约8x 1013、约4x 109至约8x 1012约2x 1010至约6x 1011、约4x 107至约8x 1013、约4x 107至约8x 1012、约4x 107至约8x 1011、约4x 107至约8x 1010、约4x 107至约8x 109,或约4x 107至约8x 108颗粒/英亩(1.6x 107-3.2x 1014、1.6x 1013-8x1013、1.6x 108-3.2x 1013、1.6x 109-3.2x 1012、8x 109-2.4x 1011、1.6x 107-3.2x 1013、1.6x107-3.2x 1012、1.6x 1073.2x 1011、1.6x 107-3.2x 1010、1.6x 107-3.2x 109、1.6x 10-3.2x 108颗粒/公顷)。在一个实施例中，本披露的组合物以每克的土壤约7x 105至约1x107颗粒的比率作为单次应用来应用。在另一实施例中，本披露的组合物以每克的土壤约1x106至约5x 106颗粒的比率作为单次应用来应用。在其他实施例中，本披露的组合物以每克的土壤约1x 105至约3x 106颗粒的比率作为多次应用来应用。
制备杀有害生物微细胞的方法
本披露的另外的方面包括制备杀有害生物微细胞的方法，这些方法包括以下步骤：(a)提供杀有害生物亲代细菌，该杀有害生物亲代细菌包括引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变；(b)使该杀有害生物亲代细菌在允许形成杀有害生物微细胞的条件下生长；以及(c)使用离心、切向流过滤(TFF)、或TFF和离心将杀有害生物微细胞纯化。在该方面的一些实施例中，步骤(c)产生约1010个杀有害生物微细胞/升、约1011个杀有害生物微细胞/升、约1012个杀有害生物微细胞/升、约1013个杀有害生物微细胞/升、约1014个杀有害生物微细胞/升、约1015个杀有害生物微细胞/升、约1016个杀有害生物微细胞/升、或约1017个杀有害生物微细胞/升。该方面的一些实施例可以与前述实施例中任一项组合，进一步包括步骤(d)使这些杀有害生物微细胞干燥以产生贮存稳定的杀有害生物微细胞组合物。在该方面的一些实施例中，贮存稳定的杀有害生物微细胞组合物保留杀有害生物活性至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或至少13个月。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的另外的实施例中，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。修饰可以包括过表达或表达不足(例如，突变、缺失等)。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括ftsZ多肽的过表达。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括minC多肽、minD多肽、和minE多肽的表达不足。
产生杀有害生物微细胞的亲代细菌
本披露的另外的方面包括产生杀有害生物微细胞的亲代细菌，其中(i)杀有害生物亲代细菌包括修饰亲代细菌的细胞分配功能的遗传突变；并且(ii)杀有害生物亲代细菌展现出商业相关的杀有害生物活性，其中对至少一种植物有害生物的LD50少于100mg/kg。在该方面的其他实施例中，修饰亲代细菌的细胞分配功能包括修饰以下中的至少一种的水平或活性：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，z-环抑制蛋白选自以下的组：minC多肽、minD多肽或minE多肽；其中细胞分裂拓扑特异性因子选自以下的组：minE多肽或DivIVA多肽，并且其中隔膜机构组分选自以下的组：ftsZ多肽或ftsA多肽。修饰可以包括过表达或表达不足(例如，突变、缺失等)。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括ftsZ多肽的过表达。在一些实施例中，杀有害生物亲代细菌包括minC多肽、minD多肽、和minE多肽的表达不足。产生示例性杀有害生物微细胞的亲代细菌提供在表1A-1B中。
控制有害生物的方法
本披露的又另一方面包括控制有害生物的方法，这些方法包括：将如前述实施例中任一项所述的杀有害生物组合物应用于植物或待种植的区域。在该方面的一些实施例中，应用包括以下中的至少一个：注射应用、叶面应用、出苗前应用、或出苗后应用。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，控制包括以下中的至少一个：当与未用组合物处理的对照植物相比时，植物上的有害生物数量减少，并且当与未用组合物处理的对照植物相比时，对植物的物理损坏减少。在该方面的一些实施例中，物理损坏包括摄食损坏和钻蛀损坏。物理损坏可以表现为多种植物表型，包括但不限于嚼碎过的或参差不齐的叶、缺失的叶、叶中的洞、茎孔、叶变形、叶变色、叶斑、枯萎、生长迟缓、环绕或枯死的茎、发黄、断裂损坏或根损坏。在该方面的另外的实施例中，有害生物数量的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少35％减少、至少40％减少、至少45％减少、至少50％减少、至少55％减少、至少60％减少、至少65％减少、至少70％减少、至少75％减少、或至少80％减少，并且物理损坏的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少35％减少、至少40％减少、至少45％减少、至少50％减少、至少55％减少、至少60％减少、至少65％减少、至少70％减少、至少75％减少、或至少80％减少。在该方面的其他实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，将组合物配制为以下中的至少一种：即用型(RTU)配制品、悬浮液浓缩物、罐混合物、气溶胶、种子处理、根浸渍、土壤处理、灌溉配制品、喷洒配制品、或浸透处理。在该方面的一些实施例中，其可以与前述实施例中任一项组合，有害生物选自以下的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、或尾孢属物种。
定义
如本文所用，术语“控制”意指植物有害生物的杀伤，数量减少，和/或任何或所有生命阶段的生长、摄食或正常生理发育减少，和/或对植物有害生物感染和/或侵染的影响减少。有效量是能够显著减少由植物有害生物感染引起的有害生物生长、摄食、根渗透、根部成熟和/或一般正常生理发育和/或症状的量。在一些实施例中，由植物有害生物感染引起的症状和/或植物有害生物颗粒的数量与未处理的对照相比减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。
如本文所用，对于线虫有害生物，术语“控制”意指线虫的杀伤，数量减少，和/或任何或所有生命阶段的生长、摄食或正常生理发育(包括，对于根结线虫，穿透根以及在根内发育的能力)减少，线虫感染和/或侵染的影响(例如，瘿瘤形成、渗透、和/或根内发育)减少，植物对线虫感染和/或侵染的抗性，植物对线虫感染和/或侵染的影响(例如，瘿瘤形成和/或渗透)的抗性，植物对线虫感染和/或侵染的耐受性，植物对线虫感染和/或侵染的影响(例如，瘿瘤形成和/或渗透)的耐受性、或其任何组合。本领域普通技术人员已知植物对寄生线虫的抗性和耐受性，如通过Trudgill,D.L.“Resistance to and Tolerance ofPlant Parasitic Nematodes in Plants[植物寄生线虫在植物中的抗性和耐受性].”Annual Review of Phytopathology[植物病理学年评].1991；29:167-192所证明，将其特别地和完整地通过引用并入本文，用于它教导的所有内容。有效量是能够显著减少由线虫感染引起的有害生物生长、摄食、根渗透、根部成熟和/或一般正常生理发育和症状的量。在一些实施例中，症状和/或线虫与未处理的对照相比减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。
术语“微细胞”是指包括至少一个膜并且具有适用于容纳负载物(例如，以下中的一种或多种：核酸、质粒、多肽、蛋白质、酶、氨基酸、小分子、基因编辑系统、激素、免疫调节剂、碳水化合物、脂质、有机颗粒、无机颗粒或核糖核蛋白复合物(RNP))的内部体积的非染色体、非复制、封闭膜系统。微细胞是异常的细胞分裂的产物的非染色体细胞，并且含有RNA和蛋白质，但几乎没有或没有染色体DNA。微细胞能够进行质粒定向合成。微细胞可以优选地使用亲代细菌的基因操纵(例如破坏亲代细菌的细胞分裂机构)衍生自亲代细菌细胞(例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞)。在一些实施例中，微细胞可以包括亲代细胞表面的一种或多种内源或异源特征，例如，细胞壁、细胞壁修饰、鞭毛或菌毛，和/或亲代细胞内部体积的一种或多种内源或异源特征，例如，核酸、质粒、蛋白质、小分子、转录机构或翻译机构。在其他实施例中，微细胞可以缺乏亲代细胞的一种或多种特征。在仍其他实施例中，微细胞可以加载有未包括在亲代细胞中的特征，或以其他方式被该特征修饰。
“杀有害生物微细胞”是指从杀有害生物亲代细菌细胞中获得的微细胞。在优选的实施例中，杀有害生物微细胞保留所有或部分的亲代细菌细胞的杀有害生物活性。
