JP2024517408A - 農業用途のための殺有害生物性ミニ細胞及びその組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、殺有害生物性ミニ細胞、殺有害生物性ミニ細胞を含む組成物、及び殺有害生物性ミニ細胞を作製する方法を提供する。【選択図】図４Ｃ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１７５，４８８号の優先権を主張し、該特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＡＳＣＩＩテキストファイル上の配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１６５８５２００１８４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２２年４月１３日、サイズ：１，４１０バイト）。

本開示は、殺有害生物性ミニ細胞、殺有害生物性ミニ細胞を含む組成物、及び殺有害生物性ミニ細胞を作製する方法に関する。

細胞を標的とし、生物学的薬剤を送達することができる送達ベクター、そのような送達ベクターを含む組成物、及び前記ベクターを細胞に送達し、それによって動物、植物、及び昆虫の細胞、組織、並びに生物を含む生物学的系を調節する関連方法が必要とされている。特に、送達ベクター及び活性成分（例えば、殺有害生物性活性成分）の両方として機能する送達ベクターの必要性が存在する。

従って、本開示は、殺有害生物性ミニ細胞を含む組成物を提供する。殺有害生物性ミニ細胞は、昆虫、真菌、及び線虫を含む有害生物を抑制することができる殺有害生物性親細菌から生成される。殺有害生物性ミニ細胞は、親細胞の殺有害生物活性を保持し、自然に分解される。さらに、殺有害生物性ミニ細胞は、タンパク質毒素及び核酸を含む様々な生物学的活性成分を生成、増幅、及び送達するために使用することができる。本開示はさらに、殺有害生物性親細菌の細胞分割機能を改変することによって殺有害生物性ミニ細胞を生成する方法を提供する。

本開示の態様は、液体担体相と、担体相中に分散した複数の殺有害生物性ミニ細胞とを含む殺有害生物性組成物を含み、複数の殺有害生物性ミニ細胞は、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来し、複数の殺有害生物性ミニ細胞は、組成物が植物に施用された際に、植物中又は植物上の少なくとも１つの有害生物を防除するのに十分な粒子濃度で存在する。この態様のいくつかの実施形態では、防除は、組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物上の有害生物数の減少、及び組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物への物理的損傷の減少のうちの少なくとも１つを含む。この態様のさらなる実施形態では、有害生物数の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少であり、物理的損傷の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態において、複数の殺有害生物性ミニ細胞の少なくとも一部はさらに、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態において、複数の殺有害生物性ミニ細胞の一部は、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素及び外因性の殺有害生物性核酸のいずれか又は両方を発現するようにコードされた外因性発現カセットをさらに含む。この態様のいくつかの実施形態において、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素は、Ｐｉｒ毒素又はＣｒｙ毒素のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態において、外因性の殺有害生物性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）である。この態様のいくつかの実施形態において、外因性の殺有害生物性活性成分は、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、又は広範囲の活性を有する成分の群から選択される。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、親細菌の細胞分割機能における改変は、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含む。この態様のさらなる実施形態では、ｚリング阻害タンパク質は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子は、ｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構構成要素は、ｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・スピノセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓｅ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、乳化病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、キセノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・エントモファーガ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ）、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．）、クロモバクテリウム・サブツガエ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の群から選択される。この態様のさらなる実施形態では、殺有害生物性親細菌は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＴＩ４７７、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ６６３３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ２１３３２、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ９９４３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＳＴ７１３、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＣＩＢ３６１０、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０２Ａ ＤＳＭ３２０１９、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０３ ＤＳＭ３２２８５、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０５ ＤＳＭ２４９１８、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＲＴＩ３０１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ２４、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ４２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＢＡ－１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＬＭＧ５－２９０３２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＭＢＩ６００、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＣＥＣＴ８８３６、又はバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株Ｍ４（Ｓ４９９）の群から選択される。この態様のいくつかの実施態様では、殺有害生物性親細菌はフォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）であり、殺有害生物性ミニ細胞は、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素Ｐｉｒを含む。この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、殺有害生物性ミニ細胞は、外因性の殺有害生物性分子を含む。この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、一般に、１つ以上の外因性の殺有害生物性活性成分を発現する遺伝子改変された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、組成物は、葉面処理、注入処理、発芽前処理、及び発芽後処理のうちの少なくとも１つとして植物に施用される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、組成物は、使用準備完了（ＲＴＵ）製剤、懸濁濃縮物、タンクミックス、エアロゾル、種子処理剤、根浸漬剤、土壌処理剤、潅漑製剤、スプリンクラー製剤、及び灌注処理剤（ｄｒｅｎｃｈ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のうちの少なくとも１つとして製剤化される。この態様のいくつかの実施形態では、組成物は、種子処理剤として製剤化される。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、約１×１０^２～約１×１０^９粒子／種子の割合で施用され、該割合は種子の大きさに基づいて決定される。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、約１×１０^４粒子／種子の割合で施用される。この態様の他の実施形態では、組成物は根浸漬剤として製剤化される。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、約１×１０^３～約１×１０^８粒子／植物根系の割合で施用される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、農薬界面活性剤をさらに含み、農薬界面活性剤は、噴霧性、展延性、及び注入性の特徴のうちの少なくとも１つを改善する。この態様のさらなる実施形態では、液体担体相は、水性又は油性である。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態は、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分のうちの少なくとも１つをさらに含む。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素は、Ｐｉｒ毒素又はＣｒｙ毒素を含む。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）若しくはその前駆体、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）若しくはその前駆体、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）若しくはその前駆体である。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性活性成分は、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、又は広範囲の活性を有する成分の群から選択される。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、種子処理剤として製剤化される。この態様のいくつかの実施形態では、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分は、種子１００ｋｇ当たり約１ｇ～約１０ｇの量で存在する。この態様のいくつかの実施形態では、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分は、約１×１０^４粒子／種子の量で存在する。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、根浸漬剤として製剤化される。この態様のいくつかの実施形態では、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分は、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ活性成分／Ｌで存在する。この態様のいくつかの実施形態では、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分は、約１×１０^３～約１×１０^３粒子／植物根系の量で存在する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、ミニ細胞粒子濃度は約１×１０^２～約８×１０^１４である。この態様のいくつかの実施形態では、ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性は、同じ有害生物を標的とする。この態様の他の実施形態では、ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性は、異なる有害生物を標的とする。担体相中に分散した外因性成分を有する、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性と、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性は、同じ有害生物を標的とする。担体相中に分散した外因性成分を有する、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性と、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性は、異なる有害生物を標的とする。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム（Ａｓｉａｎ ｓｐｏｔｔｅｄ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）及びセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性ミニ細胞は安定なままであり、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも１３ヶ月間、殺有害生物活性を保持する。

本開示のさらなる態様は、（ａ）親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む殺有害生物性親細菌を提供する工程；（ｂ）殺有害生物性ミニ細胞の形成を可能にする条件下で殺有害生物性親細菌を増殖させる工程；並びに（ｃ）遠心分離、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、又はＴＦＦ及び遠心分離を使用して殺有害生物性ミニ細胞を精製する工程を含む、殺有害生物性ミニ細胞を作製する方法を含む。この態様のいくつかの実施態様では、工程（ｃ）は、１リットル当たり約１０^１０の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１１の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１２の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１３の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１４の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１５の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１６の殺有害生物性ミニ細胞、又は１リットル当たり約１０^１７の殺有害生物性ミニ細胞を生成する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態は、殺有害生物性ミニ細胞を乾燥させて、保存安定性の殺有害生物性ミニ細胞組成物を生成する工程（ｄ）をさらに含む。この態様のいくつかの実施形態では、保存安定性殺有害生物性ミニ細胞組成物は、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも１３ヶ月間、殺有害生物活性を保持する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、親細菌の細胞分割機能における改変は、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含む。この態様のさらなる実施形態では、ｚリング阻害タンパク質は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され；細胞分裂トポロジー特異性因子は、ｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構構成要素は、ｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。

本開示のさらなる態様は、（ｉ）殺有害生物性親細菌が親細菌の細胞分割機能を改変する遺伝子突然変異を含み、（ｉｉ）殺有害生物性親細菌が１００ｍｇ／ｋｇ未満の少なくとも１つの植物有害生物に対するＬＤ５０を有する商業的に関連する殺有害生物活性を示す、殺有害生物性ミニ細胞生成親細菌を含む。この態様の他の実施形態では、親細菌の細胞分割機能を改変することは、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つのレベル又は活性を改変することを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、ｚリング阻害タンパク質はｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され；細胞分裂トポロジー特異性因子はｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構成分はｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。

本開示のさらに別の態様は、有害生物を防除する方法を含み、この方法は、前述の実施形態のいずれか１つの殺有害生物性組成物を、植物又は植え付けられる領域に散布することを含む。この態様のいくつかの実施形態では、散布は、注入散布、葉面散布、発芽前散布、又は発芽後散布のうちの少なくとも１つを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、防除は、組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物上の有害生物数の減少、及び組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物への物理的損傷の減少のうちの少なくとも１つを含む。この態様のさらなる実施形態では、有害生物数の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少であり、物理的損傷の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、組成物は、使用準備完了（ＲＴＵ）製剤、懸濁濃縮物、タンクミックス、エアロゾル、種子処理剤、根浸漬剤、土壌処理剤、潅漑製剤、スプリンクラー製剤、又は灌注処理剤のうちの少なくとも１つとして製剤化される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）又はセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）の群から選択される。

本開示のさらに別の態様は、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来する複数の乾燥殺有害生物性ミニ細胞を含む水和性粉末を含み、水和性粉末は、組成物が植物に散布されるときに、植物内又は植物上の少なくとも１つの有害生物を防除するための殺有害生物性組成物を作り出すために、水性担体中に分散しるように構成される。この態様のいくつかの実施形態は、粘土成分、カオリン成分、タルク成分、白亜成分、カルサイト成分、石英成分、軽石成分、珪藻土成分、バーミキュライト成分、ケイ酸塩成分、二酸化ケイ素成分、シリカ粉末成分、アルミニウム成分、硫酸アンモニウム成分、リン酸アンモニウム成分、炭酸カルシウム成分、尿素成分、糖成分、デンプン成分、おがくず成分、粉砕ココナッツ殻成分、粉砕コーンコブ成分、及び粉砕タバコ柄成分のうちの少なくとも１つを含む、農薬として許容される固体担体成分をさらに含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、水性担体は水を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、防除は、組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物上の有害生物数の減少、及び組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物への物理的損傷の減少のうちの少なくとも１つを含む。この態様のさらなる実施形態では、有害生物数の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少であり、物理的損傷の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）又はセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、親細菌の細胞分割機能を改変することは、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つのレベル又は活性を改変することを含む。この態様のさらなる実施形態では、ｚリング阻害タンパク質はｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子はｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構成分はｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。

本開示のさらなる態様は、種子と、種子を覆うコーティングとを含む植物用（ｐｌａｎｔａｂｌｅ）組成物を含み、コーティングは、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来する複数の殺有害生物性ミニ細胞を含み、前記複数の殺有害生物性ミニ細胞は、種子又はそれから出現する実生を食べる少なくとも１つの有害生物に対して殺有害生物活性をもたらすのに十分な粒子濃度で存在する。この態様のいくつかの実施形態では、親細菌の細胞分割機能における改変は、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含む。この態様のさらなる実施形態では、ｚリング阻害タンパク質はｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子はｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構構成要素はｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、本態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・スピノセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓｅ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、乳化病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、キセノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・エントモファーガ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ）、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．）、クロモバクテリウム・サブツガエ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の群から選択される。この態様のさらなる実施形態では、殺有害生物性親細菌は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＴＩ４７７、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ６６３３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ２１３３２、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ９９４３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＳＴ７１３、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＣＩＢ３６１０、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０２Ａ ＤＳＭ３２０１９、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０３ ＤＳＭ３２２８５、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０５ ＤＳＭ２４９１８、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＲＴＩ３０１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ２４、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ４２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＢＡ－１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＬＭＧ５－２９０３２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＭＢＩ６００、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＣＥＣＴ８８３６、又はバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株Ｍ４（Ｓ４９９）の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、コーティングは約１×１０^２～約１×１０^９粒子／種子の粒子濃度を含み、濃度は、種子の大きさに基づいて決定される。この態様のさらなる実施形態では、粒子濃縮物は約１×１０^４粒子／種子を含む。）。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）及びセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、種子はダイズ、イチゴ、クロスグリ、ホワイトカラント、アカフサスグリ、ブラックベリー、ラズベリー、トマト、コショウ、チリ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、レタス、チコリー、アブラナ属、トウモロコシ、コムギ、イネ、キャノーラ、メロン、ケール、ニンジン、又はマメの群から選択される植物である。

本開示のさらなる態様は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、ｍｉｎＥポリペプチド、ｆｔｓＺポリペプチド、ｆｔｓＡポリペプチド、ｐａｒＡポリペプチド、ｐａｒＢポリペプチド、ＤｉｖＩＶＡポリペプチド、又はそれらの組み合わせの群から選択される１つ以上の細胞分割機能因子のレベル又は活性の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む殺有害生物性親細菌に由来する、殺有害生物性ミニ細胞を含む殺有害生物性組成物を含む。本態様のいくつかの実施態様では、殺有害生物性ミニ細胞は、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性ミニ細胞は、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素及び外因性の殺有害生物性核酸のいずれか又は両方を発現するようにコードされた外因性発現カセットをさらに含む。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素は、Ｐｉｒ毒素又はＣｒｙ毒素のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）である。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性活性成分は、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、又は広範囲の活性を有する成分の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性は、同じ有害生物を標的とする。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性は、異なる有害生物を標的とする。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）及びセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性ミニ細胞は安定なままであり、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも１３ヶ月間、殺有害生物活性を保持する。

