JP5940985B2 - コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるアニリンの製造方法 - Google Patents
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Description
ここで、アニリンは、染料、タイヤの加硫促進剤や老化防止剤等のゴム製品材料のような化学製品;繊維、導電性ポリマーのような機能材料;農薬;医薬品などの原料として広く利用されている。
しかし、再生可能資源を原料としたバイオアニリン生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖類からの代謝反応段数が非常に多いために生産性が低い。また、生産物であるアニリンによる菌の増殖阻害や、アニリンによる細胞毒性等の難点がある。このため、工業的生産は不可能とされている。
例えば、非特許文献1は、マイコバクテリウム スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)を培養した後、洗菌した細胞に4-アミノ安息香酸を添加すると、微量のアニリンが生成することを開示している。しかし、非特許文献1の方法はアニリン生産性が実用上十分ではない。なお、非特許文献1は、4-アミノ安息香酸からのアニリン生成に関わる酵素、その活性、及び活性を有する酵素遺伝子には言及していない。
また、非特許文献2は、病原性大腸菌エシェリキア コリ(Escherichia coli)O111の洗菌した細胞、又は細胞抽出液に、アントラニル酸(2-アミノ安息香酸)、又は4-アミノ安息香酸を添加すると、微量のアニリンが生成することを開示している。しかし、非特許文献2の方法はアニリン生産性が実用上十分ではない。なお、非特許文献2は、アントラニル酸、又は4-アミノ安息香酸からのアニリン生成に関わる酵素、その活性、及び活性を有する酵素遺伝子には言及していない。
また、特許文献1は、ストレプトマイセス グリセウス(Streptomyces griseus)を、アニリン原料としてグルコースを含むTSB(Trypticase Soy Broth)培地で、好気条件下に4〜5日間培養することにより、培養液中にアニリンを生成させる技術を開示している。しかし、特許文献1には、具体的なアニリンの生産量や、生産効率などが示されておらず、特許文献1の方法の実用性については不明である。
項1. アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ(aminobenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、アニリン生産能を有する形質転換体。
項2. アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、バチラス サブチリス(Bacillus subtilis)由来の遺伝子、ラクトバチルス ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)由来の遺伝子、ラクトバチラス ブレビス(Lactobacillus brevis)由来の遺伝子、シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)由来の遺伝子、エシェリキア コリ(Escherichia coli)由来の遺伝子、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の遺伝子、又はエンテロバクター クロアカエ(Enterobacter cloacae)由来の遺伝子である項1に記載の形質転換体。
項3. アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである項1に記載の形質転換体。
(a) 配列番号16の塩基配列からなるDNA、配列番号19の塩基配列からなるDNA、配列番号22の塩基配列からなるDNA、配列番号25の塩基配列からなるDNA、配列番号28の塩基配列からなるDNA、配列番号31の塩基配列からなるDNA、又は配列番号34の塩基配列からなるDNA
(b) (a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項4. 宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである項1〜3の何れかに記載の形質転換体。
項5. 宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR(FERM P−18976)、ATCC13032、又はATCC13869である項4に記載の形質転換体。
項6. コリネバクテリウム グルタミカム ANI-1(受託番号:NITE BP-1001)形質転換体。
項7. 項1〜6の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、アミノ安息香酸、そのエステル、及び/又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応培地中のアニリンを回収する工程とを含むアニリンの製造方法。
項8. 反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項7に記載のアニリンの製造方法。
項9. 還元条件下の反応液の酸化還元電位が−200〜−500ミリボルトである項7又は8に記載のアニリンの製造方法。
一般に微生物はアニリンのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてアニリンを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くアニリンを製造することができる。
(I)アニリン生産能を有する形質転換体
本発明のアニリン生産能を有する形質転換体は、アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された形質転換体である。
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599(1974)〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
中でも、安全でかつアニリン生産性が高い点で、コリネバクテリウム グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等が挙げられる。中でも、R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
旧分類のブレビバクテリウム ラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウム フラバムのMJ-233株(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41株(FERM BP-1498)なども好適なコリネバクテリウム グルタミカムである。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)(例えばATCC6872株)等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス(Mycobacterium bovis)(例えばATCC19210株、ATCC27289株)等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ(Micrococcus freudenreichii)(例えばNo. 239株(FERM P-13221))、マイクロコッカス ルテウス(Micrococcus leuteus)(例えばNo. 240株(FERM P-13222))、マイクロコッカス ウレアエ(Micrococcus ureae)(例えばIAM1010株)、マイクロコッカス ロゼウス(Micrococcus roseus)(例えばIFO3764株)等が挙げられる。
中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR(FERM P-18976)株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005/010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
