CN107312758B - 一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶突变体 - Google Patents

一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种5‑羰基‑2‑戊烯酰基辅酶A还原酶突变体，属于生物工程领域。本发明对产己二酸代谢途径3‑氧代己二酰辅酶A途径中的限速基因Tfu_1647进行定点突变，得到一株己二酸产量提高的突变体。采用本发明的突变菌株发酵24h，己二酸产量由对照菌株的0.24g/L提高到1.01g/L，提高了近5倍。采用本发明的突变体，大大提高了己二酸产量，降低生产成本，促进己二酸在工业上的推广应用。

Description

一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体
技术领域
本发明涉及一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体，属于生物工程领域。
背景技术
己二酸(adipic acid)又称肥酸，是一种重要的平台化合物，当前己二酸最重要的应用领域是合成尼龙类纤维(比如尼龙6,6)。预计到2018年，己二酸全球的市场价值将达到63亿美元。
工业上己二酸的生产路线主要通过硝酸对环己醇—环己酮的混合物(醇酮油，也称KA油)进行氧化制取。但是该方法具有工艺流程长、副产物多、产品收率低、工业“三废”排放严重等问题，特别是温室气体的排放量十分大。因此，人们迫切需要寻找一种能替代传统化学合成己二酸的方法。随着生物技术的发展，全生物合成法生产有机酸具有生产成本低，生产工艺简单，污染小，产品纯度高等优势，所以该方法越来越受人们青睐。近年来，许多国内外的研究机构投入了大量的资源对上述方法进行了深入的研究。总部位于美国Genomatica公司和Verdezyne公司是该研究领域的领跑者。
Verdezyne公司通过研究发现，有些酵母在降解甘油三酯的程中能够积累己二酸。比如该公司利用椰子油(coconut oil)作为底物，利用酵母，将皂化后的脂肪酸经过一系列β氧化和ω氧化，成功积累了己二酸。由于该方法仅能以椰子油做底物，所并不适合在我国推广。
Genomatica公司通过生物信息学和系统的方法，寻找到了多种可能利用糖质原料全生物合成己二酸的途径，并对其中两个代谢途径的可行性进了探讨，其中一个途径是3-氧代己二酸途径(3-oxoadipate pathway)，另一个是3-氧代己二酰辅酶A途径(3-oxoadipyl-CoApathway)。经过计算，该公司认为以上两种途径在大肠杆菌中表达后都能达到92％的理论产率(以葡萄糖为底物)。
上海交通大学的钟建江教授研究团队发现了与3-氧代己二酰辅酶A途径类似的途径(如图1)，然后将不同来源的5种酶的基因，连接到质粒后导入大肠杆菌进行表达，从而获得己二酸的积累。本人所在团队对一株褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)进行代谢改造后，发现该工程菌株B6能够生产己二酸。本团队发现该菌生产己二酸的途径为3-氧代己二酰辅酶A途径(如图1)，包括：Tfu_0875(β-酮硫解酶，β-ketothiolase)，Tfu_2399(3-羟酰基-辅酶A脱氢酶，3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)Tfu_0067(3-羟基己二酰脱氢酶，3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase)，Tfu_1647(5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶，5-carboxy-2-pentenoyl-CoAreductase)以及Tfu_2577和Tfu_2576(succinyl-CoAsynthase，琥珀酰辅酶A合成酶)。将该途径的六种基因导入到大肠杆菌中，同样也获得了己二酸的积累。但是这两个途径都不能高效积累己二酸。
发明内容
为解决上述问题，本发明以表达5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶的基因Tfu_1647为研究对象，通过Discovery Studio(DS)对Tfu-1647理性预测并进行定点突变，以提高目的产物己二酸的产量。
本发明的第一个目的是提供一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体，所述突变体相对于5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本，将第334位的谷氨酸突变为精氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种编码上述突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供一种含有编码上述突变体核苷酸序列的重组质粒载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达上述突变体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞还表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的β-酮硫解酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的琥珀酰辅酶A合成酶，以及氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的琥珀酰辅酶A合成酶。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞的构建方法是：
(1)设计定点突变所用引物，以携带5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本基因的载体为模板进行突变并构建含有突变体的质粒载体pTrc99A-0067-1647；其中质粒载体pTrc99A-0067-1647是指在质粒pTrc99A上连接氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶的基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶基因；
(2)将突变质粒转化进宿主细胞；
