CN107312738B

CN107312738B - 一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法

Info

Publication number: CN107312738B
Application number: CN201710616371.6A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 张权; 陈修来; 刘佳; 罗秋玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-07-26
Filing date: 2017-07-26
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2037-07-26
Also published as: US20190032062A1; CN107312738A; US10508279B2

Abstract

本发明公开了一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段从大肠杆菌K4(ATCC 23502)中克隆获得磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和氨基转移酶基因glmS，将构建好的表达质粒pETM6R1‑RBS1‑glmM‑GGGS‑glmS导入大肠杆菌K4(ATCC 23502)，通过氨苄青霉素抗性平板筛选获得高效生产果糖软骨素工程菌ZQ33。工程菌株ZQ33在5L发酵罐下采用补料分批发酵策略，发酵36h，果糖软骨素的产量达到了3.99g/L，较野生型菌株提高了108.90％。

Description

一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是一种由葡萄糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1,3键和β-1,4键交替连接而成的直链酸性粘多糖，广泛存在于人体软骨、肌腱、椎间盘等结缔组织中，与透明质酸、肝素、硫酸角质素组成了糖胺聚糖。硫酸软骨素极其类似物具有多种生物活性和药用价值，在临床上用于治疗风湿病和关节炎，可赋予软骨凝胶样特性和抗变形能力，享有人体“软黄金”之称，同时硫酸软骨素极其类似物作为膳食补充剂和保湿剂，广泛应用于食品和化妆品领域。

目前，硫酸软骨素极其类似物工业化的主要生产方法为动物组织提取法，即采用碱水解、蛋白酶酶解等工艺方法从猪、牛、鲨鱼等动物软骨中制得。但是提取法自身存在诸多问题，如原材料限制、生产工艺复杂、产品质量不稳定、产业水平不高、环境污染严重等，严重制约了硫酸软骨素极其类似物产业的发展。因此，国内外学者不断探索寻求利用微生物发酵法高效生产硫酸软骨素极其类似物的方法。

近年来，国内外研究人员从生化工程和代谢工程两个方面对微生物生产硫酸软骨素及其类似物进行了系统性地研究。其中，1988年发现了E.coli O10:K4:H4的荚膜多糖结构为硫酸软骨素类似物果糖软骨素，1996年利用K4菌株进行发酵研究，采用Rodriguez的发酵培养基，果糖软骨素的产量达到了300mg/L，通过表达软骨素合成酶基因kfoC，抗终止子rfaH等策略提高果糖软骨素的产量。进一步提高果糖软骨素产量成为亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一株高产果糖软骨素的大肠杆菌工程菌，以及应用该工程菌生产果糖软骨素的方法。本发明通过在大肠杆菌细胞中过量表达合成果糖软骨素途径中的关键酶(磷酸葡萄糖胺变位酶glmM和氨基转移酶glmS)，进而实现了果糖软骨素的高效生产，为果糖软骨素的工业化生产奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是过表达了磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶是通过核糖体结合位点RBS1与表达载体相连；所述核糖体结合位点RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶是通过融合表达方式进行表达。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸葡萄糖胺变位酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述的氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是按照核糖体结合位点RBS1、磷酸葡萄糖胺变位酶glmM基因、寡肽连接子GGGS和氨基转移酶glmS基因的顺序融合后，整合到核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的表达载体上进行表达；所述核糖体结合位点RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述寡肽连接子GGGS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌K4ATCC23502。

本发明的第二个目的是提供一种所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤为：

(1)获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1的磷酸葡萄糖胺变位酶glmM和氨基酸序列如SEQ ID NO.2氨基转移酶glmS基因；

(2)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.5的核糖体结合位点RBS1和核苷酸序列如SEQID NO.6的寡肽连接子GGGS基因；

(3)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的表达载体pETM6R1；

(4)将步骤(1)和(2)所得的基因，按照核糖体结合位点RBS1、磷酸葡萄糖胺变位酶glmM基因、寡肽连接子GGGS基因和氨基转移酶glmS基因的顺序，连接到步骤(3)的表达载体上，得到重组质粒pETM6R1-RBS1-glmM-GGGS-glmS；