“杀有害生物亲代细菌细胞”是指对植物有害生物具有直接毒性活性的亲本细菌细胞。直接毒性活性意指无需与作物植物相互作用即可导致植物有害生物死亡的能力。在优选的实施例中，杀有害生物亲代细菌的LD50少于100mg/kg。LD50是一次性给予材料的量，它导致一组测试靶标有害生物的50％(一半)的死亡。
如本文所用，术语“亲代细菌细胞”是指从中衍生微细胞的细胞(例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞)。亲代细菌细胞典型地为活细菌细胞。术语“活细菌细胞”是指含有基因组并且能够进行细胞分裂的细菌细胞。优选的亲代细菌细胞提供在表2A中。亲代细菌细胞包括引起亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变。
术语“细胞分裂拓扑特异性因子”是指细菌物种中细胞分裂机构的一种组分，该组分参与确定隔膜的位点，并且通过限制细胞分裂机构的其他组分的位置，例如限制一个或多个Z-环抑制蛋白的位置来起作用。示例性细胞分裂拓扑特异性因子包括minE，该minE在大肠杆菌中首次发现，并且已经在大量革兰氏阴性细菌物种和革兰氏阳性细菌物种中鉴定(Rothfield等人,Nature Reviews Microbiology[自然评论微生物学],3:959-968,2005)。minE通过将Z-环抑制蛋白minC和minD限制于细胞的极而起作用。第二示例性细胞分裂拓扑特异性因子为DivIVA，其在枯草芽孢杆菌中首次发现(Rothfield等人,Nature ReviewsMicrobiology[自然评论微生物学],3:959-968,2005)。
术语“Z-环抑制蛋白”是指细菌物种中细胞分裂机构的一种组分，该组分参与确定隔膜的位点，并且通过抑制稳定FtsZ环的形成或将这样的组分锚定至膜来起作用。Z-环抑制蛋白的定位可以通过细胞分裂拓扑特异性因子，例如MinE和DivIVA来调节。示例性Z-环抑制蛋白包括minC和minD，minC和minD在大肠杆菌中首次发现，并且已经在大量革兰氏阴性细菌物种和革兰氏阳性细菌物种中鉴定(Rothfield等人,Nature ReviewsMicrobiology[自然评论微生物学],3:959-968,2005)。在大肠杆菌中和在其他物种中，minC、minD和minE存在于相同的遗传基因座中，该遗传基因座可以称为“min操纵子”、minCDE操纵子或min或minCDE遗传基因座。
列举的实施例
以下枚举的实施例代表本发明的一些方面。
1.一种杀有害生物组合物，其包含：
液体载剂相；以及
分散在该载剂相中的多个杀有害生物微细胞，
其中该多个杀有害生物微细胞衍生自多个杀有害生物亲代细菌，该多个杀有害生物亲代细菌包含引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变，并且
其中当该组合物应用于植物时，该多个杀有害生物微细胞以足以控制在该植物中或在该植物上的至少一种有害生物的颗粒浓度存在。
2.如实施例1所述的杀有害生物组合物，其中控制包括以下中的至少一个：
当与未用组合物处理的对照植物相比时，植物上的有害生物数量减少，并且
当与未用组合物处理的对照植物相比时，对植物的物理损坏减少。
3.如实施例2所述的杀有害生物组合物，其中
有害生物数量的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少，并且
物理损坏的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少。
4.如实施例1-3中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该多个杀有害生物微细胞的至少一部分进一步包含以下中的至少一种：外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。
5.如实施例4所述的杀有害生物组合物，其中该多个杀有害生物微细胞的部分进一步包含外源表达盒，该外源表达盒被编码以表达该外源杀有害生物蛋白质毒素和该外源杀有害生物核酸中的任一种或两种。
6.如实施例4或5所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物蛋白质毒素包含Pir毒素和Cry毒素中的至少一种。
7.如实施例4或5所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或发夹RNA(hpRNA)。
8.如实施例4所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物活性成分选自由以下组成的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、以及具有广谱活性的成分。
9.如实施例1-8中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。
10.如实施例9所述的杀有害生物组合物，其中该z-环抑制蛋白选自由以下组成的组：minC多肽、minD多肽和minE多肽；其中该细胞分裂拓扑特异性因子选自由以下组成的组：minE多肽和DivIVA多肽，并且其中该隔膜机构组分选自由以下组成的组：ftsZ多肽和ftsA多肽。
11.如实施例1-10中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌选自由以下组成的组：除虫链霉菌、刺糖多孢菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、双酶梭菌、日本金龟子芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、发光杆菌、嗜线虫致病杆菌、嗜虫沙雷氏菌、嗜虫耶尔森氏菌、喜昆虫假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属物种、萨布茨格色杆菌和大肠杆菌。
12.如实施例11所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌菌株RTI477、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 6633、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 21332、枯草芽孢杆菌菌株168、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 9943、枯草芽孢杆菌菌株QST713、和枯草芽孢杆菌菌株NCIB 3610，萎缩芽孢杆菌菌株ABI02A DSM 32019、萎缩芽孢杆菌菌株ABI03 DSM 32285、萎缩芽孢杆菌菌株ABI05DSM 24918，解淀粉芽孢杆菌菌株RTI301、解淀粉芽孢杆菌FZB24、解淀粉芽孢杆菌FZB42、解淀粉芽孢杆菌BA-1、解淀粉芽孢杆菌LMG 5-29032、解淀粉芽孢杆菌MBI600、解淀粉芽孢杆菌CECT8836、和解淀粉芽孢杆菌M4(S499)。
13.如实施例1-11中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌是发光杆菌，并且其中该杀有害生物微细胞包含外源杀有害生物蛋白质毒素Pir。
14.如实施例1-11中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌是枯草芽孢杆菌，并且其中该杀有害生物微细胞包含该外源杀有害生物分子。
15.如实施例1-10中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌是经遗传修饰的表达一种或多种外源杀有害生物活性成分的大肠杆菌。
16.如实施例1-15中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该组合物作为叶面处理、注射处理、出苗前处理、和出苗后处理中的至少一种应用于该植物。
17.如实施例1-16中任一项所述的杀有害生物组合物，其中将该组合物配制为以下中的至少一种：即用型(RTU)配制品、悬浮液浓缩物、罐混合物、气溶胶、种子处理、根浸渍、土壤处理、灌溉配制品、喷洒配制品、和浸透处理。
18.如实施例17所述的杀有害生物组合物，其中将该组合物配制为种子处理。
19.如实施例18所述的杀有害生物组合物，其中该组合物以约1x 102至约1x109颗粒/种子的比率应用，并且其中该比率根据种子大小来确定。
20.如实施例19所述的杀有害生物组合物，其中该组合物以约1x 104颗粒/种子的比率应用。
21.如实施例17所述的杀有害生物组合物，其中将该组合物配制为根浸渍。
22.如实施例21所述的杀有害生物组合物，其中该组合物以约1x 103至约1x108颗粒/植物根系的比率应用。
23.如实施例1-22中任一项所述的杀有害生物组合物，其进一步包含农用化学表面活性剂，其中该农用化学表面活性剂改善以下特征中的至少一种：喷雾性、铺展性、和可注射性。
24.如实施例1-23中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该液体载剂相是水性或油性的。
