CN102618597A

CN102618597A - 大肠杆菌工程菌及其生产软骨素的方法

Info

Publication number: CN102618597A
Application number: CN2012100980570A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 吴秋林; 杨爱华; 刘杰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2012-04-06
Publication date: 2012-08-01

Abstract

本发明公开了一种高产荚膜多糖的大肠杆菌基因工程菌，并以此荚膜多糖制备软骨素的方法。通过在大肠杆菌中过量表达荚膜多糖合成基因簇转录调控因子slyA蛋白，促进大肠杆菌荚膜多糖合成基因簇的表达，从而增加大肠杆菌K4生产荚膜多糖。发酵培养该大肠杆菌工程菌后荚膜多糖产量比原菌提高112％，并收集制备获得纯度大于93％的软骨素。本发明为开发硫酸软骨素的发酵法生产技术奠定一定的基础。

Description

大肠杆菌工程菌及其生产软骨素的方法

技术领域

本发明涉及高产软骨素的基因工程菌及其构建方法，属于基因工程领域。涉及生产软骨素的方法，属于发酵工程领域。

背景技术

软骨素(Chondroitin，Ch)是未硫酸化的硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)，是由葡糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1，3键和β-1，4键交替连接而成的多糖。可在其活性位点硫酸化形成硫酸软骨素。目前，硫酸软骨素的工业化生产是以动物软骨为原料，通过提取法生产硫酸软骨素。然而，由于原料来源有限(动物软骨的生产周期较长)、产业水平不高(工艺繁琐、收率不高、质量不稳)、产品质量不高(采用γ射线杀菌导致辐射残留)、污染严重(产生大量的有机物和蛋白废水)等产业瓶颈，严重制约了硫酸软骨素提取产业的发展。目前已经研究了利用微生物发酵法生产硫酸软骨素。

已知某些微生物能合成硫酸软骨素类似物作为其荚膜多糖。如，1996年Manzoni首次报道以E.coli K4为生产菌株，进行发酵生产果糖软骨素，而USP 6777398 B2公开了利用K4荚膜多糖制备硫酸软骨素的方法。此外，WO 0102597，USP 20100151532A1，WO 2010136435A1公开了大肠杆菌K4发酵生产软骨素的发酵工艺。同时近几年对大肠杆菌荚膜多糖的合成途径，以及SlyA蛋白等转录调控因子的转录调控机制有了进一步的研究(Advanced in AppliedMicrobiology，2008，65：1-26；Journal ofBiological Chemistry，2007，282(46)：33326-33335)。但由于微生物自身代谢的经济学本能和工业生产环境与自然环境的巨大差异，导致软骨素的产量、产率和生产强度较低，成为制约发酵法生产硫酸软骨素工业化的关键瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产软骨素的大肠杆菌工程菌，以及应用该工程菌生产软骨素的方法。

本发明的发明人对大肠杆菌K4荚膜多糖合成途径的调控机制进行了深入的研究，发现SlyA蛋白是荚膜多糖合成途径的正调控因子，其过量表达能增强荚膜多糖合成基因簇启动子的转录活性，高效合成荚膜多糖，因此完成了本发明。

本发明的目的1是提供导入了编码SlyA蛋白的基因工程序列并且具有高效生产软骨素的能力的大肠杆菌工程菌。

在本文中，所述的编码SlyA蛋白的基因工程序列优选为编码选自由以下(A)和(B)所组成的组的DNA：

(A)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和

(B)包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的同一性在90％以上，并编码具有SlyA蛋白转录调控活性的蛋白的DNA。

所述的SlyA蛋白选自由以下(a)和(b)所组成的组的蛋白质：

(a)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质；以及

(b)包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列的的同一性在95％以上，并具有SlyA蛋白转录调控活性。

所述编码SlyA蛋白的基因工程序列优选来源于为大肠杆菌K4，包括ATCC23502(American Type Culture Collection-USA)，Bi 8337/41(International EscherichiaCentre-Denmark)，NCTC 9005(Nationa Collection of Type Cultures-UK)，U 1-412616(Freiburgcollection)。

本发明的目的2是提供生产软骨素的方法，其至少包括以下步骤

(1)培养如上所述的大肠杆菌工程菌；

(2)从该培养物中收集荚膜多糖；

(3)将收集到的荚膜多糖进行脱果糖处理，得到软骨素。

本发明的目的3是提供包含插入编码slyA蛋白的基因工程序列的表达载体。

附图说明

图1是表达SlyA基因的重组载体的结构图。

图2是重组载体的酶切图谱。泳道1为Bam HI和Hind III双酶切为441 bp和4414 bp两条带，泳道2和3为重组质粒，M为分子量标记。

图3是SlyA的表达图谱。泳道1为未加IPTG诱导的大肠杆菌工程菌，泳道2为加入IPTG诱导的大肠杆菌重组菌，泳道3为导入pTrcHisA的大肠杆菌，泳道4为大肠杆菌K4原菌，M为分子量标记。

