CN113652425A

CN113652425A - 一种增强启动子活性的方法及其应用

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Publication number: CN113652425A
Application number: CN202110952951.9A
Authority: CN
Inventors: 佟毅; 李义; 陶进; 梁颖超; 刘松; 徐奎栋; 周景文; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangnan University; Jilin COFCO Bio Chemical Co Ltd; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2021-11-16

Abstract

本发明公开了一种增强启动子活性的方法及其应用，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌为表达宿主，通过分析启动子的结构特征，然后改造影响其强度重要的‑35区、‑10区和两者之间的间隔序列spacer区，结合流式细胞仪的分选策略，获得启动子强度显著增强的变体。利用改造后的启动子来表达普鲁兰酶，可使普鲁兰酶胞外酶活提高至改造前的3.08倍。从而为枯草芽孢杆菌在蛋白质的过量生产中，提供一个强启动子，有利于进一步提高基因的表达。

Description

一种增强启动子活性的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种增强启动子活性的方法及其应用，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

靶蛋白的有效表达始于靶基因的有效转录，而转录的高低直接取决于其上游启动子的转录强度。因此，启动子的强弱，直接决定着目的基因的表达水平。目前挖掘强启动子的方式往往是用易于检测的报告蛋白(如绿色荧光蛋白GFP、半乳糖苷酶等)进行表征，然而这项工作耗时耗力，且频繁使用天然启动子会导致基因组重组的概率升高。因此，在现有强启动子的基础上，构建合成启动子的方法是一种较为省力且有效的策略。然而，大部分枯草芽孢杆菌的天然启动子较长，介于100-300bp。使用易错PCR等完全非理性改造，会产生大量无效突变，增大了筛选的范围。而根据启动子的结构，对特定的重要区域进行改造，既可以缩小突变区域的范围，又能提高获得强启动子的可能性。因此，基于启动子的结构建立一种方便省事且有效的启动子改造策略对改善基因的表达非常重要。

发明内容

本发明是通过对启动子的-35和-10区及中间的spacer区域进行突变所完成。以sfGFP作为报告基因，改造后启动子的荧光强度提高至原始启动子的9.22倍，可极大的提高目的基因的表达水平。

本发明提供了启动子，所述启动子是对核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子进行 (a)～(d)任一种改造：

(a)将-35区替换为序列TTGACA；

(b)将-10区替换为TATAAT；

(c)将-35区替换为序列TTGACA，并将-10区替换为TATAAT；

(d)将-35区替换为序列TTGACA，并将-35区和-10区的spacer区域的aaaacatttttttcatt进行饱和突变。

在一种实施方式中，将aaaacatttttttcatt突变为cccctgagacgttcatt。

在有一种实施方式中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子的-35区替换为序列 TTGACA，并将-35区和-10区的spacer区域的aaaacatttttttcatt突变为cccctgagacgttcatt，得到的启动子序列如SEQ ID NO.19所示。

本发明提供了含有权利要求1所述启动子的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体为能在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母中表达的载体；包括但不限于pP43NMK质粒。

本发明提供了携带所述启动子或所述表达载体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不现由于大肠杆、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母。

本发明提供了一种生产蛋白的方法，利用所述启动子启动目的蛋白的表达。

在一种实施方式中，将编码目的蛋白的基因连接至所述启动子的下游，构建得到重组质粒，将重组质粒转入枯草芽孢杆菌中得到重组菌。

在一种实施方式中，将所述重组菌接种至培养基中，在35～40℃培养获得OD₆₀₀为4.5±1 的种子液，将种子液按体积比1％～5％的量接种至发酵体系中，在30～35℃培养。

在一种实施方式中，将所述重组菌接种至培养基中，在37℃培养获得OD₆₀₀为4.5±1的种子液，将种子液按体积比4％的量接种至发酵体系中，在30℃培养。

在一种实施方式中，所述蛋白包括但不限于普鲁兰酶、绿色荧光蛋白。

在一种实施方式中，所述普鲁兰酶NCBI登录号为AMQ67157，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；在编码普鲁兰酶的基因前连接核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的 AprE信号肽序列。

在一种实施方式中，编码所述绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供了一种提升蛋白表达量的方法，所述方法是利用所述启动子启动目的蛋白的表达；所述目的蛋白包括但不限于普鲁兰酶、绿色荧光蛋白。

在一种实施方式中，将编码所述普鲁兰酶的基因序列如SEQ ID NO.21所示。

本发明提供了所述的启动子，或所述表达载体，或所述微生物细胞在提升目的蛋白表达量中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过改造启动子重要的-35、-10区及其间隔spacer区域，在野生型P_srfA启动子的基础上构建了一个强启动子P_S1E。将其应用于sfGFP的表达时，其荧光强度提高至野生型的 9.22倍；将其应用于Pul表达时，其普鲁兰酶酶活提高至野生型的3.08倍。

