CN103384721B

CN103384721B - 棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法

Info

Publication number: CN103384721B
Application number: CN201180055596.XA
Authority: CN
Inventors: 汤川英明; 乾将行
Original assignee: GREEN PHENOL TECHNOLOGY RES ASS
Current assignee: Green Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2031-11-17
Also published as: WO2012067174A1; EP2641964A4; ES2754080T3; JPWO2012067174A1; KR101914464B1; EP2641964A1; EP2641964B1; CN103384721A; KR20130138773A; US8846367B2; JP5887277B2; US20130267000A1

Abstract

一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosine？phenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。一种苯酚的制造方法，其中，包括使该转化体在还原条件下、在含有酪氨酸、其盐或其酯的反应液中反应的步骤和回收反应培养基中的苯酚的步骤。

Description

棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法

技术领域

本发明涉及苯酚生产技术。更详细而言，本发明涉及为了赋予苯酚生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体及使用该转化体的高效的苯酚的制造技术。

背景技术

在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。

但是，对于以可再生资源为原料的生物苯酚生产而言，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低，并且作为产物的苯酚会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚产生的细胞毒性等，基于上述理由，目前还不能进行工业性的生产。

作为苯酚的重要用途，可以列举酚醛树脂。酚醛树脂是由苯酚与醛类的加成缩合反应生成且在塑料中具有最古老历史的树脂，由于其优良的耐热性、耐久性等优点，目前仍被用于汽车用金属替代材料、半导体密封材料、电路基板等各种用途。另外，对于迄今为止的酚醛树脂而言，由于原料苯酚与醛类的反应性极高，所得到的高分子形成复杂的三维网状结构，因此，难以实现聚合物的精密结构设计和在纳米材料中的发展，从而认为难以应用于高附加价值的用途。但是近年来，随着高分子的物性理论和仿真技术的快速发展，只要使网状结构精密化则能够由酚醛树脂创制高功能性材料。在这样的背景下，日本的酚醛树脂生产量正在逐年增加。

目前的苯酚的工业生产法(异丙苯法)是以石油来源的苯和丙烯作为原料、需要大量的溶剂类和大量的热能的、典型的化学工业的高能耗型工艺。因此，从保护地球环境和减少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发二氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型工艺，即建立生物苯酚制造技术。

迄今为止尚未报道过自然界中的苯酚生产菌。另外，也尚未获知利用基因重组菌生产苯酚且能够得到足以实用的苯酚生产率的技术。

在此，酪氨酸酚解酶为催化由苯酚、丙酮酸和氨合成酪氨酸的反应及其逆反应的酶(例如专利文献1)。例如，专利文献2中教导了使用肠杆菌(Enterobacteriaceae)属细菌来源的酪氨酸酚解酶由苯酚、丙酮酸和氨合成酪氨酸的技术。

另外，为了高效地生产酪氨酸酚解酶，已知用各种生物来源的酪氨酸酚解酶基因转化大肠杆菌的技术(专利文献3～5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2006-320238

专利文献2：日本特开平8-154675

专利文献3：日本特开2005-278453

专利文献4：WO90/04031

专利文献5：日本特开平4-218380

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题在于提供能够以酪氨酸为原料高效地制造苯酚的微生物、以及能够以酪氨酸为原料高效地制造苯酚的方法。

用于解决问题的手段

为了解决上述问题，本发明人反复进行了研究，得到下述发现。

(i)在棒状细菌中导入酪氨酸酚解酶(tyrosinephenol-lyase)基因而得到的转化体由酪氨酸高效地生产苯酚。

(ii)该转化体中，存在于宿主棒状细菌的染色体上的苯酚2-单加氧酶(2-monooxygenase)基因(poxF)被破坏或发生缺陷时，能够更高效地生产苯酚。

(iii)该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯酚生产效率特别高。

本发明是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯酚的制造方法。

第1项.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosinephenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。

第2项.如第1项所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)来源的基因、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacteriumhafniense)来源的基因、橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostocpunctiforme)来源的基因或齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)来源的基因。

