CN103282485B

CN103282485B - 棒状细菌转化体及使用该转化体的苯胺的制造方法

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Publication number: CN103282485B
Application number: CN201180063494.2A
Authority: CN
Inventors: 汤川英明; 乾将行
Original assignee: Sumitomo Rubber Industries Ltd; Research Institute of Innovative Technology for the Earth RITE
Current assignee: Sumitomo Rubber Industries Ltd; Research Institute of Innovative Technology for the Earth RITE
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2031-12-27
Also published as: US9453248B2; US20130302860A1; US20160130617A1; BR112013016132A2; JPWO2012090978A1; EP2660313A4; WO2012090978A1; JP5940985B2; CN103282485A; EP2660313A1

Abstract

一种具有苯胺生产能力的转化体，其通过将编码具有氨基苯甲酸脱羧酶(aminobenzoate？decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。一种苯胺的制造方法，其中包括使该转化体在还原条件下、在含有氨基苯甲酸、其酯和/或其盐的反应液中反应的步骤和回收反应培养基中的苯胺的步骤。

Description

棒状细菌转化体及使用该转化体的苯胺的制造方法

技术领域

本发明涉及苯胺生产技术。更详细而言，本发明涉及为了赋予苯胺生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体及使用该转化体的高效的苯胺的制造技术。

背景技术

在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。

在此，苯胺作为染料、轮胎的硫化促进剂和抗老化剂等橡胶制品材料等化学制品、纤维、导电性聚合物等功能材料、农药、医药品等的原料而得到广泛利用。

目前，苯胺以原油作为原料通过化学方法进行生产。作为苯胺的化学制造方法，有使用锡或铁和盐酸将硝基苯还原的方法、使用铜、镍等金属催化剂对硝基苯进行氢化的还原法、在高温高压下使氯苯与氨反应的方法(氨解作用)等，但这些方法均为需要溶剂类和高热能的、典型的化学工业的高能耗型工艺。因此，从保护地球环境和减少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发二氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型工艺，即建立生物苯胺制造技术。

但是，对于以可再生资源为原料的生物苯胺生产而言，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低。另外，存在作为产物的苯胺会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯胺产生的细胞毒性等难点。因此，目前还不能进行工业性的生产。

作为利用非基因重组菌的苯胺生成技术，具体而言，已知以下的方法。

例如，非专利文献1公开了如下内容：对耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)进行培养后，向洗菌后的细胞中添加4-氨基苯甲酸时，生成微量的苯胺。但是，非专利文献1的方法中，苯胺生产率在实用方面不充分。另外，非专利文献1未提及由4-氨基苯甲酸生成苯胺所涉及的酶、其活性及具有活性的酶基因。

另外，非专利文献2公开了如下内容：向病原性大肠杆菌大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)O111的洗菌后的细胞或细胞提取液中添加邻氨基苯甲酸(2-氨基苯甲酸)或4-氨基苯甲酸时，生成微量的苯胺。但是，非专利文献2的方法中，苯胺生产率在实用方面不充分。另外，非专利文献2未提及由邻氨基苯甲酸或4-氨基苯甲酸生成苯胺所涉及的酶、其活性及具有活性的酶基因。

另外，专利文献1公开了通过将灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)在含有葡萄糖作为苯胺原料的TSB(TrypticaseSoyBroth)培养基中、在需氧条件下培养4～5天而在培养液中生成苯胺的技术。但是，专利文献1中未说明具体的苯胺的生产量和生产效率等，关于专利文献1的方法的实用性是不清楚的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008-274225号公报

非专利文献

非专利文献1：TheJournalofBiologicalChemistry,Vol.193,1951,453-458.

非专利文献2：JournaloftheAmericanChemicalSociety,Vol.79,1957,628-630.

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题在于提供能够以氨基苯甲酸为原料高效地制造苯胺的微生物、以及能够以氨基苯甲酸为原料高效地制造苯胺的方法。

用于解决问题的手段

为了解决上述问题，本发明人反复进行了研究，发现在棒状细菌中导入氨基苯甲酸脱羧酶(aminobenzoatedecarboxylase)基因而得到的转化体能够高效地由氨基苯甲酸生产苯胺。另外发现，该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯胺生产效率特别高。

本发明是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯胺的制造方法。

第1项．一种具有苯胺生产能力的转化体，其通过将编码具有氨基苯甲酸脱羧酶(aminobenzoatedecarboxylase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。

第2项．如第1项所述的转化体，其中，编码具有氨基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)来源的基因、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)来源的基因、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)来源的基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)来源的基因、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)来源的基因或阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)来源的基因。