附图说明

图1为PsrfA表达荧光蛋白的质粒图谱PsrfA-sfGFP。

图2为通过保守序列替换生成的4个启动子变体及其荧光强度图。

图3为启动子spacer区域突变文库的构建、表征和测序流程图。

图4为启动子文库在流式细胞仪的荧光强度表达情况图。

图5为分选的3000个单克隆的荧光强度图。

图6为融合构建的强启动子的普鲁兰酶的表达情况图。

图7为质粒pP43NMK-srfA-Pul的图谱。

图8为野生型P_srfA和改造后的启动子P_s1E的启动子的发酵结果图。

具体实施方式

1、培养基组成：

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5；

发酵培养基(g/L)：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。

各组分溶解后高压灭菌；冷却到60℃，再加100mL灭菌的0.17mol/L的KH₂PO₄、0.72mol/L 的K₂HPO₄溶液(2.31g的KH₂PO₄和12.54g的K₂HPO₄溶在足量的水中，使终体积为100mL； 0.22μm的滤膜过滤除菌)。

2、培养方法：

种子培养：挑取单菌落接入种子培养基中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养8h；

发酵培养：种子培养液按4％的接种量接入发酵培养基中，培养温度37℃。

3、绿色荧光蛋白表达量及生物量测定

在96孔板中加入用PBS缓冲液(100mM和pH 7.2)稀释成合适浓度的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，绿色荧光激发波长：480nm，绿色荧光发射波长：520nm，细胞生长OD吸收波长：600nm。

一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

4、普鲁兰酶酶活测定方式

将1mL 1g/100mL普鲁兰多糖底物和0.9mL 100mM pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液混合均匀，置于60℃水浴锅内预热10min，加入普鲁兰酶液0.1mL，反应10min后，加入3mL DNS显色液，然后于沸水浴中煮7min，置于冰水中终止显色反应，再加10mL去离子水，混匀，在540nm下测定吸光值。单位时间内生成1μmol还原糖的酶量定义为一个酶活力单位。

实施例1：构建含有启动子PsrfA、报告基因sfGFP的重组质粒

将PsrfA启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)使用引物srfA-F/srfA-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.2和3所示)和srfA-F-plasmid/srfA-R-plasmid(核苷酸序列如SEQID NO.4 和5所示)通过一步克隆试剂盒连接至P43NMK质粒，构建得到质粒P43NMK-srfA；

采用相同的手段，将sfGFP荧光蛋白报告基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)使用引物sfGFP-F/sfGFP-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.7和8所示)和 sfGFP-F-plasmid/sfGFP-R-plasmid(核苷酸序列如SEQ ID NO.9和10所示)，通过一步克隆试剂盒融合至PsrfA的下游，得到构建P43NMK-srfA_sfGFP，如图1所示。

实施例2：替换-35或-10区的非保守序列的重组质粒的构建

以P43NMK-srfA_sfGFP质粒为模板，使用3个引物对srfA-35-F和srfA-35-R、srfA-10-F 和srfA-10-R、srfA-35/10-F和srfA-35/10-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.11至16所示)，分别用保守序列替换启动子的-35区(-36～-30bp)、-10区(-13～-7bp)、同时替换-35和-10区。获得含有3个启动子突变体的重组质粒，3个启动子变体依次命名为P1、P2、P3。其结果如图 2所示。

实施例3：含有不同启动子的重组菌的构建及绿色荧光蛋白的表达

将实施例1和实施例2中构建得到的4的重组质粒分别转化到枯草芽孢杆菌WB600中，将单菌落接种至含有20mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，在37℃发酵8个小时作为种子液，OD₆₀₀约为4.5；然后按照4％的体积比接种至含有20mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，在37℃发酵30小时后，测定sfGFP的表达强度和OD₆₀₀。

荧光强度定义为sfGFP的表达强度/OD₆₀₀。其结果如图3所示。如结果所示，P1启动子 (仅替换-35区为保守序列TTGACA)的荧光强度最高，是天然启动子PsrfA的1.8倍。

实施例4：启动子spacer区域的饱和突变

将实施例2中构建得到的最佳启动子变体P1的-35区和-10区的spacer区域(aaaacatttttttcatt)进行饱和突变：以P1启动子变体质粒为模板，使用引物srfA-spacer-F和 srfA-spacer-R(SEQ ID NO.17和18)，构建spacer区域饱和突变的启动子文库(如图4所示)。将得到的重组质粒转化至宿主枯草芽孢杆菌WB600中，然后在37℃下培养8小时使文库细胞达到对数生长期。