25.如实施例1-24中任一项所述的杀有害生物组合物，其进一步包含以下中的至少一种：分散在该载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。
26.如实施例25所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物蛋白质毒素包含Pir毒素和Cry毒素。
27.如实施例25所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或其前体、发夹RNA(hpRNA)或其前体、或者微RNA(miRNA)或其前体。
28.如实施例25所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物活性成分选自由以下组成的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、以及具有广谱活性的成分。
29.如实施例25-28中任一项所述的杀有害生物组合物，其中将该组合物配制为种子处理。
30.如实施例29所述的杀有害生物组合物，其中分散在该载剂相中的该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、和该外源杀有害生物活性成分以每100kg的种子约1g至约10g的量存在。
31.如实施例29所述的杀有害生物组合物，其中分散在该载剂相中的该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、和该外源杀有害生物活性成分以约1x 104颗粒/种子的量存在。
32.如实施例25-28中任一项所述的杀有害生物组合物，其中将该组合物配制为根浸渍。
33.如实施例32所述的杀有害生物组合物，其中分散在该载剂相中的该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、和该外源杀有害生物活性成分以约25mg至约200mg活性成分/L存在。
34.如实施例32所述的杀有害生物组合物，其中分散在该载剂相中的该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、和该外源杀有害生物活性成分以约1x 103至约1x 103颗粒/植物根系的量存在。
35.如实施例1-34中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该微细胞颗粒浓度的范围为约1x 102至约8x 1014。
36.如实施例4-35中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该微细胞的杀有害生物活性以及该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向相同的有害生物。
37.如实施例4-35中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该微细胞的杀有害生物活性以及该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。
38.如实施例25-37中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性以及分散在该载剂相中的该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、和该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向相同的有害生物。
39.如实施例25-37中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性以及分散在该载剂相中的该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、和该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。
40.如实施例1-39中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该至少一种有害生物选自由以下组成的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、和尾孢属物种。
41.如实施例1-40中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物微细胞保持稳定并且保留杀有害生物活性至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或至少13个月。
42.一种制备杀有害生物微细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供杀有害生物亲代细菌，该杀有害生物亲代细菌包含引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变；
b)使该杀有害生物亲代细菌在允许形成杀有害生物微细胞的条件下生长；以及
c)使用离心、切向流过滤(TFF)、或TFF和离心将杀有害生物微细胞纯化。
43.如实施例42所述的方法，其中步骤(c)产生约1010个杀有害生物微细胞/升、约1011个杀有害生物微细胞/升、约1012个杀有害生物微细胞/升、约1013个杀有害生物微细胞/升、约1014个杀有害生物微细胞/升、约1015个杀有害生物微细胞/升、约1016个杀有害生物微细胞/升、或约1017个杀有害生物微细胞/升。
44.如实施例42或实施例43所述的方法，其进一步包括步骤(d)使这些杀有害生物微细胞干燥以产生贮存稳定的杀有害生物微细胞组合物。
45.如实施例44所述的方法，其中该贮存稳定的杀有害生物微细胞组合物保留杀有害生物活性至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或至少13个月。
46.如实施例42-45中任一项所述的方法，其中该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。
47.如实施例46所述的方法，其中该z-环抑制蛋白选自由以下组成的组：minC多肽、minD多肽和minE多肽；其中该细胞分裂拓扑特异性因子选自由以下组成的组：minE多肽和DivIVA多肽，并且其中该隔膜机构组分选自由以下组成的组：ftsZ多肽和ftsA多肽。
48.一种产生杀有害生物微细胞的亲代细菌，其中
(i)该杀有害生物亲代细菌包含修饰该亲代细菌的细胞分配功能的遗传突变；并且
(ii)该杀有害生物亲代细菌展现出商业相关的杀有害生物活性，其中对至少一种植物有害生物的LD50少于100mg/kg。
49.如实施例48所述的产生杀有害生物微细胞的亲代细菌，其中修饰该亲代细菌的细胞分配功能包括修饰以下中的至少一种的水平或活性：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。
50.如实施例48或实施例49所述的产生杀有害生物微细胞的亲代细菌，其中该z-环抑制蛋白选自由以下组成的组：minC多肽、minD多肽和minE多肽；其中该细胞分裂拓扑特异性因子选自由以下组成的组：minE多肽和DivIVA多肽，并且其中该隔膜机构组分选自由以下组成的组：ftsZ多肽和ftsA多肽。
51.一种控制有害生物的方法，该方法包括：
将如实施例1-41中任一项所述的杀有害生物组合物应用于植物或待种植的区域。
52.如实施例51所述的方法，其中该应用包括以下中的至少一个：注射应用、叶面应用、出苗前应用、或出苗后应用。
53.如实施例51或实施例52所述的方法，其中控制包括以下中的至少一个：
当与未用组合物处理的对照植物相比时，植物上的有害生物数量减少，并且当与未用组合物处理的对照植物相比时，对植物的物理损坏减少。
54.如实施例53所述的方法，其中
有害生物数量的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少，并且
物理损坏的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少。
55.如实施例51-54中任一项所述的方法，其中将该组合物配制为以下中的至少一种：即用型(RTU)配制品、悬浮液浓缩物、罐混合物、气溶胶、种子处理、根浸渍、土壤处理、灌溉配制品、喷洒配制品、或浸透处理。
56.如实施例51-55中任一项所述的方法，其中该有害生物选自由以下组成的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、和尾孢属物种。
57.一种可湿性粉剂，其包含：
衍生自多个杀有害生物亲代细菌的多个干燥的杀有害生物微细胞，该多个杀有害生物亲代细菌包含引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变，
将该可湿性粉剂配置为在水性载剂中分散以产生杀有害生物组合物，用于当组合物应用于植物时控制在该植物中或在该植物上的至少一种有害生物。
58.如实施例57所述的可湿性粉剂，其进一步包含含有以下中的至少一种的农用化学可接受的固体载剂组分：粘土组分、高岭土组分、滑石组分、白垩组分、方解石组分、石英组分、浮石组分、硅藻土组分、蛭石组分、硅酸盐组分、二氧化硅组分、二氧化硅粉剂组分、铝组分、硫酸铵组分、磷酸铵组分、碳酸钙组分、尿素组分、糖组分、淀粉组分、锯末组分、研磨的椰子壳组分、研磨的玉米芯组分、以及研磨的烟草秆组分。