第3项．如第1项所述的转化体，其中，编码具有氨基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA，

(a)由序列号16的碱基序列构成的DNA、由序列号19的碱基序列构成的DNA、由序列号22的碱基序列构成的DNA、由序列号25的碱基序列构成的DNA、由序列号28的碱基序列构成的DNA、由序列号31的碱基序列构成的DNA或由序列号34的碱基序列构成的DNA；

(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有氨基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。

第4项．如第1项～第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。

第5项．如第4项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)、ATCC13032或ATCC13869。

第6项．谷氨酸棒杆菌ANI-1(保藏编号：NITEBP-1001)转化体。

第7项．一种苯胺的制造方法，其中，包括：

使第1项～第6项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有氨基苯甲酸、其酯和/或其盐的反应液中反应的步骤，和

回收反应液中的苯胺的步骤。

第8项．如第7项所述的苯胺的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。

第9项．如第7项或第8项所述的苯胺的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200～-500毫伏。

发明效果

通过使用本发明的转化体，能够由氨基苯甲酸、其盐或其酯以高效率制造苯胺。

一般而言，微生物的增殖会因苯胺这样的溶剂的细胞毒性而受到抑制，因此，难以使用微生物来制造苯胺，但根据本发明方法，能够使用微生物以实用上足够良好的效率制造苯胺。

附图说明

图1是表示实施例中使用的质粒的构成的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

(I)具有苯胺生产能力的转化体

本发明的具有苯胺生产能力的转化体是将编码具有氨基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到的转化体。

宿主

棒状细菌为Bargey’sManualofDeterminativeBacteriology(伯杰氏系统细菌学手册),Vol.8,599(1974)中定义的一组微生物，只要是在通常的需氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，则可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。

作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacteriumhalotolerance)、解烷棒杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)等。

其中，从安全且苯胺生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒杆菌。作为优选的菌株，可以列举：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)R株(FERMP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41(FERMBP-1498)等。其中，优选R株(FERMP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。

另外，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacteriumlilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中[Liebl,W.etal.,TransferofBrevibacteriumdivaricatumDSM20297T,“Brevibacteriumflavum”DSM20411,“Brevibacteriumlactofermentum”DSM20412andDSM1412,andCorynebacteriumglutamicumandtheirdistinctionbyrRNAgenerestrictionpatterns.IntJSystBacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等,棒状细菌的分类,发酵与工业,45:944-963(1987)]。

旧分类的乳糖发酵短杆菌ATCC13869株、黄色短杆菌的MJ-233株(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41株(FERMBP-1498)等也是优选的谷氨酸棒杆菌。

作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)(例如ATCC6872株)等。

作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)(例如ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株)等。

作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)(例如ATCC19210株、ATCC27289株)等。

作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcusfreudenreichii)(例如No.239株(FERMP-13221))、藤黄微球菌(Micrococcusleuteus)(例如No.240株(FERMP-13222))、脲微球菌(Micrococcusureae)(例如IAM1010株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764株)等。

另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvatecarboxylase)、苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase)等的基因的破坏株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高苯胺的生产率或抑制副产物的生成。

其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因的破坏株，特别是谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。

这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，WO2005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。

棒状细菌比其他细菌对苯胺等溶剂的耐性高。另外，与其他需氧性细菌相比，棒状细菌能够在实质上不增殖的还原条件下高效地进行物质生产。从这些方面而言，棒状细菌适合利用本发明方法制造苯胺。

氨基苯甲酸脱羧酶基因

氨基苯甲酸脱羧酶是催化使碳酸从氨基苯甲酸脱离而生成苯胺的反应及其逆反应的酶。

编码具有氨基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，优选枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)来源的基因、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)来源的基因、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)来源的基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)来源的基因、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)来源的基因或阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)来源的基因。其中，优选枯草芽孢杆菌来源的基因和阴沟肠杆菌来源的基因。特别是在以邻氨基苯甲酸(2-氨基苯甲酸)为底物的情况下，优选枯草芽孢杆菌来源的基因，在以4-氨基苯甲酸为底物的情况下，优选阴沟肠杆菌来源的基因。

作为枯草芽孢杆菌来源的基因，可以列举由序列号16的碱基序列构成的DNA，作为鼠李糖乳杆菌来源的基因，可以列举由序列号19的碱基序列构成的DNA，作为短乳杆菌来源的基因，可以列举由序列号22的碱基序列构成的DNA，作为恶臭假单胞菌来源的基因，可以列举由序列号25的碱基序列构成的DNA，作为大肠埃希氏菌来源的基因，可以列举由序列号28的碱基序列构成的DNA，作为酿酒酵母来源的基因，可以列举由序列号31的碱基序列构成的DNA，作为阴沟肠杆菌来源的基因，可以列举由序列号34的碱基序列构成的DNA。