第3项.如第1项所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA，

(a)由序列号16的碱基序列构成的DNA、由序列号23的碱基序列构成的DNA、由序列号24的碱基序列构成的DNA、由序列号25的碱基序列构成的DNA、由序列号26的碱基序列构成的DNA或由序列号27的碱基序列构成的DNA，

(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。

第4项.如第1项～第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶(phenol2-monooxygenase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

第5项.如第1项～第4项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。

第6项.如第1项～第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)、ATCC13032或ATCC13869。

第7项.如第1项～第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶(phenol2-monooxygenase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

第8项.谷氨酸棒杆菌PHE31(保藏编号：NITEBP-999)转化体。

第9项.一种苯酚的制造方法，其中，包括：

使第1项～第8项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有酪氨酸、其盐或其酯的反应液中反应的步骤，和

回收反应培养基中的苯酚的步骤。

第10项.如第9项所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。

第11项.如第9项或第10项所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200～-500毫伏。

发明效果

通过使用本发明的转化体，能够由酪氨酸以高效率制造苯酚。

一般而言，微生物的增殖会因苯酚这样的溶剂的细胞毒性而受到抑制，因此，难以使用微生物来制造苯酚，但根据本发明方法，能够使用微生物以实用上足够良好的效率制造苯酚。

附图说明

图1是表示实施例中使用的质粒的构成的图。

图2是表示苯酚对各种微生物在需氧条件下的增殖的影响的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

(I)具有苯酚生产能力的转化体

本发明的具有苯酚生产能力的转化体是将编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到的转化体。

宿主

棒状细菌为BargeysManualofDeterminativeBacteriology(伯杰氏系统细菌学手册),Vol.8,599(1974)中定义的一组微生物，只要是在通常的需氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。

作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacteriumhalotolerance)、解烷棒杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)等。

其中，从安全且苯酚生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒杆菌。作为优选的菌株，可以列举：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)R株(FERMP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41(FERMBP-1498)等。其中，优选R株(FERMP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。

另外，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacteriumlilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中[Liebl,W.etal.,TransferofBrevibacteriumdivaricatumDSM20297T,“Brevibacteriumflavum”DSM20411,“Brevibacteriumlactofermentum”DSM20412andDSM1412,andCorynebacteriumglutamicumandtheirdistinctionbyrRNAgenerestrictionpatterns.IntJSystBacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等,棒状细菌的分类,发酵与工业,45:944-963(1987)]。

旧分类的乳糖发酵短杆菌ATCC13869株、黄色短杆菌的MJ-233株(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41株(FERMBP-1498)等也是优选的谷氨酸棒杆菌。

作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)(例如ATCC6872株)等。

作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)(例如ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株)等。

作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)(例如ATCC19210株、ATCC27289株)等。

作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcusfreudenreichii)(例如No.239株(FERMP-13221))、藤黄微球菌(Micrococcusleuteus)(例如No.240株(FERMP-13222))、脲微球菌(Micrococcusureae)(例如IAM1010株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764株)等。

另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvatecarboxylase)、苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase)等的基因的破坏株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高苯酚的生产率或抑制副产物的生成。

其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因的破坏株，特别优选谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。

这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，WO2005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。

如实施例3所示，本发明人发现，与其他细菌相比，棒状细菌对苯酚的耐性极高。在这一点上，棒状细菌适合利用本发明方法制造苯酚。

另外，与其他需氧性细菌相比，棒状细菌能够在实质上不增殖的还原条件下高效地进行物质生产。在这一点上，棒状细菌也适合利用本发明方法制造苯酚。

酪氨酸酚解酶酶基因(tpl)

酪氨酸酚解酶是催化从酪氨酸脱去丙酮酸和氨而生成苯酚的反应及其逆反应的酶。另外，酪氨酸酚解酶也催化由儿茶酚和丙酮酸生成L-DOPA的反应。

编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，优选成团泛菌(Pantoeaagglomerans)来源的基因、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacteriumhafniense)来源的基因、橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostocpunctiforme)来源的基因、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)来源的基因，更优选成团泛菌来源的基因。