(5)将步骤(4)得到的重组质粒转化到大肠杆菌K4ATCC 23502中，得到大肠杆菌重组菌。

本发明的第三个目的是提供所述大肠杆菌在生产果糖软骨素中的应用，所述应用发酵培养基：甘油10g/L，大豆蛋白胨1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，K₂HPO₄ 10g/L，MgCl₂ 0.1g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，柠檬酸钠0.5g/L；补料培养基：甘油400g/L，大豆蛋白胨40g/L；37℃下补料分批发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是按5-15％的接种量接种至发酵罐中，培养5-10h 添加0.05-0.15mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为35-38℃。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是在发酵过程中，当溶氧陡然上升，开始进行补料，补料策略为pH-stat，当pH超过7.0时，开始补料，当pH低于7.0时，停止补料。

本发明有益效果

本发明采用融合表达磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶，实现了基因的高效表达；在大肠杆菌K4中过表达，有效提高了果糖软骨素的产量，相比于未过表达磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶的大肠杆菌K4，果糖软骨素产量从1.91g/L提高至3.99g/L，提高了108.9％。本发明方法在工业上用于提高果糖软骨素的产量具有潜在且非常广泛的价值。

附图说明

图1所示为磷酸葡萄糖胺变位酶与氨基转移酶串联表达融合片段的构建示意图；

图2所示为表达磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶融合片段重组载体的结构图；

图3所示为含有磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶重组载体的重组菌株在摇瓶发酵中的果糖软骨素产量；

图4所示为含有磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶重组载体的重组菌株在5L发酵罐上补料发酵的果糖软骨素产量。

具体实施方式

序列表中未相关核苷酸序列信息：

(1)SEQ ID NO.1序列信息为大肠杆菌来源的磷酸葡萄糖胺变位酶glmM氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.2序列信息为大肠杆菌来源的氨基转移酶glmS氨基酸序列；

(3)SEQ ID NO.3序列信息为人工构建融合片段RBS1-glmM-GGGS-glmS的基因序列；

(4)SEQ ID NO.4序列信息为大肠杆菌诱导型启动子pTrc的基因序列；

(5)SEQ ID NO.5序列信息为RBS1基因序列；

(6)SEQ ID NO.6序列信息为GGGS基因序列；

(7)SEQ ID NO.7序列信息为人工构建质粒pETM6R1的基因序列；

采用硫酸咔唑比色法测定果糖软骨素中的葡萄糖醛酸含量，再乘以2.88倍即获得果糖软骨素的含量。

实施例1：融合片段RBS1-glmM-GGGS-glmS的构建

本发明所用的磷酸葡萄糖胺变位酶glmM基因和氨基转移酶glmS基因来源于大肠杆菌 K4(ATCC23502)，大肠杆菌K4接种于25mL Luria-Bertani(LB)液体培养基，在37℃，200rpm培养12h，收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌菌株的基因组DNA。

根据已公布的基因组信息序列，分别设计序列如SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9引物对 RH-glmM-S1/RH-glmM-A、序列如SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11引物对RH-glmS-S/ RH-glmS-A，以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取glmM 和glmS基因，然后以RH-glmM-S1/RH-glmS-A为引物对，已经获取的glmM和glmS基因片段为模板，采用标准的融合PCR扩增体系和程序，获得融合片段RBS1-glmM-GGGS-glmS。