59.如实施例57或实施例58所述的可湿性粉剂，其中该水性载剂包含水。
60.如实施例57-59中任一项所述的可湿性粉剂，其中控制包括以下中的至少一个：
当与未用组合物处理的对照植物相比时，植物上的有害生物数量减少，并且当与未用组合物处理的对照植物相比时，对植物的物理损坏减少。
61.如实施例60所述的可湿性粉剂，其中
有害生物数量的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少，并且
物理损坏的减少是至少10％减少、至少15％减少、至少20％减少、至少25％减少、至少30％减少、至少40％减少、至少50％减少、至少60％减少、至少70％减少、或至少80％减少。
62.如实施例57-61中任一项所述的可湿性粉剂，其中该至少一种有害生物选自由以下组成的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、和尾孢属物种。
63.如实施例57-62中任一项所述的可湿性粉剂，其中修饰该亲代细菌的细胞分配功能包括修饰以下中的至少一种的水平或活性：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。
64.如实施例63所述的可湿性粉剂，其中该z-环抑制蛋白选自由以下组成的组：minC多肽、minD多肽和minE多肽；其中该细胞分裂拓扑特异性因子选自由以下组成的组：minE多肽和DivIVA多肽，并且其中该隔膜机构组分选自由以下组成的组：ftsZ多肽和ftsA多肽。
65.一种可种植的组合物，其包含：
种子；以及
覆盖该种子的涂层，其中该涂层包含衍生自多个杀有害生物亲代细菌的多个杀有害生物微细胞，该多个杀有害生物亲代细菌包含引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个突变，并且
其中该多个杀有害生物微细胞以足以对摄食该种子或由此产生的幼苗的至少一种有害生物产生杀有害生物活性的颗粒浓度存在。
66.如实施例65所述的可种植的组合物，其中该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分。
67.如实施例66所述的可种植的组合物，其中该z-环抑制蛋白选自由以下组成的组：minC多肽、minD多肽和minE多肽；其中该细胞分裂拓扑特异性因子选自由以下组成的组：minE多肽和DivIVA多肽，并且其中该隔膜机构组分选自由以下组成的组：ftsZ多肽和ftsA多肽。
68.如实施例65-67中任一项所述的可种植的组合物，其中该杀有害生物亲代细菌选自由以下组成的组：除虫链霉菌、刺糖多孢菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、双酶梭菌、日本金龟子芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、发光杆菌、嗜线虫致病杆菌、嗜虫沙雷氏菌、嗜虫耶尔森氏菌、喜昆虫假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属物种、萨布茨格色杆菌和大肠杆菌。
69.如实施例68所述的可种植的组合物，其中该杀有害生物亲代细菌选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌菌株RTI477、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 6633、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 21332、枯草芽孢杆菌菌株168、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 9943、枯草芽孢杆菌菌株QST713、和枯草芽孢杆菌菌株NCIB 3610，萎缩芽孢杆菌菌株ABI02A DSM 32019、萎缩芽孢杆菌菌株ABI03 DSM 32285、萎缩芽孢杆菌菌株ABI05DSM 24918，解淀粉芽孢杆菌菌株RTI301、解淀粉芽孢杆菌FZB24、解淀粉芽孢杆菌FZB42、解淀粉芽孢杆菌BA-1、解淀粉芽孢杆菌LMG 5-29032、解淀粉芽孢杆菌MBI600、解淀粉芽孢杆菌CECT8836、和解淀粉芽孢杆菌M4(S499)。
70.如实施例65-69中任一项所述的可种植的组合物，其中该涂层包含约1x 102至约1x 109颗粒/种子的颗粒浓度，并且其中该浓度根据种子大小来确定。
71.如实施例70所述的可种植的组合物，其中该颗粒浓度包含约1x 104颗粒/种子。
72.如实施例65-71中任一项所述的可种植的组合物，其中该至少一种有害生物选自由以下组成的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、和尾孢属物种。
73.如实施例65-72中任一项所述的可种植的组合物，其中该种子来自选自由以下组成的组的植物：大豆、草莓、黑醋栗、白醋栗、红醋栗、蓝莓、覆盆子、番茄、胡椒、辣椒、马铃薯、茄子、黄瓜、莴苣、菊苣、芸苔属、玉米、小麦、稻、低芥酸菜籽、甜瓜、羽衣甘蓝、胡萝卜、和豆科植物。
74.一种杀有害生物组合物，其包含：
杀有害生物微细胞，其中该杀有害生物微细胞衍生自杀有害生物亲代细菌，该杀有害生物亲代细菌包含引起选自由以下组成的组的一个或多个细胞分配功能因子的水平或活性中的修饰的至少一个遗传突变：minC多肽、minD多肽、minE多肽、ftsZ多肽、ftsA多肽、parA多肽、parB多肽、DivIVA多肽、及其组合。
75.如实施例74所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物微细胞包含以下中的至少一种：外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。
76.如实施例75所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物微细胞进一步包含外源表达盒，该外源表达盒被编码以表达该外源杀有害生物蛋白质毒素和该外源杀有害生物核酸中的任一种或两种。
77.如实施例75或实施例76所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物蛋白质毒素包含Pir毒素或Cry毒素。
78.如实施例75或实施例76所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或发夹RNA(hpRNA)。
79.如实施例75所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物活性成分选自由以下组成的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、以及具有广谱活性的成分。
80.如实施例74-79中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该微细胞的杀有害生物活性以及该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向相同的有害生物。
81.如实施例74-79中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该微细胞的杀有害生物活性以及该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。
82.如实施例74-81中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该至少一种有害生物选自由以下组成的组：小菜蛾(DBM)、红粉甲虫(RFB)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、地中海粉斑螟、秋粘虫(FAW)、亚洲斑点螟蛉、鳞翅目物种、鞘翅目物种、双翅目物种、疫霉属物种、蜜环菌属物种、炭疽菌属物种、葡萄孢属物种、和尾孢属物种。
83.如实施例74-82中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物微细胞保持稳定并且保留杀有害生物活性至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或至少13个月。
实例
通过参考以下实例将更好地理解当前披露的主题，这些实例作为本发明的示例而不是限制而提供。
实例1：通过遗传修饰产生杀有害生物微细胞
该实例显示了可以通过各种遗传突变从杀有害生物亲代细菌细胞产生的杀有害生物微细胞。在该实例中，提供了产生杀有害生物微细胞的方法，该方法包括破坏参与调节亲代细菌的细胞分配功能的一种或多种基因，即，破坏z-环抑制蛋白(例如，minC或minD)或破坏z-环抑制蛋白和细胞分裂拓扑特异性因子(例如，minCDE)。另外，提供了经由破坏min操纵子或过表达隔膜机构组分FtsZ产生ADAS产生的菌株的遗传手段。
材料和方法
靶基因的生物信息学鉴定