(3)将连接了氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的β-酮硫解酶基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因的质粒pRSF-0875-2399转化进宿主细胞；
(4)将连接了氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因的质粒pCD-2576-2577转化进宿主细胞，最终得到重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供一种上述突变体在生产己二酸中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将含有权利要求1所述突变株的单菌落接入含有Kan，Amp，Str三种抗生素的LB培养基中，35-38℃，200-250r/min摇床培养过夜，将该种子液以2-5％接种量接入到发酵培养基中，待菌体生长至OD＝0.7左右，加入IPTG诱导，然后转入28-32℃培养。
本发明有益效果
本发明对产己二酸代谢途径3-氧代己二酰辅酶A途径中的限速基因Tfu_1647进行定点突变，得到一株己二酸产量提高的突变菌株。采用本发明的突变菌株发酵24h，己二酸产量由对照菌株的0.24g/L提高到1.01g/L，提高了近5倍。采用本发明的突变体，大大提高了己二酸产量，降低生产成本，促进己二酸在工业上的推广应用。
附图说明
图1：己二酸积累途径；
图2：model-1647的活性口袋；
图3：pTrc99A-0067-1647的质粒图谱；
图4：突变菌株的己二酸产量结果。
具体实施方式
实施例1：突变位点选择
同源建模
以5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶(对应的基因为Tfu-1647)的氨基酸序列SEQID NO.1为基础，利用swiss-model对5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶进行同源建模，得到模型model-1647。
活性口袋及活性位点的预测
利用Discovery Studio 3.0对模型model-1647进行模拟，寻找活性口袋，如图2所示。
实施例2：突变体的构建
利用定点突变成功构建一个突变体E334R。
具体步骤如下：
(1)定点突变
以突变点为中心，突变点的前后各扩展15-20bp，设计序列如SEQ ID NO.3/SEQ IDNO.4所示的引物对6号-F:agtgatgtcgctatgaggattactactgatgccgtgca/6号-R:ggcatcagtagtaatcctcatagcgacatcactggcg。
以突变点为中心，以连接有亲本基因的质粒pTrc99A-0067-1647为模版(质粒图谱见图3)进行全质粒PCR(PCR的体系见表1)。其中连接有亲本基因的质粒pTrc99A-0067-1647是指在质粒pTrc99A上连接氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶的基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本基因。
表1：质粒pTrc99A-0067-1647全质粒PCR的体系
其反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，反应进行28个循环之后，72℃再延伸10min。
(2)PCR产物的纯化
用PCR纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)对PCR产物进行纯化。首先，将PCR产物转移至干净的1.5mL的离心管中再用ddH2O补充至100μL，然后向里面加入5倍体积(500μL)的buffer B3，充分混匀，将混合液转移至全部转移至吸附柱，8000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。向吸附柱中加入500μL WashSolution，9000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，该步骤重复两次。然后将空吸附柱和收集管放入离心机，10000g离心2min，以除尽残余的乙醇。最后，在吸附膜的中央加入50℃预热的ddH2O 40μL，室温静置2min，9000g离心1min。将得到的DNA溶液于-20℃保存或直接用于后续实验。
(3)DpnI酶消化PCR纯化产物
将纯化产物用DpnI进行消化，其消化的体系见表2。
表2：消化PCR产物的体系
将该混合液加入200μL的离心管中，在涡旋器上震荡混匀，然后瞬时离心一下，置于37℃水浴锅中，保温2h。然后于-20℃保存或直接用于后续实验。
(4)质粒转化入JM109感受态细胞
将步骤(3)所得消化产物20μL加入到感受态JM109细胞中，混匀，置于冰上，冰浴30min以上后，42℃热激90sec，热激后迅速将其转移至冰上，继续冰浴3-5min，然后向其中加入800μL的LB培养基后置于37℃，220r/min的摇床上孵育。1h后3500g离心2min，弃去800μL上清，用剩余的液体将菌体悬浮起来，均匀地涂布在含50μg/mLAmp的固体LB平板上，置37℃培养箱里培育过夜。
(5)突变质粒的提取
从上步中的平板上挑取单菌落，放入含50μg/mLAmp的LB培养基里，37℃，220r/min的摇床上孵育10-16h，取菌液5mL，8000g离心2min，收集菌体，倒尽培养基，加入250μL的Buffer P1，吹打悬浮菌体，然后加入250μL的Buffer P2，立即温和地颠倒离心管10次混匀，静置2-4min，最后向离心管中再加入350μL的Buffer P3，温和地颠倒离心管10次混匀。于离心机中12000g离心10min，将上清小心的转移至吸附柱，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。然后向吸附柱中加入500μL的去蛋白液Buffer DW1，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，继续将吸附柱放入同一收集管中，向其中加入500μLWash Solution，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，该步骤重复两次。然后将空吸附柱和收集管放入离心机，10000g离心2min，以除尽残余的乙醇。最后，在吸附膜的中央加入50℃预热的ddH2O 60μL，室温静置2min，9000g离心1min。将得到的DNA溶液于-20℃保存或直接用于后续实验。