另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号16、19、22、25、28、31或34的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有氨基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。

本发明中，“严格的条件”是指一般的条件、例如MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆实验指南),第二版,1989,Vol2,p11.45中记载的条件。具体而言，是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5～10℃的温度下发生杂交的情况。

氨基苯甲酸脱羧酶活性可以通过将J.Am.Chem.Soc.,79,628-630(1957)中记载的方法加以改变来测定。简单地来说明，将棒状细菌在营养培养基中在33℃下培养18小时，将所得的培养物用基础培养基清洗2次后，再悬浊于基础培养基中，制成完整细胞(IntactCell)。接着，作为反应，向完整细胞中加入25mMHEPES(pH7.0)作为缓冲液，并以终浓度为5mM的方式添加邻氨基苯甲酸或4-氨基苯甲酸盐/酯作为底物。在33℃下以200rpm振荡6小时后，将反应液离心分离成细菌和上清，将上清用0.22μm的过滤器过滤，并将所得物作为试样。通过GC/MS或HPLC能够对生成的苯胺生成量进行定量。

另外，本发明中，也可以使用由与序列号16、19、22、25、28、31或34的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有氨基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。

本发明中，碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社ゼネティックス制造)算出的值。

由序列号16、19、22、25、28、31或34的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过例如使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交从其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有氨基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。

用于转化的载体的构建

将通过PCR扩增得到的编码氨基苯甲酸脱羧酶的DNA分别克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。

作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举：乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)2256来源的pAM330[日本特开昭58-67699]、[Miwa,K.etal.,Crypticplasmidsinglutamicacid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和[Yamaguchi,R.etal.,DeterminationofthecompletenucleotidesequenceofttheBrevibacteriumlactofermentumplasmidpAM330andtheanalysisofitsgeneticinformation.NucleicAcidsSymp.Ser.16:265-267(1985)]、谷氨酸棒杆菌ATCC13058来源的pHM1519[Miwa,K.etal.,Crypticplasmidsinglutamicacid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和pCRY30[Kurusu,Y.etal.,Identificationofplasmidpartitionfunctionincoryneformbacteria.Appl.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌T250来源的pCG4[日本特开昭57-183799]、[Katsumata,R.etal.,Protoplasttransformationofglutamate-producingbacteriawithplasmidDNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭62-166890]、pEK0、pEC5、pEKEx1[Eikmanns,B.J.etal.,AfamilyofCorynebacteriumglutamicum/Escherichiacolishuttlevectorsforcloning,controlledgeneexpression,andpromoterprobing.Gene,102:93-98(1991)]等。

作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒杆菌R来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(ldhA)的启动子PldhA等，其中，优选PgapA。

作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnBT1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnBT1T2终止子。

转化

转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu,Y.etal.,Electroporation-transformationsystemforCoryneformbacteriabyauxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447(1990)]和[VertesA.A.etal.,Presenceofmrr-andmcr-likerestrictionsystemsinCoryneformbacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。

转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。

作为碳源，可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为氮源，可以列举：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。

作为营养物质，可以列举例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选约5～约8。

作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui,M.etal.,MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。

培养温度设定为约15℃～约45℃即可，培养时间设定为约1天～约7天即可。

(II)苯胺的制造方法

可以通过包括使上述说明过的本发明的转化体在含有氨基苯甲酸、其盐和/或其酯的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯胺的步骤的方法来制造苯胺。

微生物的增殖

在反应之前，优选将转化体在需氧条件下、在约25℃～约35℃的温度下培养约12小时～约48小时而使其增殖。

培养用培养基

反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。

作为碳源，也可以使用：糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等)；甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。

碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。

作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。

作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选约6～约8。

作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui,M.etal.,MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。

反应液

反应液可以使用含有苯胺前体(苯胺原料)的水、缓冲液、无机盐培养基等。

作为前体，可以使用氨基苯甲酸、其盐和/或其酯。作为氨基苯甲酸，可以使用2-氨基苯甲酸(邻氨基苯甲酸)、3-氨基苯甲酸(间氨基苯甲酸)、4-氨基苯甲酸(对氨基苯甲酸)中的任何一种。其中，从具有水溶性因而容易用于反应的观点出发，优选2-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸。