发光杆菌菌株TT01和Kleinii：目的基因的序列是在巴斯德研究所(InstitutPasteur)支持的数据库PhotoList万维网服务器(http://genolist.pasteur.fr/PhotoList/genome.cgi)上发现的。
枯草芽孢杆菌沙漠亚种(Bacillus subtilis subsp.inaquosorum)：为了鉴定在没有基因组序列的物种中要破坏的序列，采取了以下程序。使用引物017和引物046通过PCR从染色体扩增rDNA，并且经由Sanger测序进行测序(表1)。然后使用核苷酸BLAST鉴定最接近的测序相对菌株。这种最近亲属的基因组序列用于鉴定参与微细胞形成的基因(divIVA、minC、minD)，并设计靶向这些基因座破坏的引物。另外，鉴定孢子形成的主要调节因子spo0A的序列，并用于设计引物以扩增遗传破坏的同源区域。
表1.引物列表和序列
| 引物名称 | 序列 |
| oAF086 | TGGTAATCTATGTATCCTGGCAAC(SEQ ID NO:1) |
| oLK015 | TTCGCCAGATGATAAGGAAC(SEQ ID NO:2) |
| oLK092 | GGTCTCGgcattctcgcaatattatccatcctgcc(SEQ ID NO:3) |
| oLK111 | taGGTCTCgtctcgatataaaggcacaaagcgg(SEQ ID NO:4) |
| oZC017 | ATACTTGTCCACTTTGCACCG(SEQ ID NO:5) |
| oZC046 | TTCGGGTAGACAAATTGCAC(SEQ ID NO:6) |
经由ftsZ过表达和min突变从发光杆菌菌株中产生杀有害生物微细胞
经由ftsZ蛋白的过表达产生微细胞：通过天然ftsZ蛋白的过表达由发光杆菌菌株TT01和Kleinii产生杀有害生物微细胞。对含有序列和天然核糖体结合位点(RBS)的BsaIgBlock进行排序。使用金门组装(Golden Gate assembly)，将gBlock移动到表达载体Pla071(含有氨苄青霉素抗性和aTc诱导的TetR启动子的CloDF来源)中。所得表达载体是Pla097，并且经由化学感受态细胞的热休克转化为大肠杆菌DH5α。一旦完成，质粒从大肠杆菌菌株中小量制备出来，然后转化为发光杆菌菌株。发光杆菌菌株在CASO培养基中生长，在5％[w/v]蔗糖+1mM HEPES缓冲液中洗涤，在CASO+羧苄西林50μg/mL上进行铺板，并且在30℃下生长两天。挑选生长在回收板上的菌落，并进行菌落PCR以测试适当的质粒繁殖。使用引物oLK015(SEQ ID NO:2)和oAF086(SEQ ID NO:1)以验证发光杆菌基因ftsZ的存在和成功的质粒转化。
为了产生微细胞，从冷冻的甘油原液中将平板划线，并在30℃下孵育两天。挑选菌落并接种在LB+Carb 50中以在30℃下生长过夜。第二天早晨将过夜培养物以1:200稀释在更大体积的培养基加抗生素中。使培养物生长达到OD 600 0.5，然后将培养物用100ng/mL的aTc诱导，并生长过夜。第二天，将培养物加工以收集在实例2中描述的分化离心工艺后过夜产生的微细胞。
经由minCDE操纵子的缺失产生微细胞：为了敲除操纵子，用自杀质粒转染细胞。质粒pPINT是从在美茵茨约翰内斯·古腾堡大学(Johannes-Gutenberg-Mainz)，分子生理学研究所(Institut für Molekulare Physiologie)的Ralf Heermann实验室获得的。pPINT质粒具有多克隆位点(MCS)，该多克隆位点允许添加同源臂以插入抗生素盒。同源臂是使用引物产生的，其中切割位点突出端与结合至基因组的pPINT MCS匹配。一个臂设置为在minC上游包含500bp，并且另一个臂设置为在minE下游包含500bp。使用限制性酶切消化和连接，然后将最终的pPINT质粒转化为营养缺陷型供体pir+大肠杆菌菌株。由于质粒的R6K来源，这是必要的。一旦供体菌株具有质粒，就开始转染方案。转染导致同源重组，以将抗生素盒插入minCDE操纵子所在的位置。将发光杆菌属菌株在Kan35上铺板，以从转染中选择适当的抗生素抗性。在第一级选择之后，将菌落放置在含有琼脂的蔗糖上以选择供体菌株。使用落在同源臂外的引物和落在抗生素盒内的引物进行PCR验证。产生微细胞是因为minCDE操纵子被去除并且没有细胞分裂的调节。没有minCDE，细胞的分裂是不受控制的；ftsZ环将在细菌的极点形成，并且在闭合时产生微细胞。对于微细胞产生，从甘油冷冻原液中将新鲜平板划线，并在30℃下孵育过夜。第二天，将单个菌落接种在50mL LB培养物中。将培养物在30℃下生长过夜，并且第二天，取10mL的过夜培养物并接种在500mL培养物中。重复此工艺，使两个烧瓶之间总共有一(1)升材料。如上所陈述，由于minCDE突变，将产生微细胞。第二天，将培养物加工以收集在实例2中描述的分化离心工艺后过夜产生的微细胞。
经由min突变从枯草芽孢杆菌沙漠亚种中产生杀有害生物微细胞
为了产生枯草芽孢杆菌沙漠亚种的杀有害生物微细胞，产生了divIVA和minCD的基因组缺失。divIVA和/或minCD基因座被侧接loxP重组位点的编码卡那霉素抗性或红霉素抗性的抗生素抗性基因替代(遵循类似于Koo,等人2017的策略)。还缺失孢子形成的主要调节因子spo0A以预防孢子的形成，这将与微细胞的形成竞争，并且大小相似，使微细胞纯化更麻烦。简而言之，divIVA、minCD或spo0A基因座的上游和下游的1kb区域通过PCR扩增。然后经由PCR将这些同源臂缝合到编码抗生素抗性标记和loxP位点的基因上，以创建敲除盒。然后按照标准转化程序将盒转化为枯草芽孢杆菌沙漠亚种。
然后通过使用Cre-lox重组酶系统去除抗性标记。简而言之，含有divIVA、minCD和spo0A基因座中的破坏的菌株用质粒pDR422进行转化，该质粒编码组成型表达的Cre重组酶基因和温度敏感的复制起源，并且在30℃下在壮观霉素选择性LB-琼脂平板上铺板。第二天，将几个菌落重新划线到非选择性LB-琼脂平板上并且在37℃下孵育以去除pDR422质粒。将所得菌落抗性补充到卡那霉素、红霉素、壮观霉素和普通LB-琼脂平板上，以确认所有抗生素抗性的丧失。
通过观察枯草芽孢杆菌沙漠亚种的培养物中的微细胞来证实微细胞的产生。简而言之，挑选单个突变体枯草芽孢杆菌的菌落并且在37℃下在LB中生长3小时，或直到达到OD600＝1。然后将1μL的培养物置于由1.5％琼脂糖在PBS中制成的显微镜载玻片上的垫子上。将盖玻片置于顶部，并通过相差光学显微镜用100X油浸物镜对培养物进行成像。
结果
下表2A提供了杀有害生物亲代细菌细胞、最近亲属细菌和分类。表2B提供了在产生微细胞的杀有害生物亲代细菌细胞中鉴定的蛋白质。
表2A.杀有害生物亲代细菌、最近亲属细菌和分类。
表2B.在产生微细胞的杀有害生物亲代细菌细胞中鉴定的蛋白质(Y＝存在蛋白质)。
图1提供了显示将发光杆菌ftsZ基因成功插入到表达载体中的测序图。
实例2：杀有害生物微细胞的分离和表征
可以使用几种方法从亲代细菌培养物中纯化微细胞。该实例描述了用于微细胞分离的三种方法：离心工艺、切向流过滤(TFF)工艺、和组合的离心-TFF工艺。在所有情况下，抗生素处理都用于对微细胞培养物进行灭菌。
材料和方法
培养基优化
LB被用作基线，并且完成研究以鉴定更理想的发酵培养基。测试了几种培养基用于细菌菌株的微细胞产生。测试的培养基包括具有不同碳源(Cas氨基酸/酵母提取物/蛋白胨)、LB和TB+2％甘油的限定培养基。按照微细胞方案在250mL烧瓶中用50mL的材料完成研究。用Spectradyne测量纯化的微细胞样品，并且对结果进行比较。
产生微细胞的菌株的培养
为了产生微细胞，从冷冻的甘油原液中将平板划线，并在30℃下孵育两天。挑选菌落并接种在LB+Carb 50中的过夜培养物以在30℃下生长过夜。第二天早晨将过夜培养物以1:200稀释在更大体积的培养基加抗生素中。使培养物生长达到OD 600 0.5，然后将培养物用100ng/mL的aTc诱导，并生长过夜。第二天，将培养物加工以收集在以下描述的分化离心工艺后过夜产生的微细胞。
在37℃下在2.5L摇瓶中将枯草芽孢杆菌的产生微细胞的菌株在1升培养物中在富含培养基(LB)中随着以250rpm的振荡生长。通过从新鲜LB-琼脂平板中选择单个菌落来接种培养物并且培养12、16、18或24小时。
离心颗粒纯化
简而言之，将细菌培养物稀释至OD600＝10，并且使用最慢的加速速度在1升瓶中以4000x g(Sorval Lynx 6000)离心40分钟。然后将富含微细胞的上清液以17,000g离心1小时以沉淀微细胞。然后将所得沉淀重悬于含有200μg/mL头孢曲松和20μg/mL环丙沙星的50mL的新鲜LB中，并将培养物置于30℃下2小时以去除任何残留的亲代细菌。将溶液在旋转桶式转子(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))中以4,000x g离心15min，以去除死亡的亲代细菌细胞和大碎片。然后将微细胞以20,000x g(Sorval Lynx 6000)沉淀20min，并重悬于等体积的0.2μm过滤的PBS中。重复此步骤，共2次洗涤，并将所得微细胞沉淀重悬于最终体积为1mL的0.2μm过滤的PBS中。
TFF颗粒纯化
简而言之，通过使用0.65μM过滤器的第一切向流过滤(TFF)去除大部分亲代细胞，并在没有浓缩的情况下收集渗透物。然后去除污染物，并经由使用750kDa TFF过滤器将富含微细胞的渗透物浓缩10倍，收集渗余物。然后将富含微细胞的渗透物用200μg/mL头孢曲松和20μg/mL环丙沙星处理，并且将培养物置于30℃下2小时以去除任何残留的亲代细菌，然后如上所述进行加工。