作为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)来源的基因，可以列举由序列号16的碱基序列构成的DNA，作为布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的基因，可以列举由序列号23的碱基序列构成的DNA，作为哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacteriumhafniense)来源的基因，可以列举由序列号24的碱基序列构成的DNA，作为橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)来源的基因，可以列举由序列号25的碱基序列构成的DNA，作为点型念珠蓝细菌(Nostocpunctiforme)来源的基因，可以列举由序列号26的碱基序列构成的DNA，作为齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)来源的基因，可以列举由序列号27的碱基序列构成的DNA。

另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号16、23、24、25、26或27的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。

本发明中，“严格的条件”是指一般的条件、例如MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆实验指南),第二版,1989,Vol2,p11.45中记载的条件。具体而言，是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5～10℃的温度下发生杂交的情况。

酪氨酸酚解酶活性可以通过对《J.Biol.Chem.,245,1767-1772(1970)“MaterialsandMethods”》中记载的方法加以改变来进行测定。简单地来说明，向试验用液中添加被测酶，制备含有50mM磷酸钾缓冲液,pH8.0、2.5mML-Tyr、0.1mM磷酸吡哆醛、20%甘油和酶的反应液，在30℃下进行30分钟反应(0分钟，5分钟，10分钟，20分钟，30分钟)。通过添加0.6N的盐酸(终浓度)来停止反应。将其离心分离后，用过滤器过滤，利用HPLC对生成的苯酚进行分析、定量(CosmosilC18ARII，流动相20%MeOH、0.07%高氯酸)。由反应初速度和蛋白浓度计算出比活性(将每1分钟产生1微摩尔的苯酚的酶量作为1个单位)。

另外，本发明中，也可以使用由与序列号16、23、24、25、26或27的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。

本发明中，碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社ゼネティックス制造)算出的值。

由序列号16、23、24、25、26或27的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过例如使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交从其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。

用于转化的载体的构建

将通过PCR扩增得到的编码酪氨酸酚解酶的DNA分别克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。

作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举：乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)2256来源的pAM330[日本特开昭58-67699]、[Miwa,K.etal.,Crypticplasmidsinglutamicacid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和[Yamaguchi,R.etal.,DeterminationofthecompletenucleotidesequenceofttheBrevibacteriumlactofermentumplasmidpAM330andtheanalysisofitsgeneticinformation.NucleicAcidsSymp.Ser.16:265-267(1985)]、谷氨酸棒杆菌ATCC13058来源的pHM1519[Miwa,K.etal.,Crypticplasmidsinglutamicacid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和pCRY30[Kurusu,Y.etal.,Identificationofplasmidpartitionfunctionincoryneformbacteria.Appl.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌T250来源的pCG4[日本特开昭57-183799]、[Katsumata,R.etal.,Protoplasttransformationofglutamate-producingbacteriawithplasmidDNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭62-166890]、pEK0、pEC5、pEKEx1[Eikmanns,B.J.etal.,AfamilyofCorynebacteriumglutamicum/Escherichiacolishuttlevectorsforcloning,controlledgeneexpression,andpromoterprobing.Gene,102:93-98(1991)]等。

作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒杆菌R来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(ldhA)的启动子PldhA等，其中，优选PgapA。

作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnBT1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnBT1T2终止子。

转化

转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu,Y.etal.,Electroporation-transformationsystemforCoryneformbacteriabyauxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447(1990)]和[VertesA.A.etal.,Presenceofmrr-andmcr-likerestrictionsystemsinCoryneformbacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。

转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。

作为碳源，可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为氮源，可以列举：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。

作为营养物质，可以列举例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选约5～约8。

作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui,M.etal.,MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。