作为盐，可以列举钠盐、钾盐、盐酸盐等。另外，作为酯，可以列举与碳原子数1～4的醇形成的酯等。

从在反应液中的溶解度升高的观点出发，优选盐。前体可以单独使用一种或者混合使用两种以上。

反应液中的氨基苯甲酸、其盐和/或其酯的浓度优选约0.1～约10(w/v%)，更优选约0.5～约7(w/v%)，进一步优选约0.5～约5(w/v%)。浓度为上述范围时，能够高效地制造苯胺。

作为缓冲液，可以列举磷酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸缓冲液等。缓冲液的浓度优选约10mM～约150mM。

作为无机盐培养基，可以列举含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等无机盐中的一种或两种以上的无机盐的培养基。其中，优选含有硫酸镁的培养基。作为无机盐培养基，具体而言，可以列举BT培养基[Omumasaba,C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。

反应液的pH优选约6～约8。反应中，优选在使用氨水溶液、氢氧化钠水溶液等并利用pH控制器(例如，エイブル株式会社制造，型号：DT-1023)将反应液的pH控制在中性附近、特别是约7的同时进行反应。

反应条件

反应温度即反应中的转化体的存活温度优选约20℃～约40℃，更优选约25℃～约35℃。反应温度为上述温度范围时，能够高效地制造苯胺。

另外，反应时间优选约1天～约7天，更优选约1天～约3天。

培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。

<还原条件>

反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行，优选在还原条件下进行。在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，能够更高效地生产苯胺。

还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV～约-500mV，更优选约-250mV～约-500mV。

反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEYJAMES公司制造，ORP电极)可以准确地测定。

处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液制备用的液体介质，反应液用水溶液的制备方法可以参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig,Net.al.(1981):Thedissimilatorysulfate-reducingbacteria,InTheProkaryotes,AHandbookonHabitats,IsolationandIdentificationofBacteria,Ed.byStarr,M.P.et.al.p.926-940,Berlin,SpringerVerlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等而得到期望的还原条件下的水溶液。

具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约10mmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸馏水等处理约1分钟～约60分钟、优选约5分钟～约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而制成还原条件下的反应液用水溶液。

另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。

将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。

反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的pH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。

苯胺的回收

通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出苯胺。可以通过回收反应液来回收苯胺，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出苯胺。作为这种公知的方法，可以列举蒸馏法、膜透过法、有机溶剂提取法等。

实施例

以下，利用实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。

实施例1苯胺生产基因的克隆和表达

(1)从微生物中提取染色体DNA

从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBRC14144中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRCMediumNo.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)NBRC3425中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRCMediumNo.804培养基[将多聚蛋白胨5g、酵母提取物5g、葡萄糖5g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)ATCC367中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到乳杆菌MRS肉汤(BD公司制造的BD288130)中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从恶臭假单胞菌(PseudomonasputidaKT2440)ATCC47054中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到LB培养基[将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从大肠埃希氏菌(EscherichiacoliK-12MG1655)中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到LB培养基[将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NBRC10217中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRCMediumNo.108培养基[将葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母提取物3g、麦芽提取物3g溶解于1L蒸馏水中]中后，在24℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)NBRC13535中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRCMediumNo.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

(2)克隆载体的构建

克隆载体pCRB22的构建

通过以下的PCR法对分别包含乳酪棒杆菌JCM12072来源的质粒pCASE1的DNA复制起点(以下记作pCASE1-ori)序列和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了分别将pCASE1-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号1(pCASE1-ori序列)、序列号2(克隆载体-pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。

pCASE1-ori序列扩增用引物

(a-1)：5’-ATAGATCTAGAACGTCCGTAGGAGC-3’(序列号3)

(b-1)：5’-ATAGATCTGACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列号4)

另外，引物(a-1)和(b-1)上附加有BglII限制性内切酶位点。

克隆载体pHSG298扩增用引物

(a-2)：5’-ATAGATCTAGGTTTCCCGACTGGAAAG-3’(序列号5)

(b-2)：5’-ATAGATCTCGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列号6)

另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。

模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制造)。

实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmpPCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRaLATaq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pCASE1-ori序列时使用引物(a-1)与(b-1)的组合进行，扩增克隆载体pHSG298时使用引物(a-2)与(b-2)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃60秒

退火过程：52℃60秒

延伸过程：72℃

pCASE1-ori序列150秒

克隆载体pHSG298180秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在pCASE1-ori序列的情况下能够检测到约1.4-kb的DNA片段，在克隆载体pHSG298的情况下能够检测到约2.7-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含乳酪棒杆菌株来源的质粒pCASE1-ori序列的约1.4-kb的DNA片段10μl和包含克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段10μl分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接A液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接A液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段以外，还确认到pCASE-ori序列的约1.4-kb的DNA片段。