本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に記載される。

本出願は、添付の図面と併せて以下の説明を参照することによって理解することができる。

フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）ｆｔｓＺ遺伝子が発現ベクターに首尾よく挿入されたことを示す配列決定マップを示す。プライマーｏＬＫ０１５は左から、プライマーｏＡＦ０８６は右から読み取る（表１のプライマー配列）。 ４８時間にわたる増殖について試験した種々の培地におけるＰ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）のＯＤ_６００を示す図である。 Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）から生産された殺有害生物性ミニ細胞を特徴付けるアッセイを示す。図３Ａは、ミニ細胞単離前（左側、「親細胞」）及びミニ細胞単離後（右側、「ＡＤＡＳ粒子」）のミニ細胞生成Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株の培養物の位相差顕微鏡画像である。親細菌細胞は左側に矢印で示され、一方、ミニ細胞は右側に矢印で示される。図３Ｂは、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株ＴＴ０１（黒色）及びＰ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株クレイニイ（Ｋｌｅｉｎｎｉ）（灰色）についての、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ ｎＣＳ１で計数することによって測定された粒径分布及び濃度のグラフである。図３Ｃは、サイトゾルシャペロンＧｒｏＥＬについてのウェスタンブロットの画像を示す。単離したミニ細胞はＧｒｏＥＬを含む。 プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）（コナガ；ＤＢＭ）を、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）から生成されたミニ細胞を含む殺有害生物性組成物で処理したＬＤ５０アッセイの結果を示す。図４Ａは、ＤＢＭ幼虫に、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株ＴＴ０１に由来するミニ細胞粒子の一連の濃度を与えた人工食餌ＬＤ５０アッセイの結果を示す。図４Ｂは、ＤＢＭ幼虫に、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株クレイニイ（Ｋｌｅｉｎｎｉ）に由来するミニ細胞粒子の一連の濃度を給餌した人工食餌ＬＤ５０アッセイの結果を示す。図４Ａ～４Ｂにおいて、死亡率は、給餌の３日後に記録された。図４Ｃは、ＤＢＭ幼虫に、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株ＴＴ０１又はＫｌｅｉｎｉに由来するミニ細胞粒子の一連の濃度を与え、３日後に死亡率を記録した、リーフディスクアッセイＬＤ５０アッセイの結果を示す。 コナガ（ＤＢＭ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、ビート・アーミー・ワーム（Ｂｅｅｔ Ａｒｍｙ Ｗｏｒｍ）（ＢＡＷ）、及びヨーロッパ・コーン・ボーラー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｒｎ Ｂｏｒｅｒ）（ＥＣＢ）に対する、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）から生成されたミニ細胞の効果を比較する昆虫死亡率アッセイの結果を示す。図５Ａは、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株ＴＴ０１に由来するミニ細胞を用いた死亡率アッセイを示す。図５Ｂは、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株クレイニイ（Ｋｌｅｉｎｉｉ）に由来するミニ細胞を用いた死亡率アッセイを示す。

以下の説明は、例示的な方法、パラメータなどを示す。しかしながら、そのような説明は本開示の範囲に対する限定を意図するものではなく、例示的な実施形態の説明として提供されることを認識するべきである。

殺有害生物性組成物及びその製剤
本開示の態様は液体担体相と、担体相中に分散した複数の殺有害生物性ミニ細胞とを含む殺有害生物性組成物を含み、複数の殺有害生物性ミニ細胞は、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来し、複数の殺有害生物性ミニ細胞は、組成物が植物に施用された際に、植物中又は植物上の少なくとも１つの有害生物を防除するのに十分な粒子濃度で存在する。この態様のいくつかの実施形態では、防除は、組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物上の有害生物数の減少、及び組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物への物理的損傷の減少のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態では、物理的損傷は、食害及び穿孔損傷を含む。物理的損傷は、かまれた又は破れた葉、欠落した葉、葉のトンネル、茎の穴、葉の歪み、葉の変色、葉の斑点、しおれ、発育阻害、帯状若しくは死滅した茎、黄変、破損、又は根の損傷を含むが、これらに限定されない、様々な植物表現型において現れ得る。この態様のさらなる実施形態では、有害生物数の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも３５％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも４５％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも５５％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも６５％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも７５％の減少、又は少なくとも８０％の減少であり、物理的損傷の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも３５％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも４５％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも５５％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも６５％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも７５％の減少、又は少なくとも８０％の減少である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、複数の殺有害生物性ミニ細胞の少なくとも一部はさらに、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態では、複数の殺有害生物性ミニ細胞の一部は、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素及び外因性の殺有害生物性核酸のいずれか又は両方を発現するようにコードされた外因性発現カセットをさらに含む。外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性殺有害生物活性成分は、ミニ細胞内にあるか、ミニ細胞膜に付着している。「外因性」という用語は、本明細書で使用される場合、外因性プラスミドによって発現される天然タンパク質を含む。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素は、Ｐｉｒ毒素又はＣｒｙ毒素のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）である。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性活性成分は、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、又は広範囲の活性を有する成分の群から選択される。選択的除草活性を有する成分は、ハマウツボ（オロバンチェ属（Ｏｒｏｂａｎｃｈｅ ｓｐｐ．））などの寄生植物を標的とすることができる。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、親細菌の細胞分割機能における改変は、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含む。この態様のさらなる実施形態では、ｚリング阻害タンパク質は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子は、ｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構構成要素はｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。改変は、過剰発現又は過小発現（例えば、突然変異、欠失など）を含み得る。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ｆｔｓＺポリペプチドの過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの過小発現を含む。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・スピノセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓｅ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、乳化病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、キセノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・エントモファーガ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ）、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．）、クロモバクテリウム・サブツガエ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の群から選択される。この態様のさらなる実施形態では、殺有害生物性親細菌は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＴＩ４７７、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ６６３３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ２１３３２、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ９９４３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＳＴ７１３、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＣＩＢ３６１０、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０２Ａ ＤＳＭ３２０１９、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０３ ＤＳＭ３２２８５、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０５ ＤＳＭ２４９１８、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＲＴＩ３０１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ２４、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ４２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＢＡ－１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＬＭＧ５－２９０３２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＭＢＩ６００、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＣＥＣＴ８８３６、又はバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株Ｍ４（Ｓ４９９）の群から選択される。この態様のいくつかの実施態様では、殺有害生物性親細菌はフォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）であり、殺有害生物性ミニ細胞は、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素Ｐｉｒを含む。この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、殺有害生物性ミニ細胞は外因性の殺有害生物性分子を含む。この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、１つ以上の外因性の殺有害生物性活性成分を発現する遺伝子改変大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、組成物は、葉面処理、注入処理、発芽前処理、及び発芽後処理のうちの少なくとも１つとして植物に施用される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、組成物は、使用準備完了（ＲＴＵ）製剤、懸濁濃縮物（例えば、液体流動性製剤）、タンクミックス、エアロゾル、種子処理剤、根浸漬剤、土壌処理剤、潅漑製剤、スプリンクラー製剤、及び灌注処理剤のうちの少なくとも１つとして製剤化される。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、乾燥流動性製剤（例えば、水分散性顆粒）、可溶性粉末製剤、マイクロカプセル化製剤、又は乳化性濃縮製剤として製剤化される。この態様のいくつかの実施形態では、組成物は、種子処理剤として製剤化される。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、約１×１０^２～約１×１０^９粒子／種子の割合で施用され、該割合は種子の大きさに基づいて決定される。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、約１×１０^４粒子／種子の割合で施用される。この態様の他の実施形態では、組成物は根浸漬剤として製剤化される。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、約１×１０^３～約１×１０^８粒子／植物根系の割合で施用される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のさらなる実施形態は、農薬界面活性剤をさらに含み、農薬界面活性剤は、噴霧性、展延性、及び注入性の特徴のうちの少なくとも１つを改善する。この態様のさらなる実施形態では、液体担体相は、水性又は油性である。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態は、担体相中に分散した、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分のうちの少なくとも１つをさらに含む。外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分は担体相中にあり、ミニ細胞内にないか、又はミニ細胞膜に付着していない。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素は、Ｐｉｒ毒素又はＣｒｙ毒素を含む。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）若しくはその前駆体、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）若しくはその前駆体、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）若しくはその前駆体である。トランスジェニック植物において発現され得る組換えｍｉＲＮＡ前駆体、及びｍｉＲＮＡ前駆体の設計（例えば、特定の配列を切断するための成熟ｍｉＲＮＡを生成するための）は、米国特許第７，７８６，３５０号及び米国特許第８，４１０，３３４号に開示されている。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性活性成分は、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、又は広範囲の活性を有する成分の群から選択される。選択的除草活性を有する成分は、ハマウツボ（オロバンチェ属（Ｏｒｏｂａｎｃｈｅ ｓｐｐ．））などの寄生植物を標的とすることができる。この態様のさらなる実施形態では、組成物は、種子処理剤として製剤化される。この態様のいくつかの実施形態では、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分は、種子１００ｋｇ当たり約１ｇ～約１０ｇの量で存在する。この態様のいくつかの実施形態では、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分は、約１×１０^４粒子／種子の量で存在する。この態様のさらなる実施形態では、組成物は根浸漬剤として製剤化される。この態様のいくつかの実施形態では、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分は、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ活性成分／Ｌ存在する。この態様のいくつかの実施形態では、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分は、約１×１０^３～約１×１０^３粒子／植物根系で存在する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、ミニ細胞粒子濃度は１×１０^２～約８×１０^１４である。この態様のいくつかの実施形態では、ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分（例えば、ミニ細胞内又はミニ細胞膜に付着した）の殺有害生物活性は、同じ有害生物を標的とする。この態様の他の実施形態では、ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分（例えば、ミニ細胞内又はミニ細胞膜に付着した）の殺有害生物活性は、異なる有害生物を標的とする。担体相中に分散した外因性成分を有する、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分（例えば、ミニ細胞内又はミニ細胞膜に付着した）の殺有害生物活性と、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性は、同じ有害生物を標的とする。担体相中に分散した外因性成分を有する、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分（例えば、ミニ細胞内、又はミニ細胞膜に付着した）の殺有害生物活性と、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性有害生物活性成分の殺有害生物活性は、異なる有害生物を標的とする。

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）及びセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性ミニ細胞は安定なままであり、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも１３ヶ月間、殺有害生物活性を保持する。

本開示のさらに別の態様は、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来する複数の乾燥殺有害生物性ミニ細胞を含む水和剤を含み、水和剤は、組成物が植物に施用された際に、植物内又は植物上の少なくとも１つの有害生物を防除するための殺有害生物性組成物を作り出すために、水性担体中に分散するように構成されている。この態様のいくつかの実施形態は、粘土成分、カオリン成分、タルク成分、白亜成分、カルサイト成分、石英成分、軽石成分、珪藻土成分、バーミキュライト成分、ケイ酸塩成分、二酸化ケイ素成分、シリカ粉末成分、アルミニウム成分、硫酸アンモニウム成分、リン酸アンモニウム成分、炭酸カルシウム成分、尿素成分、糖成分、デンプン成分、おがくず成分、粉砕ココナッツ殻成分、粉砕コーンコブ成分、及び粉砕タバコ柄成分のうちの少なくとも１つを含む、農薬的に許容される固体担体成分をさらに含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、水性担体は水を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、防除は、組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物上の有害生物数の減少、及び組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物への物理的損傷の減少のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態では、物理的損傷は食害及び穿孔損傷を含む。物理的損傷は、かまれた又は破れた葉、欠落した葉、葉のトンネル、茎の穴、葉の歪み、葉の変色、葉の斑点、しおれ、発育阻害、帯状又は死滅した茎、黄変、破損、又は根の損傷を含むが、これらに限定されない、様々な植物表現型において現れ得る。この態様のさらなる実施形態では、有害生物数の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも３５％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも４５％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも５５％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも６５％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも７５％の減少、又は少なくとも８０％の減少であり、物理的損傷の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも３５％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも４５％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも５５％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも６５％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも７５％の減少、又は少なくとも８０％の減少である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム（Ａｓｉａｎ ｓｐｏｔｔｅｄ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）又はセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）からなる群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、親細菌の細胞分割機能を改変することは、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つのレベル又は活性を改変することを含む。この態様のさらなる実施形態では、ｚリング阻害タンパク質は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子は、ｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構構成要素は、ｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。改変は、過剰発現又は過小発現（例えば、突然変異、欠失など）を含み得る。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌はｆｔｓＺポリペプチドの過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの過小発現を含む。

本開示のさらなる態様は、種子と、種子を覆うコーティングとを含む植物用組成物を含み、コーティングは、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来する複数の殺有害生物性ミニ細胞を含み、前記複数の殺有害生物性ミニ細胞は、種子又はそれから出現する実生を摂食する少なくとも１つの有害生物に対して殺有害生物活性をもたらすのに十分な粒子濃度で存在する。この態様のいくつかの実施形態では、親細菌の細胞分割機能における改変は、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含む。この態様のさらなる実施形態では、ｚリング阻害タンパク質は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子は、ｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構構成要素は、ｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。改変は、過剰発現又は過小発現（例えば、突然変異、欠失など）を含み得る。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌はｆｔｓＺポリペプチドの過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの過小発現を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・スピノセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓｅ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、乳化病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、キセノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・エントモファーガ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ）、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．）、クロモバクテリウム・サブツガエ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の群から選択される。この態様のさらなる実施形態では、殺有害生物性親細菌は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＴＩ４７７、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ６６３３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ２１３３２、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ９９４３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＳＴ７１３、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＣＩＢ３６１０、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０２Ａ ＤＳＭ３２０１９、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０３ ＤＳＭ３２２８５、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０５ ＤＳＭ２４９１８、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＲＴＩ３０１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ２４、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ４２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＢＡ－１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＬＭＧ５－２９０３２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＭＢＩ６００、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＣＥＣＴ８８３６、又はバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株Ｍ４（Ｓ４９９）の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、コーティングは、約１×１０^２～約１×１０^９粒子／種子の粒子濃度を含み、濃度は、種子の大きさに基づいて決定される。この態様のさらなる実施形態では、粒子濃度は約１×１０^４粒子／種子を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）又はセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、種子は、ダイズ、イチゴ、クロスグリ、ホワイトカラント、アカフサスグリ、ブラックベリー、ラズベリー、トマト、コショウ、チリ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、レタス、チコリー、アブラナ属、トウモロコシ、コムギ、イネ、キャノーラ、メロン、ケール、ニンジン、又はマメの群から選択される植物である。