培养温度设定为约15℃～约45℃即可，培养时间设定为约1天～约7天即可。

宿主染色体基因的破坏或缺失

宿主棒状细菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因(poxF)被破坏或发生缺失，由此，能够更高效地制造苯酚。

制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有：使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。

具体而言，通过实施例1的项目中记载的方法，能够得到苯酚2-单加氧酶基因(poxF)被破坏或发生缺失的棒状细菌。

(II)苯酚的制造方法

可以通过包括使上述说明过的本发明的转化体在含有酪氨酸的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤的方法来制造苯酚。

微生物的增殖

在反应之前，优选将转化体在需氧条件下、在约25℃～约38℃的温度下培养约12小时～约48小时而使其增殖。

培养用培养基

反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。

作为碳源，也可以使用：糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等)；甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。

碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。

作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。

作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选约6～约8。

作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui,M.etal.,MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可

反应液

反应液可以使用含有苯酚前体(苯酚原料)的水、缓冲液、无机盐培养基等。

作为前体，可以使用酪氨酸(L-酪氨酸、D-酪氨酸或它们的混合物)、其盐或其酯。其中，优选L-酪氨酸、其盐或其酯。作为盐，可以列举钠盐、钾盐、盐酸盐等。另外，作为酯，可以列举与碳原子数1～4的醇的酯等。酪氨酸难溶于水，因此优选使用酪氨酸盐，更优选钠盐。前体可以单独使用一种或者两种以上混合使用。

反应液中的酪氨酸、其盐或其酯的浓度优选约0.5～约10(w/v%)，更优选约1～约7(w/v%)，进一步优选约2～约5(w/v%)。浓度为上述范围时，能够高效地制造苯酚。

作为缓冲液，可以列举磷酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸缓冲液等。缓冲液的浓度优选约10mM～约150mM。

作为无机盐培养基，可以列举含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等无机盐中的一种或两种以上的培养基。其中，优选含有硫酸镁的培养基。作为无机盐培养基，具体而言，可以列举BT培养基[Omumasaba,C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。

反应液的pH优选约6～约8。反应中，优选在使用氨水溶液、氢氧化钠水溶液等利用pH控制器(例如，エイブル株式会社制造，型号：DT-1023)将反应液的pH控制在中性附近、特别是约7的同时进行反应。

反应条件

反应温度即反应中的转化体的存活温度优选约20℃～约50℃，更优选约25℃～约47℃。反应温度为上述温度范围时，能够高效地制造苯酚。

另外，反应时间优选约1天～约7天，更优选约1天～约3天。

培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。

<还原条件>

反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行，优选在还原条件下进行。在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，能够更高效地生产苯酚。

还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV～约-500mV，更优选约-250mV～约-500mV。

反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEYJAMES公司制造，ORP电极)能够准确地测定。

处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液制备用的液体介质，反应液用水溶液的制备方法参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig,Net.al.(1981):Thedissimilatorysulfate-reducingbacteria,InTheProkaryotes,AHandbookonHabitats,IsolationandIdentificationofBacteria,Ed.byStarr,M.P.et.al.p.926-940,Berlin,SpringerVerlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。

具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约10mmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸馏水等处理约1分钟～约60分钟、优选约5分钟～约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。

另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。

将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。

反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的pH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。

苯酚的回收

通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出苯酚。可以通过回收反应液来回收苯酚，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出苯酚。作为这种公知的方法，可以列举蒸馏法、膜透过法、有机溶剂提取法等。

实施例

以下，利用实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。

实施例1苯酚生产基因的克隆和表达

(1)从微生物中提取染色体DNA

从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)R(FERMP-18976)中提取染色体DNA的操作如下进行：向A培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g溶解于1L蒸馏水中]中添加终浓度为4%的50%(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，使用铂环接种后，在33℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从成团泛菌(Pantoeaagglomerans)NBRC12686中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRCMediumNo.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