引物序列信息：5’→3’方向

RH-glmM-S1:GCTCTAGAAAGAGGGCGCGGCAGAGAAGGAGGAGGTAAGAAATGAGTAATCGTAAATATTTCGGT

RH-glmM-A:CGCCAACAATTCCACACATAGAACCACCACCAACGGCTTTTACTGCA TCG

RH-glmS-S:CGATGCAGTAAAAGCCGTTGGTGGTGGTTCTATGTGTGGAATTGTTGG CG

RH-glmS-A:CCGCTCGAGTTACTCAACCGTAACCGATTTTG

PCR扩增获取的融合片段RBS1-glmM-GGGS-glmS，采用琼脂糖凝胶核酸电泳切胶回收，回收产物连接pMD19T载体，体系10μL：5μL solution连接酶，4μL目的片段，1μLpMD19 T载体，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性转化子进行测序，比对正确，证明融合片段RBS1-glmM-GGGS-glmS构建成功，质粒命名为 pMD19-RBS1-glmM-GGGS-glmS。

实施例2：融合片段RBS2-glmM-GGGS-glmS的构建

将实施例1中RH-glmM-S1序列替换为序列如SEQ ID NO.12的RH-glmM-S2、序列如SEQ ID NO.13的RH-glmM-S3序列，其他方法与实施例1一致，构建得到融合片段 RBS2-glmM-GGGS-glmS、RBS3-glmM-GGGS-glmS。

引物序列信息：5’→3’方向

RH-glmM-S2:GCTAGATATTTAAACTATCACGACATAAGGAGGTCAGGGATGAGTAATCGTAAATATTTCGGT

RH-glmM-S3:GCTCTAGACGACATAACGTTAGAAAAGAATAAGGTAGTTTCATGAGTAATCGTAAATATTTCGGT

实施例3：表达载体pETM6R1的构建

根据pTrcHisA质粒公布的序列，分别设计序列如SEQ ID NO.14/SEQ ID NO.15引物对 pTrcHisA-S/pTrcHisA-A，以质粒pTrcHisA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取pTrc启动子基因序列。

引物序列信息：5’→3’方向

pTrcHisA-S:CCCTAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATATTGACAATTAATCATCCGG

pTrcHisA-A:GCTCTAGAGGTAATTTTTAATAATAAAGTTAATCG

在上下游引物两端分别引入AvrII和XbaI限制性酶切位点。PCR扩增获取的pTrc片段和质粒pETM6分别采用AvrII和XbaI进行双酶切，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μL：6μL双酶切目的片段，2μL双酶切载体，1μLT4DNAligasebuffer，1μLT4DNAligase，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性转化子进行测序，比对正确，证明重组质粒pETM6R1构建成功。

实施例4：重组质粒pETM6R1-RBS1-glmM-GGGS-glmS的构建

JM109(带有质粒pMD19-RBS1-glmM-GGGS-glmS)菌株接种于25mL LB液体培养基，在37℃，200rpm培养12h，收集菌体，采用细菌质粒提取试剂盒提取大肠杆菌菌株的质粒pMD19-RBS1-glmM-GGGS-glmS。实施案例1中，在glmM上游引物RH-glmM-S1和glmS下游引物RH-glmS-A分别引入了XbaI和XhoI限制性酶切位点。质粒pETM6R1和 pMD19-RBS1-glmM-GGGS-glmS分别采用XbaI和XhoI进行双酶切，采用琼脂糖核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μL：6μL双酶切目的片段，2μL双酶切载体，1μL T4DNAligase buffer，1μLT4DNAligase，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性转化子进行测序，比对正确，证明重组质粒 pETM6R1-RBS1-glmM-GGGS-glmS构建成功。重组质粒转化Escherichia coli K4，以100 mg/mL的氨苄青霉素平板筛选，并对重组菌株进行PCR验证和测序验证，对成功转入 pETM6R1-RBS1-glmM-GGGS-glmS的大肠杆菌菌株命名为ZQ33。

实施例5：重组质粒pETM6R1-RBS2-glmM-GGGS-glmS、pETM6R1-RBS3-glmM-GGGS-glmS的构建

按照实施例4的方法将实施例2所得融合片段RBS2-glmM-GGGS-glmS、 RBS3-glmM-GGGS-glmS连接到质粒pETM6R1，再转化进大肠杆菌K4内，得到重组大肠杆菌ZQ32、ZQ31。