本開示のさらなる態様は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、ｍｉｎＥポリペプチド、ｆｔｓＺポリペプチド、ｆｔｓＡポリペプチド、ｐａｒＡポリペプチド、ｐａｒＢポリペプチド、ＤｉｖＩＶＡポリペプチド、又はそれらの組み合わせの群から選択される１つ以上の細胞分割機能因子のレベル又は活性の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む殺有害生物性親細菌に由来する、殺有害生物性ミニ細胞を含む殺有害生物性組成物を含む。改変は、過剰発現又は過小発現（例えば、突然変異、欠失など）を含み得る。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌はｆｔｓＺポリペプチドの過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの過小発現を含む。この態様のいくつかの実施態様では、殺有害生物性ミニ細胞は、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性ミニ細胞は、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素及び外因性の殺有害生物性核酸のいずれか又は両方を発現するようにコードされた外因性発現カセットをさらに含む。外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性殺有害生物活性成分は、ミニ細胞内にあるか、ミニ細胞膜に付着している。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素は、Ｐｉｒ毒素又はＣｒｙ毒素のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）である。この態様のいくつかの実施形態では、外因性の殺有害生物性活性成分は、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、又は広範囲の活性を有する成分の群から選択される。選択的除草活性を有する成分は、ハマウツボ（オロバンチェ属（Ｏｒｏｂａｎｃｈｅ ｓｐｐ．））などの寄生植物を標的とすることができる。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性は、同じ有害生物を標的とする。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性は、異なる有害生物を標的とする。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）又はセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、殺有害生物性ミニ細胞は安定なままであり、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも１３ヶ月間、殺有害生物活性を保持する。

有効量は、粒子の数、好ましくは殺有害生物性親細胞又は殺有害生物性ミニ細胞の活性粒子の数によって測定することができる。親細胞の活性粒子の数は、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を評価することによって測定することができる。ミニ細胞の活性粒子の数は、フローサイトメトリーのような技術を用いてミニ細胞小胞の数を計数することによって測定することができる。

種子処理として使用される場合、本開示の組成物は、種子の大きさに応じて、約１×１０^２～約１×１０^９粒子／種子の割合で施用される。いくつかの実施形態では、施用量は、１×１０^４～約１×１０^７粒子／種子である。いくつかの実施形態では、施用量は、約１×１０^２～約１×１０^８、約１×１０^２～約１×１０^７、約１×１０^２～約１×１０^６、約１×１０^２～約１×１０^５、約１×１０^２～約１×１０^４、約１×１０^２～約１×１０^３、約１×１０^３～約１×１０^５又は好ましくは約１×１０^４粒子／種子である。前記組成物を少なくとも１つの追加の活性成分（“ａｉ”）と組み合わせるか又は使用する場合、少なくとも１つの追加の活性成分は、約０．００１～約１０００グラム、約０．０１～約５００グラム、約０．１～約３００グラム、約１～約１００グラム、約１～約５０グラム、約１～約２５グラム、好ましくは約１～約１０グラム／１００ｋｇ種子、及び／又は約１×１０^２～約１×１０^８、約１×１０^２～約１×１０^７、約１×１０^２～約１×１０^６、約１×１０^２～約１×１０^５、約１×１０^２～約１×１０^４、約１×１０^２～約１×１０^３、約１×１０^３～約１×１０^５、若しくは好ましくは約１×１０^４粒子／種子の量で存在し得る。

本組成物は、約１×１０^３～約１×１０^８粒子／植物根系の割合で根浸漬剤として施用することもできる。前記組成物が少なくとも１つの追加の活性成分と組み合わされるか又は使用される場合、少なくとも１つの追加の活性成分は、約０．００１～約１０００ｍｇ、約０．０１～約５００、約０．１～約４００、約１～約３００、約１０～約２５０、好ましくは約２５～約２００ｍｇ ａｉ／Ｌ、及び／又は約１×１０^３～約１×１０^８粒子／植物根系の量で存在し得る。

土壌処理剤として使用される場合、本開示の組成物は、土壌表面灌注（ｓｏｉｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｒｅｎｃｈ）、シャンクイン（ｓｈａｎｋｅｄ－ｉｎ）、畝間（ｉｎ－ｆｕｒｒｏｗ）注入及び／若しくは施用として、又は潅漑水との混合によって施用することができる。植え付け時、播種中若しくは播種後、又は移植後、及び植物成長の任意の段階で施用することができる、灌注土壌処理のための施用量は、約４×１０^７～約８×１０^１４、約４×１０^９～約８×１０^１３、約４×１０^１１～約８×１０^１２ 約２×１０^１２～約６×１０^１３、約２×１０^１２～約３×１０^１３、又は約４×１０^１３～約２×１０^１４粒子／エーカー（１．６×１０^７～３．２×１０^１４、１．６×１０^９～３．２×１０^１３、１．６×１０^１１～３．２×１０^１２、８×１０^１１～２．４×１０^１３、８×１０^１１～１．２×１０^１３又は１．６×１０^１３～８×１０^１３粒子／ｈａ）である。いくつかの実施形態では、施用量は、約１×１０^１２～約６×１０^１２又は約１×１０^１３～約６×１０^１３粒子／エーカー（４×１０^１１～２．４×１０^１２又は４×１０^１２～２．４×１０^１３粒子／ｈａ）である。植え付け時に施用される畝間処理のための施用量は、約２．５×１０^１０～約５×１０^１１粒子／１０００作条フィート（８．３×１０^９～１．７×１０^１１粒子／１０００作条ｍ）である。いくつかの実施形態では、施用量は、約６×１０^１０～約３×１０^１２、約６×１０^１０～約４×１０^１１、約６×１０^１１～約３×１０^１２、又は約６×１０^１１～約４×１０^１２粒子／１０００作条フィート（２×１０^１０～１０^１２、２０×１０^１０～１．３×１０^１１、２×１０^１１～１０^１２又は２×１０^１１～１．３×１０^１２粒子／１０００作条ｍ））である。土壌中にシャンク又は注入される場合の施用量は、約４×１０^７～約８×１０^１４、約４×１０^１３～約２×１０^１４ 約４×１０^８～約８×１０^１３、約４×１０^９～約８×１０^１２ 約２×１０^１０～約６×１０^１１、約４×１０^７～約８×１０^１３、約４×１０^７～約８×１０^１２、約４×１０^７～約８×１０^１１、約４×１０^７～約８×１０^１０、約４×１０^７～約８×１０^９、又は約４×１０^７～約８×１０^８粒子／エーカー（１．６×１０^７～３．２×１０^１４、１．６×１０^１３～８×１０^１３、１．６×１０^８～３．２×１０^１３、１．６×１０^９～３．２×１０^１２、８×１０^９～２．４×１０^１１、１．６×１０^７～３．２×１０^１３、１．６×１０^７～３．２×１０^１２、１．６×１０^７～３．２×１０^１１、１．６×１０^７～３．２×１０^１０、１．６×１０^７～３．２×１０^９、１．６×１０^７～３．２×１０^８粒子／ｈａ）である。

当業者は、ブロードキャスト処理（施用がより低い割合であるが、より頻繁に行われる）及び他のあまり一般的でない土壌処理のために割合を調整する方法を理解するであろう。前記組成物が、少なくとも１つの追加の活性成分と組み合わされるか、又は使用される場合、少なくとも１つの追加の活性成分は、約１０～約１，０００、約１０～約７５０、約１０～約５００、約２５～約５００、約２５～約２５０、好ましくは約５０～約２００ｇのａｉ／ｈａ、及び／又は約４×１０^７～約８×１０^１４、約４×１０^１３～約２×１０^１４、約４×１０^８～約８×１０^１３、約４×１０^９～約８×１０^１２ 約２×１０^１０～約６×１０^１１、約４×１０^７～約８×１０^１３、約４×１０^７～約８×１０^１２、約４×１０^７～約８×１０^１１、約４×１０^７～約８×１０^１０、約４×１０^７～約８×１０^９、若しくは約４×１０^７～約８×１０^８粒子／エーカー（１．６×１０^７～３．２×１０^１４、１．６×１０^１３～８×１０^１３、１．６×１０^８～３．２×１０^１３、１．６×１０^９～３．２×１０^１２、８×１０^９～２．４×１０^１１、１．６×１０^７～３．２×１０^１３、１．６×１０^７～３．２×１０^１２１．６×１０^７～３．２×１０^１１、１．６×１０^７～３．２×１０^１０、１．６×１０^７～３．２×１０^９、１．６×１０^７～３．２×１０^８粒子／ｈａ）の量で存在することができる。

本開示の組成物は、植え付け前又は種子の発芽前に土壌に導入することができる。本開示の組成物はまた、植物の場所、植物の根と接触する土壌、植物の基部の土壌、又は植物の基部の周囲の土壌（例えば、植物の基部の約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約２５ｃｍ、約３０ｃｍ、約３５ｃｍ、約４０ｃｍ、約４５ｃｍ、約５０ｃｍ、約５５ｃｍ、約６０ｃｍ、約６５ｃｍ、約７０ｃｍ、約７５ｃｍ、約８０ｃｍ、約８５ｃｍ、約９０ｃｍ、約９５ｃｍ、約１００ｃｍ、若しくはそれ以上の距離以内の周囲又は下方）に導入することができる。組成物は、滴下潅漑、スプリンクラー、土壌注入又は土壌灌注を含むが、これらに限定されない様々な技術を利用することによって施用することができる。組成物はまた、異なる植物の場所に移植する前に、プラグトレイ内の土壌及び／若しくは植物に、又は実生に施用されてもよい。植物の根と接触している土壌、植物の基部、又は植物の基部の周囲の特定の距離内の土壌に施用する場合（土壌浸漬処理としてを含む）、組成物は、単一の施用として又は複数の施用として施用することができる。組成物（少なくとも１つの追加の活性成分を有するものを含む）は、灌漑処理について上記に示した量で、又は約１×１０^５～約１×１０^８粒子／土壌グラム、１×１０^５～約１×１０^７粒子／土壌グラム、１×１０^５～約１×１０^６粒子／土壌グラム、７×１０^５～約１×１０^７粒子／土壌グラム、１×１０^６～約５×１０^６粒子／土壌グラム、若しくは１×１０^５～約３×１０^６粒子／土壌グラム、及び／又は約４×１０^７～約８×１０^１４、約４×１０^８～約８×１０^１３、約４×１０^９～約８×１０^１２約２×１０^１０～約６×１０^１１、約４×１０^７～約８×１０^１３、約４×１０^７～約８×１０^１２、約４×１０^７～約８×１０^１１、約４×１０^７～約８×１０^１０、約４×１０^７～約８×１０^９、若しくは約４×１０^７～約８×１０^８粒子／エーカー（１．６×１０^７～３．２×１０^１４、１．６×１０^１３～８×１０^１３、１．６×１０^８～３．２×１０^１３、１．６×１０^９～３．２×１０^１２、８×１０^９～２．４×１０^１１、１．６×１０^７～３．２×１０^１３、１．６×１０^７～３．２×１０^１２、１．６×１０^７３．２×１０^１１１．６×１０^７～３．２×１０^１０、１．６×１０^７～３．２×１０^９、１．６×１０～３．２×１０^８粒子／ｈａ）の量で施用され得る。一実施形態では、本開示の組成物は、１ｇの土壌当たり約７×１０^５～約１×１０^７粒子の割合で単一施用として施用される。別の実施形態では、本開示の組成物は、１ｇの土壌当たり約１×１０^６～約５×１０^６粒子の割合で単一施用として施用される。他の実施形態では、本開示の組成物は、１ｇの土壌当たり約１×１０^５～約３×１０^６の割合で複数の施用として施用される。

殺有害生物性ミニ細胞の作製方法
本開示のさらなる態様は、（ａ）親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む殺有害生物性親細菌を提供する工程；（ｂ）殺有害生物性ミニ細胞の形成を可能にする条件下で殺有害生物性親細菌を増殖させる工程；並びに（ｃ）遠心分離、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、又はＴＦＦ及び遠心分離を使用して殺有害生物性ミニ細胞を精製する工程を含む、殺有害生物性ミニ細胞を作製する方法を含む。この態様のいくつかの実施態様では、工程（ｃ）は、１リットル当たり約１０^１０の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１１の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１２の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１３の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１４の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１５の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１６の殺有害生物性ミニ細胞、又は１リットル当たり約１０^１７の殺有害生物性ミニ細胞を生成する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態は、殺有害生物性ミニ細胞を乾燥させて、保存安定性の殺有害生物性ミニ細胞組成物を生成する工程（ｄ）をさらに含む。この態様のいくつかの実施形態では、保存安定性殺有害生物性ミニ細胞組成物は、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも１３ヶ月間、殺有害生物活性を保持する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、親細菌の細胞分割機能における改変は、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含む。この態様のさらなる実施形態では、ｚリング阻害タンパク質は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子は、ｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構構成要素は、ｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。改変は、過剰発現又は過小発現（例えば、突然変異、欠失など）を含み得る。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ｆｔｓＺポリペプチドの過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの過小発現を含む。

殺有害生物性ミニ細胞生成親細菌
本開示のさらなる態様は、（ｉ）殺有害生物性親細菌が親細菌の細胞分割機能を改変する遺伝子突然変異を含み、（ｉｉ）殺有害生物性親細菌が１００ｍｇ／ｋｇ未満の少なくとも１つの植物有害生物に対するＬＤ５０を有する商業的に関連する殺有害生物活性を示す、殺有害生物性ミニ細胞生成親細菌を含む。この態様の他の実施形態では、親細菌の細胞分割機能を改変することは、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つのレベル又は活性を改変することを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、ｚリング阻害タンパク質は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、又はｍｉｎＥポリペプチドの群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子は、ｍｉｎＥポリペプチド又はＤｉｖＩＶＡポリペプチドの群から選択され、隔壁機構構成要素は、ｆｔｓＺポリペプチド又はｆｔｓＡポリペプチドの群から選択される。改変は、過剰発現又は過小発現（例えば、突然変異、欠失など）を含み得る。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌はｆｔｓＺポリペプチドの過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、殺有害生物性親細菌は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの過小発現を含む。例示的な殺有害生物性ミニ細胞生成親細菌を表１Ａ～１Ｂに提供する。