(2)克隆载体的构建

克隆载体pCRB22的构建

通过以下的PCR法对分别包含乳酪棒杆菌JCM12072来源的质粒pCASE1的DNA复制起点(以下记作pCASE1-ori)序列和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了分别将pCASE1-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号1(pCASE1-ori序列)、序列号2(克隆载体-pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。

pCASE1-ori序列扩增用引物

(a-1)：5’-ATAGATCTAGAACGTCCGTAGGAGC-3’(序列号3)

(b-1)：5’-ATAGATCTGACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列号4)

另外，引物(a-1)和(b-1)上附加有BglII限制性内切酶位点。

克隆载体pHSG298扩增用引物

(a-2)：5’-ATAGATCTAGGTTTCCCGACTGGAAAG-3’(序列号5)

(b-2)：5’-ATAGATCTCGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列号6)

另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。

模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制造)。

实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmpPCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRaLATaq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pCASE1-ori序列时使用引物(a-1)与(b-1)的组合进行，扩增克隆载体pHSG298时使用引物(a-2)与(b-2)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃60秒

退火过程：52℃60秒

延伸过程：72℃

pCASE1-ori序列150秒

克隆载体pHSG298180秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在pCASE1-ori序列的情况下检测到约1.4-kb的DNA片段，在克隆载体pHSG298的情况下检测到约2.7-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含乳酪棒杆菌株来源的质粒pCASE1-ori序列的约1.4-kb的DNA片段10μl和包含克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段10μl分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接A液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接A液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段以外，还确认到pCASE-ori序列的约1.4-kb的DNA片段。

将包含pCASE1-ori序列的克隆载体命名为pCRB22。

克隆载体pCRB207的构建

通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的gapA基因的启动子序列(以下记作PgapA)的DNA片段和包含克隆载体pKK223-3(法玛西亚公司制造)来源的rrnBT1T2双向终止子序列(以下记作终止子序列)的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了分别将PgapA序列和终止子序列克隆化，基于序列号7(PgapA序列)、序列号8(终止子序列)分别合成下述一对引物来使用。

PgapA序列扩增用引物

(a-3)：5’-CTCTGTCGACCCGAAGATCTGAAGATTCCTG-3’(序列号9)

(b-3)：5’-CTCTGTCGACGGATCCCCATGGTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号10)

另外，引物(a-3)上附加有SalI限制性内切酶位点，引物(b-3)上附加有SalI、BamHI和NcoI限制性内切酶位点。

终止子序列扩增用引物

(a-4)：5’-CTCTGCATGCCCATGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGA-3’(序列号11)

(b-4)：5’-CTCTGCATGCTCATGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3(序列号12)

另外，引物(a-4)上附加有SphI和NcoI限制性内切酶位点，引物(b-4)上附加有SphI和BspHI限制性内切酶位点。

模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)的染色体DNA和pKK223-3质粒(法玛西亚公司制造)。

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增PgapA序列时使用引物(a-3)与(b-3)的组合进行，扩增终止子序列时使用引物(a-4)与(b-4)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃60秒

退火过程：52℃60秒

延伸过程：72℃

PgapA序列45秒

终止子序列30秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在PgapA序列的情况下检测到约0.6-kb的DNA片段，在终止子序列的情况下检测到约0.4-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含谷氨酸棒杆菌R来源的PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段10μl和克隆载体pCRB22约4.1-kb分别用限制性内切酶SalI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接B液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接B液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶SalI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB22的约4.1-kb的DNA片段以外，还确认到PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段。

将包含PgapA序列的克隆载体命名为pCRB206。

将由上述PCR扩增出的包含pKK223-3质粒来源的终止子序列的约0.4-kb的DNA片段10μl用限制性内切酶NcoI和BspHI进行切割，将上述的克隆载体pCRB2062μl用限制性内切酶NcoI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接C液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接C液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB206的约4.7-kb的DNA片段以外，还确认到终止子序列的约0.4-kb的DNA片段。

