JPH03240492A - 新規なプラスミド、それを保有するコリネ型細菌及びβ―チロシナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、β−チロシナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ領
域と、コリネ型細菌細胞内で増殖能及び安定化機能を有
するＤＮＡ領域とを保有するプラスミド、該プラスミド
で形質転換されたコリネ型細菌、及び該コリネ型細菌を
培養してβ−チロシナーゼを製造する方法に関する。

（従来の技術） β−チロシナーゼは、フェノールとＬ−セリン又はフェ
ノールとピルビン酸とアンモニアからし一チロシンを、
カテコールとＬ−セリンからＬ−ジヒドロキシフェニル
アラニン（以下「Ｌ−ドーパ」という）等を産生ずる有
用な酵素である。

このような産業上有用なβ−チロシナーゼを産生ずる微
生物としては、エシェリヒア属、シュードモナス属、フ
ラボバクテリウム属、アグロバクテリウム属、エアロバ
クク属、エルビニア属、プロテウス属、シトロバクタ属
、エンテロバクタ属、サルモネラ属等に属する菌株が知
られているが、工業的利用上多くの利点を有し、アミノ
酸、有機酸、核酸発酵などに実績のあるコリネ型細菌を
用いてβ−チロシナーゼを生産することは従来全く知ら
れていない。

ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ型細菌について
、組換えＤＮＡ技術による菌株の育種改良は、エシェリ
ヒア・つり等に比べてまだ遅れており、特にコリネ型細
菌を宿主とする工業的に有用な安定性に優れたベクター
の開発が強く望まれていた。

一般に組換えベクターの宿主内での安定性に関して、従
来より、培養時の宿主からのプラスミドの脱落や挿入遺
伝子の欠落等種々の遺伝子的不安定性が問題となってい
たが、本発明者らは、先にコリネ型細菌内で複製増殖し
つるブレビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍｓｔａｔｉｏｎｉｓ　）　　Ｉ　ＦＯ
１２１４４由来のプラスミドｐＢＹ５０３上に安定化機
能を担うＤＮＡ断片が存在することを発見し、該ＤＮＡ
断片を不安定なプラスミドベクターに結合させることに
より安定化させる方法を提案した（特願平１−１８３７
０６号明細書参照）。

（発明が解決しようとする課題） そこで本発明者らは、上記プラスミドの安定化機能を担
うＤＮＡ断片を利用し、かつ本来β−チロシナーゼ産生
能を有していないコリネ型細菌に、エシェリヒア・イン
ターメディア由来のβチロシナーゼ構造遺伝子を導入し
た新規なプラスミドを得、このプラスミドでコリネ型細
菌を形質転換し、さらにこの菌を用いてβ−チロシナー
ゼを著量産生させることに成功した。

（課題を解決するための手段） 本発明は、β−チロシナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ領
域（ａ）と、コリネ型細菌細胞内で増殖能を有するＤＮ
Ａ領域（ｂ）及びプラスミド安定化機能を有するＤＮＡ
領域（Ｃ）とを保有するプラスミド、該プラスミドで形
質転換されたβ−チロシナーゼ産生能を有するコリネ型
細菌、並びに該コリネ型細菌を培養して培養物からβ−
チロシナーゼを採取することを特徴とするβ−チロシナ
ーゼの製造法である。

以下、本発明において新規に創製したプラスミドの構成
についてさらに詳しく説明する。

本発明のプラスミドは、必須のＤＮＡ領域として、フェ
ノールとＬ−セリン又はフェノールとピルビン酸とアン
モニアからし一チロシンを、またカテコールとＬ−セリ
ンからＬ−ドーパ等を生成する機能をもつ酵素、すなわ
ちβ−チロシナーゼ（ＥＣ４，１，９９，２］をコード
する構造遺伝子（以下「β−チロシナーゼ構造遺伝子」
と略称する）を含むＤＮＡ領域（ａ）を保有する。この
ＤＮＡ領域（ａ）は、β−チロシナーゼ構造遺伝子と共
に該構造遺伝子の発現に関与するプロモータＤＮＡ及び
このプロモータを制御する遺伝子とを含むＤＮＡ断片（
以下、これを「Ｔ領域」と略称することがある）であり
、β−チロシナーゼを菌株が産生ずるためのシグナルと
なる調節遺伝子領域であって、例えば、エシェリヒア・
コリ染色体ＤＮＡ由来のトリプトファンプロモーター及
びオペレータ画分を含むＤＮＡ領域、エシェリヒアイン
ターメディア染色体ＤＮＡ由来のβ−チロシナーゼプロ
モータ及びその発現を調節するＤＮＡ領域等を包含する
。