有害生物を防除する方法
本開示のさらに別の態様は、有害生物を防除する方法を含み、この方法は、前述の実施形態のいずれか１つの殺有害生物性組成物を、植物又は植え付けられる領域に施用することを含む。この態様のいくつかの実施形態では、施用は、注入施用、葉面施用、発芽前施用、又は発芽後施用のうちの少なくとも１つを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、防除は、組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物上の有害生物数の減少、及び組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物への物理的損傷の減少のうちの少なくとも１つを含む。この態様のいくつかの実施形態では、物理的損傷は、食害及び穿孔損傷を含む。物理的損傷は、かまれた又は破れた葉、欠落した葉、葉のトンネル、茎の穴、葉の歪み、葉の変色、葉の斑点、しおれ、発育阻害、帯状若しくは死滅した茎、黄変、破損、又は根の損傷を含むが、これらに限定されない、様々な植物表現型において現れ得る。この態様のさらなる実施形態では、有害生物数の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも３５％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも４５％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも５５％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも６５％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも７５％の減少、又は少なくとも８０％の減少であり、物理的損傷の減少は、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも３５％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも４５％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも５５％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも６５％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも７５％の減少、又は少なくとも８０％の減少である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様の他の実施形態では、組成物は、使用準備完了（ＲＴＵ）製剤、懸濁濃縮物、タンクミックス、エアロゾル、種子処理剤、根浸漬剤、土壌処理剤、潅漑製剤、スプリンクラー製剤、又は灌注処理剤のうちの少なくとも１つとして製剤化される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施形態では、有害生物は、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）又はセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）の群から選択される。

定義
本明細書で使用される「防除」という用語は、植物有害生物の任意の又は全ての生活段階の死滅、数の減少、及び／若しくは成長、摂食若しくは正常な生理学的発達の減少、並びに／又は植物有害生物感染及び／若しくは寄生の影響の減少を意味する。有効量は、有害生物の成長、摂食、根の浸透、根の成熟、及び／又は植物有害生物感染から生じる一般的な正常な生理学的発達及び／又は症状を顕著に減少させることができる量である。いくつかの実施形態では、植物有害生物感染から生じる症状及び／又は植物有害生物粒子の数は、未処理対照に対して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。

線虫有害生物については、本明細書で使用される「防除」という用語は、線虫の任意の又は全ての生活段階の死滅、数の減少、及び／若しくは成長、摂食若しくは正常な生理学的発達（ネコブセンチュウについては根に侵入し、根内で発達する能力を含む）の減少、線虫感染及び／若しくは寄生の影響（例えば、かじり、侵入及び／又は根内での発達）の減少、線虫による感染及び／若しくは寄生に対する植物の抵抗性、線虫感染及び／若しくは寄生の影響（例えば、かじり及び／又は侵入）に対する植物の抵抗性、線虫による感染及び／若しくは寄生に対する植物の耐性、線虫感染及び／若しくは寄生の影響（例えば、かじり及び／又は侵入）に対する植物の耐性、又はそれらの任意の組み合わせを意味する。寄生線虫に対する植物の抵抗性及び耐性は、Ｔｒｕｄｇｉｌｌ，Ｄ．Ｌ．”Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｎｄ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｒａｓｉｔｉｃ Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ．”Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１９９１；２９：１６７－１９２（これは、それが教示する全てについて、参照により具体的且つ完全に本明細書に組み込まれる）によって示されるように、当業者に知られている。有効量は、有害生物の成長、摂食、根の浸透、根の成熟、並びに／又は線虫感染から生じる一般的な正常な生理学的発達及び症状を顕著に減少させることができる量である。いくつかの実施形態では、症状及び／又は線虫は、未処置対照に対して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。

「ミニ細胞」という用語は、少なくとも１つの膜を含み、カーゴ（例えば、核酸、プラスミド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、アミノ酸、小分子、遺伝子編集系、ホルモン、免疫調節剤、炭水化物、脂質、有機粒子、無機粒子、又はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）のうちの１つ以上）を含むのに適した内部容積を有する、無染色体非複製包囲膜系を指す。ミニ細胞は異常な細胞分裂の産物であり、ＲＮＡ及びタンパク質を含むが、染色体ＤＮＡをほとんど又は全く含有しない無染色体細胞である。ミニ細胞は、プラスミド指向性合成が可能である。ミニ細胞は、好ましくは例えば、親細胞の細胞分裂機構を破壊する親細胞の遺伝子操作を使用して、親細菌細胞（例えば、グラム陰性又はグラム陽性細菌細胞）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ミニ細胞は、親細胞表面の１つ以上の内因性又は異種性の特徴、例えば、細胞壁、細胞壁修飾、鞭毛、若しくは線毛、及び／又は親細胞の内部容積の１つ以上の内因性又は異種性の特徴、例えば、核酸、プラスミド、タンパク質、小分子、転写機構、若しくは翻訳機構を含み得る。他の実施形態では、ミニ細胞は、親細胞の１つ以上の特徴を欠いていてもよい。さらに他の実施形態では、ミニ細胞は、親細胞に含まれない特徴を装填されるか、又はそうでなければ該特徴で修飾され得る。

「殺有害生物性ミニ細胞」は、殺有害生物性親細菌細胞から得られるミニ細胞を指す。好ましい実施形態では、殺有害生物性ミニ細胞は、特許細菌細胞の殺有害生物活性の全部又は一部を保持する。

「殺有害生物性親細菌細胞」は、植物有害生物に対して直接的な毒性活性を有する親細菌細胞を指す。直接的な毒性活性は、作物植物との相互作用を必要とすることなく、植物有害生物を死滅させることができることを意味する。好ましい実施形態では、殺有害生物性親細胞のＬＤ５０は、１００ｍｇ／ｋｇ未満である。ＬＤ５０は、試験標的有害生物群の５０％（半分）の死亡を引き起こす、全て一度に与えられる、物質の量である。

本明細書で使用される場合、「親細菌細胞」という用語は、ミニ細胞が由来する細胞（例えば、グラム陰性又はグラム陽性細菌細胞）を指す。親細菌細胞は、典型的には生存細菌細胞である。「生存細菌細胞」という用語は、ゲノムを含み、細胞分裂が可能な細菌細胞を指す。好ましい親細菌細胞を表２Ａに示す。親細菌細胞は、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む。

「細胞分裂トポロジー特異性因子」という用語は、細菌種における細胞分裂機構の構成要素を指し、これは、隔壁の場所の決定に関与し、細胞分裂機構の他の構成要素の位置を制限することによって、例えば、１つ以上のＺリング阻害タンパク質の位置を制限することによって機能する。例示的な細胞分裂トポロジー特異性因子としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において最初に発見され、広範囲のグラム陰性細菌種及びグラム陽性細菌種において以来同定されているｍｉｎＥが挙げられる（Ｒｏｔｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：９５９－９６８，２００５）。ｍｉｎＥは、Ｚリング阻害タンパク質ｍｉｎＣ及びｍｉｎＤを細胞の極に制限することによって機能する。第２の例示的な細胞分裂トポロジー特異性因子は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において最初に発見されたＤｉｖＩＶＡである（Ｒｏｔｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：９５９－９６８，２００５）。

「Ｚリング阻害タンパク質」という用語は、細菌種における細胞分裂機構の構成要素を指し、これは、隔壁の場所の決定に関与し、安定なＦｔｓＺリングの形成を阻害することによって、又はそのような構成要素を膜に固定することによって機能する。Ｚリング阻害タンパク質の局在化は、細胞分裂トポロジー特異性因子、例えば、ＭｉｎＥ及びＤｉｖＩＶＡによって調節され得る。例示的なＺリング阻害タンパク質としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において最初に発見され、広範囲のグラム陰性細菌種及びグラム陽性細菌種において以来同定されているｍｉｎＣ及びｍｉｎＤが挙げられる（Ｒｏｔｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：９５９－９６８，２００５）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の種において、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、及びｍｉｎＥは、「ｍｉｎオペロン」、ｍｉｎＣＤＥオペロン、又はｍｉｎ若しくはｍｉｎＣＤＥ遺伝子座と称され得る同じ遺伝子座に存在する。