实施例6：重组菌株ZQ31、ZQ32、ZQ33摇瓶发酵

挑取ZQ31、ZQ32、ZQ33重组菌株进行摇瓶发酵。单克隆接种于50mL(500mL摇瓶) 含有10mg/mLAmp的LB培养基作为摇瓶发酵的种子液，置于37℃ 200rpm培养10h。摇瓶发酵的接种量为1％，发酵条件为：转速200rpm，温度37℃，初始pH控制在7.0。发酵培养基为：甘油10g/L，大豆蛋白胨1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，K₂HPO₄ 10g/L，MgCl₂ 0.1g/L， (NH₄)₂SO₄ 1g/L，柠檬酸钠0.5g/L。培养5h添加1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为 37℃，每4h取样一次测定果糖软骨素的产量。为测定果糖软骨素的产量，收集发酵液，10000 rpm下室温离心15min，上清转移至另一离心管中，加入3倍体积的无水乙醇充分混匀至4℃ 冰箱醇沉过夜。10000rpm离心10min，去除液体，白色沉淀置于65℃ 10min，然后用超纯水复溶，用于下一步产量的测定。整个培养过程以大肠杆菌K4为对照，但不加入氨苄青霉素。

根据果糖软骨素的产量测定，结果如图3所示，发酵37h，原始菌株K4、重组菌株ZQ31、 ZQ32、ZQ33果糖软骨素产量分别为0.106、0.115、0.206、0.418g/L，较原菌产量均有所提高，其中ZQ33较原菌提高了294.3％。

实施例7：重组菌株ZQ33在5L发酵罐进行分批补料发酵

挑取ZQ33重组菌株进行上罐发酵。单克隆接种于50mL(500mL摇瓶)含有10mg/mLAmp的LB培养基作为上罐的种子液，置于37℃ 200rpm培养10h。发酵罐装液量为2.5L，发酵培养基为：甘油10g/L，大豆蛋白胨1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，K₂HPO₄ 10g/L，MgCl₂ 0.1g/L， (NH₄)₂SO₄ 1g/L，柠檬酸钠0.5g/L；补料培养基：甘油400g/L，大豆蛋白胨40g/L；37℃ 下补料分批发酵。发酵培养基的pH控制为7.0。按10％的接种量接种至发酵罐中，培养5h 添加1mmol/L的IPTG进行诱导，发酵过程中，当溶氧陡然上升，开始进行补料，补料策略为pH-stat，当pH超过7.0时，开始补料，当pH低于7.0时，停止补料，补料周期为5S，补料持续至发酵结束，每4h取样一次测定果糖软骨素的产量。果糖软骨素处理及测定方法同实施例6。

根据果糖软骨素的产量测定，结果如图4所示，发酵36h，重组菌株ZQ33和未过表达磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶的野生型菌株产量均达到最大值，分别为3.99g/L和1.91 g/L。

以上结果说明，本发明技术采用基因工程技术，过量表达果糖软骨素合成路径上的葡萄糖胺变位酶glmM和氨基转移酶glmS能够有效提高果糖软骨素的产量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 445

<212> PRT

<213> 大肠杆菌K4(Escherichia coli K4 ATCC 23502)

<400> 1

Met Ser Asn Arg Lys Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Gly Arg Val

1 5 10 15

Gly Asp Ala Pro Ile Thr Pro Asp Phe Val Leu Lys Leu Gly Trp Ala

20 25 30

Ala Gly Lys Val Leu Ala Arg His Gly Ser Arg Lys Ile Ile Ile Gly

35 40 45

Lys Asp Thr Arg Ile Ser Gly Tyr Met Leu Glu Ser Ala Leu Glu Ala

50 55 60

Gly Leu Ala Ala Ala Gly Leu Ser Ala Leu Phe Thr Gly Pro Met Pro

65 70 75 80

Thr Pro Ala Val Ala Tyr Leu Thr Arg Thr Phe Arg Ala Glu Ala Gly

85 90 95

Ile Val Ile Ser Ala Ser His Asn Pro Phe Tyr Asp Asn Gly Ile Lys

100 105 110

Phe Phe Ser Ile Asp Gly Thr Lys Leu Pro Asp Ala Val Glu Glu Ala

115 120 125

Ile Glu Ala Glu Met Glu Lys Glu Ile Ser Cys Val Asp Ser Ala Glu

130 135 140

Leu Gly Lys Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Ala Gly Arg Tyr Ile Glu