コリネ型細菌は、他細菌に比べて、アニリンのような溶剤に対する耐性が高い。また、コリネ型細菌は、他の好気性細菌に比べて、実質的に増殖しない還元条件下で効率よく物質生産を行える。これらの点で、コリネ型細菌は本発明方法によるアニリン製造に好適である。
アミノベンゾエート デカルボキシラーゼは、アミノ安息香酸から炭酸を脱離させてアニリンを生成する反応、及びその逆反応を触媒する酵素である。
アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、バチラス サブチリス(Bacillus subtilis)由来の遺伝子、ラクトバチルス ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)由来の遺伝子、ラクトバチラス ブレビス(Lactobacillus brevis)由来の遺伝子、シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)由来の遺伝子、エシェリキア コリ(Escherichia coli)由来の遺伝子、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の遺伝子、又はエンテロバクター クロアカエ(Enterobacter cloacae)由来の遺伝子が好ましい。中でも、バチラス サブチリス由来の遺伝子、及びエンテロバクター クロアカエ由来の遺伝子が好ましい。特に、アントラニル酸(2-アミノ安息香酸)を基質とした場合はバチラス サブチリス由来の遺伝子が好ましく、4-アミノ安息香酸を基質とした場合はエンテロバクター クロアカエ由来の遺伝子が好ましい。
本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Vol2, p11.45に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Tm)より5〜10℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
また、本発明では、配列番号16、19、22、25、28、31、又は34の塩基配列と同一性が90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上の塩基配列からなり、かつアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8(GENETYX 株式会社ゼネティックス製)により算出した値である。
PCRで増幅したアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素をコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。
プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)2256由来のpAM330〔特開昭58-67699〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903(1984)〕 及び 〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267(1985)〕、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13058由来のpHM1519 〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903(1984)〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 (1991)〕、コリネバクテリウム グルタミカム T250由来のpCG4〔特開昭57-183799〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 (1984)〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 (1991)〕などが挙げられる。
好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)のtrp ターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法 〔Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 (1990)〕 及び 〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 (1993)〕により行うことができる。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール;酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸;エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で使用でき、又は2種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1〜10(w/v%)とすればよい。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10(w/v%)とすればよい。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1(w/v%)とすればよい。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約0.1〜10(w/v%)とすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン(ビタミンB1)、ピリドキシン(ビタミンB6)、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のpHは約5〜8が好ましい。
培養温度は約15〜45℃とすればよく、培養時間は約1〜7日間とすればよい。
上記説明した本発明の形質転換体を、アミノ安息香酸、その塩、及び/又はそのエステルを含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のアニリンを回収する工程とを含む方法によりアニリンを製造することができる。
微生物の増殖
反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25〜35℃で、約12〜48時間培養して増殖させることが好ましい。
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類(グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖;スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖;澱粉のような多糖;糖蜜等)、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸;エタノール、プロパノールのようなアルコール;ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1(w/v%)とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン(ビタミンB1)、ピリドキシン(ビタミンB6)、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のpHは約6〜8が好ましい。
反応液は、アニリン前駆体(アニリン原料)を含有する水、緩衝液、無機塩培地などを用いることができる。
前駆体としては、アミノ安息香酸、その塩、及び/又はそのエステルを用いることができる。アミノ安息香酸としては、2-アミノ安息香酸(o-アミノ安息香酸;アントラニル酸)、3-アミノ安息香酸(m-アミノ安息香酸)、4-アミノ安息香酸(p-アミノ安息香酸)の何れも使用できる。中でも、水溶性であるため反応に使用し易い点で、2-アミノ安息香酸、4-アミノ安息香酸が好ましい。
塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などが挙げられる。また、エステルとしては、炭素数1〜4のアルコールとのエステルなどが挙げられる。
反応液への溶解度が高くなる点で、塩が好ましい。前駆体は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
反応液中のアミノ安息香酸、その塩、及び/又はそのエステルの濃度は、約0.1〜10(w/v%)が好ましく、約0.5〜7(w/v%)がより好ましく、約0.5〜5(w/v%)がさらにより好ましい。上記範囲であれば、効率良く、アニリンを製造できる。