将包含rrnBT1T2终止子序列的克隆载体命名为pCRB207。

克隆载体pCRB209的构建

通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的gapA(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenaseA，甘油醛-3-磷酸脱氢酶A)基因的启动子(以下记作PgapA)序列的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将pCRB207序列克隆化，基于序列号13(pCRB207)分别合成下述一对引物来使用。

pCRB207序列扩增用引物

(a-5)：5’-CTCTCATATGCTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’(序列号14)

(b-5)：5’-CTCTCATATGGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号15)

另外，引物(a-5)和(b-5)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

模板DNA使用含有gapA启动子和rrnBT1T2终止子序列的克隆载体pCRB207。

实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmpPCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRaLATaq(宝酒造株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pCRB207序列时使用引物(a-5)与(b-5)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃60秒

退火过程：52℃60秒

延伸过程：72℃307秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到包含克隆载体pCRB207序列的约5.1-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含pCRB207来源基因的约5.1-kb的DNA片段10μl用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝酒造株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接D液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接D液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶NdeI对该质粒进行切割，确认了限制性内切酶位点的插入。

将包含PgapA序列和rrnBT1T2终止子序列的克隆载体命名为pCRB209。

(3)苯酚生产基因的克隆

成团泛菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含成团泛菌来源的、编码具有酪氨酸酚解酶活性的基因的tpl基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将tpl基因克隆化，基于序列号16(成团泛菌tpl基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

tpl基因扩增用引物

(a-6)：5’-CTCTCATATGAACTATCCTGCCGAGC-3’(序列号17)

(b-6)：5’-CTCTCATATGTTAAATAAAGTCAAAACGCGCAGTAAAG-3’(序列号18)

另外，引物(a-6)和(b-6)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

成团泛菌的模板DNA使用提取自由NITE生物资源中心(NBRC)获得的成团泛菌NBRC12686的染色体DNA。

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增成团泛菌tpl基因时使用引物(a-6)与(b-6)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃60秒

退火过程：52℃60秒

延伸过程：72℃

成团泛菌tpl基因82秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在成团泛菌tpl基因的情况下能够检测到约1.4-kb的DNA片段。

(4)苯酚生产基因表达质粒的构建

苯酚生产基因向pCRB209中的克隆

将上述第(3)项中所示的通过PCR扩增出的包含成团泛菌株来源的tpl基因的约1.4-kb的DNA片段10μl和含有PgapA启动子的克隆载体pCRB2092μl分别用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接E液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接E液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对各培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB209的约5.1-kb的DNA片段以外，在成团泛菌株来源的tpl基因(连接E液)的情况下，还确认到长度为约1.4-kb的插入片段。

将包含成团泛菌株来源的tpl基因的质粒命名为pCRB209-tpl/PA(图1)。

(5)谷氨酸棒杆菌的染色体基因破坏用质粒的构建

谷氨酸棒杆菌株poxF基因破坏用质粒的构建

通过以下的PCR法对用于构建谷氨酸棒杆菌株的染色体上poxF基因的无痕破坏用质粒所需要的DNA片段进行扩增。

PCR时，基于谷氨酸棒杆菌R的序列，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

poxF-1区扩增用引物

(a-7)：5’-CTCTTCTAGATACGTCCTAAACACCCGAC-3’(序列号19)

(b-7)：5’-GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC-3’(序列号20)

另外，引物(a-7)上附加有XbaI限制性内切酶位点。

poxF-2区扩增用引物

(a-8)：5’-CAAGTCAGCAATGGTTGGTC-3’(序列号21)

(b-8)：5’-CTCTTCTAGATGATCAGTACCAAGGGTGAG-3’(序列号22)

另外，引物(b-8)上附加有XbaI限制性内切酶位点。

模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R的染色体DNA。

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增poxF-1区时使用引物(a-7)与(b-7)的组合进行，扩增poxF-2区时使用引物(a-8)与(b-8)进行。

PCR循环：

变性过程：94℃60秒

退火过程：52℃60秒

延伸过程：72℃

poxF-1区50秒

poxF-2区50秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在谷氨酸棒杆菌poxF-1区的情况下能够检测到约0.8-kb的DNA片段，在poxF-2区的情况下能够检测到约0.8-kb的DNA片段。