列挙された実施形態
以下に列挙された実施形態は、本発明のいくつかの態様を代表するものである。
１．殺有害生物性組成物であって、
液体担体相、及び
担体相中に分散した複数の殺有害生物性ミニ細胞
を含み、
複数の殺有害生物性ミニ細胞が、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来し、
複数の殺有害生物性ミニ細胞が、組成物が植物に施用された際に、植物中又は植物上の少なくとも１つの有害生物を防除するのに十分な粒子濃度で存在する、殺有害生物性組成物。
２．防除が以下の少なくとも１つを含む、実施形態１の殺有害生物性組成物：
組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物上の有害生物数の減少、及び
組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の、植物に対する物理的損傷の減少。
３．有害生物数の減少が、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少であり、
物理的損傷の減少が、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少である、実施形態２の殺有害生物性組成物。
４．複数の殺有害生物性ミニ細胞の少なくとも一部が、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分の少なくとも１つをさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
５．複数の殺有害生物性ミニ細胞の一部が、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素及び外因性の殺有害生物性核酸のいずれか又は両方を発現するようにコードされた外因性発現カセットをさらに含む、実施形態４の殺有害生物性組成物。
６．外因性の殺有害生物性タンパク質毒素が、Ｐｉｒ毒素及びＣｒｙ毒素のうちの少なくとも１つを含む、実施形態４又は５の殺有害生物性組成物。
７．外因性の殺有害生物性核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）である、実施形態４又は５の殺有害生物性組成物。
８．外因性の殺有害生物性活性成分が、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、及び広範囲の活性を有する成分からなる群から選択される、実施形態４の殺有害生物性組成物。
９．親細菌の細胞分割機能における改変が、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含む、実施形態１～８のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
１０．ｚリング阻害タンパク質が、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドからなる群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子が、ｍｉｎＥポリペプチド及びＤｉｖＩＶＡポリペプチドからなる群から選択され、隔壁機構構成要素が、ｆｔｓＺポリペプチド及びｆｔｓＡポリペプチドからなる群から選択される、実施形態９の殺有害生物性組成物。
１１．殺有害生物性親細菌が、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・スピノセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓｅ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、乳化病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、キセノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・エントモファーガ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ）、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．）、クロモバクテリウム・サブツガエ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からなる群から選択される、実施形態１～１０のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
１２．殺有害生物性親細菌が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＴＩ４７７、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ６６３３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ２１３３２、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ９９４３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＳＴ７１３、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＣＩＢ３６１０、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０２Ａ ＤＳＭ３２０１９、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０３ ＤＳＭ３２２８５、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０５ ＤＳＭ２４９１８、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＲＴＩ３０１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ２４、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ４２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＢＡ－１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＬＭＧ５－２９０３２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＭＢＩ６００、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＣＥＣＴ８８３６、及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株Ｍ４（Ｓ４９９）からなる群から選択される、実施形態１１の殺有害生物性組成物。
１３．殺有害生物性親細菌が、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）であり、殺有害生物性ミニ細胞が、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素Ｐｉｒを含む、実施形態１～１１のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
１４．殺有害生物性親細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、殺有害生物性ミニ細胞が外因性の殺有害生物性分子を含む、実施形態１～１１のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
１５．殺有害生物性親細菌が、１つ以上の外因性の殺有害生物性活性成分を発現する遺伝子改変大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、実施形態１～１０のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
１６．組成物が、葉面処理、注入処理、発芽前処理、及び発芽後処理の少なくとも１つとして植物に施用される、実施形態１～１５のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
１７．組成物が、使用準備完了（ＲＴＵ）製剤、懸濁濃縮物、タンクミックス、エアロゾル、種子処理剤、根浸漬剤、土壌処理剤、潅漑製剤、スプリンクラー製剤、及び灌注処理剤のうちの少なくとも１つとして製剤化される、実施形態１～１６のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
１８．組成物が種子処理剤として製剤化される、実施形態１７の殺有害生物性組成物。
１９．組成物が、約１×１０^２～約１×１０^９粒子／種子の割合で施用され、割合が種子の大きさに基づいて決定される、実施形態１８の殺有害生物性組成物。
２０．組成物が、約１×１０^４粒子／種子の割合で施用される、実施形態１９の殺有害生物性組成物。
２１．組成物が、根浸漬剤として製剤化される、実施形態１７の殺有害生物性組成物。
２２．組成物が、約１×１０^３～約１×１０^８粒子／植物根系の割合で施用される、実施形態２１の殺有害生物性組成物。
２３．農薬界面活性剤をさらに含み、農薬界面活性剤が、噴霧性、展延性、及び注入性の特徴の少なくとも１つを改善する、実施形態１～２２のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
２４．液体担体相が、水性又は油性である、実施形態１～２３のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
２５．担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分の少なくとも１つをさらに含む、実施形態１～２４のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
２６．外因性の殺有害生物性タンパク質毒素が、Ｐｉｒ毒素及びＣｒｙ毒素を含む、実施形態２５の殺有害生物性組成物。
２７．外因性の殺有害生物性核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）若しくはその前駆体、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）若しくはその前駆体、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）若しくはその前駆体である、実施形態２５の殺有害生物性組成物。
２８．外因性の殺有害生物性活性成分が、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、及び広範囲の活性を有する成分からなる群から選択される、実施形態２５の殺有害生物性組成物。
２９．組成物が種子処理剤として製剤化される、実施形態２５～２８のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
３０．担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分が、種子１００ｋｇ当たり約１ｇ～約１０ｇの量で存在する、実施形態２９の殺有害生物性組成物。
３１．担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分が、約１×１０^４粒子／種子の量で存在する、実施形態２９の殺有害生物性組成物。
３２．組成物が根浸漬剤として製剤化される、実施形態２５～２８のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
３３．担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分が、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ活性成分／Ｌで存在する、実施形態３２の殺有害生物性組成物。
３４．担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分が、約１×１０^３～約１×１０^３の粒子／植物根系の量で存在する、実施形態３２の殺有害生物性組成物。
３５．ミニ細胞粒子濃度が約１×１０^２～約８×１０^１４である、実施形態１～３４のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
３６．ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が、同じ有害生物を標的とする、実施形態４～３５のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
３７．ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が、異なる有害生物を標的とする、実施形態４～３５のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
３８．外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性と、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が同じ有害生物を標的とする、実施形態２５～３７のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
３９．外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性と、担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が異なる有害動植物を標的とする、実施形態２５～３７のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
４０．少なくとも１つの有害生物が、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）及びセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）からなる群から選択される、実施形態１～３９のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
４１．殺有害生物性ミニ細胞が安定なままであり、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、又は少なくとも１３ヶ月間、殺有害生物活性を保持する、実施形態１～４０のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
４２．殺有害生物性ミニ細胞を作製する方法であって、
ａ）親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む殺有害生物性親細菌を提供する工程と、
ｂ）殺有害生物性ミニ細胞の形成を可能にする条件下で、殺有害生物性親細菌を増殖させる工程と、
ｃ）遠心分離、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、又はＴＦＦ及び遠心分離を用いて殺有害生物性ミニ細胞を精製する工程と、
を含む、方法。
４３．工程（ｃ）が、１リットル当たり約１０^１０の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１１の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１２の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１３の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１４の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１５の殺有害生物性ミニ細胞、１リットル当たり約１０^１６の殺有害生物性ミニ細胞、又は１リットル当たり約１０^１７の殺有害生物性ミニ細胞を生成する、実施形態４２の方法。
４４．工程（ｄ）殺有害生物性ミニ細胞を乾燥させて、保存安定性の殺有害生物性ミニ細胞組成物を生成する工程をさらに含む、実施形態４２又は実施形態４３の方法。
４５．保存安定性殺有害生物性ミニ細胞組成物が、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも１３ヶ月間、殺有害生物活性を保持する、実施形態４４の方法。
４６．親細菌の細胞分割機能における改変が、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含む、実施形態４２～４５のいずれか１つの方法。
４７．ｚリング阻害タンパク質が、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドからなる群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子が、ｍｉｎＥポリペプチド及びＤｉｖＩＶＡポリペプチドからなる群から選択され、隔壁機構構成要素が、ｆｔｓＺポリペプチド及びｆｔｓＡポリペプチドからなる群から選択される、実施形態４６の方法。
４８．殺有害生物性ミニ細胞生成親細菌であって、
（ｉ）殺有害生物性親細菌が、親細菌の細胞分割機能を改変する遺伝子突然変異を含み、
（ｉｉ）殺有害生物性親細菌が、１００ｍｇ／ｋｇ未満の少なくとも１つの植物有害生物に対するＬＤ５０を有する商業的に関連する殺有害生物活性を示す、殺有害生物性ミニ細胞生成親細菌。
４９．親細菌の細胞分割機能を改変することが、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素の少なくとも１つのレベル又は活性を改変することを含む、実施形態４８の殺有害生物性ミニ細胞生成親細菌。
５０．ｚリング阻害タンパク質が、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドからなる群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子が、ｍｉｎＥポリペプチド及びＤｉｖＩＶＡポリペプチドからなる群から選択され、隔壁機構構成要素が、ｆｔｓＺポリペプチド及びｆｔｓＡポリペプチドからなる群から選択される、実施形態４８又は実施形態４９の殺有害生物性ミニ細胞生成親細菌。
５１．有害生物の防除方法であって、
実施形態１～４１のいずれか１つの殺有害生物性組成物を、植物又は植え付けられる領域に施用すること、を含む方法。
５２．施用が、注入施用、葉面施用、発芽前施用、又は発芽後施用のうちの少なくとも１つを含む、実施形態５１の方法。
５３．防除が、以下のうちの少なくとも１つを含む、実施形態５１又は実施形態５２の方法：
組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物上の有害生物数の減少、及び
組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物に対する物理的損傷の減少。
５４．有害生物数の減少が、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少であり、物理的損傷の減少が、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少である、実施形態５３の方法。
５５．組成物が、使用準備完了（ＲＴＵ）製剤、懸濁濃縮物、タンクミックス、エアロゾル、種子処理剤、根浸漬剤、土壌処理剤、潅漑製剤、スプリンクラー製剤、又は灌注処理剤のうちの少なくとも１つとして製剤化される、実施形態５１～５４のいずれか１つの方法。
５６．有害生物が、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）及びセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）からなる群から選択される、実施形態５１～５５のいずれか１つの方法。
５７．水和剤であって、
親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来する複数の乾燥殺有害生物性ミニ細胞、
を含み、
組成物が植物に施用された際に、植物中又は植物上の少なくとも１つの有害生物を防除するための殺有害生物性組成物を作り出すために、水性担体中に分散するように構成されている、水和剤。
５８．粘土成分、カオリン成分、タルク成分、白亜成分、カルサイト成分、石英成分、軽石成分、珪藻土成分、バーミキュライト成分、ケイ酸塩成分、二酸化ケイ素成分、シリカ粉末成分、アルミニウム成分、硫酸アンモニウム成分、リン酸アンモニウム成分、炭酸カルシウム成分、尿素成分、糖成分、デンプン成分、おがくず成分、粉砕ココナッツ殻成分、粉砕コーンコブ成分、及び粉砕タバコ茎成分のうちの少なくとも１つを含む農薬的に許容される固体担体成分をさらに含む、実施形態５７の水和剤。
５９．水性担体が水を含む、実施形態５７又は実施形態５８の水和剤。
６０．防除が以下の少なくとも１つを含む、実施形態５７～５９のいずれか１つの水和剤：
組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物上の有害生物数の減少、及び
組成物で処理されていないチェック植物と比較した場合の植物に対する物理的損傷の減少。
６１．有害生物数の減少が、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少であり、物理的損傷の減少が、少なくとも１０％の減少、少なくとも１５％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも２５％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、又は少なくとも８０％の減少である、実施形態６０の水和剤。
６２．少なくとも１つの有害生物が、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）及びセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）からなる群から選択される、実施形態５７～６１のいずれか１つの水和剤。
６３．親細菌の細胞分割機能を改変することが、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つのレベル又は活性を改変することを含む、実施形態５７～６２のいずれか１つの水和剤。
６４．ｚリング阻害タンパク質が、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドからなる群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子が、ｍｉｎＥポリペプチド及びＤｉｖＩＶＡポリペプチドからなる群から選択され、隔壁機構構成要素が、ｆｔｓＺポリペプチド及びｆｔｓＡポリペプチドからなる群から選択される、実施形態６３の水和剤。
６５．種子と、
種子を被うコーティングであって、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来する複数の殺有害生物性ミニ細胞を含む、コーティングと、
を含み、
複数の殺有害生物性ミニ細胞が、種子又はそこから出現する実生を摂食する少なくとも１つの有害生物に殺有害生物活性をもたらすのに十分な粒子濃度で存在する、植物用組成物。
６６．親細菌の細胞分割機能における改変が、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含む、実施形態６５の植物用組成物。
６７．ｚリング阻害タンパク質が、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドからなる群から選択され、細胞分裂トポロジー特異性因子が、ｍｉｎＥポリペプチド及びＤｉｖＩＶＡポリペプチドからなる群から選択され、隔壁機構構成要素が、ｆｔｓＺポリペプチド及びｆｔｓＡポリペプチドからなる群から選択される、実施形態６６の植物用組成物。
６８．殺有害生物性親細菌が、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・スピノセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓｅ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、乳化病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、キセノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・エントモファーガ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ）、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．）、クロモバクテリウム・サブツガエ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からなる群から選択される、実施形態６５～６７のいずれか１つの植物用組成物。
６９．殺有害生物性親細菌が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＴＩ４７７、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ６６３３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ２１３３２、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ９９４３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＳＴ７１３、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＣＩＢ ３６１０、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０２Ａ ＤＳＭ ３２０１９、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０３ ＤＳＭ ３２２８５、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０５ ＤＳＭ ２４９１８、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＲＴＩ３０１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ２４、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ４２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＢＡ－１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＬＭＧ ５－２９０３２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＭＢＩ６００、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＣＥＣＴ８８３６、及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株Ｍ４（Ｓ４９９）からなる群から選択される、実施形態６８の植物用組成物。
７０．コーティングが約１×１０^２～約１×１０^９粒子／種子の粒子濃度を含み、濃度が、種子の大きさに基づいて決定される、実施形態６５～６９のいずれか１つの植物用組成物。
７１．粒子濃度が約１×１０^４粒子／種子を含む、実施形態７０の植物用組成物。
７２．少なくとも１つの有害生物が、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）及びセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）からなる群から選択される、実施形態６５～７１のいずれか１つの植物用組成物。
７３．種子が、ダイズ、イチゴ、クロスグリ、ホワイトカラント、アカフサスグリ、ブラックベリー、ラズベリー、トマト、コショウ、チリ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、レタス、チコリー、アブラナ属、トウモロコシ、コムギ、イネ、キャノーラ、メロン、ケール、ニンジン、又はマメからなる群から選択される、実施形態６５～７２のいずれか１つの植物用組成物。
７４．殺有害生物性組成物であって、
ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、ｍｉｎＥポリペプチド、ｆｔｓＺポリペプチド、ｆｔｓＡポリペプチド、ｐａｒＡポリペプチド、ｐａｒＢポリペプチド、ＤｉｖＩＶＡポリペプチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の細胞分割機能因子のレベル又は活性の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む殺有害生物性親細菌に由来する殺有害生物性ミニ細胞
を含む、殺有害生物性組成物。
７５．殺有害生物性ミニ細胞が、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分の少なくとも１つを含む、実施形態７４の殺有害生物性組成物。
７６．殺有害生物性ミニ細胞が、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素及び外因性の殺有害生物性核酸のいずれか又は両方を発現するようにコードされた外因性発現カセットをさらに含む、実施形態７５の殺有害生物性組成物。
７７．外因性の殺有害生物性タンパク質毒素が、Ｐｉｒ毒素又はＣｒｙ毒素を含む、実施形態７５又は実施形態７６の殺有害生物性組成物。
７８．外因性の殺有害生物性核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）である、実施形態７５又は実施形態７６の殺有害生物性組成物。
７９．外因性の殺有害生物性活性成分が、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、及び広範囲の活性を有する成分からなる群から選択される、実施形態７５の殺有害生物性組成物。
８０．ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が同じ有害生物を標的とする、実施形態７４～７９のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
８１．ミニ細胞の殺有害生物活性と外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、又は外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が異なる有害生物を標的とする、実施形態７４～７９のいずれか１つの殺有害生物性組成物。
８２．少なくとも１つの有害動植物が、コナガ（ＤＢＭ）、コクヌストモドキ（ＲＦＢ）、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、スジコナマダラメイガ、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、アジアンスポットボールワーム、鱗翅目属（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、鞘翅目属（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、双翅目属（Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）及びセルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）からなる群から選択される、実施形態７４～８１のいずれかの殺有害生物性組成物。
８３．殺有害生物性ミニ細胞が安定なままであり、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも１３ヶ月間、殺有害生物活性を保持する、実施形態７４～８２のいずれか１つの殺有害生物性組成物。

本開示の主題は、限定としてではなく、本発明の例示として提供される以下の実施例を参照することによってより良く理解されるであろう。

実施例１：遺伝子改変による殺有害生物性ミニ細胞の生成
この実施例は、殺有害生物性ミニ細胞が種々の遺伝子突然変異によって殺有害生物性親細菌細胞から生成され得ることを示す。この実施例では、親細菌の細胞分割機能の調節に関与する１つ以上の遺伝子の破壊、すなわち、ｚリング阻害タンパク質（例えば、ｍｉｎＣ又はｍｉｎＤ）の破壊、又はｚリング阻害タンパク質及び細胞分裂トポロジー特異性因子（例えば、ｍｉｎＣＤＥ）の破壊を含む殺有害生物性ミニ細胞を生成する方法が提供される。さらに、ｍｉｎオペロンの破壊又は隔壁機構構成要素ＦｔｓＺの過剰発現を介してＡＤＡＳ生成株を作製する遺伝的手段が提供される。

材料及び方法
標的遺伝子のバイオインフォマティクスによる同定
フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株ＴＴ０１及びクレイニイ（Ｋｌｅｉｎｉｉ）：目的の遺伝子の配列は、パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）によってサポートされているデータベースＰｈｏｔｏＬｉｓｔ Ｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＰｈｏｔｏＬｉｓｔ／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｇｉ）上で見出された。

枯草菌亜種イナクオソラム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍ）：ゲノム配列をもたない種で破壊する配列を同定するために、以下の手順を行う。プライマーＰｒｉｍｅｒｓ０１７及びＰｒｉｍｅｒｓ０４６を用いてＰＣＲにより染色体からｒＤＮＡを増幅し、サンガー配列決定により配列決定する（表１）。次いで、最も近い配列決定された近縁株を、ヌクレオチドＢＬＡＳＴを用いて同定する。この最も近い近縁のゲノム配列を用いて、ミニ細胞形成に関与する遺伝子（ｄｉｖＩＶＡ、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ）を同定し、これらの遺伝子座の破壊を標的とするプライマーを設計する。さらに、胞子形成のマスターレギュレーターであるｓｐｏ０Ａの配列を同定し、遺伝子破壊のための相同領域を増幅するためのプライマーを設計するために使用する。

ｆｔｓＺ過剰発現及びｍｉｎ突然変異を介したフォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株からの殺有害生物性ミニ細胞の生成。
ｆｔｓＺタンパク質の過剰発現によるミニ細胞の生成：殺有害生物性ミニ細胞を、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株ＴＴ０１及びクレイニイ（Ｋｌｅｉｎｉｉ）から、天然ｆｔｓＺタンパク質の過剰発現によって生成した。配列及び天然リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むＢｓａＩ ｇＢｌｏｃｋを順序付けた。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを使用して、ｇＢｌｏｃｋを発現ベクターＰｌａ０７１（アンピシリン耐性及びａＴｃによって誘導されるＴｅｔＲプロモーターを含むＣｌｏＤＦ起点）に移動させた。得られた発現ベクターはＰｌａ０９７であり、化学的にコンピテントな細胞による熱ショックを介して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに形質転換した。これが完了したら、プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株からミニプレップし、次いでフォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）に形質転換した。フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株をＣＡＳＯ培地中で増殖させ、５％［ｗ／ｖ］スクロース＋１ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で洗浄し、ＣＡＳＯ＋カルベニシリン５０μｇ／ｍＬ上にプレーティングし、３０℃で２日間増殖させた。回収プレート上で増殖したコロニーを採取し、コロニーＰＣＲを行って、適切なプラスミド増殖を試験した。プライマーｏＬＫ０１５（配列番号２）及びｏＡＦ０８６（配列番号１）を用いて、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）遺伝子ｆｔｓＺの存在及びプラスミド形質転換の成功を検証した。