离心-TFF颗粒纯化
这种微细胞分离的方法组合了来自“离心颗粒纯化”和“TFF颗粒纯化”的步骤。简而言之，如在“离心颗粒纯化”中将培养物稀释至OD600＝10，并且经由离心去除亲代细胞。然后，如在“TFF颗粒纯化”中将富含微细胞的上清液从污染物中纯化，并且通过使用750kDa过滤器经由TFF浓缩。然后如在“离心颗粒纯化”和“TFF颗粒纯化”中将富含微细胞的渗透物用抗生素处理，洗涤，并浓缩。
微细胞的表征
通过显微镜、粒度分析和蛋白质印迹针对胞质蛋白GroEL对分离的微细胞进行验证。图3A示出了微细胞分离前和分离后，产生发光杆菌菌株的微细胞的培养物的相差显微镜图像。图3B示出了粒度分析结果。通过用Spectradyne nCS1计数来测量粒度分布和浓度。
为了证实微细胞是真正的微细胞，而不是细胞外囊泡，有报道称发光杆菌属物种产生，对胞质伴侣蛋白GroEL进行了蛋白质印迹。简而言之，将3.33μL的1x LDS样品缓冲液(赛默公司(Thermo))与含有1e9颗粒的10μL的样品混合。将样品在1.5mL管中在95℃下煮沸5min，并在台式离心机中旋转以去除盖子上的任何冷凝液。将整个样品加载到Bolt 4％-12％ Bis-Tris PAGE凝胶(赛默公司)上。将7μL的Chameleon Duo梯(LiCOR)作为标准品加载。通过在恒定的200V下运行25min，在凝胶上分离蛋白质。然后使用iBlot系统(赛默公司)使用V0程序将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。转移后，使用制造商推荐的抗体稀释液经由iBind(赛默公司)将膜与小鼠抗GroEL抗体(艾博抗公司(Abcam)ab82592)和山羊抗小鼠Alexa Fluor 647(赛默公司A32728)一起孵育。然后使用Alexa Fluor 647的智能曝光设置用iBright成像仪(赛默公司)对印迹进行成像。图3C示出了胞质伴侣蛋白GroEL的蛋白质印迹的图像。
结果
图2示出了培养基优化测试的结果。
图3A-3C示出了表征由发光杆菌产生的杀有害生物微细胞的测定。图3A是显微镜图像，其中约500nm的球形微细胞颗粒清晰可见(右图)。图3B示出了粒度分析结果，其中显示了从1L培养物中收集的浓度大于1e10、1e11和1e12/升，平均大小为450nm。图3C示出了胞质伴侣蛋白GroEL的蛋白质印迹的图像。可以看出，只有微细胞对GroEL呈阳性，而细胞外囊泡则不是，因为它们只含有周质材料。
实例3：用包括衍生自杀有害生物亲代细菌的杀有害生物微细胞的杀有害生物组合物对植物的处理在保持植物健康的同时杀伤昆虫有害生物
该实例证明了通过用包括衍生自昆虫病原微生物发光杆菌的杀有害生物微细胞的杀有害生物组合物处理昆虫小菜蛾(Plutella xylostella)(小菜蛾(DiamondbackMoth))来杀伤它们或降低其适应度的能力。该实例还证明了这种处理引起易感植物的植物损坏减少。
材料和方法
昆虫饲养
小菜蛾卵购自班宗研究公司(Benzon Research)，并且以购自班宗研究公司的人工饲料(通用夜蛾饲料)饲养。如下制备饲料：
1.将162g的通用夜蛾饲料粉末添加至沸水中
2.将内含物充分混合15分钟，同时保持温度在80℃与90℃之间
3.将混合物冷却至70℃，添加5mL的亚麻籽油并充分混合
4.然后将食物分配至饲养容器中并使其冷却且固化
将DBM卵置于饲料上并使其可孵化和喂养。将所有饲养容器均维持在25℃，16小时:8小时的明:暗循环和34％湿度下。一旦幼虫达到第二龄期，它们就用于人工饲料或叶圆盘测定。在这个阶段，幼虫也可以用于全株植物的测定。
使用人工饲料、叶圆盘测定和全株植物的昆虫实验处理
对于人工饲料测定，0.38mL的夜蛾饲料分配到48孔板的每个孔中，冷却并在4℃下储存过夜。第二天，将30μL的108、109、1010、或1011杀昆虫微细胞组合物(如实例2中制备)或作为阴性对照的无菌PBS分层在每个孔的饲料顶部。在通风橱中干燥1小时后，将一个第二龄期DBM幼虫置于每个孔中。然后将板用呼吸更轻松的片(Breathe Easier sheet)(凯杰公司(Qiagen))牢固地粘住，并置于维持在25℃，16小时:8小时的明:暗循环和34％湿度的培养箱中。
对于叶圆盘测定，叶圆盘由低芥酸菜籽叶用圆形皮革切割机制成。然后将每个叶盘置于12孔板中1％高压灭菌琼脂凝胶的顶部。在微细胞组合物应用和昆虫侵染之前，用Lemnatec成像仪拍摄每个板的图像。为了便于铺展，将Silwet L-77添加到所有微细胞溶液中以达到0.05％的最终浓度。然后将25μL的含有108、109、1010、或1011的发光杆菌微细胞溶液或作为阴性对照的PBS分配到叶圆盘上，并使其完全干燥。干燥后，将五个第二龄期DBM幼虫置于每个叶圆盘上。将板用呼吸更轻松的片密封，并置于维持在25℃，16小时:8小时的明:暗循环和34％湿度的培养箱中。
对于全株植物测定，使用了三叶期低芥酸菜籽植物。将新鲜的DBM卵用湿纸巾留在孵化室中过夜。将12株低芥酸菜籽植物置于每个笼中，然后喷洒微细胞溶液。在侵染前使它们干燥1小时。将饲养室中的纸巾(含有数百只新生虫)切成两半并置于每个笼中。
处理后的植物健康和昆虫适应度读数(LD50测定)
在人工饲料或叶圆盘测定中，在3天后确定杀有害生物微细胞对昆虫适应度的影响。对活幼虫进行计数并确定发育阶段。确定死亡率和发育迟缓。通过绘制幼虫存活百分比与应用于人工饲料的微细胞数量并拟合剂量反应曲线(GraphPad Prism 9)来确定DBM幼虫上发光杆菌微细胞的LD50。
对于叶圆盘测定，用Lemnatech成像仪拍摄叶圆盘板的照片，并计算消耗的叶圆盘的百分比。
对于全株植物测定，通过日常观察和照片记录幼虫大小和对植物的损坏。在实验结束时对化蛹和非化蛹幼虫的数量进行计数，并测量每株植物的重量以评估微细胞对DBM存活和摄食的影响。
结果
图4A-4C示出了LD50测定的结果，其中用含有由发光杆菌产生的微细胞的杀有害生物组合物处理小菜蛾(Plutella xylostella)(小菜蛾(Diamondback Moth)；DBM)。图4A-4B示出了人工饲料LD50测定的结果，其中DBM幼虫摄食一系列浓度的衍生自发光杆菌菌株TT01(图4A)或Kleinni(图4B)的微细胞颗粒。在摄食后3天记录死亡率。图4C示出了叶圆盘测定LD50测定的结果，其中DBM幼虫摄食一系列浓度的衍生自发光杆菌菌株TT01或Kleinii的微细胞颗粒，并且3天后记录死亡率。在这些测定中，杀有害生物微细胞证明了死亡率和强烈的发育迟缓表型。
实例4：用包括衍生自杀有害生物亲代细菌的杀有害生物微细胞的杀有害生物组合物处理一组鳞翅目昆虫显示出小菜蛾的高易感性
该实例证明了通过用包括衍生自昆虫病原微生物发光杆菌的杀有害生物微细胞的杀有害生物组合物处理昆虫小菜蛾(Plutella xylostella)(小菜蛾(DiamondbackMoth))来特别杀伤它们而非其他昆虫幼虫或降低其适应度的能力。
材料和方法
使用人工饲料的昆虫饲养和实验处理
欧洲玉蜀黍螟(大丽花螟蛾(Ostrinia nubilalis)；ECB)和草地贪夜蛾(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；FAW)卵获得自班宗研究公司。如实例3中进行昆虫饲养。如实例3中设置人工饲料测定。
处理后的昆虫适应度读数(死亡率％)
如实例3中进行昆虫适应度和死亡率的读数。
结果
图5A-5B示出了来自发光杆菌的杀有害生物微细胞对小菜蛾(DBM)而非草地贪夜蛾(FAW)、甜菜夜蛾(BAW)和欧洲玉蜀黍螟(ECB)具有毒性。
实例5：进一步包括外源杀昆虫活性成分的杀有害生物微细胞的产生
该实例证明了氯虫苯甲酰胺(CTPR)的包封和加载浓度定量(包封功效)。
材料和方法
将来自发光杆菌E1.2(500μL)的杀有害生物微细胞在PBS中洗脱。用5μL的CTPR原液(10mg/ml)将杀有害生物微细胞或PBS溶液(500μL)加标，然后在37C下在培养箱中孵育24hr。然后用过滤器(Microcon-300kDa，EMD密理博公司(EMD Milipore))将100μL样品(加标的杀有害生物微细胞或PBS)进行离心过滤工艺。将样品用在PBS中的无菌1％ MeOH洗涤6次并且以15,000g离心6次持续1min以去除游离A.I。第6次过滤后，将所有滤液收集在一个管中作为总滤液。将另外的在PBS中的100μL 1％ MeOH添加到过滤器中以洗涤并从过滤器中回收渗余物(ADAS)。将渗余物(杀有害生物微细胞)和滤液进行LC-MS以检测CTPR的浓度。
实例6：通过包封外源杀昆虫活性成分增加衍生自杀有害生物亲代细菌的杀有害生物微细胞的杀昆虫效力和光谱
材料和方法
昆虫饲养(DBM、FAW、ECB)
如实例4中进行DBM、ECB和FAW幼虫的昆虫饲养。
实验处理
在人工饲料和LDA测定中用实例5的杀有害生物微细胞处理昆虫。
昆虫适应度读数
如实例4中进行处理后的昆虫适应度读数(LDA测定)。
实例7：用包括衍生自杀真菌亲代细菌的杀有害生物微细胞的杀有害生物组合物对植物的处理在保持植物健康同时抑制真菌有害生物
该实例证明了通过用衍生自杀真菌微生物枯草芽孢杆菌沙漠亚种的杀有害生物微细胞处理导致疾病葡萄孢属灰霉病的真菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)来抑制它们的能力。该实例还证明了这种处理引起易感植物的植物和果实损坏减少。