接着，将由上述PCR扩增出的poxF-1区片段与poxF-2区片段各1μl混合，通过PCR进行两种片段的结合反应。

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)使用poxF-1区片段与poxF-2区片段进行。

PCR循环：

变性过程：95℃20秒

退火过程：52℃5秒

延伸过程：72℃50秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

进而，以所得到的poxF-1与poxF-2的结合片段为模板，通过PCR进行poxF缺失片段的扩增。

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增poxF缺失片段时使用引物(a-7)与(b-8)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：95℃20秒

退火过程：52℃5秒

延伸过程：72℃97秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到约1.6-kb的poxF缺失片段。

将由上述PCR扩增出的谷氨酸棒杆菌R来源的poxF缺失序列的约1.7-kb的DNA片段10μl与约4.4-kb的无痕染色体基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]2μl分别用限制性内切酶XbaI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接F液。

利用氯化钙法[JournalofMolecularBiology,53,159(1970)]以所得到的连接F液转化大肠杆菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶XbaI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRA725的约4.4-kb的DNA片段以外，在谷氨酸棒杆菌株来源的poxF缺失基因(连接F液)的情况下，还确认到长度为约1.7-kb的插入片段。

将包含谷氨酸棒杆菌株来源的poxF缺失基因的质粒命名为pCRA725-poxF/CG。

(6)与苯酚分解相关的基因破坏株的构建

无痕染色体基因导入用载体pCRA725是不能在谷氨酸棒杆菌R内复制的质粒。使用pCRA725-poxF/CG，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[A液体培养基和1.5%琼脂]上。将使用上述培养基得到的一重交叉株涂布到含有10%(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml溶解在1L蒸馏水中，并加入1.5%琼脂]上。

在质粒pCRA725-poxF/CG为与染色体上的同源区的一重交叉株的情况下，由于pCRA725-poxF/CG上的卡那霉素耐性基因的表达而显示出卡那霉素耐性，并且由于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的sacR-sacB基因的表达而显示出在含蔗糖培养基中的致死性，相对于此，在质粒pCRA725-poxF/CG为二重交叉株的情况下，由于pCRA725-poxF/CG上的卡那霉素耐性基因的脱落而显示出卡那霉素敏感性，并且由于sacR-sacB基因的脱落而显示出在含蔗糖培养基中的生长性。因此，无痕染色体基因破坏株显示出卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性。

因此，选择出显示卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性的菌株。将该谷氨酸棒杆菌R株poxF基因无痕破坏株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ΔpoxF。

(7)苯酚生产基因导入株的构建

使用上述的质粒pCRB209-tpl/PA，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌ΔpoxF株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入质粒。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB209-tpl/PA的导入。

将所得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)PHE31。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)PHE31保藏于日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8(邮政编码292-0818)的独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心(保藏日：2011年9月28日，保藏编号：NITEBP-999)。

实施例2谷氨酸棒杆菌苯酚生产基因导入株和副产物途径破坏株的苯酚生成实验

将实施例1中制作的谷氨酸棒杆菌PHE31株(导入有苯酚生产基因表达质粒pCRB209-tpl/PA的poxF染色体基因无痕破坏株)涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在28℃下于暗处静置20小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌PHE31株接种到装有10ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的试管中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。

将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌PHE31株接种到装有500ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的容量2L的三角烧瓶中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。

通过离心分离(4℃、5000g、15分钟)回收以上述方式培养增殖后的各菌体。将所得到的菌体悬浊到50mlBT(-尿素)液体培养基[0.7%硫酸铵、0.05%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钾、0.05%硫酸镁七水合物、0.0006%硫酸铁七水合物、0.00042%硫酸锰水合物、0.00002%生物素、0.00002%硫胺素盐酸盐]中以使菌体终浓度为10%。将该菌体悬浊液装入容量100ml的培养瓶中，在还原条件下(氧化还原电位：-450mV)在反应开始起0小时、1小时、3小时、10小时后分别逐次添加40mM的L-酪氨酸二钠盐作为底物，在保持于33℃的水浴中边搅拌边反应。