(6)导入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中
将突变质粒pTrc99A-0067-1647与该己二酸合成途径中的另外两个质粒pRSF-0875-2399，pCD-2576-2577(质粒pRSF-0875-2399是指在质粒pRSF上连接了氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的β-酮硫解酶基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因；质粒pCD-2576-2577是指在质粒pCD上连接了氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因)各5μL加入到100μL的BL21(DE3)感受态细胞中，混匀，置于冰上，冰浴30min以上后，42℃热激90sec，热激后迅速将其转移至冰上，继续冰浴3-5min，然后向其中加入800μL的LB培养基后置于37℃，220r/min的摇床上孵育。1h后3500g离心2min，弃去800μL上清，用剩余的液体将菌体悬浮起来，均匀地涂布在含Kan，Amp，Str(浓度都为50μg/mL)的固体LB平板上，置37℃培养箱里培育过夜，得到表达突变体E334R的突变菌株，命名为突变菌株6号。
实施例3：突变体对己二酸积累的影响
发酵培养突变的重组菌
挑取实施例2中得到的表达突变体E334R的突变菌株6号的单菌落接入含有Kan，Amp，Str(浓度都为50μg/mL)三种抗生素的LB培养基中，37℃，220r/min摇床培养过夜(种子液)，将该种子液以2％的比例接入到发酵培养基M9中(除M9中必含的盐外还包含1.5～2.5mM MgSO4、0.08～0.12mM CaCl2、50g/mL的Kan，Amp，Str三种抗生素和4g/L的葡萄糖)，待菌体生长至OD＝0.7左右，加入1M的IPTG30uL诱导，然后转入30℃摇床培养。分别在诱导后10h，14h，18h，22h，26h，30h，34h，38h，42h，46h取样1.5mL，置于2mL的离心管中，-20℃保存或直接用于后续实验。
高效液相色谱检测发酵液
将发酵液于12000g离心5min，取上清，用0.22μm的滤膜过滤入液相瓶中，以5mM的硫酸为流动相，柱温为30℃，流速为0.6mL/min，检测己二酸的积累量。其中未进行突变的重组菌BL21(DE3)pRSF-0875-2399，pTrc99A-0067-1647，pCD-2576-2577按同样的方法处理，作为对照。
突变株与对照相比，发酵24小时，己二酸产量提高近5倍，对照的产量是0.24g/L，而突变菌株6号的产量为1.01g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala Asp Val Asp Glu Gln Ser Arg Phe Pro Gln Glu Ala Tyr Glu Ala
35 40 45
Leu Arg Ala Ser Asp Phe His Ala Pro His Val Ala Glu Glu Tyr Gly
50 55 60
Gly Val Gly Ala Asp Ala Leu Ala Thr Cys Ile Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ala Arg Val Cys Ala Ser Ser Ser Leu Ile Pro Ala Val Asn Lys Leu
85 90 95
Gly Ser Met Pro Leu Ile Leu Ser Gly Ser Asp Glu Val Lys Gln Arg
100 105 110
Tyr Leu Pro Glu Leu Ala Ser Gly Glu Ala Met Phe Ser Tyr Gly Leu
115 120 125
Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Asp Thr Ala Ser Met Arg Thr Arg Ala
130 135 140
Val Arg Asp Gly Asp Asp Trp Ile Leu Asn Gly Gln Lys Ser Trp Ile
145 150 155 160
Thr Asn Ala Gly Ile Ser Lys Tyr Tyr Thr Val Met Ala Val Thr Asp
165 170 175
Pro Asp Gly Pro Arg Gly Arg Asn Ile Ser Ala Phe Val Val His Ile
180 185 190
Asp Asp Pro Gly Phe Ser Phe Gly Glu Pro Glu Arg Lys Leu Gly Ile
195 200 205
Lys Gly Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ile Phe Asp Asn Val Arg Ile Pro
210 215 220
Gly Asp Arg Leu Val Gly Lys Val Gly Glu Gly Leu Arg Thr Ala Leu
225 230 235 240
Arg Thr Leu Asp His Thr Arg Val Thr Ile Gly Ala Gln Ala Val Gly
245 250 255
Ile Ala Gln Gly Ala Leu Asp Tyr Ala Leu Gly Tyr Val Lys Glu Arg
260 265 270
Lys Gln Phe Gly Lys Ala Ile Ala Asp Phe Gln Gly Ile Gln Phe Met
275 280 285
Leu Ala Asp Met Ala Met Lys Leu Glu Ala Ala Arg Gln Met Val Tyr
290 295 300
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305 310 315 320
Gly Ala Ala Ala Lys Cys Phe Ala Ser Asp Val Ala Met Glu Ile Thr
325 330 335
Thr Asp Ala Val Gln Leu Leu Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Arg Asp Tyr
340 345 350