145 150 155 160

Phe Cys Lys Ala Thr Phe Pro Asn Glu Leu Ser Leu Ser Glu Leu Lys

165 170 175

Ile Val Val Asp Cys Ala Asn Gly Ala Thr Tyr His Ile Ala Pro Asn

180 185 190

Val Leu Arg Glu Leu Gly Ala Asn Val Ile Ala Ile Gly Cys Glu Pro

195 200 205

Asn Gly Val Asn Ile Asn Ala Glu Val Gly Ala Thr Asp Val Arg Ala

210 215 220

Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Glu Lys Ala Asp Leu Gly Ile Ala Phe

225 230 235 240

Asp Gly Asp Gly Asp Arg Val Ile Met Val Asp His Glu Gly Asn Lys

245 250 255

Val Asp Gly Asp Gln Ile Met Tyr Ile Ile Ala Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Gln Gly Gln Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Thr Leu Met Ser Asn Met

275 280 285

Gly Leu Glu Leu Ala Leu Lys Gln Leu Gly Ile Pro Phe Ala Arg Ala

290 295 300

Lys Val Gly Asp Arg Tyr Val Leu Glu Lys Met Gln Glu Lys Gly Trp

305 310 315 320

Arg Ile Gly Ala Glu Asn Ser Gly His Val Ile Leu Leu Asp Lys Thr

325 330 335

Thr Thr Gly Asp Gly Ile Val Ala Gly Leu Gln Val Leu Ala Ala Met

340 345 350

Ala Arg Asn His Met Ser Leu His Asp Leu Cys Ser Gly Met Lys Met

355 360 365

Phe Pro Gln Ile Leu Val Asn Val Arg Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Asp

370 375 380

Pro Leu Glu His Glu Ser Val Lys Ala Val Thr Ala Glu Val Glu Ala

385 390 395 400

Ala Leu Gly Asn Arg Gly Arg Val Leu Leu Arg Lys Ser Gly Thr Glu

405 410 415

Pro Leu Ile Arg Val Met Val Glu Gly Glu Asp Glu Ala Gln Val Thr

420 425 430

Glu Phe Ala His Arg Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala Val

435 440 445

<210> 2

<211> 608

<212> PRT

<213> 大肠杆菌K4(Escherichia coli K4 ATCC 23502)

<400> 2

Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg

35 40 45

Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu

50 55 60

His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu

65 70 75 80

Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val

85 90 95

Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu

100 105 110

Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile

115 120 125

Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu

130 135 140

Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val

145 150 155 160

Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly

165 170 175

Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu

195 200 205

Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp

210 215 220

Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln

225 230 235 240

Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu

245 250 255

Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile

260 265 270

Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu

275 280 285

Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser

290 295 300

Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly

305 310 315 320

Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser

325 330 335

Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu

340 345 350

Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr

355 360 365

Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg

370 375 380

Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val

385 390 395 400

Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu Val

405 410 415

Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His Asp

420 425 430

Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met Leu

435 440 445

Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp Lys

450 455 460

His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala Leu

465 470 475 480

Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu Ala

485 490 495

Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp Ala

500 505 510

Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu Lys

515 520 525

Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu Tyr

530 535 540

Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met His

545 550 555 560

Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe Tyr

565 570 575

Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys Gly

580 585 590

Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu

595 600 605

<210> 3

<211> 3217

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tctagaaaga gggcgcggca gagaaggagg aggtaagaaa tgagtaatcg taaatatttc 60