对取样得到的反应液进行离心分离(4℃、15000g、10分钟)，使用所得到的上清液进行苯酚的定量。

结果，谷氨酸棒杆菌PHE31株在还原条件下的反应中在24小时后生成了34mM的苯酚。

实施例3作为苯酚生产用宿主的适性试验

苯酚对需氧增殖的影响

对谷氨酸棒杆菌、大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌进行需氧培养中的苯酚的生长抑制试验。另外，本试验中使用的恶臭假单胞菌S12作为耐溶剂性菌进行了报道，并公开了迄今为止唯一作为苯酚生产的宿主使用的技术。

将谷氨酸棒杆菌R涂布在A琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置15小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有10mlA液体培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g溶解于1L蒸馏水中]的试管中，在33℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。

将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌R接种到100mlA液体培养基中以使初始菌体浓度OD₆₁₀为0.05，同时添加苯酚使终浓度为0mM、0.16mM、0.2mM、0.24mM、0.32mM，并在33℃下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD₆₁₀的吸光度来进行。

将大肠埃希氏菌JM109涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在37℃下于暗处静置15小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的大肠埃希氏菌JM109接种到装有10mlLB液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%氯化钠]的试管中，在37℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。

将上述条件下生长的大肠埃希氏菌JM109接种到100mlLB液体培养基中以使初始菌体浓度OD₆₁₀为0.05，同时添加苯酚使终浓度为0mM、0.16mM、0.20mM，并在37℃下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD₆₁₀的吸光度来进行。

将恶臭假单胞菌F1和S12涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在30℃下于暗处静置15小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的恶臭假单胞菌F1和S12接种到装有10mlLB(+葡萄糖)液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和0.4%葡萄糖]的试管中，在30℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。

将上述条件下生长的恶臭假单胞菌F1和S12株接种到100mlLB(+葡萄糖)液体培养基中以使初始菌体浓度OD₆₁₀为0.05，同时添加苯酚使终浓度为0mM、0.10mM、0.20mM，并在30℃下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD₆₁₀的吸光度来进行。向培养基中添加苯酚对需氧增殖的影响的分析结果示于图2中。

对于大肠埃希氏菌而言，在0.16%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。

恶臭假单胞菌F1和作为耐溶剂性菌被报道的恶臭假单胞菌S12显示出基本相同的倾向，在0.10%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。

与此相对，谷氨酸棒杆菌即使在使大肠埃希氏菌的增殖受到显著抑制的0.16%的苯酚存在下对增殖也几乎没有影响，即使在使大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌的增殖完全被抑制的0.20%的苯酚存在下也显示出良好的生长。而且在0.24%的苯酚存在下能够增殖。

由此表明，谷氨酸棒杆菌与大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌相比对苯酚具有高耐性，作为苯酚生产的宿主具有高适性。

产业上的可利用性

根据本发明方法，能够使用微生物以实用的效率由酪氨酸制造苯酚。

Claims

1.一种苯酚的制造方法，其中，包括：

使转化体在还原条件下、在含有酪氨酸、其盐或其酯的反应液中反应的步骤，和

回收反应培养基中的苯酚的步骤，

所述转化体通过将编码酪氨酸酚解酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌而得到，所述编码酪氨酸酚解酶的基因来源于成团泛菌(Pantoeaagglomerans)且由序列号16的碱基序列构成，所述宿主谷氨酸棒杆菌为存在于保藏编号为FERMP-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的编码苯酚2-单加氧酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。

2.如权利要求1所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。

3.如权利要求1所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200～-500毫伏。

4.如权利要求1所述的苯酚的制造方法，其中，转化体为保藏编号为NITEBP-999的谷氨酸棒杆菌PHE31。

5.谷氨酸棒杆菌PHE31转化体，其保藏编号为NITEBP-999。