Pro Val Glu Arg Met Met Arg Asp Ala Lys Ile Thr Gln Ile Tyr Glu
355 360 365
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Lys
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85 90 95
Val Ile Ala Ala Asn Arg Ala Ile Ala Val Gly Asp Ala Ser Leu Ala
100 105 110
Val Ala Gly Gly Val Glu Ser Met Ser Arg Ala Pro Trp Val Leu Pro
115 120 125
Lys Pro Ala Gln Gly Phe Pro Thr Gly His Glu Thr Leu Tyr Ser Thr
130 135 140
Thr Leu Gly Trp Arg Met Val Asn Pro Ala Met Pro Glu Gln Trp Thr
145 150 155 160
Val Ser Leu Gly Glu Ser Thr Glu Gln Val Ala Ala Thr Tyr Gly Ile
165 170 175
Ser Arg Ala Glu Gln Asp Ala Phe Ala Leu Arg Ser His Glu Arg Ala
180 185 190
Ala Arg Ala Trp Ala Glu Gly Val Phe Asp Ala Glu Ile Thr Gln Ile
195 200 205
Pro Gly Ala Glu Leu Glu Arg Asp Glu Ser Ile Arg Glu Thr Ser Ala
210 215 220
Glu Lys Leu Ala Ala Leu Lys Pro Ala Phe Arg Pro Asp Gly Thr Ile
225 230 235 240
Thr Ala Gly Asn Ala Ser Pro Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala Leu Leu
245 250 255
Ile Gly Asp Ala Ala Ala Ala Glu Arg Val Gly Arg Glu Pro Leu Ala
260 265 270
Arg Ile Val Ser Arg Gly Val Ala Ala Val Asp Pro Asp Val Phe Gly
275 280 285
Ile Gly Pro Val Gln Ala Ala Glu Ile Ala Leu Arg Arg Ala Gly Ile
290 295 300
Gly Trp Asp Asp Leu Ser Val Val Glu Leu Asn Glu Ala Phe Ala Ala
305 310 315 320
Gln Ser Leu Ala Cys Leu Lys Leu Trp Pro Asp Leu Asp Pro Glu Ile
325 330 335
Val Asn Pro Asn Gly Gly Ala Ile Ala Ile Gly His Pro Leu Gly Ala
340 345 350
Ser Gly Ala Arg Ile Val Gly Thr Leu Ala His Glu Leu His Arg Arg
355 360 365
Gly Gly Gly Trp Gly Leu Ala Ala Ile Cys Ile Gly Val Gly Gln Gly
370 375 380
Leu Ala Val Val Leu His Arg
385 390
<210> 6
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Met Val Glu Glu Ile Asn Lys Val Gly Val Val Gly Leu Gly Thr Met
1 5 10 15
Gly Ala Gly Ile Val Glu Val Phe Ala Arg Ala Gly Phe Thr Val Thr
20 25 30
Gly Val Glu Ile Asp Asp Ala Ala Leu Glu Arg Gly Arg Thr His Leu
35 40 45
Glu Lys Ser Leu Ala Lys Ala Val Ala Lys Gly Lys Leu Thr Glu Asp
50 55 60
Glu Gln Arg Ala Ile Leu Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Ser Arg Asp
65 70 75 80
Asp Leu Ala Asp Ala His Leu Ala Val Glu Ala Val Pro Glu Arg Leu
85 90 95
Asp Ile Lys Arg Ser Val Phe Ala Asp Leu Asp Arg Ile Leu Pro Pro
100 105 110
Ala Ala Ile Leu Ala Thr Asn Thr Ser Ser Leu Ser Val Thr Glu Ile
115 120 125
Ala Ala Leu Thr Ser Arg Pro Gly Lys Val Ile Gly Leu His Phe Phe
130 135 140
Asn Pro Ala Pro Val Met Arg Leu Val Glu Ile Val Thr Thr Val Val
145 150 155 160
Thr Glu Pro His Val Arg Glu Thr Ala Thr Gln Val Val Thr Arg Leu
165 170 175
Gly Lys Thr Pro Val Ala Val Gly Asp Arg Ala Gly Phe Val Ala Asn
180 185 190
Ala Leu Leu Val Pro Tyr Leu Asn His Ala Val Ala Val Tyr Glu Gln
195 200 205
Gly Leu Ala Thr Arg Glu Gln Ile Asp Ala Ala Ile Thr Ser Ala Ala
210 215 220
Gly Phe Pro Met Gly Pro Leu Thr Leu Met Asp Leu Val Gly Leu Asp
225 230 235 240
Val Leu Leu Asp Val Met Asp Val Leu Trp Asp Glu Phe Arg Arg Pro