ミニ細胞の生成のために、プレートを凍結グリセロールストックから画線し、３０℃で２日間インキュベートした。コロニーを採取し、ＬＢ＋Ｃａｒｂ ５０に接種して、３０℃で一晩増殖させた。翌朝、一晩培養物を、より大量の培地＋抗生物質中で１：２００に希釈した。培養物はＯＤ６００ ０．５に達するまで増殖し、次いで培養物を１００ｎｇ／ｍＬのａＴｃで誘導し、一晩増殖させた。翌日、培養物を処理して、実施例２に記載の分化遠心分離プロセスの後に一晩生成されたミニ細胞を収集した。

ｍｉｎＣＤＥオペロンの欠失によるミニ細胞の生成：オペロンをノックアウトするために、細胞に自殺プラスミドをトランスフェクトする。プラスミドｐＰＩＮＴは、Ｊｏｈａｎｎｅｓ－Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍａｉｎｚ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅのＲａｌｆ Ｈｅｅｒｍａｎｎ研究所から入手する。ｐＰＩＮＴプラスミドは、抗生物質カセットの挿入のための相同性アームの付加を可能にする多重クローニング部位（ＭＣＳ）を有する。相同性アームは、ゲノムに結合したｐＰＩＮＴ ＭＣＳに一致する切断部位オーバーハングを有するプライマーを用いて作製される。一方のアームはｍｉｎＣの上流に５００ｂｐを含むように設定され、他方のアームはｍｉｎＥの下流に５００ｂｐを含むように設定される。制限消化及びライゲーションを用いて、次いで最後のｐＰＩＮＴプラスミドを栄養要求性ドナーｐｉｒ＋大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換する。これは、プラスミドのＲ６Ｋ起点のために必要である。ドナー株がプラスミドを有すると、トランスフェクションプロトコルが開始される。トランスフェクションは、ｍｉｎＣＤＥオペロンが位置する抗生物質カセットを挿入するための相同組換えをもたらす。トランスフェクションから適切な抗生物質耐性を選択するために、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）株をＫａｎ３５上にプレーティングする。この第１のレベルの選択に続いて、ドナー株に対して選択するために、コロニーをスクロース含有寒天上に置く。ＰＣＲ検証は、相同性アームの外側に着地するプライマーと、抗生物質カセットの内側に着地するプライマーとを使用して実行される。ｍｉｎＣＤＥオペロンが除去され、細胞分裂の調節がないので、ミニ細胞が生成される。ｍｉｎＣＤＥがなければ、細胞の分裂は制御されず、ｆｔｓＺリングが細菌の極に形成され、それが締めて閉じたときにミニ細胞を作り出す。ミニ細胞生成のために、グリセロールフリーザーストックからの新鮮なプレートを画線し、３０℃で一晩インキュベートする。翌日、単一のコロニーを５０ｍＬのＬＢ培養物に接種する。培養物を３０℃で一晩増殖させ、翌日、一晩培養物１０ｍＬを採取し、５００ｍＬ培養物に接種する。このプロセスを繰り返して、２つのフラスコの間に合計１リットルの材料を有する。上述のように、ミニ細胞はｍｉｎＣＤＥ突然変異により生成される。翌日、培養物を処理して、実施例２に記載の分化遠心分離プロセスの後に一晩生成されるミニ細胞を収集する。

ｍｉｎ突然変異による枯草菌亜種イナクオソラム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍ）からの殺有害生物性ミニ細胞の生成
枯草菌亜種イナクオソラム（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ．ｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍ）の殺有害生物性ミニ細胞を生成するために、ｄｉｖＩＶＡ及びｍｉｎＣＤのゲノム欠失が生成される。ｄｉｖＩＶＡ及び／又はｍｉｎＣＤ遺伝子座は、ｌｏｘＰ組換え部位に隣接するカナマイシン耐性又はエリスロマイシン耐性のいずれかをコードする抗生物質耐性遺伝子で置き換えられる（Ｋｏｏ，ｅｔ ａｌ ２０１７年と同様の戦略に従って）。胞子形成のマスターレギュレーターであるｓｐｏ０Ａもまた、ミニ細胞の精製をより煩雑にする、ミニ細胞の形成と競合し、同様のサイズである胞子の形成を防止するために欠失される。簡潔に述べると、ｄｉｖＩＶＡ、ｍｉｎＣＤ、又はｓｐｏ０Ａ遺伝子座の上流及び下流の１ｋｂ領域をＰＣＲによって増幅する。次いで、これらの相同性アームを、ＰＣＲを介して抗生物質耐性マーカー及びｌｏｘＰ部位をコードする遺伝子に縫い付けて、ノックアウトカセットを作製する。次いで、カセットを、標準的な形質転換手順に従って、枯草菌亜種イナクオソラム（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍ）に形質転換する。

次いで、耐性マーカーを、Ｃｒｅ－ｌｏｘリコンビナーゼ系の使用によって除去する。簡潔に述べると、ｄｉｖＩＶＡ、ｍｉｎＣＤ、及びｓｐｏ０Ａ遺伝子座に破壊を含む株を、恒常的に発現するＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子及び温度感受性複製起点をコードするプラスミドｐＤＲ４２２で形質転換し、スペクチノマイシン選択的ＬＢ寒天プレート上に３０℃でプレーティングする。翌日、いくつかのコロニーを非選択的ＬＢ寒天プレート上に再度画線し、３７℃でインキュベートしてｐＤＲ４２２プラスミドを除去する。得られたコロニーをカナマイシン、エリスロマイシン、スペクチノマイシン、及び単純なＬＢ－寒天プレートにパッチして、全ての抗生物質耐性の喪失を確認する。

ミニ細胞の生成は、枯草菌亜種イナクオソラム（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍ）の培養物におけるミニ細胞の観察によって確認される。簡潔に述べると、変異型枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の単一コロニーを採取し、３７℃で３時間、又はＯＤ_６００＝１に達するまで、ＬＢ中で増殖させる。次いで、培養物１μＬを、ＰＢＳ中１．５％アガロースで作られた顕微鏡スライド上のパッド上に置く。カバースリップを上に置き、培養物を、位相差光学顕微鏡法によって１００倍油浸対物レンズで撮像する。

結果
以下の表２Ａは、殺有害生物性親細菌細胞、最も近い近縁細菌、及び分類を提供する。表２Ｂは、ミニ細胞の生成のための殺有害生物性親細菌細胞において同定されたタンパク質を提供する。

図１は、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）ｆｔｓＺ遺伝子が発現ベクター中に首尾よく挿入されたことを示す配列決定マップを提供する。

実施例２：殺有害生物性ミニ細胞の単離及び特徴付け
いくつかの方法を用いて、親細菌培養物からミニ細胞を精製することができる。この実施例は、ミニ細胞単離のための３つの方法：遠心分離プロセス、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）プロセス、及び複合遠心分離－ＴＦＦプロセスを記載する。全ての場合において、ミニ細胞培養物を滅菌するために抗生物質処理が使用される。

材料及び方法
培地の最適化
ＬＢをベースラインとして使用し、発酵用のより最適な培地を同定するための研究を行った。いくつかの培地を、細菌株のミニ細胞生成について試験した。試験した培地は、異なる炭素源（Ｃａｓアミノ酸／酵母抽出物／ペプトン）、ＬＢ、及びＴＢ＋２％グリセロールを有する限定培地を含んでいた。ミニ細胞プロトコルに従って、２５０ｍＬフラスコ中の５０ｍＬの材料を用いて研究を行った。精製ミニ細胞試料をＳｐｅｃｔｒａｄｙｎｅで測定し、結果を比較した。

ミニ細胞生成株の培養
ミニ細胞を生成するために、プレートを凍結グリセロールストックから画線し、３０℃で２日間インキュベートした。コロニーを採取し、一晩培養物をＬＢ＋Ｃａｒｂ ５０に接種して、３０℃で一晩増殖させた。翌朝、一晩培養物を、より大量の培地＋抗生物質中で１：２００に希釈した。培養物をＯＤ６００ ０．５に達するまで増殖させ、次いで培養物を１００ｎｇ／ｍＬのａＴｃで誘導し、一晩増殖させた。翌日、培養物を処理して、以下に記載する分化遠心分離プロセスの後に一晩生成されたミニ細胞を収集した。

枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のミニ細胞生成株を、リッチ培地（ＬＢ）中で、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で２．５Ｌ振盪フラスコ中で１リットル培養物中で増殖させる。培養物を、新鮮なＬＢ－寒天プレートから単一コロニーを選択することによって接種し、１２、１６、１８、又は２４時間培養する。

遠心分離粒子の精製
簡潔に述べると、細菌培養物をＯＤ６００＝１０に希釈し、最も遅い加速速度を用いて、１リットルボトル中、４０００ｘｇ（Ｓｏｒｖａｌ Ｌｙｎｘ６０００）で４０分間遠心分離する。次いで、ミニ細胞に富む上清を１７，０００ｇで１時間遠心分離して、ミニ細胞をペレット化する。次いで、得られたペレットを、２００μｇ／ｍＬのセフトリアキソン及び２０μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンを含む５０ｍＬの新鮮なＬＢに再懸濁し、培養物を２時間３０℃に置いて、残存する親細菌を除去する。この溶液をスイングバケットローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）中、４，０００ｘｇで１５分間遠心分離して、死んだ親細菌細胞及び大きな残屑を除去する。次いで、ミニ細胞を２０，０００ｘｇ（Ｓｏｒｖａｌ Ｌｙｎｘ６０００）で２０分間ペレット化し、等量の０．２μｍろ過ＰＢＳ中に再懸濁する。この工程を全２回洗浄について繰り返し、得られたミニ細胞ペレットを最終容量１ｍＬの０．２μｍろ過ＰＢＳに再懸濁する。

ＴＦＦ粒子の精製
簡潔に述べると、親細胞の大部分を、０．６５μＭフィルターを使用する第１のタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によって除去し、濃度せずに透過液を収集する。次いで、汚染物質を除去し、ミニ細胞に富む透過液を、７５０ｋＤａのＴＦＦフィルターの使用により１０倍濃縮し、残余分を収集する。次いで、ミニ細胞に富む残余分を、２００μｇ／ｍＬのセフトリアキソン及び２０μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンで処理し、培養物を２時間３０℃に置いて、残りの親細菌を除去し、次いで、上述したように処理する。

遠心分離－ＴＦＦ粒子精製
ミニ細胞単離のこの方法は、「遠心分離粒子精製」及び「ＴＦＦ粒子精製」からの工程を組み合わせる。簡潔に述べると、培養物をＯＤ６００＝１０に希釈し、「遠心分離粒子精製」におけるように遠心分離を介して親細胞を除去する。次いで、ミニ細胞に富む上清を汚染物質から精製し、「ＴＦＦ粒子精製」におけるように７５０ｋＤａフィルターを使用することによってＴＦＦを介して濃縮する。次いで、ミニ細胞に富む残余分を抗生物質で処理し、洗浄し、「遠心分離粒子精製」及び「ＴＦＦ粒子精製」におけるように濃縮する。

ミニ細胞の特徴付け
単離されたミニ細胞を、顕微鏡、粒径分析、及びサイトゾルタンパク質ＧｒｏＥＬについてのウェスタンブロッティングによって検証した。図３Ａは、ミニ細胞単離の前後のミニ細胞生成Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株の培養物の位相差顕微鏡画像を示す。図３Ｂは、粒径分析結果を示す。粒径分布及び濃度は、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ ｎＣＳ１を用いて計数することによって測定した。

ミニ細胞が真のミニ細胞であり、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）種が生成すると報告されている細胞外小胞ではないことを確認するために、サイトゾルシャペロンＧｒｏＥＬについてのウェスタンブロッティングを行った。簡潔に述べると、３．３３μＬの１倍ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）を、１ｅ９粒子を含む１０μＬの試料と混合した。試料を９５℃で５分間、１．５ｍＬチューブ中で煮沸し、ベンチトップ遠心分離機で回転させて、蓋から凝縮物を除去した。試料全体を、Ｂｏｌｔ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ）にロードした。７μＬのＣｈａｍｅｌｅｏｎ Ｄｕｏラダー（ＬｉＣＯＲ）を標準としてロードした。タンパク質を、一定の２００Ｖで２５分間流すことによってゲル上で分離した。次いで、タンパク質を、Ｖ０プログラムを使用するｉＢｌｏｔシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してニトロセルロース膜に転写した。転写後、膜を、マウス抗ＧｒｏＥＬ抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ８２５９２）及びヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ａ３２７２８）と共に、ｉＢｉｎｄ（Ｔｈｅｒｍｏ）を介して、製造業者が推奨する抗体希釈を用いてインキュベートした。次いで、ブロットを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７用のスマート露光設定を使用して、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｔｈｅｒｍｏ）で画像化した。図３Ｃは、サイトゾルシャペロンＧｒｏＥＬについてのウェスタンブロットの画像を示す。

結果
図２は、媒体最適化試験の結果を示す。

図３Ａ～３Ｃは、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）から生成された殺有害生物性ミニ細胞を特徴付けるアッセイを示す。図３Ａは、約５００ｎｍの球状ミニ細胞粒子が明瞭に見える顕微鏡画像である（右側）。図３Ｂは、１リットル当たり１ｅ１０、１ｅ１１、及び１ｅ１２を超える濃度が１Ｌの培養物から収集され、平均粒径が４５０ｎｍであることを示した、粒径分析結果を示す。図３Ｃは、サイトゾルシャペロンＧｒｏＥＬについてのウェスタンブロットの画像を示す。ミニ細胞のみがＧｒｏＥＬに対して陽性であり、一方、細胞外小胞はペリプラズム材料のみを含むので、陽性ではなかったことが分かる。

実施例３：殺有害生物性親細菌に由来する殺有害生物性ミニ細胞を含む殺有害生物性組成物による植物の処理は、植物の健康を維持しながら、昆虫有害生物を死滅させる
この実施例は、昆虫プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）（コナガ）を、昆虫病原性微生物フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｓｅｃｅｎｓ）に由来する殺有害生物性ミニ細胞を含む殺有害生物性組成物で処理することによって、それらを死滅させ又は適応度を低下させる能力を実証する。この実施例はまた、この処理が、感受性植物における植物損傷の減少をもたらすことを実証する。