ggtaccgatg ggattcgtgg tcgtgtaggg gatgcgccga tcacacctga ttttgtgctt 120

aagctgggtt gggccgcggg taaagtgctg gcgcgccacg gctcccgtaa gatcattatt 180

ggtaaagaca cgcgtatttc tggctatatg ctggagtcag cactggaagc gggtctggcg 240

gcagcgggcc tttccgcact cttcactggc ccgatgccaa caccggccgt ggcttatctg 300

acgcgtacct tccgcgcaga ggccggaatt gtgatatctg catcgcataa cccgttctac 360

gataatggca ttaaattctt ctctatcgac ggcaccaaac tgccggatgc ggtagaagag 420

gccatcgaag cggaaatgga aaaggagatc agctgcgttg attcggcaga actgggtaaa 480

gccagccgta tcgttgatgc cgcgggtcgc tatatcgagt tttgcaaagc cacgttcccg 540

aacgaactta gcctcagtga actgaagatt gtggtggatt gtgcaaacgg tgcgacttat 600

cacatcgcgc cgaacgtgct gcgcgaactg ggggcgaacg ttatcgctat cggttgtgag 660

ccaaacggtg taaacatcaa tgccgaagtg ggggctaccg acgttcgcgc gctccaggct 720

cgtgtgctgg ctgaaaaagc ggatctcggt attgccttcg acggcgatgg cgatcgcgtg 780

attatggttg accatgaagg caataaagtc gatggcgatc agatcatgta tatcatcgcg 840

cgtgaaggtc ttcgtcaggg ccagctgcgt ggtggcgctg tgggtacatt gatgagcaac 900

atggggcttg aactggcgct gaaacagtta ggaattccat ttgcgcgcgc gaaagtgggt 960

gaccgctacg tactggaaaa aatgcaggag aaaggctggc gtatcggtgc agagaattcc 1020

ggtcatgtga tcctgctgga taaaactact accggtgacg gcatcgttgc tggcttgcag 1080

gtgctggcgg ctatggcacg taaccatatg agcctgcacg acctttgcag cggcatgaaa 1140

atgttcccgc agattctggt taacgtacgt tacaccgcag gtagcggcga tccacttgag 1200

catgagtcag ttaaagccgt gaccgcagag gttgaagctg cgctgggcaa ccgtggacgc 1260

gtgttgctgc gtaaatccgg caccgaaccg ttaattcgcg tgatggtgga aggcgaagac 1320

gaagcgcagg tgactgaatt tgcacaccgc atcgccgatg cagtaaaagc cgttggtggt 1380

ggttctatgt gtggaattgt tggcgcgatc gcgcaacgtg atgtagcaga aatccttctt 1440

gaaggtttac gtcgtctgga ataccgcgga tatgactctg ccggtctggc cgttgttgat 1500

gcggaaggtc atatgacccg cctgcgtcgc ctcggtaaag tccagatgct ggctcaggca 1560

gcggaagaac atcctctgca tggcggcacc ggtattgctc atactcgctg ggcgacacac 1620

ggtgaacctt cagaagtgaa tgcgcatccg catgtttctg aacacattgt ggtggtgcat 1680

aacggcatca tcgaaaacca tgaaccgctg cgtgaagagc taaaagcgcg tggctatacc 1740

ttcgtttctg aaaccgacac cgaagtgatt gcccatctgg tgaactggga gctgaaacaa 1800

ggcgggactc tgcgtgaggc cgttctgcgt gctatcccgc agctgcgtgg tgcgtacggt 1860

acagtgatca tggactcccg tcacccggat accctgctgg cggcacgttc tggtagtccg 1920

ctggtgattg gcctggggat gggcgaaaac tttatcgctt ctgaccagct ggcgctgttg 1980

ccggtgaccc gtcgctttat cttccttgaa gagggcgata ttgcggaaat cactcgccgt 2040

tcggtaaaca tcttcgataa aactggcgcg gaagtaaaac gtcaggatat cgaatccaat 2100

ctgcaatatg acgcgggcga taaaggcatt taccgtcact acatgcagaa agagatctac 2160

gaacagccga acgcgatcaa aaacaccctt accggacgca tcagccacgg tcaggttgat 2220

ttaagcgagc tgggaccgaa cgccgacgaa ctgttgtcga aggttgagca tattcagatc 2280

ctcgcctgtg gtacttctta taactccggt atggtttccc gctactggtt tgaatcgcta 2340

gcaggtattc cgtgcgacgt cgaaatcgcc tctgaattcc gctatcgcaa atctgccgtg 2400

cgtcgtaaca gcctgatgat caccttgtca cagtctggcg aaaccgcgga taccctggct 2460

ggcctgcgtc tgtcgaaaga gctgggttac cttggttcac tggcaatctg taacgttccg 2520

ggttcttctc tggtgcgcga atccgatctg gcgctaatga ccaacgcggg tacagaaatc 2580

ggcgtggcat ccactaaagc attcaccact cagttaactg tgctgttgat gctggtggcg 2640

aagctgtctc gcctgaaagg tctggatgcc tccattgaac atgacattgt gcatggtctg 2700

caggcgttgc cgagccgtat tgagcagatg ctgtctcagg acaaacgcat tgaagctctg 2760