まず、「Ｔ領域」の供給源となる微生物としては、原核
生物に属し、β−チロシナーゼ産生能を有するものであ
ればいかなる菌株でもよく、これらの性質を有する微生
物の具体例としては、例えばエシェリヒア属、サルモネ
ラ属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、アグ
ロバクテリウム属、エアロバクク属、エルビニア属、プ
ロテウス属、ントロバククー属、エンテロバクタ−属等
に属する菌株、好適には、エシェリヒア属に属する菌株
が挙げられる。そして、上記したβ−チロシナーゼ産生
能を有する菌株の好適具体例としては、例えば、ザ・ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリ− ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第２４５巻、］７６７〜１７２
２ページ（１９７０年）に記載されているエシェリヒア
・インターメディアＡ−２１株の類縁菌株であるエシェ
リヒア・インターメディア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）　Ｆ　Ｋ　Ｕ○０１ＯＮ７が挙
げられる。本菌株は、茨城県つくば市谷田部東１丁目１
＠３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、平成元年
８月３０日付で受託番号　徹工研菌寄第］．　０　９　
７　８号（ＦＥＲＭＰ−１０９７８）どして寄託されて
いる。

「Ｔ領域」のＤＮＡ断片は、上記した微生物の染色体を
、適当な制限酵素、例えばＢａｍＨ　Ｉ、Ｅｃｏ５　２
　Ｉ、　Ｓｔｕｌ．　　ＭｌｕＩ等を用いて切断するこ
とにより調製することができる。特に好適に用いること
ができるＴ領域としては、前記のエシェリヒア・インタ
ーメディアＦＫＵＯＯＩＯＮ−７の染色体を、制限酵素
ＢａｍＨ　Ｉで切り出される長さが約９、８ｋｂのＤＮ
Ａ断片、制限酵素Ｅｃｏ５　２　Ｉ及びＢａｍｌ−ＩＩ
で切り出される長さが約８．ＯｋｂのＤＮＡ断片、制限
酵素Ｓｔｕｌ及びＢａｍｌ−ＩＩで切り出される長さが
約７．８ｋｂのＤＮＡ断片、制限酵素Ｍｌｕ　Ｉ及びＢ
ａｍＨＩで切り出される長さが６．５ｋｂのＤＮＡ断片
、制限酵素Ｍ１ｕＩ及びＳｔ．ｕＩで切り出される長さ
が４．２ｋｂのＤＮＡ断片等が挙げられる。

上記した「Ｔ領域」のＤＮＡ断片を各種制限酵素で切断
した時の切断片の長さを下記の表１に示す。

なお、本明細書において示すプラスミド及びＤＮＡ断片
の長さは、アガロースゲル電気泳動法により測定した値
である。

表　Ｉ　Ｔ領域ＤＮＡ 制限酵素　　認識部位の数　　切断片の長さ（ｋｂ）Ｎ
ｒｕＩ　　　　　　　１　　　　　　　０．７、３５Ｓ
ｐＨ工１　　　　　　　１．５、２．７ＮｓｐＶ　　　
　　　　１　　　　　　　２．３、１．９Ｔｔｈｌｌ［
　　　　　　　］、　　　　　　　４．０、０２一方、
「１゛領域」を組み込むプラスミドベクターとしては、
コリネ型細菌細胞内で安定化機能を有するＤＮＡ領域（
Ｃ）（以下、「Ｐ領域」と略称することがある）及び複
製増殖能を有するＤＮＡ領域（＋：））（以下、「Ｓ領
域」と略称することがある）とをもつものが好適に使用
され、そのうちの代表例としては、プラスミドベクター
ｐＣＲＹ−３０が挙げられる。

プラスミドベクターｐｃＲＹ３０を造成する方法として
は、ブレビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｊｂ
ａｃｔ．ｅｒ］ｕｍ　ｓｔａｔ．ｉｏｎｉｓ）　工Ｆ　
Ｏ　］　２　１　４　４（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５１５
）からプラスミドｐＢＹ５０３　（このプラスミドの詳
細は特開平１−９５７８５号公報参照）を抽出し、制限
酵素ＸｈｏＩ処理により約４．Ｏｋｂの「Ｓ領域」を調
製し、及び制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉ及びＫｐｎ　Ｉ処理に
より約２、１ｋｂの「Ｐ領域」を調製する。これらの両
断片をプラスミドｐｌ−１３Ｇ２９８（宝酒造製）のＥ
ｃｏＲＩ、　Ｋｐｎ丁部位及びＳａｌ　Ｉ部位に組み込
むことにより、プラスミドベクターｐｃＲＹ３０を調製
することができる。