材料及び方法
昆虫飼育
Ｐ．キシロステラ（Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）卵はＢｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した人工食餌（一般的な夜間食餌）で飼育した。食餌は以下のように調製した：
１． 沸騰水に１６２ｇの一般的な夜間食餌粉末を加えた
２． ８０℃～９０℃の温度を保ちながら、内容物を１５分間徹底的に混合した
３． 混合物を７０℃に冷却し、アマニ油５ｍＬを加え、徹底的に混合した
４． 次いで、食物を飼育容器に分注し、冷却させ、固化させた

ＤＢＭ卵を食餌の上に置き、孵化させ、給餌した。全ての飼育容器は、２５℃、１６時間：８時間の明：暗サイクル、及び３４％の湿度で維持した。幼虫が第２齢段階に達したら、それらを人工食餌又はリーフディスクアッセイに使用した。この段階で、幼虫を全植物アッセイに使用することもできる。

人工食餌、リーフディスクアッセイ及び全植物を用いた昆虫の実験的処理
人工食餌アッセイのために、０．３８ｍＬの夜間食餌を４８ウェルプレートの各ウェルに分注し、冷却し、４℃で一晩保存した。翌日、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１の殺虫性ミニ細胞（実施例２のように調製）、又は陰性対照としての滅菌ＰＢＳの３０μＬの組成物を、各ウェルの食餌の上に層状に重ねた。ドラフト中で１時間乾燥した後、１匹の第２齢段階ＤＢＭ幼虫を各ウェルに入れた。次いで、プレートをＢｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒシート（Ｑｉａｇｅｎ）でしっかりとテープ留めし、１６時間：８時間の明：暗サイクル及び３４％湿度で２５℃に維持されたインキュベーター中に置いた。

リーフディスクアッセイのために、リーフディスクを、円形革カッターを用いてキャノーラ葉から作製した。次いで、各リーフディスクを１２ウェルプレート中の１％のオートクレーブした寒天ゲルの上に置いた。各プレートの画像を、ミニ細胞組成物の施用及び昆虫の寄生の前に、Ｌｅｍｎａｔｅｃイメージャーで撮影した。拡散を容易にするために、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７を、０．０５％の最終濃度まで全てのミニ細胞溶液に添加した。次いで、１０^８、１０^９、１０^１０、若しくは１０^１１のＰ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）ミニ細胞、又は陰性対照としてのＰＢＳを含む２５μＬの溶液をリーフディスクに分注し、完全に乾燥させた。乾燥後、５匹の第２齢ＤＢＭ幼虫を各リーフディスク上に置いた。プレートをＢｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒシートで密封し、１６時間：８時間の明：暗サイクル及び３４％湿度で２５℃に維持されたインキュベーター中に置いた。

全植物アッセイのために、３つの葉段階キャノーラ植物を使用する。新鮮なＤＢＭ卵を、湿ったペーパータオルと共に一晩、孵化チャンバに放置する。１２個のキャノーラ植物を、ミニ細胞溶液を噴霧する前に各ケージ内に置く。それらを１時間乾燥させてから、寄生させる。育成チャンバからのペーパータオル（数百匹の新生仔を含む）を半分に切断し、各ケージ内に置く。

処理後の植物の健康及び昆虫の適応度の読み取り（ＬＤ５０アッセイ）
人工食餌又はリーフディスクアッセイにおける昆虫適応度に対する殺有害生物性ミニ細胞の効果を３日後に決定した。生育幼虫を計数し、発育段階を決定した。死亡率及び発育阻止を決定した。ＤＢＭ幼虫におけるＰ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）ミニ細胞のＬＤ５０を、人工食餌に施用したミニ細胞の数に対して幼虫の生存率をプロットし、用量応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を当てはめることによって決定した。

リーフディスクアッセイのために、リーフディスクプレートの写真をＬｅｍｎａｔｅｃｈイメージャーで撮影し、消費されたリーフディスクのパーセンテージを計算した。

植物全体のアッセイでは、幼虫の大きさ及び植物への損傷が、毎日の観察及び写真によって記録される。蛹化及び非蛹化幼虫の数を実験終了時に計数し、各植物の重量を測定して、ＤＢＭ生存及び摂食に対するミニ細胞の効果を評価する。

結果
図４Ａ～４Ｃは、プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）（コナガ；ＤＢＭ）を、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）から生成されたミニ細胞を含む殺有害生物性組成物で処理したＬＤ５０アッセイの結果を示す。図４Ａ～４Ｂは、ＤＢＭ幼虫に、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株ＴＴ０１（図４Ａ）又はクレイニイ（Ｋｌｅｉｎｎｉ）（図４Ｂ）に由来するミニ細胞粒子の一連の濃度を給餌した人工食餌ＬＤ５０アッセイの結果を示す。死亡率は、給餌の３日後に記録した。図４Ｃは、ＤＢＭ幼虫に、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）株ＴＴ０１又はクレイニイ（Ｋｌｅｉｎｉ）に由来するミニ細胞粒子の一連の濃度を給餌し、３日後に死亡率を記録した、リーフディスクアッセイＬＤ５０アッセイの結果を示す。これらのアッセイにおいて、殺有害生物性ミニ細胞は、死亡率及び強い発育阻止表現型を示した。

実施例４：鱗翅目昆虫のパネルの、殺有害生物性親細菌に由来する殺有害生物性ミニ細胞を含む殺有害生物性組成物での処理は、Ｐ．キシロステラ（Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）の高い感受性を示す
この実施例は、昆虫病原性微生物フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）に由来する殺有害生物性ミニ細胞を含む殺有害生物性組成物でそれらを処理することによる、昆虫プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）（コナガ）を特異的に死滅させるか又はその適応度を減少させる（他の昆虫幼虫ではなく）能力を実証する。

材料及び方法
人工食餌を用いた昆虫の飼育と実験的処理
ヨーロッパ・コーン・ボーラー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｒｎ Ｂｏｒｅｒ）（オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）；ＥＣＢ）及びツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；ＦＡＷ）卵をＢｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．から入手した。昆虫飼育を実施例３と同様に行った。人工食餌アッセイを実施例３と同様に設定した。

処理後の昆虫適応度の読み取り（％死亡率）
昆虫の適応度及び死亡率の読み取りを実施例３と同様に行った。

結果
図５Ａ～５Ｂは、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来の殺有害生物性ミニ細胞がコナガ（ＤＢＭ）に対して毒性であったが、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、ビート・アーミー・ワーム（ＢＡＷ）、及びヨーロッパ・コーン・ボーラー（ＥＣＢ）に対しては毒性でなかったことを示す。

実施例５：外因性の殺虫性活性成分をさらに含む殺有害生物性ミニ細胞の生成
この実施例は、クロラントラニリプロール（ＣＴＰＲ）のカプセル化と装填濃度の定量化（カプセル化の有効性）を示す。

材料及び方法
Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）Ｅ１．２（５００μＬ）由来の殺有害生物性ミニ細胞をＰＢＳに溶出した。殺有害生物性ミニ細胞又はＰＢＳ溶液（５００μＬ）のいずれかに５μＬのＣＴＰＲストック（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いで、インキュベーター中、３７Ｃで２４時間インキュベートした。次いで、１００μＬの試料（添加された殺有害生物性ミニ細胞又はＰＢＳ）を、フィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ－３００ｋＤａ、ＥＭＤ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いた遠心ろ過プロセスに供した。試料をＰＢＳ中の滅菌１％ＭｅＯＨで６回洗浄し、１５，０００ｇで１分間６回遠心分離して遊離Ａ．Ｉを除去した。６回目のろ過後、全てのろ液を全ろ液として１本のチューブに集めた。洗浄及びフィルターから残余分（ＡＤＡＳ）を回収するために、追加の１００μＬのＰＢＳ中１％ＭｅＯＨをフィルターに加えた。残余分（殺有害生物性ミニ細胞）及びろ液の両方をＬＣ－ＭＳに供してＣＴＰＲの濃度を検出した。

実施例６：外因性の殺虫性活性成分のカプセル化による、殺有害生物性親細菌に由来する殺有害生物性ミニ細胞の殺虫効力及び範囲の増加
材料及び方法
昆虫飼育（ＤＢＭ、ＦＡＷ、ＥＣＢ）
ＤＢＭ、ＥＣＢ、及びＦＡＷ幼虫の昆虫飼育は、実施例４と同様に行われる。

実験処理
昆虫は、人工飼料及びＬＤＡアッセイにおいて実施例５の殺有害生物性ミニ細胞で処理される。

昆虫適応度の読み取り
処理後の昆虫適応度の読み取り（ＬＤＡアッセイ）は、実施例４と同様に行われる。

実施例７：殺真菌性親細菌に由来する殺有害生物性ミニ細胞を含む殺有害生物性組成物による植物の処理は、真菌の有害生物を阻害し、植物の健康を維持する
この実施例は、ボトリチス灰色かび（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｇｒａｙ ｍｏｌｄ）病を引き起こす真菌ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）を、殺真菌性微生物枯草菌亜種イナクオソラム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍ）に由来する殺有害生物性ミニ細胞でそれらを処理することにより阻害する能力を実証する。この実施例はまた、この処理が、感受性植物における植物及び果実の損傷の減少をもたらすことを実証する。

材料及び方法
真菌培養及びインビトロアッセイを用いた実験的処理
抗真菌活性は、阻害アッセイの菌糸ゾーンによって実証される。Ｂ．シネレア（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）の菌叢を、ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）プレート上で室温で１週間増殖させる。この菌叢のプラグを新鮮なＰＤＡプレートの中心に置き、少なくとも１０^８、１０^９、１０^１０の枯草菌亜種イナクオソラム（Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍ）のミニ細胞でコーティングされたフィルターディスクを真菌プラグから等距離に配置する。５日後及び７日後にプレートを画像化し、阻害ゾーンをｍｍで測定する。

処理後の植物の健康及び真菌阻害の読み取り（ＬＤ５０アッセイ）
温室条件下で、灰色かび病の抑制における枯草菌亜種イナクオソラム（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍ）由来の局所施用殺有害生物性ミニ細胞の有効性を試験した。簡潔に述べると、イチゴに病原体Ｂ．シネレア（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）を接種する前に、殺有害生物性ミニ細胞を、１０＾１０ミニ細胞の出発濃度で複数回希釈して施用する。その後、疾患の重症度を試験するために、植物からのイチゴ果実の異なる時点（１、６、２４時間及び７日間）での複数のサンプリングを行う。次いで、果実の病変直径を処理間で比較する。

実施例８：外因性殺真菌活性成分をさらに含む殺有害生物性ミニ細胞の生成
材料及び方法
アゾキシストロビンのカプセル化及び装填濃度の定量化（カプセル化の有効性）
枯草菌亜種イナクオソラム（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍ）Ｅ１．３（５００μＬ）由来の殺有害生物性ミニ細胞をＰＢＳ中に溶出した。殺有害生物性ミニ細胞又はＰＢＳ溶液（５００μＬ）のいずれかに５μＬのアゾキシストロビンストック（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いでインキュベーター中、３７Ｃで２４時間インキュベートした。次いで、１００μＬの試料（添加された殺有害生物性ミニ細胞又はＰＢＳ）を、フィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ－３００ｋＤａ、ＥＭＤ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いた遠心ろ過プロセスに供した。試料をＰＢＳ中の滅菌１％ＭｅＯＨで６回洗浄し、１５，０００ｇで１分間、６回遠心分離して遊離Ａ．Ｉを除去した。６回目のろ過後、全てのろ液を全ろ液として１本のチューブに集めた。洗浄及びフィルターから残余分（殺有害生物性ミニ細胞）を回収するために、追加の１００μＬのＰＢＳ中１％ＭｅＯＨをフィルターに加えた。残余分（殺有害生物性ミニ細胞）及びろ液の両方をＬＣ－ＭＳに供して、Ａ．Ｉの濃度を検出した。

実施例９：殺真菌性化学剤のカプセル化による殺真菌性親細菌に由来する殺有害生物性ミニ細胞の殺真菌効力及び範囲の増加
材料及び方法
真菌培養（ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ））
真菌増殖は、実施例７と同様に行われる。

実施例８の外因性殺真菌活性成分をさらに含む殺有害生物性ミニ細胞を用いた実験的処理、インビトロ及びＬＤＡアッセイ
処理及び読み取りは、実施例７と同様に行われる。

実施例１０：外因性の殺虫性活性成分をさらに含む殺真菌性親細菌に由来する殺有害生物性ミニ細胞の生成
材料及び方法
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のミニ細胞へのＣＴＰＲのカプセル化及び装填濃度の定量化（カプセル化の有効性）
組み込まれたＡ．Ｉのカプセル化及び定量化は、実施例５と同様に行われる。

結果
実施例１１：外因性の殺虫性活性成分を含む殺真菌性親細菌に由来する殺有害生物性ミニ細胞を用いた殺有害生物範囲の増加
材料及び方法
真菌培養（ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ））
真菌増殖は、実施例７と同様に行われる。

昆虫飼育（ＤＢＭ）
ＤＢＭ幼虫の昆虫飼育は、実施例３と同様に行われる。

実施例１０の殺有害生物性ミニ細胞を用いた実験的処理、インビトロ及び人工食餌アッセイ
昆虫の適応度及び死亡率の読み取りは、実施例３と同様に行われる。

処理後の真菌の阻害及び昆虫の適応度の読み取り
処理及び読み取りは、実施例７と同様に行われる。

実施例１２：保存安定性殺有害生物性ミニ細胞の生成
材料及び方法
殺有害生物性ミニ細胞凍結乾燥プロセス（フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の両方）
この実施例は、活性を維持する保存安定性殺有害生物性ミニ細胞を作製する能力を実証する。

この実施例において保存安定性殺有害生物性ミニ細胞を作製するために、ミニ細胞を凍結乾燥化により凍結乾燥する。ＰＢＳ中のフォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）ＴＴ０１又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の単離されたミニ細胞を実施例２のように調製し、１ｍＬのミニ細胞を、１．５ｍＬプラスチックチューブ中、２１，０００ｇで１５分間の遠心分離によってペレット化する。ペレットを、等量の微生物凍結乾燥緩衝液（ＯＰＳ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に再懸濁し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、液体窒素中で瞬間凍結する。次いで、殺有害生物性ミニ細胞を、自動収集設定を有するＦｒｅｅＺｏｎｅベンチトップ凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）を用いて１６時間凍結乾燥する。凍結乾燥したミニ細胞のチューブをパラフィルムで密封し、使用するまで暗所内で室温で保存する。