将包含pCASE1-ori序列的克隆载体命名为pCRB22。

克隆载体pCRB207的构建

通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的gapA基因的启动子序列(以下记作PgapA)的DNA片段和包含克隆载体pKK223-3(法玛西亚公司制造)来源的rrnBT1T2双向终止子序列(以下记作终止子序列)的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了分别将PgapA序列和终止子序列克隆化，基于序列号7(PgapA序列)、序列号8(终止子序列)分别合成下述一对引物来使用

PgapA序列扩增用引物

(a-3)：5’-CTCTGTCGACCCGAAGATCTGAAGATTCCTG-3’(序列号9)

(b-3)：5’-CTCTGTCGACGGATCCCCATGGTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号10)

另外，引物(a-3)上附加有SalI限制性内切酶位点，引物(b-3)上附加有SalI、BamHI和NcoI限制性内切酶位点。

终止子序列扩增用引物

(a-4)：5’-CTCTGCATGCCCATGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGA-3’(序列号11)

(b-4)：5’-CTCTGCATGCTCATGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3(序列号12)

另外，引物(a-4)上附加有SphI和NcoI限制性内切酶位点，引物(b-4)上附加有SphI和BspHI限制性内切酶位点。

模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)的染色体DNA和pKK223-3质粒(法玛西亚公司制造)。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增PgapA序列时使用引物(a-3)与(b-3)的组合进行，扩增终止子序列时使用引物(a-4)与(b-4)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃60秒

退火过程：52℃60秒

延伸过程：72℃

PgapA序列45秒

终止子序列30秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在PgapA序列的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在终止子序列的情况下能够检测到约0.4-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含谷氨酸棒杆菌R来源的PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段10μl和克隆载体pCRB22的约4.1-kb分别用限制性内切酶SalI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接B液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接B液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶SalI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB22的约4.1-kb的DNA片段以外，还确认到PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段。

将包含PgapA序列的克隆载体命名为pCRB206。

将由上述PCR扩增出的包含pKK223-3质粒来源的终止子序列的约0.4-kb的DNA片段10μl用限制性内切酶NcoI和BspHI进行切割，将上述的克隆载体pCRB2062μl用限制性内切酶NcoI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接C液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接C液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB206的约4.7-kb的DNA片段以外，还确认到终止子序列的约0.4-kb的DNA片段。

将包含rrnBT1T2终止子序列的克隆载体命名为pCRB207。

克隆载体pCRB209的构建

通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的gapA(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenaseA，甘油醛-3-磷酸脱氢酶A)基因的启动子(以下记作PgapA)序列的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将pCRB207序列克隆化，基于序列号13(pCRB207)分别合成下述一对引物来使用。

pCRB207序列扩增用引物

(a-5)：5’-CTCTCATATGCTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’(序列号14)

(b-5)：5’-CTCTCATATGGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号15)

另外，引物(a-5)和(b-5)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

模板DNA使用含有gapA启动子和rrnBT1T2终止子序列的克隆载体pCRB207。

实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmpPCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRaLATaq(宝酒造株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pCRB207序列时使用引物(a-5)与(b-5)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃60秒

退火过程：52℃60秒

延伸过程：72℃307秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到包含克隆载体pCRB207序列的约5.1-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含pCRB207来源的基因的约5.1-kb的DNA片段10μl用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝酒造株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接D液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接D液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶NdeI对该质粒进行切割，确认了限制性内切酶位点的插入。

将包含PgapA序列和rrnBT1T2终止子序列的克隆载体命名为pCRB209。

(3)苯胺生产基因的克隆

枯草芽孢杆菌来源的苯胺生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含枯草芽孢杆菌来源的编码氨基苯甲酸脱羧酶的bsdBCD(以下记作dec/BS)基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dec/BS基因克隆化，基于序列号16(枯草芽孢杆菌dec/BS基因)，使用应用生物系统(AppliedBiosystems)公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dec/BS基因扩增用引物

(a-6)：5’-CTCTCATATGAAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG-3’(序列号17)

(b-6)：5’-CTCTCATATGGATCAAGCCTTTCGTTCCG-3’(序列号18)

另外，引物(a-6)和(b-6)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

鼠李糖乳杆菌来源的苯胺生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含鼠李糖乳杆菌来源的编码氨基苯甲酸脱羧酶的ubiDX(以下记作dec/LR)基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dec/LR基因克隆化，基于序列号19(鼠李糖乳杆菌dec/LR基因)，使用应用生物系统(AppliedBiosystems)公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dec/LR基因扩增用引物