緩衝液としては、リン酸バッファー、トリスバファー、炭酸バッファーなどが挙げられる。緩衝液の濃度は、約10〜150 mMが好ましい。
無機塩培地としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等の無機塩の1種又は2種以上を含む培地が挙げられる。中でも、硫酸マグネシウムを含む培地が好ましい。無機塩培地として、具体的には、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1(w/v%)とすればよい。
反応液のpHは約6〜8が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、pHコントローラー (例えば、エイブル株式会社製、型式:DT-1023)で、反応液のpHを中性付近、特に約7にコントロールしながら反応させることが好ましい。
反応条件
反応温度、即ち反応中の形質転換体の生存温度は、約20〜40℃が好ましく、約25〜35℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くアニリンを製造できる。
また、反応時間は、約1〜7日間が好ましく、約1〜3日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、還元条件で行うことが好ましい。還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖せず、一層効率的にアニリンを生産させることができる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−200 mV〜−500 mVが好ましく、約−250 mV〜−500 mVがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬(還元状態であれば、青色から無色への脱色)で推定できるが、正確には酸化還元電位差計(例えば、BROADLEY JAMES社製、ORP Electrodes)を用いて測定できる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約5 mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1〜60分程度、好ましくは約5〜40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤(例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等)を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
上記のようにして培養することにより、反応液中にアニリンが生産される。反応液を回収することによりアニリンを回収できるが、さらに、公知の方法でアニリンを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。
実施例1 アニリン生産遺伝子のクローニングと発現
(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
バチルス サブチリス(Bacillus subtilis)NBRC 14144からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名:GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
クローニングベクターpCRB22の構築
コリネバクテリウム カゼイ JCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点(以降、pCASE1-oriと記す)配列、及びクローニングベクターpHSG298(タカラバイオ株式会社製)をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCASE1-ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1(pCASE1-ori配列)、配列番号2(クローニングベクター−pHSG298)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-1); 5’- AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC -3’ (配列番号3)
(b-1); 5’- AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC -3’(配列番号4)
尚、プライマー(a-1)及び(b-1)には、BglII制限酵素部位が付加されている。
クローニングベクターpHSG298増幅用プライマー
(a-2); 5’- AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG -3’ (配列番号5)
(b-2); 5’- AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA -3’(配列番号6)
尚、プライマー(a-2)及び(b-2)には、BglII制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1-ori配列の場合約1.4-kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約2.7-kbのDNA断片が検出できた。
得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約2.7-kbのDNA断片に加え、pCASE-ori配列の約1.4-kb DNA断片が認められた。
pCASE1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)をコードするgapA遺伝子のプロモーター配列(以降、PgapAと記す)を含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK223-3(ファルマシア社製)由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列(以降、ターミネーター配列と記す)を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号7(PgapA配列)、配列番号8(ターミネーター配列)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-3); 5’- CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG -3’(配列番号9)
(b-3); 5’- CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’
(配列番号10)
尚、プライマー(a-3)には、SalI制限酵素部位が、プライマー(b-3)には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。
ターミネーター配列増幅用プライマー
(a-4); 5’- CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3’
(配列番号11)
(b-4); 5’- CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3
(配列番号12)
尚、プライマー(a-4)には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマー(b-4)には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約4.1-kbのDNA断片に加え、PgapA配列)の約0.6-kb DNA断片が認められた。
PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。
得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約4.7-kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約0.4-kb DNA断片が認められた。
rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のgapA(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A)遺伝子のプロモーター(以降、PgapAと記す)配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号13(pCRB207)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-5); 5’- CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG -3’ (配列番号14)
(b-5); 5’- CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’(配列番号15)
尚、プライマー(a-5)及び(b-5)にはNdeI制限酵素部位が付加されている。
鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(宝酒造株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。
PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ−をpCRB209と命名した。
バチラス サブチリス由来のアニリン生産遺伝子のクローニング
バチラス サブチリス由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするbsdBCD(以降、dec/BSと記載)遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/BS遺伝子をクローン化するべく、配列番号16(バチラス サブチリスdec/BS遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-6); 5’- CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG -3’(配列番号17)
(b-6); 5’- CTCT CATATG GATCAAGCCTTTCGTTCCG -3’ (配列番号18)
尚、プライマー(a-6)及び(b-6)には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
ラクトバチルス ラムノーサス由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするubiDX(以降、dec/LRと記載)遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/LR遺伝子をクローン化するべく、配列番号19(ラクトバチルス ラムノーサスdec/LR遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-7); 5’- CTCT CATATG ACAGCATCACCTTGGG -3’ (配列番号20)
(b-7); 5’- CTCT CATATG TCATCTTAACGACGCTCCATTC -3’(配列番号21)
尚、プライマー(a-7)及び(b-7)には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
ラクトバチルス ブレビス由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするLVIS_1987-LVIS_1986(以降、dec/LBと記載)遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/LB遺伝子をクローン化するべく、配列番号22(ラクトバチルス ブレビスdec/LB遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-8); 5’- CTCT CATATG GTAAATGATCCTTATGATTTACGAAAAG -3’
(配列番号23)
(b-8); 5’- CTCT CATATG CTAATCTCCCTCCCAACG -3’(配列番号24)
尚、プライマー(a-8)及び(b-8)には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
シュードモナス プチダ由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするubiD(以降、dec/PPと記載)遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/PP遺伝子をクローン化するべく、配列番号25(シュードモナス プチダdec/PP遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-9); 5’- CTCT CATATG AACGGGCCGGAAC -3’ (配列番号26)
(b-9); 5’- CTCT CATATG TCAATCATCCACCCCGAAG -3’(配列番号27)
尚、プライマー(a-9)及び(b-9)には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
エシェリキア コリ由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするpurEK(以降、dec/ECと記載)遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/EC遺伝子をクローン化するべく、配列番号28(エシェリキア コリdec/EC遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-10); 5’- CTCT CATATG TCTTCCCGCAATAATCCG -3’ (配列番号29)
(b-10); 5’- CTCT CATATG TTAACCGAACTTACTCTGCGC -3’(配列番号30)
尚、プライマー(a-10)及び(b-10)には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
サッカロマイセス セレビシエ由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするADE2(以降、dec/SCと記載)遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/SC遺伝子をクローン化するべく、配列番号31(サッカロマイセス セレビシエdec/SC遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-11); 5’- CTCT CCATGG ATTCTAGAACAGTTGGTATATTAG -3’(配列番号32)
(b-11); 5’- CTCT CCATGG TTACTTGTTTTCTAGATAAGCTTCGTAAC -3’
(配列番号33)
尚、プライマー(a-11)及び(b-11)には、NcoI制限酵素部位が付加されている。
エンテロバクター クロアカエ由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするECL_04083-ECL_04082-ECL_04081(以降、dec/ECLと記載)遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/ECL遺伝子をクローン化するべく、配列番号34(エンテロバクター クロアカエdec/ECL遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
dec/ECL遺伝子増幅用プライマー
(a-12); 5’- CTCT CATATG AGATTGATCGTGGGAATGAC -3’(配列番号35)
(b-12); 5’- CTCT CATATG TTACAGCAATGGCGGAATGG -3’(配列番号36)
尚、プライマー(a-12)及び(b-12)には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