具体实施方式

实施例1：构建SlyA表达载体

以大肠杆菌K4(ATCC 20502)基因组为模板，根据分子克隆实验指南(第三版)中描述的方法进行PCR，然后将得到的PCR产物插入到pTrcHisA(组氨酸融合蛋白表达载体，Invitrogen)中，由此产生pTrcHisA-SlyA。

扩增引物：

SlyAF：5′-cccaagctttcaccctttggcctgtaactcaat-3′SlyAR：5′-cgggatccatgaaattggaatcgccactaggtt-3′

实施例2：SlyA表达载体在大肠杆菌K4中表达

通过电击转化法(细胞50μL，表达载体2μL，200Ω，25F，1.8kV，电击杯0.1cm)将表达载体pTrcHisA-SlyA导入到大肠杆菌K4中，由此产生大肠杆菌工程菌。将克隆子转移到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基(含有10g/L的蛋白胨、10g/L的氯化钠和5g/L的酵母粉，pH自然)中，37℃培养过夜。将1mL培养物转移至50mL含有100μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB培养基中。37℃培养1-3小时(OD₆₀₀＝0.5-0.8)后，添加终浓度为0.5-1.0mM的IPTG。继续培养3-8小时，诱导重组SlyA蛋白的表达。取1mL诱导培养液离心收集细胞，按照分子克隆实验指南(第三版)进行SDS-PAGE电泳，确认了重组SlyA蛋白的表达。

实施例3：发酵生产荚膜多糖

将大肠杆菌工程菌接种于含有100μg/mL氨苄氢霉素的LB培养基中，37℃进行种子培养10-14h。然后以4％的接种量转接于含有100μg/mLGY培养基(含有10g/L甘油、1g/L蛋白胨、1g/L氯化铵、0.5g/L柠檬酸三钠、0.1g/L的氧化镁、9.7g/L磷酸氢二钾和2g/L磷酸二氢钾，pH 7.2～7.4)中，37℃培养1-3小时(OD₆₀₀＝0.5-0.8)后，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养至24小时。整个培养过程以大肠杆菌K4为对照，但不加入氨苄氢霉素。

发酵液中荚膜多糖的含量根据Microbial Cell Factories，2010，9：34-43中描述的咔唑法进行检测。表1为大肠杆菌工程菌与大肠杆菌K4发酵结果的比较。大肠杆菌工程菌与原菌相比，K4荚膜多糖含量和细胞得率分别为增加了112％和122％倍。

表1大肠杆菌工程菌与原菌发酵结果比较

实施例4提取荚膜多糖并制备软骨素

将30mL发酵液离心，收集上清液，进行微膜过滤去除大分子物质；然后加入蛋白酶K室温处理2小时除去蛋白质；用1％的醋酸调节溶液pH至2.0，80℃保温5小时，以脱去果糖残基；最后将所得溶液进用无水乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，再冷冻干燥得到软骨素白色粉末。纯度大于93％，MW为53kDa±3kDa。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种由大肠杆菌工程菌荚膜多糖生产软骨素的方法，其特征在于该工程菌至少包含一个编码SlyA蛋白或同功能蛋白的基因工程序列。

2.根据权利要求1的大肠杆菌工程菌，其中所述的编码SlyA蛋白的基因工程序列选自由以下(A)和(B)所组成的组的DNA：

(A)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和

3.根据权利要求1的大肠杆菌工程菌，其中所述的SlyA蛋白选自由以下(a)和(b)所组成的组的蛋白质：

(a)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质；以及

(b)包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列的同一性在95％以上，并具有SlyA蛋白转录调控活性。

4.根据权利要求1-3中任一项的大肠杆菌工程菌，其中所述的SlyA蛋白为荚膜多糖合成基因簇的转录调控因子，能激活荚膜多糖合成基因簇启动子的转录。

5.根据权利要求1-4中任一项的大肠杆菌工程菌，其中所述的大肠杆菌工程菌的原始菌株为以下任一株菌株：ATCC 23502(American Type Culture Collection-USA)，Bi8337/41(International Escherichia Centre-Denmark)，NCTC 9005(Nationa Collection of TypeCultures-UK)，U1-412616(Freiburg collection)。

6.生产软骨素的方法，至少包括以下步骤：

(1)培养根据权利要求1-5中的任一项的大肠杆菌工程菌；

(2)从该培养物中收集荚膜多糖；

(3)将收集到的荚膜多糖进行脱果糖处理，得到软骨素。

7.包含插入编码slyA蛋白的基因工程序列的表达载体。