(a-7)：5’-CTCTCATATGACAGCATCACCTTGGG-3’(序列号20)

(b-7)：5’-CTCTCATATGTCATCTTAACGACGCTCCATTC-3’(序列号21)

另外，引物(a-7)和(b-7)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

短乳杆菌来源的苯胺生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含短乳杆菌来源的编码氨基苯甲酸脱羧酶的LVIS_1987-LVIS_1986(以下记作dec/LB)基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dec/LB基因克隆化，基于序列号22(短乳杆菌dec/LB基因)，使用应用生物系统(AppliedBiosystems)公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dec/LB基因扩增用引物

(a-8)：5’-CTCTCATATGGTAAATGATCCTTATGATTTACGAAAAG-3’(序列号23)

(b-8)：5’-CTCTCATATGCTAATCTCCCTCCCAACG-3’(序列号24)

另外，引物(a-8)和(b-8)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

恶臭假单胞菌来源的苯胺生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含恶臭假单胞菌来源的编码氨基苯甲酸脱羧酶的ubiD(以下记作dec/PP)基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dec/PP基因克隆化，基于序列号25(恶臭假单胞菌dec/PP基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dec/PP基因扩增用引物

(a-9)：5’-CTCTCATATGAACGGGCCGGAAC-3’(序列号26)

(b-9)：5’-CTCTCATATGTCAATCATCCACCCCGAAG-3’(序列号27)

另外，引物(a-9)和(b-9)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

大肠埃希氏菌来源的苯胺生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含大肠埃希氏菌来源的编码氨基苯甲酸脱羧酶的purEK(以下记作dec/EC)基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dec/EC基因克隆化，基于序列号28(大肠埃希氏菌dec/EC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dec/EC基因扩增用引物

(a-10)：5’-CTCTCATATGTCTTCCCGCAATAATCCG-3’(序列号29)

(b-10)：5’-CTCTCATATGTTAACCGAACTTACTCTGCGC-3’(序列号30)

另外，引物(a-10)和(b-10)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

酿酒酵母来源的苯胺生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含酿酒酵母来源的编码氨基苯甲酸脱羧酶的ADE2(以下记作dec/SC)的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dec/SC基因克隆化，基于序列号31(酿酒酵母dec/SC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dec/SC基因扩增用引物

(a-11)：5’-CTCTCCATGGATTCTAGAACAGTTGGTATATTAG-3’(序列号32)

(b-11)：5’-CTCTCCATGGTTACTTGTTTTCTAGATAAGCTTCGTAAC-3’(序列号33)

另外，引物(a-11)和(b-11)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

阴沟肠杆菌来源的苯胺生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含阴沟肠杆菌来源的编码氨基苯甲酸脱羧酶的ECL_04083-ECL_04082-ECL_04081(以下记作dec/ECL)基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dec/ECL基因克隆化，基于序列号34(阴沟肠杆菌dec/ECL基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dec/ECL基因扩增用引物

(a-12)：5’-CTCTCATATGAGATTGATCGTGGGAATGAC-3’(序列号35)

(b-12)：5’-CTCTCATATGTTACAGCAATGGCGGAATGG-3’(序列号36)

另外，引物(a-12)和(b-12)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

对于模板DNA而言，枯草芽孢杆菌使用提取自由NITE生物资源中心(NBRC)获得的枯草芽孢杆菌NBRC14144的染色体DNA。鼠李糖乳杆菌使用提取自由NITE生物资源中心(NBRC)获得的鼠李糖乳杆菌NBRC3425的染色体DNA。短乳杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的短乳杆菌ATCC367的染色体DNA。恶臭假单胞菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的恶臭假单胞菌ATCC47054的染色体DNA。大肠埃希氏菌使用提取自大肠埃希氏菌K12MG1655的染色体DNA。酿酒酵母使用提取自由NITE生物资源中心(NBRC)获得的酿酒酵母NBRC10217的染色体DNA。阴沟肠杆菌使用提取自由NITE生物资源中心(NBRC)获得的阴沟肠杆菌NBRC13535的染色体DNA。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增枯草芽孢杆菌dec/BS基因时使用引物(a-6)与(b-6)的组合进行，扩增鼠李糖乳杆菌dec/LR基因时使用引物(a-7)与(b-7)的组合进行，扩增短乳杆菌dec/LB基因时使用引物(a-8)与(b-8)的组合进行，扩增恶臭假单胞菌dec/PP基因时使用引物(a-9)与(b-9)的组合进行，扩增大肠埃希氏菌dec/EC基因时使用引物(a-10)与(b-10)的组合进行，扩增酿酒酵母dec/SC基因时使用引物(a-11)与(b-11)的组合进行，扩增阴沟肠杆菌dec/ECL基因时使用引物(a-12)与(b-12)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃60秒