*) バチラス サブチリスdec/BS遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-6) と (b-6) の組み合わせ、ラクトバチルス ラムノーサスdec/LR遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-7) と (b-7) 、ラクトバチルス ブレビスdec/LB遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-8) と (b-8) の組み合わせ、シュードモナス プチダdec/PP遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-9) と (b-9) の組み合わせ、エシェリキア コリdec/EC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-10) と (b-10) の組み合わせ、サッカロマイセス セレビシエdec/SC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-11) と (b-11) の組み合わせ、エンテロバクター クロアカエdec/ECL遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-12) と (b-12) の組み合わせで行った。
アニリン生産遺伝子のpCRB207へのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したサッカロマイセス セレビシエ株由来 dec/SC遺伝子を含む約1.7-kbの DNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB207 2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製) 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液とした。
得られたライゲーションE液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB207約5.1-kbのDNA断片に加え、サッカロマイセス セレビシエ株由来dec/SC遺伝子(ライゲーションE液)の場合、長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。
サッカロマイセス セレビシエ株由来dec/SC遺伝子を含むプラスミドをpCRB207-dec/SCと命名した(図1)。
上記項(3)に示したPCRにより増幅したバチラス サブチリス株由来dec/BS遺伝子を含む約2.3-kbの DNA断片、ラクトバチルス ラムノーサス株由来dec/LR遺伝子を含む約2.1-kbの DNA断片、ラクトバチルス ブレビス株由来dec/LB遺伝子を含む約2.0-kbの DNA断片、シュードモナス プチダ株由来dec/PP遺伝子を含む約0.6-kb のDNA断片、エシェリキア コリ株由来dec/EC遺伝子を含む約1.6-kbの DNA断片、エンテロバクター クロアカエ株由来dec/ECL遺伝子を含む約2.3-kbの DNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB209 2μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製) 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液、G液、H液、I液、J液及びK液とした。
各々の培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約5.1-kbのDNA断片に加え、バチラス サブチリス株由来dec/BS遺伝子(ライゲーションF液)の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、ラクトバチルス ラムノーサス株由来dec/LR遺伝子(ライゲーションG液)の場合、長さ約2.1-kbの挿入断片が、ラクトバチルス ブレビス株由来dec/LB遺伝子(ライゲーションH液)の場合、長さ約2.0-kbの挿入断片が、シュードモナス プチダ株由来dec/PP遺伝子(ライゲーションI液)の場合、長さ約0.6-kbの挿入断片が、エシェリキア コリ株由来dec/EC遺伝子(ライゲーションJ液)の場合、長さ約1.6-kbの挿入断片が、エンテロバクター クロアカエ株由来dec/ECL遺伝子(ライゲーションK液)の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が認められた。
上述のプラスミド6種類pCRB209-dec/BS、pCRB209-dec/LR、pCRB209-dec/LB、pCRB209-dec/PP、pCRB209-dec/EC、pCRB207-dec/SC及びpCRB209-dec/ECLを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol.54、443-447(1990) 及び Res. Microbiol.、Vol.144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカム R 株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-dec/BS、pCRB209-dec/LR、pCRB209-dec/LB、pCRB209-dec/PP、pCRB209-dec/EC、pCRB207-dec/SC及びpCRB209-dec/ECLの導入が認められた。
実施例1において作製したコリネバクテリウム グルタミカムANI-1〜ANI-7株を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、33℃、20時間暗所に静置した。
この結果、コリネバクテリウム グルタミカムANI-1〜ANI-7株は、還元条件下における反応において、下記表1のようにアニリンを生成していた。
実施例1において作製したコリネバクテリウム グルタミカムANI-1〜ANI-7株を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、33℃、20時間暗所に静置した。
この結果、コリネバクテリウム グルタミカムANI-1〜ANI-7株は、還元条件下における反応において、下記表2のようにアニリンを生成していた。
Claims (7)
- 下記の(a)又は(b)のDNAからなるアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ(aminobenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、アニリン生産能を有する形質転換体。
(a) 配列番号16の塩基配列からなるDNA、配列番号19の塩基配列からなるDNA、配列番号22の塩基配列からなるDNA、配列番号25の塩基配列からなるDNA、配列番号28の塩基配列からなるDNA、配列番号31の塩基配列からなるDNA、又は配列番号34の塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号16、19、22、25、28、又は31の塩基配列と90%以上の同一性を有し、かつアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA - 宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである請求項1に記載の形質転換体。
- 宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR(FERM P−18976)、ATCC13032、又はATCC13869である請求項2に記載の形質転換体。
- コリネバクテリウム グルタミカム ANI-1(受託番号:NITE BP-1001)形質転換体。
- アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ(aminobenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、アニリン生産能を有する形質転換体を、還元条件下、アミノ安息香酸、そのエステル、及び/又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応培地中のアニリンを回収する工程とを含むアニリンの製造方法。
- 反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項5に記載のアニリンの製造方法。
- 還元条件下の反応液の酸化還元電位が−200〜−500ミリボルトである請求項5又は6に記載のアニリンの製造方法。
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