殺有害生物性ミニ細胞の保存及び安定性のアッセイ
凍結乾燥されたミニ細胞は、１、２、６、１２、又は２４ヶ月間保存される。活性は、水和後に測定される。簡潔に述べると、粉末ミニ細胞を１ｍＬのＰＢＳで再水和する。粒子数の維持は、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ ｎＣＳ１での濃度測定によって確認される。ミニ細胞のＡＴＰ含有量もまた、安定性を確認するために測定される。

実施例１３：水和剤（ＷＰ）殺有害生物性組成物の作製
材料及び方法
実施例１２からの凍結乾燥ミニ細胞を用いたＷＰの作製
前に生成された凍結乾燥殺有害生物性ミニ細胞を使用して、本開示による水和剤（ＷＰ）を生成することができる。本明細書で使用される水和剤は、水又は他の液体担体中に容易に分散する微粉化粒子を含む。粒子は、固体マトリックス中に保持された、典型的には凍結乾燥形態の殺有害生物性ミニ細胞を含む。典型的な固体マトリックスとしては、フーラー土、カオリン粘土、シリカ及び他の容易に湿潤する有機又は無機固体が挙げられる。水和剤は、通常、約５％～約９５％の活性成分＋少量の湿潤剤、分散剤又は乳化剤を含む。

結果
例示的な水和剤としては、以下の表３のものを挙げることができる。

当業者は、本明細書に含まれる教示を用いて、水分散性顆粒（ＷＤＧ）を生成することもできる。

実施例１４：水和剤から作製された殺有害生物性組成物の殺有害生物活性
材料及び方法
殺有害生物性組成物
実施例１３の水和剤を使用して、殺有害生物性組成物を作製する。

インビトロ及び人工食餌アッセイを用いた殺有害生物性組成物による処理に基づく殺虫活性
活性は、実施例３及び実施例７に記載されるように行われる。

実施例１５：懸濁濃縮（ＳＣ）殺有害生物性組成物の作製
材料及び方法
懸濁濃縮製剤（高濃度でのケーキングを防止するためのミニ細胞フレンドリーな界面活性剤）の作製
先の実施例で生成されたミニ細胞を使用して、本開示による懸濁濃縮物（ＳＣ）を生成することができる。本明細書で使用される懸濁濃縮物は、殺有害生物性ミニ細胞の微細に分割された固体粒子が安定に懸濁した水性製剤を含む。そのような製剤は抗沈降剤及び分散剤を含み、活性を増強するための湿潤剤並びに抗発泡剤及び結晶成長阻害剤をさらに含み得る。使用時、これらの濃縮物は水で希釈され、通常、処理される領域への噴霧として施用される。活性成分の量は、濃縮物の約０．５％～約９５％の範囲であり得る。

結果
例示的な懸濁濃縮物を以下の表４に記載する。

実施例１６：種子処理及び植物用組成物を作製する方法
材料及び方法
先の実施例で生成されたミニ細胞を使用して、本開示による種子処理及び植物用組成物を生成することができる。このような種子処理組成物では、殺有害生物性ミニ細胞に加えて、組成物は他の殺有害生物剤、界面活性剤、フィルム形成ポリマー、担体、凍結防止剤、及び他の配合添加剤を含むことができ、一緒に使用される場合、保存安定性であり、スラリー種子処理装置、直接処理装置、農場ホッパーボックス、プランターボックスなどの通常の種子処理装置での使用に適した組成物を提供する。

結果
例示的な種子処理組成物を以下の表５に記載する。

植物用組成物は、トウモロコシ種子を種子処理組成物でコーティングし、それによって、改善された植物性特性を有する新規な組成物を作り出すことによって作製することができる。

植物用組成物は、大豆種子を種子処理組成物でコーティングし、それによって、改善された植物性特性を有する新規な組成物を作り出すことによって作製することができる。

植物用組成物は、キャノーラ種子を種子処理組成物でコーティングし、それによって、改善された植物性特性を有する新規な組成物を作り出すことによって作製することができる。

植物用組成物は、イネ種子を種子処理組成物でコーティングし、それによって、改善された植物性特性を有する新規な組成物を作り出すことによって作製することができる。

植物用組成物は、コムギ種子を種子処理組成物でコーティングし、それによって、改善された植物性特性を有する新規な組成物を作り出すことによって作製することができる。

実施例１７：外因性の殺有害生物性タンパク質をさらに含む殺有害生物性ミニ細胞の生成
材料及び方法
殺有害生物性タンパク質又は発現カセットをロードする（又は代替的に、殺有害生物性タンパク質又は発現カセットを親にロードする）
Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）ミニ細胞の作製は、実施例１に記載されている通りである。さらに、殺有害生物性タンパク質、例えば、Ｂｔ由来のＣｒｙ１Ａｃ毒素の遺伝子配列を、誘導性プロモーター、Ｐｔａｃ若しくはＰｔｅｔ、又は恒常性プロモーターの背後にＣｌｏＤＦ又はｐＭＢ１複製起点を有する発現ベクターにクローニングする。或いは、殺有害生物性遺伝子がｐＰＩＮＴベクターを使用する相同組換えを介して、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）染色体上に挿入される。殺有害生物性タンパク質の発現はＯＤ６００＝０．５でａＴｃ又はＩＰＴＧで誘導されてミニ細胞内でタンパク質を生成し、ロードする。単離及び特徴付けは、先の実施例に記載した通りである。

実施例１８：外因性の殺有害生物性核酸をさらに含む殺有害生物性ミニ細胞の生成
材料及び方法
殺有害生物性核酸又は発現カセットをロードする（又は代替的に、殺有害生物性核酸又は発現カセットを親にロードする）
Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）ミニ細胞の作製は、実施例１に記載されている通りである。さらに、ｄｓＲＮＡの安定な生成を可能にするために、ＲＮａｓｅ ＩＩをコードするｒｎｃ遺伝子を破壊する必要がある。実施例１に記載されたフォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）におけるゲノム変化と同じ方法が、この課題を達成するために使用される。必要な別の変化は、実施例１に記載されているのと同様の方法を用いて、Ｔ７－ＲＮＡＰのコピーを染色体に付加することである。これは、Ｔ７プロモーターに基づく発現プラスミド系の使用を可能にする。アクチンに対するｄｓＲＮＡの発現は、ＩＰＴＧの添加によって誘導される。バイオアッセイは、先の実施例に記載されるように実施される。

実施例１９：種子処理及び植物用組成物を作製する方法
材料及び方法
実施例１７及び実施例１８で生成された殺有害生物性ミニ細胞のＵＶ安定性アッセイ
湿度制御なしで２５Ｃに設定したインキュベーター（Ｃａｒｏｎ）に４つのＴ５ ＰｏｗｅｒＶｅｇ（商標）ＦＳ＋ＵＶ電球（ＥＹＥ Ｈｏｒｔｉｌｕｘ）を設置することにより、ＵＶ曝露インキュベーターを設定する。ＵＶ（Ａ＋Ｂ）照射は、電球の下１５ｃｍの試料ステーションで１３００ｍＷ／ｃｍ^２として測定した。Ｅ１２及びＥ１３（１００ｍｌ）からの殺有害生物性活性物質を有する溶解物又は無傷の殺有害生物性ミニ細胞を、１．５ｍｌのチューブにピペットで移し、これを、単一層のサランラップ（ポリエチレン）及びゴムバンドによって密封する。次いで、チューブをサンプルステーション上のラックに配置する。１組の試料を６時間、１２時間及び２４時間ＵＶに曝露する。同じサンプルの他のセットをホイルに包み、同じ時間隔の間、インキュベーター内のサンプルステーション上に保持する。

実施例１７からの殺有害生物性活性物質を有するＵＶ曝露溶解物又は無傷殺有害生物性ミニ細胞を、実施例３と同様に設定したＤＢＭを用いた人工食餌アッセイに供する。

Claims (20)

1. 殺有害生物性組成物であって、
   液体担体相；及び
   前記担体相中に分散した複数の殺有害生物性ミニ細胞、
   を含み、
   前記複数の殺有害生物性ミニ細胞は、親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む複数の殺有害生物性親細菌に由来し、
   前記複数の殺有害生物性ミニ細胞は、前記組成物が植物に施用された際に、前記植物中又は植物上の少なくとも１つの有害生物を防除するのに十分な粒子濃度で存在する、
   殺有害生物性組成物。
2. 前記複数の殺有害生物性ミニ細胞の少なくとも一部が、外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の殺有害生物性組成物。
3. 前記複数の殺有害生物性ミニ細胞の前記一部が、前記外因性の殺有害生物性タンパク質毒素及び前記外因性の殺有害生物性核酸のいずれか又は両方を発現するようにコードされた外因性発現カセットをさらに含み、前記外因性の殺有害生物性タンパク質毒素がＰｉｒ毒素及びＣｒｙ毒素のうちの少なくとも１つを含み、前記外因性の殺有害生物性核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）である、請求項２に記載の殺有害生物性組成物。
4. 前記外因性の殺有害生物性活性成分が、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、及び広範囲の活性を有する成分からなる群から選択される、請求項２に記載の殺有害生物性組成物。
5. 前記親細菌の前記細胞分割機能における前記改変が、ｚリング阻害タンパク質、細胞分裂トポロジー特異性因子、又は隔壁機構構成要素のうちの少なくとも１つにおける改変を含み、前記ｚリング阻害タンパク質がｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドからなる群から選択され、前記細胞分裂トポロジー特異性因子がｍｉｎＥポリペプチド及びＤｉｖＩＶＡポリペプチドからなる群から選択され、前記隔壁機構構成要素がｆｔｓＺポリペプチド及びｆｔｓＡポリペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の殺有害生物性組成物。
6. 前記殺有害生物性親細菌が、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・スピノセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓｅ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、乳化病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、キセノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・エントモファーガ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ）、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．）、クロモバクテリウム・サブツガエ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からなる群から選択される、請求項１に記載の殺有害生物性組成物。
7. 前記殺有害生物性親細菌が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＴＩ４７７、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ６６３３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ２１３３２、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＡＴＣＣ ９９４３、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＳＴ７１３、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＣＩＢ ３６１０、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０２Ａ ＤＳＭ ３２０１９、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０３ ＤＳＭ ３２２８５、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）株ＡＢＩ０５ ＤＳＭ ２４９１８、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＲＴＩ３０１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ２４、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＦＺＢ４２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＢＡ－１、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＬＭＧ ５－２９０３２、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＭＢＩ６００、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株ＣＥＣＴ８８３６、及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ）株Ｍ４（Ｓ４９９）からなる群から選択される、請求項６に記載の殺有害生物性組成物。
8. 前記殺有害生物性親細菌がフォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）であり、前記殺有害生物性ミニ細胞が外因性の殺有害生物性タンパク質毒素Ｐｉｒを含む、請求項６に記載の殺有害生物性組成物。
9. 前記殺有害生物性親細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、前記殺有害生物性ミニ細胞が外因性の殺有害生物性分子を含む、請求項６に記載の殺有害生物性組成物。
10. 前記殺有害生物性親細菌が、１つ以上の外因性の殺有害生物性活性成分を発現する遺伝子組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項６に記載の殺有害生物性組成物。
11. 前記組成物が、葉面処理、注入処理、発芽前処理、及び発芽後処理のうちの少なくとも１つとして前記植物に施用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の殺有害生物性組成物。
12. 前記組成物が、使用準備完了（ＲＴＵ）製剤、懸濁濃縮物、タンクミックス、エアロゾル、種子処理剤、根浸漬剤、土壌処理剤、潅漑製剤、スプリンクラー製剤、及び灌注処理剤のうちの少なくとも１つとして製剤化される、請求項１に記載の殺有害生物性組成物。
13. 農薬界面活性剤をさらに含み、前記農薬界面活性剤が、噴霧性、展延性、及び注入性の特性の少なくとも１つを改善する、請求項１に記載の殺有害生物性組成物。
14. 前記液体担体相が、水性又は油性である、請求項１に記載の殺有害生物性組成物。
15. 前記担体相中に分散した外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、外因性の殺有害生物性核酸、及び外因性の殺有害生物性活性成分のうちの少なくとも１つをさらに含み、前記外因性の殺有害生物性タンパク質毒素がＰｉｒ毒素及びＣｒｙ毒素を含み、前記外因性の殺有害生物性核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）若しくはその前駆体、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）若しくはその前駆体、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）若しくはその前駆体である、請求項２に記載の殺有害生物性組成物。
16. 前記外因性の殺有害生物性活性成分が、殺真菌活性を有する成分、殺有害生物活性を有する成分、殺線虫活性を有する成分、選択的除草活性を有する成分、殺菌活性を有する成分、及び広範囲の活性を有する成分からなる群から選択される、請求項１５に記載の殺有害生物性組成物。
17. 前記ミニ細胞の殺有害生物活性と前記外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、前記外因性の殺有害生物性核酸、若しくは前記外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が同一の有害生物を標的とし、又は前記ミニ細胞の殺有害生物活性と前記外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、前記外因性の殺有害生物性核酸、若しくは前記外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が異なる有害生物を標的とする、請求項２に記載の殺有害生物性組成物。
18. 前記外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、前記外因性の殺有害生物性核酸、若しくは前記外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性と、前記担体相中に分散した前記外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、前記外因性の殺有害生物性核酸、若しくは前記外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が同一の有害生物を標的とし、又は前記外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、前記外因性の殺有害生物性核酸、若しくは前記外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性と、前記担体相中に分散した前記外因性の殺有害生物性タンパク質毒素、前記外因性の殺有害生物性核酸、若しくは前記外因性の殺有害生物性活性成分の殺有害生物活性が異なる有害生物を標的とする、請求項１５記載の殺有害生物性組成物。
19. 殺有害生物性ミニ細胞を作製する方法であって、
    ａ） 親細菌の細胞分割機能の改変を引き起こす少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む殺有害生物性親細菌を提供する工程と；
    ｂ） 殺有害生物性ミニ細胞の形成を可能にする条件下で前記殺有害生物性親細菌を増殖させる工程と；
    ｃ） 遠心分離、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、又はＴＦＦ及び遠心分離を用いて殺有害生物性ミニ細胞を精製する工程と
    を含む、方法。
20. 有害生物の防除方法であって、
    請求項１に記載の殺有害生物性組成物を植物又は植え付けられる領域に施用すること、を含む、方法。
    

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