245 250 255
Arg Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Arg Arg Met Val Ala Ala Gly Leu
260 265 270
Leu Gly Arg Lys Ser Gly Arg Gly Phe Tyr Asp Tyr Ser Gly Ala Asp
275 280 285
Asn Pro Ala Glu Pro Glu Pro Thr Ala Pro Leu Ala Gln Leu Val Gly
290 295 300
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305 310 315 320
Leu Asn Asp Ala Ala Arg Met Ile Gly Asp Gly Tyr Ala Thr Ala Asp
325 330 335
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340 345 350
Ala Ala Met Leu Asp Glu Arg Gly Val Lys Asn Val Thr Glu Thr Leu
355 360 365
Ala Glu Leu Ala Ala Ala Gly Leu Phe Thr Asp Asp Thr Ala Pro Leu
370 375 380
Leu Thr Met Leu Ala Lys Gln Gly Lys Asp Thr Leu Arg Ser
385 390 395
<210> 7
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Met Asn Asp Leu Arg Arg Asn Pro Ala Ser Glu Ser Gln Gly Arg Thr
1 5 10 15
Leu Val Asp Leu Phe Glu Tyr Gln Ala Lys Ala Leu Phe Ala Glu Tyr
20 25 30
Gly Val Pro Val Pro Gln Gly Lys Val Ala Ser Thr Pro Glu Glu Val
35 40 45
Arg Ala Ile Ala Glu Glu Phe Ala Ala Ala Gly Lys Pro Arg Val Val
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Val Ala Asp Gly Pro Asp Asp Ala Val Ala Lys Ala Lys Gln Ile
85 90 95
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100 105 110
Glu Ala Ser Asp Ile Ala Glu Glu Tyr Tyr Phe Ser Phe Leu Leu Asp
115 120 125
Arg Ala Asn Arg Ser Phe Leu Ser Ile Cys Ser Ala Glu Gly Gly Met
130 135 140
Glu Ile Glu Glu Val Ala Ala Thr Asn Pro Asp Ala Val Ala Lys Val
145 150 155 160
Pro Ile Ser Pro Leu Lys Gly Ala Pro Ala Asp Val Ala Ala Asp Ile
165 170 175
Val Ala Gln Gly Lys Leu Pro Glu Ala Ala Ala Gln Gly Ala Val Asp
180 185 190
Val Ile Thr Lys Leu Trp Lys Val Phe Val Glu Lys Asp Ala Thr Leu
195 200 205
Val Glu Val Asn Pro Leu Ile Leu Thr Lys Asp Gly Arg Val Val Ala
210 215 220
Leu Asp Gly Lys Val Thr Leu Asp Asp Asn Ala Glu Phe Arg Gln Asp
225 230 235 240
Leu Glu Ser Leu Ala Ser Ala Ala Glu Gly Asp Pro Leu Glu Val Lys
245 250 255
Ala Lys Glu Lys Gly Leu Asn Tyr Val Lys Leu Asp Gly Glu Val Gly
260 265 270
Ile Ile Gly Asn Gly Ala Gly Leu Val Met Ser Thr Leu Asp Val Val
275 280 285
Ala Tyr Ala Gly Glu Gln His Gly Gly Val Lys Pro Ala Asn Phe Leu
290 295 300
Asp Ile Gly Gly Gly Ala Ser Ala Glu Val Met Ala Asn Gly Leu Glu
305 310 315 320
Ile Ile Leu Ser Asp Pro Ala Val Lys Ser Val Phe Val Asn Val Phe
325 330 335
Gly Gly Ile Thr Ala Cys Asp Ala Val Ala Asn Gly Ile Val Gln Ala
340 345 350
Leu Glu Leu Leu Glu Ser Arg Gly Glu Asp Val Thr Lys Pro Leu Val
355 360 365
Val Arg Leu Asp Gly Asn Asn Ala Glu Leu Gly Arg Ser Ile Leu Asn
370 375 380
Glu Arg Asn His Pro Ala Val Arg Gln Val Asp Thr Met Asp Gly Ala
385 390 395 400
Ala Ala Leu Ala Ala Glu Leu Ala Ala Lys
405 410
<210> 8
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Met Ala Ile Phe Leu Thr Lys Asp Ser Lys Val Leu Val Gln Gly Met
1 5 10 15
Thr Gly Ser Glu Gly Thr Lys His Thr Arg Arg Met Leu Ala Ala Gly