材料和方法
使用体外测定的真菌培养和实验处理
通过抑制测定的菌丝区来证明抗真菌活性。使灰葡萄孢菌的菌苔在室温下在马铃薯右旋糖琼脂(PDA)板上生长1周。将该菌苔的一小块置于新鲜PDA板的中心，并且将以至少108、109、1010枯草芽孢杆菌沙漠亚种的微细胞涂覆的过滤器盘与真菌块等距排列。在5天和7天后对板进行成像，并以mm为单位测量抑制区。
处理后的植物健康和真菌抑制读数(LD50测定)
在温室条件下测试局部应用来自枯草芽孢杆菌沙漠亚种的杀有害生物微细胞在抑制灰霉病方面的有效性。简而言之，在用病原体灰葡萄孢菌接种草莓前，用起始浓度为10^10个微细胞的多种稀释液应用杀有害生物微细胞。之后，在不同的时间点(1、6、24小时和7天)对植物的草莓果实进行多次采样，以测试疾病严重程度。然后在处理之间比较果实中的病灶直径。
实例8：进一步包括外源杀真菌活性成分的杀有害生物微细胞的产生
材料和方法
嘧菌酯的包封和加载浓度定量(包封功效)
将来自枯草芽孢杆菌沙漠亚种E1.3(500μL)的杀有害生物微细胞在PBS中洗脱。用5μL的嘧菌酯原液(10mg/ml)将杀有害生物微细胞或PBS溶液(500μL)加标，然后在37C下在培养箱中孵育24hr。然后用过滤器(Microcon-300kDa，EMD密理博公司)将100μL样品(加标的杀有害生物微细胞或PBS)进行离心过滤工艺。将样品用在PBS中的无菌1％ MeOH洗涤6次并且以15,000g离心6次持续1min以去除游离A.I。第6次过滤后，将所有滤液收集在一个管中作为总滤液。将另外的在PBS中的100μL 1％ MeOH添加到过滤器中以洗涤并从过滤器中回收渗余物(杀有害生物微细胞)。将渗余物(杀有害生物微细胞)和滤液进行LC-MS以检测A.I的浓度。
实例9：通过包封杀真菌化学剂增加衍生自杀真菌亲代细菌的杀有害生物微细胞的杀真菌效力和光谱
材料和方法
真菌培养物(葡萄孢属、镰孢属)
如实例7中进行真菌生长。
使用进一步包括实例8体外和LDA测定的外源杀真菌活性成分的杀有害生物微细胞的实验处理
如实例7中进行处理和读数。
实例10：衍生自进一步包括外源杀昆虫活性成分的杀真菌亲代细菌的杀有害生物微细胞的产生
材料和方法
CTPR在来自枯草芽孢杆菌的微细胞中的包封和加载浓度定量(包封功效)
如实例5中完成包封和掺入的A.I的定量。
结果
实例11：使用衍生自包括外源杀昆虫活性成分的杀真菌亲代细菌的杀有害生物微细胞增加杀有害生物光谱
材料和方法
真菌培养物(葡萄孢属)
如实例7中进行真菌生长。
昆虫饲养(DBM)
如实例3中进行DBM幼虫的昆虫饲养。
使用实例10体外和人工饲料测定的杀有害生物微细胞的实验处理
如实例3中进行昆虫适应度和死亡率的读数。
处理后的真菌抑制和昆虫适应度读数
如实例7中进行处理和读数。
实例12：储存稳定的杀有害生物微细胞的产生
材料和方法
杀有害生物微细胞冻干工艺(衍生的发光杆菌属和芽孢杆菌属两者)
该实例证明了产生维持活性的储存稳定的杀有害生物微细胞的能力。
为了产生该实例中的储存稳定的杀有害生物微细胞，经由冻干将微细胞冷冻干燥。如实例2中制备发光杆菌TT01或枯草芽孢杆菌在PBS中的分离的微细胞，并且通过在1.5mL塑料管中以21,000g离心15min将1mL的微细胞沉淀。将沉淀重悬于等体积的微生物冷冻干燥缓冲液(OPS诊断公司(OPSDiagnostics))中，转移到15mL锥形管中，并在液氮中快速冷冻。然后使用具有自动收集设置的FreeZone台式冷冻干燥机(Labconco)将杀有害生物微细胞冷冻干燥16小时。冷冻干燥的微细胞管用石蜡膜密封，并在室温下在黑暗中储存直至使用。
杀有害生物微细胞的储存和稳定性的测定
将冷冻干燥的微细胞储存1、2、6、12或24个月的时间段。水化后测量活性。简而言之，用1mL PBS将粉末状的微细胞再水化。通过在Spectradyne nCS1上的浓度测量来证实颗粒数量的维持。还测定了微细胞的ATP含量以证实稳定性。
实例13：可湿性粉剂(WP)杀有害生物组合物的产生
材料和方法
使用来自实例12的冻干的微细胞产生WP
根据本披露如以前生产的冻干的杀有害生物微细胞可用于制备可湿性粉剂(WP)。如本文所用，可湿性粉剂包括在水中或其他液态载剂中容易分散的细碎的颗粒。含有杀有害生物微细胞的颗粒典型地以冻干形式保留在固体基质中。典型的固体基质包括漂白土、高岭土、硅石和其他容易湿化的有机或无机固体。可湿性粉剂通常含有约5％到约95％的活性成分加上少量的润湿剂、分散剂或乳化剂。
结果
示例性可湿性粉剂可以包括下表3中的那些。
表3.示例性可湿性粉剂。
本领域技术人员还能够使用本文所包含的教导内容生产水可分散的颗粒(WDG)。
实例14：从可湿性粉剂中产生的杀有害生物组合物的杀有害生物活性
材料和方法
杀有害生物组合物
使用实例13的可湿性粉剂产生杀有害生物组合物。
使用体外和人工饲料测定基于用杀有害生物组合物处理的杀昆虫活性
如实例3和实例7中所述完成活性。
实例15：悬浮液浓度(SC)杀有害生物组合物的产生
材料和方法
悬浮液浓缩物配制品的产生(在高浓度下预防结块的微细胞友好型表面活性剂)
根据本披露如前面的实例中产生的微细胞可用于产生悬浮液浓缩物(SC)。本文使用的悬浮液浓缩物包括杀有害生物微细胞的细碎的固体颗粒稳定悬浮于其中的水性配制品。这样的配制品包括抗防沉剂和分散剂，并且可以进一步包括润湿剂以增强活性，以及消泡剂和晶体生长抑制剂。在使用时，将这些浓缩物在水中稀释，并且通常作为喷雾剂应用至有待处理的区域。活性成分的量的范围可以是浓缩物的约0.5％至约95％。
结果
示例性悬浮液浓缩物描述在下表4中。
表4.示例性悬浮液浓缩物。
| 成分 | 量(％w/v) |
| 杀有害生物微细胞 | 40 |
| 萘磺酸盐缩合物 | 4 |
| 非离子型聚合物水性分散剂 | 1 |
| 黄原胶 | 0.5 |
| 防腐剂 | 0.1 |
| 水 | 平衡 |
实例16：种子处理和产生可种植的组合物的方法
材料和方法
根据本披露如前面的实例中产生的微细胞可用于产生种子处理和可种植的组合物。在这样的种子处理组合物中，除了杀有害生物微细胞之外，组合物还可以包括其它杀有害生物剂、表面活性剂、成膜聚合物、载剂、防冻剂和其它处方添加剂，并且当一起使用时提供储存稳定的且适用于普通种子处理设备的组合物，例如浆料种子处理器、直接处理器、农场料斗箱、种植箱等。
结果
示例性种子处理组合物描述在下表5中。
表5.示例性悬浮液浓缩物。
| 成分 | 量 |
| 杀有害生物微细胞 | 40％ |
| EO/PO嵌段共聚物 | 3％ |
| 三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚 | 0.5％ |
| 钙盐，颜料红 | 5％ |
| 硅油 | 0.2％ |
| 水 | 平衡 |
可以通过用种子处理组合物涂覆玉米种子来产生可种植的组合物，从而产生具有改善的植物能力特征的新型组合物。
可以通过用种子处理组合物涂覆大豆种子来产生可种植的组合物，从而产生具有改善的植物能力特征的新型组合物。
可以通过用种子处理组合物涂覆低芥酸菜籽种子来产生可种植的组合物，从而产生具有改善的植物能力特征的新型组合物。
可以通过用种子处理组合物涂覆稻种子来产生可种植的组合物，从而产生具有改善的植物能力特征的新型组合物。
可以通过用种子处理组合物涂覆小麦种子来产生可种植的组合物，从而产生具有改善的植物能力特征的新型组合物。
实例17：进一步包括外源杀有害生物蛋白质的杀有害生物微细胞的产生
材料和方法
用杀有害生物蛋白质或表达盒加载(或可替代地用杀有害生物蛋白质或表达盒加载亲代)
发光杆菌微细胞的产生如实例1中所述。另外，杀有害生物蛋白质的基因序列(例如来自Bt的Cry1Ac毒素)克隆到在诱导型启动子(Ptac或Ptet)或组成型启动子后的具有CloDF或pMB1复制来源的表达载体中。可替代地，使用pPINT载体经由同源重组将杀有害生物基因插入到发光杆菌染色体中。在OD600＝0.5下用aTc或IPTG诱导杀有害生物蛋白质的表达以产生和加载在微细胞中的蛋白质。分离和表征如前面的实例中所述。
实例18：进一步包括外源杀有害生物核酸的杀有害生物微细胞的产生
材料和方法
用杀有害生物核酸或表达盒加载(或可替代地用杀有害生物核酸或表达盒加载亲代)
发光杆菌微细胞的产生如实例1中所述。另外，为了能够稳定产生dsRNA，需要破坏编码RNA酶II的rnc基因。如实例1所陈述的用于发光杆菌属的基因组改变的相同方法将用于完成该任务。另一个必要的改变是使用如实例1所陈述的类似方法将T7-RNAP的拷贝添加到染色体中。这允许使用基于T7启动子的表达质粒系统。dsRNA对肌动蛋白的表达是通过添加IPTG诱导的。如前面的实例中所述的进行生物测定。
实例19：种子处理和产生可种植的组合物的方法
材料和方法
实例17和实例18中产生的杀有害生物微细胞的UV稳定性测定
通过在设置在25C的无湿度控制的培养箱(卡隆公司(Caron))中安装4个T5PowerVegTM FS+UV灯泡(EYE Hortilux公司)来设置UV暴露培养箱。在灯泡下方15cm的样品站上测量的UV(A+B)辐照为1300mW/cm2。当裂解物或具有来自E12和E13(100ml)的杀有害生物活性的完整杀有害生物微细胞移液到1.5ml管中时，该管由单层保鲜膜(Saran wrap)(聚乙烯)和橡皮筋密封。然后将管置于样品站上的架子中。将一组样品暴露在UV下6hr、12hr和24hr。另一组相同的样品用箔包裹，并在培养箱的样品站上保持相同的时间间隔。