退火过程：52℃60秒

延伸过程：72℃

枯草芽孢杆菌dec/BS基因137秒

鼠李糖乳杆菌dec/LR基因123秒

短乳杆菌dec/LB基因123秒

恶臭假单胞菌dec/PP基因45秒

大肠埃希氏菌dec/EC基因94秒

酿酒酵母dec/SC基因103秒

阴沟肠杆菌dec/ECL基因135秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在枯草芽孢杆菌dec/BS基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在鼠李糖乳杆菌dec/LR基因的情况下能够检测到约2.1-kb的DNA片段，在短乳杆菌dec/LB基因的情况下能够检测到约2.0-kb的DNA片段，在恶臭假单胞菌dec/PP基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在大肠埃希氏菌dec/EC基因的情况下能够检测到约1.6-kb的DNA片段，在酿酒酵母dec/SC基因的情况下能够检测到约1.7-kb的DNA片段，在阴沟肠杆菌dec/ECL基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段。

(4)苯胺生产基因表达质粒的构建

苯胺生产基因向pCRB207中的克隆

将上述第(3)项中所示的通过PCR扩增出的包含酿酒酵母株来源的dec/SC基因的约1.7-kb的DNA片段10μl和含有PgapA启动子的克隆载体pCRB2072μl用限制性内切酶NcoI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接E液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接E液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB207的约5.1-kb的DNA片段以外，在酿酒酵母株来源的dec/SC基因(连接E液)的情况下，还确认到长度为约1.7-kb的插入片段。

将包含酿酒酵母株来源的dec/SC基因的质粒命名为pCRB207-dec/SC(图1)。

苯胺生产基因向pCRB209中的克隆

将上述第(3)项中所示的通过PCR扩增出的包含枯草芽孢杆菌株来源的dec/BS基因的约2.3-kb的DNA片段、包含鼠李糖乳杆菌株来源的dec/LR基因的约2.1-kb的DNA片段、包含短乳杆菌株来源的dec/LB基因的约2.0-kb的DNA片段、包含恶臭假单胞菌株来源的dec/PP基因的约0.6-kb的DNA片段、包含大肠埃希氏菌株来源的dec/EC基因的约1.6-kb的DNA片段、包含阴沟肠杆菌株来源的dec/ECL基因的约2.3-kb的DNA片段10μl和含有PgapA启动子的克隆载体pCRB2092μl分别用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接F液、连接G液、连接H液、连接I液、连接J液和连接K液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的6种连接F液、连接G液、连接H液、连接I液、连接J液和连接K液分别转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对各培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB209的约5.1-kb的DNA片段以外，在枯草芽孢杆菌株来源的dec/BS基因(连接F液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在鼠李糖乳杆菌株来源的dec/LR基因(连接G液)的情况下，还确认到长度为约2.1-kb的插入片段，在短乳杆菌株来源的dec/LB基因(连接H液)的情况下，还确认到长度为约2.0-kb的插入片段，在恶臭假单胞菌株来源的dec/PP基因(连接I液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在大肠埃希氏菌株来源的dec/EC基因(连接J液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在阴沟肠杆菌株来源的dec/ECL基因(连接K液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段。

将包含枯草芽孢杆菌株来源的dec/BS基因的质粒命名为pCRB209-dec/BS，将包含鼠李糖乳杆菌株来源的dec/LR基因的质粒命名为pCRB209-dec/LR，将包含短乳杆菌株来源的dec/LB基因的质粒命名为pCRB209-dec/LB，将包含恶臭假单胞菌株来源的dec/PP基因的质粒命名为pCRB209-dec/PP，将包含大肠埃希氏菌株来源的dec/EC基因的质粒命名为pCRB209-dec/EC，将包含阴沟肠杆菌株来源的dec/ECL基因的质粒命名为pCRB209-dec/ECL(图1)。

(5)苯胺生产基因导入株的构建

使用上述7种质粒pCRB209-dec/BS、pCRB209-dec/LR、pCRB209-dec/LB、pCRB209-dec/PP、pCRB209-dec/EC、pCRB207-dec/SC和pCRB209-dec/ECL，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB209-dec/BS、pCRB209-dec/LR、pCRB209-dec/LB、pCRB209-dec/PP、pCRB209-dec/EC、pCRB207-dec/SC和pCRB209-dec/ECL的导入。