20 25 30
Thr Asn Ile Val Gly Gly Val Asn Pro Arg Lys Ala Gly Gln Val Val
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Met Lys Ala Thr Gly Ala Asp Val Thr Val Ile Phe Val Pro Pro Lys
65 70 75 80
Phe Ala Lys Asp Ala Val Ile Glu Ala Ile Asp Ala Glu Ile Gly Leu
85 90 95
Ala Val Val Ile Thr Glu Gly Ile Pro Val His Asp Thr Ala Thr Phe
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Pro Ala Asp Ile Thr Lys Pro Gly Arg Ile Gly Leu Val Ser Lys Ser
145 150 155 160
Gly Thr Leu Thr Tyr Gln Met Met Tyr Glu Leu Arg Asp Ile Gly Phe
165 170 175
Ser Thr Cys Val Gly Ile Gly Gly Asp Pro Ile Ile Gly Thr Thr His
180 185 190
Ile Asp Ala Leu Ala Ala Phe Glu Ala Asp Pro Asp Thr Asp Val Ile
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245 250 255
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
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180 185 190
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195 200 205
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Leu Asp Gly Lys Val Thr Leu Asp Asp Asn Ala Glu Phe Arg Gln Asp
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Leu Glu Ser Leu Ala Ser Ala Ala Glu Gly Asp Pro Leu Glu Val Lys
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340 345 350
Leu Glu Leu Leu Glu Ser Arg Gly Glu Asp Val Thr Lys Pro Leu Val
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Val Arg Leu Asp Gly Asn Asn Ala Glu Leu Gly Arg Ser Ile Leu Asn
370 375 380
Glu Arg Asn His Pro Ala Val Arg Gln Val Asp Thr Met Asp Gly Ala
385 390 395 400
Ala Ala Leu Ala Ala Glu Leu Ala Ala Lys
405 410

Claims (9)

1.一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本，将第334位的谷氨酸突变为精氨酸；所述5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.含有编码权利要求1所述突变体核苷酸序列的重组质粒载体。
4.表达权利要求1所述突变体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞还表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的β-酮硫解酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的琥珀酰辅酶A合成酶，以及氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的琥珀酰辅酶A合成酶。
6.根据权利要求4所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。
7.根据权利要求4所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的构建方法是：
(1)设计定点突变所用引物，以携带5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本基因的载体为模板进行突变并构建突变体的质粒载体；其中质粒载体是指在质粒pTrc99A上连接氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶的基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶基因；
(2)将突变质粒转化进宿主细胞；
(3)将连接了氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的β-酮硫解酶基因和氨基酸序列如SEQID NO.6所示的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因的质粒pRSF转化进宿主细胞；
(4)将连接了氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因的质粒pCD转化进宿主细胞，最终得到重组细胞。
8.权利要求1所述突变体在生产己二酸中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用是将含有权利要求1所述突变体的单菌落接入含有Kan，Amp，Str三种抗生素的LB培养基中，35-38℃，200-250r/min摇床培养过夜得到种子液，将种子液以2-5％接种量接入到发酵培养基中，待菌体生长至OD＝0.7左右，加入IPTG诱导，然后转入28-32℃培养。
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