ｒ’ｒ領域」をプラスミドベクターｐｃＲＹ３０に導入
するには、ＭｌｕＩ及びＳｔ．ｕＩで切り出された約４
．２ｋｂの「Ｔ領域ＪにＥｃｏＲＩリンカ−ＤＮＡを連
結させ、プラスミドベクターｐ．ｃＲＹ３０を制限酵素
ＥｃｏＲＩて処理することにより開裂させ、そこに４２
ｋｂの「Ｔ領域」を連結させることにより行う。

次にコリネ型細菌を、以上に述べた「Ｔ領域」及び「Ｐ
領域」と「Ｓ領域」を保持するプラスミドｐｃＲＹ３０
−ＴＰＬＩで形質転換するが、この形質転換しうるコリ
ネ型細菌としては、例えばブレビバクテリウム・アンモ
ニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏ
ｎｉａｇｅｎｅｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ６８７１、同ＡＴＣ
Ｃ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６；ブレビバクテリ
ウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍｌ　Ａ　Ｔ　ＣＣ１４０２０
、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕ
ｍｌＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルク
ミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａ
ｍｉｃｕｍｌ　Ａ　Ｔ　ＣＣ３１８３０及びブレビバク
テリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｆｌａｖｕｍ）Ｍ　Ｊ　２３３　（Ｆ　Ｅ　ＲＭＢＰ−
１４９７）由来の菌株等が用いられる。それらの中でも
ブレビバクテリウム・フラバムＭ　Ｊ　２３’３由来の
菌株が特に好適に用いられる。

なおブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来の菌
株を宿主として用いる場合、本菌株が保有するプラスミ
ドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７８７号公報参照）
により形質転換が困難である場合があるので、そのよう
な場合には、本菌株よりプラスミドｐＢＹ５０２を除去
することが望ましい。そのようなプラスミドｐＢＹ５０
２を除去する方法としては、例えば継代培養を繰り返す
ことにより、自然に欠失させることも可能であるし、人
為的に除去することも可能である［Ｂａｃｔ、Ｒｅｖ、
　３６　　ｐ３６１〜４０５　（１９７２）参照］。上
記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に除去する方法の一
例を示せば以下のとおりである。

宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３の生育を
不完全に阻害する濃度のアクリジンオレンジ（濃度：０
．２〜５０μｇ／ｍｊ）もしくはエヂジウムプロミド（
濃度、０．２〜５０μｇ／−）等を含む培地に、１ｍｌ
’当り約１０細胞になるように植菌し、生育を不完全に
阻害しながら、約２４時間約３５°Ｃで培養する。培養
液を希釈後寒天培地１ ２ に塗布し、約３５℃で約２日培養する。出現したコロニ
ーから各々独立にプラスミド抽出操作を行い、プラスミ
ドが除去されている株を選択する。

この操作によりプラスミドｐＢＹ５０２が除去されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来菌株が得ら
れた。

このようにして得られるブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３−３由来菌株への前記プラスミドの形質転換法
としては、エシェリヒア・コリ及びエルビニア・カロト
ボラについて知られているように［Ｃａ１ｖｉｎ、　Ｎ
、Ｍ、ａｎｄ　Ｈａｎａｗａｌｔ　Ｐ、Ｃ，Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆ　Ｂａｃｔｅｌｉｏｌｏｇｙ、　１７０．２７
９６　（１９８８）Ｉｔｏ、に、Ｎ１５ｈｉｂａ、Ｔ、
ａｎｄ　Ｉｚａｋｉ、ｋｌ、　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　　５２．２９３（１９８８）参照］、ＤＮＡ受容菌
にパルス波を通電することによりプラスミドを導入する
ことが可能である。

上記の方法で形質転換して得られるβ−チロシナーゼ産
生能を有するコリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ２３３−ＴＰＬＩ（微工研菌寄第１１１
２２号）株の培養方法を以下に述べる。

培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通常の栄養培地
で行うことができ、炭素源としては、例えばグルコース
、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、そして窒素源
としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単
独もしくは混合して用いられる。また無機塩としては、
例えばリン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、
硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザ
ミノ酸、ビオチン、Ｌ−チロシン等の各種ビタミン等の
栄養素を培地に添加することもできる。

培養は、通常通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、約２
０〜約４０℃、好ましくは２５〜３５℃の温度で行うこ
とができる。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７
〜８イ」近て行い、培養中のｐＨの調整は酸又はアルカ
リを添加して行うことがてきる。

培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１〜５容量％、
更に好ましくは２〜３容量％である。また、培養期間は
通常１〜７日間とすることができ、最適期間は１〜３日
間である。