将暴露于UV的裂解物或具有实例17的杀有害生物活性的完整杀有害生物微细胞用实例3中设置的DBM进行人工饲料测定。
序列表
<110> 英薇艾欧科学股份有限公司（Invaio Sciences, Inc.）
<120> 用于农业应用的杀有害生物微细胞及其组合物
<130> 16585-20018.40
<140> 尚未指定
<141> 一并同时提交
<150> US 63/175,488
<151> 2021-04-15
<160> 6
<170> 用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 1
tggtaatcta tgtatcctgg caac 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 2
ttcgccagat gataaggaac 20
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 3
ggtctcggca ttctcgcaat attatccatc ctgcc 35
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 4
taggtctcgt ctcgatataa aggcacaaag cgg 33
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 5
atacttgtcc actttgcacc g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 6
ttcgggtaga caaattgcac 20
Claims (20)
1.一种杀有害生物组合物，其包含：
液体载剂相；以及
分散在该载剂相中的多个杀有害生物微细胞，
其中该多个杀有害生物微细胞衍生自多个杀有害生物亲代细菌，该多个杀有害生物亲代细菌包含引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变，并且
其中当该组合物应用于植物时，该多个杀有害生物微细胞以足以控制在该植物中或在该植物上的至少一种有害生物的颗粒浓度存在。
2.如权利要求1所述的杀有害生物组合物，其中该多个杀有害生物微细胞的至少一部分进一步包含以下中的至少一种：外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分。
3.如权利要求2所述的杀有害生物组合物，其中该多个杀有害生物微细胞的该部分进一步包含外源表达盒，该外源表达盒被编码以表达该外源杀有害生物蛋白质毒素和该外源杀有害生物核酸中的任一种或两种，其中该外源杀有害生物蛋白质毒素包含Pir毒素和Cry毒素中的至少一种，并且其中该外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或发夹RNA(hpRNA)。
4.如权利要求2所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物活性成分选自由以下组成的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、以及具有广谱活性的成分。
5.如权利要求1所述的杀有害生物组合物，其中该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰包括以下中的至少一种修饰：z-环抑制蛋白、细胞分裂拓扑特异性因子、或隔膜机构组分；其中该z-环抑制蛋白选自由以下组成的组：minC多肽、minD多肽和minE多肽；其中该细胞分裂拓扑特异性因子选自由以下组成的组：minE多肽和DivIVA多肽；并且其中该隔膜机构组分选自由以下组成的组：ftsZ多肽和ftsA多肽。
6.如权利要求1所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌选自由以下组成的组：除虫链霉菌、刺糖多孢菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、双酶梭菌、日本金龟子芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、发光杆菌、嗜线虫致病杆菌、嗜虫沙雷氏菌、嗜虫耶尔森氏菌、喜昆虫假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属物种、萨布茨格色杆菌和大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌菌株RTI477、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 6633、枯草芽孢杆菌菌株ATCC21332、枯草芽孢杆菌菌株168、枯草芽孢杆菌菌株ATCC 9943、枯草芽孢杆菌菌株QST713、和枯草芽孢杆菌菌株NCIB 3610，萎缩芽孢杆菌菌株ABI02A DSM 32019、萎缩芽孢杆菌菌株ABI03 DSM 32285、萎缩芽孢杆菌菌株ABI05DSM 24918，解淀粉芽孢杆菌菌株RTI301、解淀粉芽孢杆菌FZB24、解淀粉芽孢杆菌FZB42、解淀粉芽孢杆菌BA-1、解淀粉芽孢杆菌LMG 5-29032、解淀粉芽孢杆菌MBI600、解淀粉芽孢杆菌CECT8836、和解淀粉芽孢杆菌M4(S499)。
8.如权利要求6所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌是发光杆菌，并且其中该杀有害生物微细胞包含外源杀有害生物蛋白质毒素Pir。
9.如权利要求6所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌是枯草芽孢杆菌，并且其中该杀有害生物微细胞包含该外源杀有害生物分子。
10.如权利要求6所述的杀有害生物组合物，其中该杀有害生物亲代细菌是经遗传修饰的表达一种或多种外源杀有害生物活性成分的大肠杆菌。
11.如权利要求1-10中任一项所述的杀有害生物组合物，其中该组合物作为叶面处理、注射处理、出苗前处理、和出苗后处理中的至少一种应用于该植物。
12.如权利要求1所述的杀有害生物组合物，其中将该组合物配制为以下中的至少一种：即用型(RTU)配制品、悬浮液浓缩物、罐混合物、气溶胶、种子处理、根浸渍、土壤处理、灌溉配制品、喷洒配制品、和浸透处理。
13.如权利要求1所述的杀有害生物组合物，其进一步包含农用化学表面活性剂，其中该农用化学表面活性剂改善以下特征中的至少一种：喷雾性、铺展性、和可注射性。
14.如权利要求1所述的杀有害生物组合物，其中该液体载剂相是水性或油性的。
15.如权利要求2所述的杀有害生物组合物，其进一步包含以下中的至少一种：分散在该载剂相中的外源杀有害生物蛋白质毒素、外源杀有害生物核酸、和外源杀有害生物活性成分，其中该外源杀有害生物蛋白质毒素包含Pir毒素和Cry毒素，并且其中该外源杀有害生物核酸是双链RNA(dsRNA)或其前体、发夹RNA(hpRNA)或其前体、或微RNA(miRNA)或其前体。
16.如权利要求15所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物活性成分选自由以下组成的组：具有杀真菌活性的成分、具有杀昆虫活性的成分、具有杀线虫活性的成分、具有选择性除草活性的成分、具有杀细菌活性的成分、以及具有广谱活性的成分。
17.如权利要求2所述的杀有害生物组合物，其中该微细胞的杀有害生物活性以及该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向相同的有害生物，或者其中该微细胞的杀有害生物活性以及该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。
18.如权利要求15所述的杀有害生物组合物，其中该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性以及该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、或该外源杀有害生物活性成分在该载剂相中分散的杀有害生物活性靶向相同有害生物，或者其中该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性以及分散在该载剂相中的该外源杀有害生物蛋白质毒素、该外源杀有害生物核酸、或该外源杀有害生物活性成分的杀有害生物活性靶向不同的有害生物。
19.一种制备杀有害生物微细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供杀有害生物亲代细菌，该杀有害生物亲代细菌包含引起该亲代细菌的细胞分配功能中的修饰的至少一个遗传突变；
b)使该杀有害生物亲代细菌在允许形成杀有害生物微细胞的条件下生长；以及
c)使用离心、切向流过滤(TFF)、或TFF和离心将杀有害生物微细胞纯化。
20.一种控制有害生物的方法，该方法包括：
将如权利要求1所述的杀有害生物组合物应用于植物或待种植的区域。
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