gcagaagatt tctctgacaa acatcacgcg ctgttcctgg gccgtggcga tcagtaccca 2820

atcgcgctgg aaggcgcatt gaagctgaaa gagatctctt acattcacgc tgaagcctac 2880

gctgcaggtg aactgaaaca cggtccgctg gcgctgattg atgccgatat gccggttatc 2940

gtcgttgcac cgaacaacga attgctggaa aaactaaaat ccaacattga agaagttcgc 3000

gcgcgtggcg gtcagttgta tgtcttcgcc gatcaggatg cgggttttgt aagtagcgat 3060

aacatgcaca tcatcgagat gccgcatgtg gaagaggtga ttgcaccaat cttctacacc 3120

gttccgctgc agctactggc ttatcacgtc gcgctgatca aaggtaccga cgttgaccag 3180

ccgcgtaacc tggcaaaatc ggttacggtt gagtaac 3217

<210> 4

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cctaggatcg agatcgatct cgatcccgcg aaattaatac gactcactat attgacaatt 60

aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 120

agcgccgctg agaaaaagcg aagcggcact gctctttaac aatttatcag acaatctgtg 180

tgggcactcg accggaatta tcgattaact ttattattaa aaattacctc taga 234

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

aagagggcgc ggcagagaag gaggaggtaa gaa 33

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ggtggtggtt ct 12

<210> 7

<211> 5351

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60

acaggaaaca gcgccgctga gaaaaagcga agcggcactg ctctttaaca atttatcaga 120

caatctgtgt gggcactcga ccggaattat cgattaactt tattattaaa aattacctct 180

agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tggcagatct caattggata 240

tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt ctggtaaaga aaccgctgct 300

gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagtc gcagcttaat taacctaaac 360

tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 420

gggttttttg ctagcgaaag gaggagtcga ctatatccgg attggcgaat gggacgcgcc 480

ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 540

tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 600

cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 660

acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 720

ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 780

gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 840

tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 900

ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc tggcggcacg atggcatgag attatcaaaa 960

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 1020

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 1080

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 1140

cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 1200

gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 1260

gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 1320

tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 1380

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 1440

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 1500

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 1560

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 1620

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 1680

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 1740

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 1800

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 1860

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 1920

tcatgattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 1980

ttagaaaaat aaacaaatag gtcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 2040