このようにして得られる培養物から菌体を集めることに
より、Ｂ−ヂロシナーゼ活性画分を得ることができる。

かくして培養された菌株は、β−チロシナーゼをその菌
体内に含有しているので、取得菌体を例えば超音波処理
、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段にて
破砕して得られる無細胞抽出液を、塩析、イオン交換ク
ロマトグラフ、ゲル濾過等のそれ自体公知の分離・精製
法［例えば、日本生化学金線　生化学実験講座第１巻「
タンパク貿の化学■分離・精製」東京化学同人刊、１〜
３３４頁：堀尾武−１山下仁平編「蛋白質・酵素の基礎
実験法」南江堂刊、ｌ〜３７９頁等参照］に付すことに
よりβ−チロシナーゼを採取することができる。

（実施例） 以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさ
らに具体的に説明する。しかしながら、実施例は本発明
の具体的に認識を得る一助とみなすべきものであり、本
発明の範囲を限定するためのものでないことを理解しな
りればならない。

（Ａ）エシェリヒア・インターメディアＦＫＵＯＯ１０
Ｎ−７の全ＤＮＡの抽出り培地（トリプトン１０ｇ、酵
母エキス５ｇ、グルコースＩｇ、ＮａＣｆ２１５ｇ、蒸
留水１℃ｐＨ７，２）１００ｍｆｆを容量５００＋ｎｔ
’（７）三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅
菌処理した。

この培地にエシェリヒア・インターメディアＦＫＵＯＯ
１０Ｎ−７株を植菌し、３７℃で１５時間培養した後、
この培養液２ｄを採り、新たに上記培地１００−に接種
し、再度３７°Ｃで５ ４時間培養をした。

培養終了後、この培養液全量を遠心分離（８０００×ｇ
、１５分間、４°Ｃ）して集菌し、菌体を５０ｍＭ１□
リス緩衝液（ｐＨ８，０）　−１０ｍＭＥＤＴＡ　・２
Ｎａ溶液５０−に懸濁した。次にリゾヂウムを最終濃度
が２ｍｇ／ｉになるように添加し、５分間静置後、１０
％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を６ｉ添加し、６５°Ｃ
で３０分間保温した。この溶菌液に、５ＭＮａＣ，Ｃ溶
液１５ｍ／を添加し、０℃で１時間冷却し、全量を遠心
分離（１２０００ｘ　ｇ、６０分間、４℃）し、上清画
分を分取し、２倍量のエタノールを加え、混合後、遠心
分離（５０００ｘｇ、１０分間、４°ｃ）した６得られ
た沈殿物を１０ｍ１．ｌトリス緩衝液（ｐＨ７，５）−
１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液に溶解させ、フェノール処
理（除タンパク処理）　Ｊ３よびＲＮＡ分解酵素による
処理を行い、最終的にＤＮＡ１．５ｍｇを得た。

（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たエシェリヒア・インターメディアの
全Ｄ　Ｎ　Ａ、　２５　ｕｇを、制限酵素ＢａｍＨ１６ ５ｕｎｉｔｓを用い、３７°Ｃて１時間反応させ分解し
た。この分解ＤＮＡに、プラスミドｐ　ＬＩ　Ｃ３（フ
ァルマシア製）を制限酵素Ｂａｍ＋−目で切断したもの
を混合し、５０ｎ＋Ｍｔ−リス緩衝液（ｐＨ７，６）、
１０ｍＭジチオスレイトール、ｌｌｌｌＭＡ　Ｔ　Ｐ　
、　　１０　ｍＭＭ　ｇ　ＣＲ２及びＴ４リガーゼ１　
ｕｎｉｔの各成分を添加しく各成分の濃度は最終濃度で
ある）、１２°Ｃで１５時間反応させ、結合させた。

（Ｃ）目的遺伝子を含むプラスミドの選抜上記（Ｂ）項
で得たプラスミド混液を用い、常法に従いエシェリヒア
・コリＨＢＩＯＩ株を形質転換し、アンピシリン５０＋
、＋ｇ／ｍｆ及びＬ−チロシン２　ｍｇ／　ｄを添加し
たＬＢ（前記り培地がらグルコースを除いた培地）寒天
培地上にコロニーを得た。このコロニーの中からし一チ
ロシンを分解してコロニーの周辺に透明な領域（クリア
ーゾーン）を形成する１株を分離した。この菌株よりプ
ラスミドをアルカリ−３ＤＳ法［Ｔ、Ｍａｎ］ａｔ、ｉ
ｓ、　ＥＦ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　
；　　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８
２）ｐ９０〜９１参照］により抽出した。このプラスミ
ドを制限酵素Ｂａｍ　ＨＩで切断し、分子量をアガロー
スゲル電気泳動を用いて調べたところ、プラスミドｐＵ
ｃ１３のＢａｍＨＩ部位に長さ約９．８ｋｂのＤＮＡの
挿入がみられた（以下このプラスミドをｐＵｃ１３−Ｔ
ＰＬＩと称する）。さらに、再度このプラスミドＤＮＡ
を用いて常法によりエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ株を
形質転換したところ、これらの形質転換菌株はアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ及びＬ−チロシン２　ｍｇ／−を添
加した前記ＬＢ寒天培地上に生育し、コロニーはすべて
クリアーゾーンを形成した。