将导入有pCRB209-dec/BS质粒的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ANI-1，将导入有pCRB209-dec/LR质粒的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ANI-2，将导入有pCRB209-dec/LB质粒的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ANI-3，将导入有pCRB209-dec/PP质粒的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ANI-4，将导入有pCRB209-dec/EC质粒的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ANI-5，将导入有pCRB207-dec/SC质粒的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ANI-6，将导入有pCRB209-dec/ECL质粒的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ANI-7。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ANI-1保藏于日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8(邮政编码292-0818)的独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(保藏日：2010年11月16日，保藏编号：NITEBP-1001)。

实施例2谷氨酸棒杆菌苯胺生产基因导入株的由邻氨基苯甲酸生成苯胺的实验

将实施例1中制作的谷氨酸棒杆菌ANI-1～ANI-7株涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置20小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌ANI-1～ANI-7株接种到装有10ml的含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的试管中，在33℃下、在需氧条件下进行20小时的振荡培养。将以上述方式培养增殖的各菌体通过离心分离(4℃、15000g、10分钟)回收菌体。将所得到的菌体用10ml的BT液体培养基[(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml]清洗两次后，以使OD₆₁₀=10的方式用BT液体培养基悬浊。将该菌体悬浊液装入容量为15ml的离心管中，在还原条件下(氧化还原电位：-450mV)添加邻氨基苯甲酸作为底物，使其达到25mM，在保持于33℃的水浴中搅拌的同时使其反应6小时。将取样得到的反应液离心分离(4℃、15000g、10分钟)，使用所得到的上清液利用GC/MS对苯胺进行定量

结果，谷氨酸棒杆菌ANI-1～ANI-7株在还原条件下的反应中如下述表1所示生成了苯胺。

表1

以邻氨基苯甲酸为底物时的谷氨酸棒杆菌ANI-1～ANI-7株的苯胺生成实验

另外，除了不向培养基中添加卡那霉素以外，对于谷氨酸棒杆菌野生株进行了与上述同样的实验，结果未确认到苯胺生成。

实施例3谷氨酸棒杆菌苯胺生产基因导入株的由4-氨基苯甲酸盐/酯生成苯胺的实验

将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌ANI-1～ANI-7株接种到装有10ml的含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的试管中，在33℃下、在需氧条件下进行20小时的振荡培养。将以上述方式培养增殖的各菌体通过离心分离(4℃、15000g、10分钟)回收菌体。将所得到的菌体用10ml的BT液体培养基[(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml]清洗两次后，以使OD₆₁₀=10的方式用BT液体培养基悬浊。将该菌体悬浊液装入容量为15ml的离心管中，在还原条件下(氧化还原电位：-450mV)添加4-氨基苯甲酸盐/酯作为底物，使其达到5mM，在保持于33℃的水浴中搅拌的同时使其反应6小时。将取样得到的反应液离心分离(4℃、15000g、10分钟)，使用所得到的上清液利用GC/MS对苯胺进行定量。

结果，谷氨酸棒杆菌ANI-1～ANI-7株在还原条件下的反应中如下述表2所示生成了苯胺。

表2

以4-氨基苯甲酸盐/酯为底物时的谷氨酸棒杆菌ANI-1～ANI-7株的苯胺生成实验

产业上的可利用性

根据本发明方法，能够使用微生物以实用的效率由氨基苯甲酸制造苯胺。

Claims

1.一种具有苯胺生产能力的转化体，其通过将编码具有氨基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到，其中，该基因为以下DNA，

由序列号19的碱基序列构成的DNA、由序列号22的碱基序列构成的DNA、由序列号25的碱基序列构成的DNA、由序列号28的碱基序列构成的DNA、由序列号31的碱基序列构成的DNA或由序列号34的碱基序列构成的DNA。

2.如权利要求1所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。

3.如权利要求1所述的转化体，其中，宿主棒状细菌是保藏编号为FERMP-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869。

4.保藏编号为NITEBP-1001的谷氨酸棒杆菌ANI-1转化体。

5.一种苯胺的制造方法，其中，包括：

使权利要求1-4任一项所述的转化体在还原条件下、在含有氨基苯甲酸、其酯和/或其盐的反应液中反应的步骤，和

回收反应培养基中的苯胺的步骤。

6.如权利要求5所述的苯胺的制造方法，其中，反应步骤中，转化体不增殖。

7.如权利要求5所述的苯胺的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200～-500毫伏。