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 2100

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 2160

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 2220

ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 2280

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 2340

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 2400

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 2460

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 2520

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 2580

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 2640

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 2700

ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 2760

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 2820

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 2880

tgtgcggtat ttcacaccgc atatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 2940

atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga 3000

cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 3060

agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 3120

aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg 3180

tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt 3240

ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt tggtcactga tgcctccgtg 3300

taagggggat ttctgttcat gggggtaatg ataccgatga aacgagagag gatgctcacg 3360

atacgggtta ctgatgatga acatgcccgg ttactggaac gttgtgaggg taaacaactg 3420

gcggtatgga tgcggcggga ccagagaaaa atcactcagg gtcaatgcca gcgcttcgtt 3480

aatacagatg taggtgttcc acagggtagc cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac 3540

ataatggtgc agggcgctga cttccgcgtt tccagacttt acgaaacacg gaaaccgaag 3600

accattcatg ttgttgctca ggtcgcagac gttttgcagc agcagtcgct tcacgttcgc 3660

tcgcgtatcg gtgattcatt ctgctaacca gtaaggcaac cccgccagcc tagccgggtc 3720

ctcaacgaca ggagcacgat catgctagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact 3780

gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt gagctaactt 3840

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 3900

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt 3960

ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga 4020

gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt 4080

ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat 4140

gtccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg 4200

atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg 4260

ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt 4320

gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg 4380

gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg 4440

cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag 4500

aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag 4560

cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt 4620

acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc 4680

ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt 4740

ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat 4800

gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct 4860

ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc 4920

gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca 4980

tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga cgctctccct 5040

tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg agcaccgccg 5100

ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc acggggcctg 5160

ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc 5220

catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgccgg 5280

ccacgatgcg tccggcgtag cctaggatcg agatcgatct cgatcccgcg aaattaatac 5340

gactcactat a 5351

<210> 8

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gctctagaaa gagggcgcgg cagagaagga ggaggtaaga aatgagtaat cgtaaatatt 60

tcggt 65

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cgccaacaat tccacacata gaaccaccac caacggcttt tactgcatcg 50

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgatgcagta aaagccgttg gtggtggttc tatgtgtgga attgttggcg 50

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ccgctcgagt tactcaaccg taaccgattt tg 32

<210> 12

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gctagatatt taaactatca cgacataagg aggtcaggga tgagtaatcg taaatatttc 60

ggt 63

<210> 13

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gctctagacg acataacgtt agaaaagaat aaggtagttt catgagtaat cgtaaatatt 60

tcggt 65

<210> 14

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ccctaggatc gagatcgatc tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta tattgacaat 60

taatcatccg g 71

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

gctctagagg taatttttaa taataaagtt aatcg 35

Claims

1.一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是过表达了磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶，所述磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶是通过核糖体结合位点RBS1与表达载体相连；所述重组大肠杆菌是按照核糖体结合位点RBS1、磷酸葡萄糖胺变位酶glmM基因、寡肽连接子GGGS和氨基转移酶glmS基因的顺序融合后，整合到核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的表达载体上进行表达；所述核糖体结合位点RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述寡肽连接子GGGS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶是通过融合表达方式进行表达。

3.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述磷酸葡萄糖胺变位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌K4 ATCC 23502。

5.一种权利要求1所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤为：

(1)获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1的磷酸葡萄糖胺变位酶glmM和氨基酸序列如SEQID NO.2氨基转移酶glmS基因；

(2)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.5的核糖体结合位点RBS1和核苷酸序列如SEQ IDNO.6的寡肽连接子GGGS基因；

(3)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的表达载体pETM6R1；

(5)将步骤(4)得到的重组质粒转化到大肠杆菌K4 ATCC 23502中，得到大肠杆菌重组菌。

6.权利要求1所述大肠杆菌在生产果糖软骨素中的应用，其特征在于，所述应用发酵培养基：甘油10g/L，大豆蛋白胨1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，K₂HPO₄ 10g/L，MgCl₂ 0.1g/L，(NH₄)₂SO₄1g/L，柠檬酸钠0.5g/L；补料培养基：甘油400g/L，大豆蛋白胨40g/L；37℃下补料分批发酵。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述应用是按5-15％的接种量接种至发酵罐中，培养5-10h添加0.05-0.15mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为35-38℃。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述应用是在发酵过程中，当溶氧陡然上升，开始进行补料，补料策略为pH-stat，当pH超过7.0时，开始补料，当pH低于7.0时，停止补料。