得られた９、８ｋｂのＤＮＡ断片５　ｕｇを制限酵素Ｍ
ｌｕ　Ｉ及びＳｔｕ　Ｉを各々５　ｕｎｉｔＳを用い、
またｐＵｃ４Ｋ　（ファルマシア製）ｌｕｇをＢａｍ１
（Ｉ５　ｕｎｉｔｓを用いて３７℃で１時間反応させ分
解した。両分解ＤＮＡをさらにＳ　１　ｎｕｃｌｅａｓ
ｅて処理することにより平滑末端とした後、混合して上
記方法にて結合させた。

得られた混液を用い、常法に従いエシェリヒア・コリＨ
Ｂ１０１株を形質転換し、アンピシリン５０ｕｇ／献及
びＬ−チロシン２　ｍｇ／艷を添加した前記ＬＢ寒天培
地上にコロニーを得た。このコロニーの中からし一チロ
シンを分解してコロニーの周辺に透明な領域（クリアー
ゾーン）を形成する１株を分離した。この菌株よりプラ
スミドをアルカリ−５ＤＳ法［Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、
Ｅ、ＦＦｒｉｔｓｃｈ　　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ；　　
　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２
）ｐ９０〜９１参照］により抽出した。このプラスミド
を制限酵素ＥｃｏＲＩて切断し、分子量をアガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べたところ、プラスミドｐＵｃ４
にのＥｃｏＲＩ部位に長さ約４．２ｋｂのＤＮＡの挿入
がみられた（以下このプラスミドをｐＵＣ４に−ＴＰＬ
２と称す）。さらに、再度このプラスミドＤＮＡを用い
、常法によりエシェリヒア・コリＨＢ　１０１株を形質
転換したところ、これらの形質転換菌株はアンピシリン
５０μｇ／ｍｌ及びＬ−チロシン２　ｍｇ／−を添加し
たＬＢ寒天培地上に生育し、　９ コロニーはすべてクリアーゾーンを形成した。

以上により、β−チロシナーゼ構造遺伝子を含む約４．
２ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができた。

なお、本断片を各種制限酵素で切断した時の切断片の長
さは前記表１に示したとおりである。

（Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭＢＰ−２５１５）
から分離された分子量約１０メガダルトンのプラスミド
であり、特開平１−９５７８５号公報に記載の方法によ
り調製した。

半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ，）　２Ｓ　Ｏ−
７ｇ　、　Ｋ　２　ＨＰ　Ｏ４０、５ｇ　、　　Ｋ　Ｈ
−ＰＯ４０，５ｇ、ＭｇＳＯ４０、５ｇ、ＦｅＳＯ４・
７Ｈ２０６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２０６ｍｇ、酵
母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオヂン２００Ｌ
１ｇ、塩酸チアミン　０ ２００μｇ、グルコース２０ｇ及び純水１℃］１℃に、
ブレビバクテリウム・スタチオニス１ＦＯ１２１４４を
対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌
体を１０ｍｇ／−の濃度にリゾチームを含む緩衝液［２
５ｍＭｈリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ｌｏ
ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース］　２０−に懸濁
し、３７°Ｃで１時間反応させた。反応液にアルカリ−
３ＤＳ液［０，２ＮＮａＯＨ１１％ｆｗ／ｖ）　Ｓ　Ｄ
　Ｓ］　４０ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて
１５分間静置した。

次しこ、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリ
ウム溶液６０ｔ、ｄ、酢酸１１．５ｄ及び純水２８．５
艷の混合液３３０艷を添加し、充分混和してから氷水中
に１５分間静置した。

溶菌物全量を遠心管に移し、４°Ｃで１０分間、］、５
．ＯＯＯＸｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た。