接着，使用PBS缓冲液稀释细胞OD₆₀₀约为0.3左右，将稀释后的细胞通过流式细胞仪进行检测和分选；分选结果图如图4所示。将具有高荧光强度的P₁ gate进行分选，总共分选了3000个单细胞，直接接种到含有300uL LB培养基的96深孔板中，在37℃下发酵30小时后，测定荧光强度，如图5所示。将具有最高荧光强度的变体进行测序，其spacer区域的核苷酸序列为cccctgagacgttcatt，将此启动子命名为启动子P_S1E，核苷酸序列如SEQ IDNO.19 所示。

按照实施例4的方式，对含有野生型启动子P_srfA、保守序列改造的启动子P1和spacer 区域突变的启动子P_s1E的重组菌进行发酵、实现荧光蛋白的表达。表达的荧光蛋白sfGFP的强弱对比如图6所示：野生型与P₁启动子的荧光强度分别为45436、84021，P_s1E启动子荧光强度为419116，是野生型的9.22倍，是P₁启动子的4.9倍。

实施例5：利用强启动子生产普鲁兰酶

(1)P43NMK-srfA-Pul野生型的构建

利用引物，将由AprE信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示)以及普鲁兰酶编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)组成的序列扩增出来，将其克隆至含有启动子P_SrfA的质粒P43NMK-srfA下游，实现了普鲁兰酶的胞外表达。具体方式为使用引物srfA-pul-F和 SrfA-Pul-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.22和23所示)扩增AprE信号肽和Pul酶核苷酸序列，然后使用DNA Ligation Kit Ver.2.1将PCR产物环化，将AprE信号肽和普鲁兰酶克隆至 P43NMK-srfA中的PsrfA的下游，构建得到pP43NMK-srfA-Pul，如图7所示。

为了进一步的提高普鲁兰酶的胞外酶活，将实施例3筛选到的强启动子P_S1E替换上述野生型PsrfA启动子。具体实施方式为，使用引物srfA-S1E-F和srfA-S1E-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.24和25所示)扩增P43NMK-srfA-Pul质粒，得到启动子替换后的质粒pP43NMK-s1E-Pul。

将上述质粒pP43NMK-srfA-Pul和pP43NMK-s1E-Pul，分别转化到枯草芽孢杆菌WB600 中。在抗性平板上生长后，挑取单菌落接种到含有20mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，在37℃发酵8个小时作为种子液，OD₆₀₀为4.5±1；然后按照4％的体积比接种至含有25mL 液体TB培养基的250mL摇瓶中，在30℃发酵48小时后，测定Pul酶活。野生型P_srfA和改造后的启动子P_s1E的启动子的发酵结果如图8所示，利用野生型P_srfA表达的普鲁兰酶酶活为26.1U/mL，利用启动子P_s1E表达的普鲁兰酶酶活为80.4U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林中粮生化有限公司

江南大学

<120> 一种增强启动子活性的方法及其应用

<130> BAA211049A

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atttaaactg aacggtagaa agataaaaaa tattgaaaac aatgaataaa tagccaaaat 360

tggtttctta ttagggtggg gtcttgcggt ctttatccgc ttatgttaaa cgccgcaatg 420

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<213> 人工序列

<400> 23

aacgttaacg caaacaacaa gctgatccac aattttttgc ttctcatatt gtcatacctc 60

ccctaatctt tataagcagt gaacat 86

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cccctgagac gttcatttaa actgaacggt agaaagat 38

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atgaacgtct caggggtgtc aacgaaaaat gggtgaaaag t 41

Claims

1.启动子，其特征在于，所述启动子是对核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子进行(a)～(d)任一种改造：

(a)将-35区替换为序列TTGACA；

(b)将-10区替换为TATAAT；

(c)将-35区替换为序列TTGACA，并将-10区替换为TATAAT；

2.含有权利要求1所述启动子的表达载体。

3.携带权利要求1所述启动子或权利要求2所述表达载体的微生物细胞。

4.一种生产蛋白的方法，其特征在于，利用权利要求1所述启动子启动目的蛋白的表达。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将编码目的蛋白的基因连接至所述启动子的下游，构建得到重组质粒，将重组质粒转入枯草芽孢杆菌中得到重组菌。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组菌接种至培养基中，在35～40℃培养获得OD₆₀₀为4.5±1的种子液，将种子液按体积比1％～5％的量接种至发酵体系中，在30～35℃培养。

7.根据权利要求4～6任一所述方法，其特征在于，所述蛋白包括但不限于普鲁兰酶、绿色荧光蛋白。

8.一种提升蛋白表达量的方法，其特征在于，利用权利要求1所述启动子启动目的蛋白的表达；所述目的蛋白包括但不限于普鲁兰酶、绿色荧光蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将编码所述普鲁兰酶的基因序列如SEQ IDNO.21所示。

10.权利要求1所述的启动子，或权利要求2所述表达载体，或权利要求3所述微生物细胞在提升目的蛋白表达量中的应用。