これに等量のフェノール−クロロボルム液（フェノール
：クロロホルム＝１：１混和液）ヲ加えて懸濁した後、
遠心管に移し、室温下で５分間、１５．０００Ｘ　ｇの
遠心分離にかり、水層を回収した。水層に２倍量のエタ
ノールを加え、−２０’Ｃて１時間静置後、４°Ｃで］
０分間、１５．０００Ｘ　ｇの遠心分離にかけ、沈澱を
回収した。

沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリス１０ｍＭ、ＥＤ
ＴＡ　　１ｍＭ、ＨＣｌ２にてｐＨ＝８．０に調整］２
ｄに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍濃度の
ＴＥ緩衝液１００−に塩化セシウム１７０ｇを溶解させ
た液］　１５ｍ１と］、　Ｏｍｇ／　ｙｎｌエチジウム
ブロマイド溶液ｌ−を加えて、密度を１．３９２ｇ／ｍ
Ｆに合わせた。この溶液を１２°Ｃで４２時間、　］、
］、６．０００Ｘ　ｇの遠心分離を行った。

プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射により遠心管内で
下方のバンドとして見い出される。このハンドを注射器
で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミドｐ
ＢＹ５０３を含む分画液を得た。

次いてこの分画液を等量のイソアミルアルコールで４回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後に
ＴＥ緩衝液に対して透析を行った。このようにして得ら
れたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液に３Ｍ酢酸す
ｌ・リウム溶液を最終濃度３０ｍ）混こなるよう添加し
た後、２倍量のエタノールを加え、−２０°Ｃて１時間
静置した。

この溶液を１５．０ＯＯＸ　ｇの遠心分離にかりてＤＮ
Ａを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を５０　ｕｇ得
た。

（Ｂ）プラスミドｐＨ３Ｇ２９８の準備プラスミドｐＨ
３Ｇ２９８は、エシェリヒア・コリ内で複製し、クロラ
ムフェニコール耐性を弁理する分子量的１．８メガダル
トンのプラスミドであり、市販品どして宝酒造より購入
が可能である。

（Ｃ）プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の調製プラスミ
ドｐＨ３Ｇ２９８　（宝酒造製）０．５ｕｇに制限酵素
Ｓａｌ工（５ｕｎｉｔｓ　）を３７°Ｃで１時間反応さ
せ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。

前記（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ３ ４ ５０３２Ｊｙｇに制限酵素ＸｈｏＴ　（１ｕｎｉｔ）を
３７°Ｃて３０分間反応させ、プラスミドＤ　Ｎ　Ａを
部分分解した。

両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素を不
活性化するために６５℃で１０分間加熱処理した後、該
失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭトリス
緩衝液ｒ＋Ｈ７，６，１０ｍＭＭｇＣｎ２．１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ’　４リガーゼ
］　ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃで
１５時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コ
リＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換
した。

形質転換株は３０ｕｇ／ｉ（最終濃度）のカナマイシン
１００１メｇ／ｍｆ’　（最終濃度）のＩ　ＰＴＧ（イ
ソプロピル−〇−Ｄ−チオガラクトピラノシド）　、　
　１００ｕｇ／ｙｎｌ　（最終濃度）のＸ　−ｇａｌ（
５−７’ロモー４−クロロ−３−インドリル−βＤ−ガ
ラクトピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、
酵母エキス５ｇ、Ｎａ（，２５ｇ及び純水ｌＩ２１．Ｉ
Ｈ７，２）で３７°Ｃにて２４時間培養し、生育株とし
て得た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育し
てきたものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−３Ｄ
Ｓ法［Ｔ、Ｍａｎｊａｔｉｓ、　　　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔ
ｓｃｈ　　、　　　、Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　、”Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　”　　（１９８２）
　ｐ　９０〜９１参照］によりＤＮＡを抽出した。

その結果、プラスミドｐ　ＨＳ　Ｇ　２９８のＳａｌ　
Ｉ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０に、Ｉ
〕の断片が挿入されたプラスミドＰＨ３Ｇ２９８ｏｒｊ
を得た。

次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で得られたプラス
ミドｐＢＹ５０３ＤＮＡをＫｐｎ　工及びＥｃｏＲ工に
て処理して得られる約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を上記プ
ラスミドｐ　ＨＳ　Ｇ　２９８ｏｒｉのＫｐｎ　Ｉ及び
Ｅｃｏ　Ｒ丁部位にクローニングし、プラスミドベクタ
ーｐｃＲＹ３０を作製した。

実施例１で得られたプラスミドｐＵＣ４に−ＴＰＬ２Ｄ
ＮＡ　　５μｇ及び実施例２で得られたプラスミドベク
ターｐｃＲＹ３ＧＤＮＡ　　１μｇを各々制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ　　５　ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１時間反応
させ分解した。両分解ＤＮＡを混合し、上記方法にて結
合させ、常法に従いエシェリヒア・コリ８３１０１株を
形質転換し、カナマイシン３０μｇ　／　ｍｆ’及びＬ
−チロシン２μｇ／−を添加した前記ＬＢ寒天培地中に
コロニーを得た。このコロニーからＬ−チロシンを分解
してコロニーの周辺に透明な領域（クリアーゾーン）を
形成する１株を分離した。この菌株よりプラスミドＤＮ
Ａを常法に従い抽出し、コリネ型細菌へ形質転換した。

形質転換は、電気パルス法を用いて行った。

ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株を１
００−の前記Ａ培地で対数増殖期初期まで培養し、ペニ
シリンＧを１ｕｎｉｔ／ｉになるように添加し、さらに
２時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体な
２０艷のパルス用溶液（２７２ｍＭ　５ｕｃｒｏｓｅ、
７ｍＭＫＨ２ＰＯ４１ｍＭ　Ｍｇ０ｆ２２　：Ｉ）Ｈ７
，４）にて洗浄した。さらに菌体を遠心分離して集め、
５艷のパルス用溶液に懸濁し、０７５−の細胞と、前記
で得られたプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ｆｔＪ液５０μを混
合し、水中にて２０分間静置した。シーンパルサー（バ
イオラド社製）を用いて、２５００ボルト、２５μＦＤ
に設定し、パルスを印加後水中に２０分間静置した。全
量を３−の前記Ａ培地に移し３０℃にて１時間培養後、
カナマイシン１５μｇ／ｍｌ　（最終濃度）を含む前記
Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日間培養した。出現
したカナマイシン耐性株より、前記実施例２（Ａ）項に
記載の方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミド
を各種制限酵素による切断片の分子量及び長さ（ｋｂ）
を測定した。結果を下記の表２に示す。

７ 表　２　プラスミドｐｃＲＹ３０−ＴＰＬ　１ＥｃｏＲ
Ｉ　　　　　　２　　　　　５．９　ｆ８．９）、２．
７　（４，２）ＫｐｎＩ　　　　　　ｌ　　　　　　　
　　８．６　（１３，１）ＢａｍＨＩ　　　　　　１　
　　　　　　　　８．６　（１３，１）ＳｏｌＩ　　　
　　　　１　　　　　　　　　８．６　ｆ１３．１１上
記制限酵素により特徴づけられるプラスミドを’ｐｃＲ
Ｙ３０−ＴＰＬＩ°゛と命名した。

なお、プラスミドｐｃＲＹ３０−ＴＰＬＩにより形質転
換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−Ｔ
ＰＬ１は、茨城県つくば南東１丁目１番３号の工業技術
院微生物工業技術研究所に、平成元年１１月１７日付で
受託番号：微工研菌寄第１１ｔ２２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−１１１２２）として寄託されている。

前記のＡ培地１００ｍ１’を５００−容三角フラスコに
分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理したも　８ のに、実施例３で得た形質転換株ＭＪ２３３−ＴＰＬ１
を植菌し、３０°Ｃにて２４時間振盪培養を行った後、
同様にして調製したＡ培地１００ｉを５００−容三角フ
ラスコに分注し、１２０°Ｃて１５分間滅菌したものに
、１艷当り５０　ｃｅｌｌｓの割合になるように植継し
、同じく３０°Ｃにて２４時間振盪培養を行った。次に
遠心分離して集菌し、菌体を洗浄後、カナマイシンを１
５μＨ／　ｍｌの割合で添加したＡ培地及び無添加のＡ
培地を用いて調製した平板培地に一定量塗抹し、３０’
Ｃにて１日培養後生育コロニーをカウントした。

この結果、カナマイシン添加および無添加培地に生育し
たコロニーは同数であること、さらにＡ培地生育コロニ
ーは全てカナマイシン添加培地に生育すること、すなわ
ち該プラスミドの高度の安定性を確認した。

実施例５．−チロシナーゼ活　　硯能 培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１４ｇ、ＫＨ２
ＰＯ２０５％、Ｋ２　ＨＰｏ。

００５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ・７Ｈ２００，０５％、Ｃ
ａＣｇ□２１−１２０　　２　ｐｐｍ　　、　　Ｆ　　
ｅ　　Ｓ　　０４７Ｈ２０２ｐｐｍ　　、Ｍｎ　ＳＯ４
・　４〜６１（＋＋　　Ｏ２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ４７Ｈｉ
Ｏ２ｐｐｍ、ＮＮａＣｌ２２ｐｐ、ビオチン２００ｕｇ
／ｆ２、チアミンＨＣｌ２］、ＯＯ＋ｙｇ／ｆｆ、トリ
プトン０．１％及び酵母エキス０．１％）１００ｍｌ’
を５００−容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７
，０）した後、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３−ＴＰＬＩ株を植菌し、無菌的にグルコースを最終濃
度２％（ｗ／Ｖ）になるように加え、３０°Ｃにて］５
時間振盪培養した。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２．３％、ＫＨ，
ＰＯ２・０．０５％、Ｋ２１−ＩＰｏ。

０．０５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２０００５％、Ｆ
ｅ５０＋−７Ｈｚ０　２０ｐｐｍ　、Ｍｎ５Ｏ４ｎ８２
０　２０ｐｐｍ、ビオチン２００ｕ＋！／ｆ２、チアミ
ン・ＨＣｆ２１１００ｊＪ／ρ、トリプトン０３％及び
酵母エキス０３％）の１０００ｍ＃を２℃容通気撹拌橿
に仕込み、滅菌（１２０’Ｃｌ２Ｏ分間）後、無菌的に
グルコースを最終濃度２％（Ｗ／Ｖ）　となるように加
え、さらに前記前培養物を各々２０ｍ１＋添加して、回
転数１１００Ｏｒｐ、通気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐ
Ｈ７，６にて１０時間培養を行った。この培養液より菌
体を集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で２
回洗浄した後に、湿菌体２５０ｍｇに同様のリン酸緩衝
液１献を加え、水冷中細音波破砕を行い、粗酵素液とし
た。次に、１％フェノール、４％Ｌ−セリン、］％塩化
アンモニウム、０２％ＥＤＴＡ及び０．４％亜硫酸ナト
リウム（ｐＨ８，０）からなる反応液５ｉに上記の粗酵
素液０２−を加え、３０℃で３０分間反応させた。生成
したし一チロシンを薄層クロマトグラフィーで分離定量
し、β−ヂロシナーゼ活性を算出した。

また、対照として、プラスミドｐＣＲＹ３０−ＴＰＬＩ
を保持しないブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
についても同様の操作を行い、β−ヂロシナーゼ活性を
求めた。

その結果、本発明のプラスミドで形質転換したブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ２２３１ ２ ＴＰＬＩ菌株は約１５７Ｉｍｏｌ−チロシン／ｇｗｅｔ
　ｃｅｌｌ、／　ｆ１ｒ／　ｆ２のβ−ヂロシナーゼ活
性を示したのに対し、対照として用いた菌株は全く活性
が検出されなかった。

「発明の効果］ 本発明のプラスミドｐｃＲＹ３０−ＴＰＬＩは、コピー
数が多く、宿主の細胞分裂に際して脱落することなく、
安定して娘細胞に受は継がれ、また菌体内で効率的にβ
−チロシナーゼを発現できるという優れた特性を有して
いる。

従って、本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−Ｔ　Ｐ　Ｌ
　１で形質転換された微生物を用いたβ−チロシナーゼ
の製造法は、Ｌ−チロシンもしくはＬ−チロシン誘導体
の製造において、工業的に応用することが大いに期待さ
れる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）β−チロシナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ領域（
   ａ）と、コリネ型細菌細胞内で複製増殖能を有するＤＮ
   Ａ領域（ｂ）及びプラスミド安定化機能を有するＤＮＡ
   領域（ｃ）とを保有するプラスミド。 （２）β−チロシナーゼ構造遺伝子を含む ＤＮＡ領域がエシェリヒア・インターメディアＦＫＵＯ
   ＯＩＯＮ−７染色体由来のＤＮＡ断片であり、複製増殖
   能を有するＤＮＡ領域及び安定化機能を有するＤＮＡ領
   域がプラスミドｐＢＹ５０３由来のＤＮＡ断片である請
   求項１記載のプラスミド。 （３）プラスミドが下記で示される制限酵素地図を有す
   るプラスミドｐＣＲＹ３０−ＴＰＬ１である請求項１又
   は２に記載のプラスミド。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （４）請求項１ないし３のいずれか１項に記載のプラス
   ミドで形質転換されたコリネ型細菌。 （５）宿主がブレビバクテリウム属に属する細菌である
   請求項４に記載のコリネ型細菌。（６）形質転換体がβ
   −チロシナーゼ産生能を有するブレビバクテリウム・フ
   ラバムＭＪ２３３である請求項４に記載のコリネ型細菌
   。 （７）請求項４ないし６のいずれか１項に記載のコリネ
   型細菌を培養して、培養物からβ−チロシナーゼを採取
   することを特徴とするβ−チロシナーゼの製造法。