CN103221533A

CN103221533A - 棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法

Info

Publication number: CN103221533A
Application number: CN2011800543731A
Authority: CN
Inventors: 汤川英明; 乾将行
Original assignee: GREEN PHENOL TECHNOLOGY RESEARCH ASSOCIATION
Current assignee: Green Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2031-11-09
Also published as: US20130273624A1; EP2639295A4; WO2012063862A1; EP2639295B1; JP5996434B2; EP2639295A1; KR20140012026A; JP5996434B6; KR101972556B1; JPWO2012063862A1; CN103221533B; US9404115B2

Abstract

一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)活性的酶的基因和编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。一种苯酚的制造方法，其中包括使该转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤。

Description

棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法

技术领域

本发明涉及苯酚生产技术。更详细而言，本发明涉及为了赋予苯酚生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体及使用该转化体的高效的苯酚的制造技术。

背景技术

在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。

但是，对于以可再生资源为原料的生物苯酚生产而言，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低，并且作为产物的苯酚会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚产生的细胞毒性等，基于上述理由，目前还不能进行工业性的生产。

作为苯酚的重要用途，可以列举酚醛树脂。酚醛树脂是由苯酚与醛类的加成缩合反应生成且在塑料中具有最古老历史的树脂，由于其优良的耐热性、耐久性等优点，目前仍被用于汽车用金属替代材料、半导体密封材料、电路基板等各种用途。另外，对于迄今为止的酚醛树脂而言，由于原料苯酚与醛类的反应性极高，所得到的高分子形成复杂的三维网状结构，因此，难以实现聚合物的精密结构设计和在纳米材料中的发展，从而认为难以应用于高附加价值的用途。但是近年来，随着高分子的物性理论和仿真技术的快速发展，只要使网状结构精密化则能够由酚醛树脂创制高功能性材料。在这样的背景下，日本的酚醛树脂生产量正在逐年增加。

目前的苯酚的工业生产法(异丙苯法)是以石油来源的苯和丙烯作为原料、需要大量的溶剂类和大量的热能的、典型的化学工业的高能耗型工艺。因此，从保护地球环境和减少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发二氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型工艺，即建立生物苯酚制造技术。

迄今为止尚未报道过自然界中的苯酚生产菌。

另外，也尚未获知利用基因重组菌生产苯酚且能够得到足以实用的苯酚生产率的技术。

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题在于提供能够以糖类为原料高效地制造苯酚的微生物、以及能够以糖类为原料高效地制造苯酚的方法。

用于解决问题的手段

为了解决上述问题，本发明人反复进行了研究，得到下述发现。

(i)在棒状细菌中导入分支酸-丙酮酸裂解酶基因和4-羟基苯甲酸脱羧酶基因而得到的转化体能够高效地生产苯酚。

(ii)该转化体中，存在于宿主棒状细菌的染色体上的4-羟基苯甲酸羟化酶基因被破坏或发生缺陷时，能够更高效地生产苯酚。

(iii)该转化体中，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶基因以比转化前的宿主基因的表达水平高的水平进行表达时，能够更高效地生产苯酚。

(iv)该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯酚生产效率特别高。

本发明是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯酚的制造方法。

第1项.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)活性的酶的基因和编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。

第2项.如第1项所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的基因、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)来源的基因、维氏固氮菌(Azotobactervinelandii)来源的基因、需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)来源的基因、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)等柠檬酸杆菌属细菌来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)来源的基因、地中海海单胞菌(Marinomonas mediterranea)来源的基因、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)来源的基因、真氧产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)来源的基因、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)来源的基因或脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)来源的基因。

第3项.如第1项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌来源的基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的基因、克氏柠檬酸杆菌来源的基因、产气肠杆菌来源的基因、阴沟肠杆菌来源的基因、霍氏肠杆菌来源的基因、阪崎肠杆菌来源的基因、大肠埃希氏菌来源的基因、弗格森埃希氏菌来源的基因、多粘类芽孢杆菌来源的基因或菠萝泛菌来源的基因。

第4项.如第1项所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA，

(a)由序列号31、序列号34、序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92或序列号93的碱基序列构成的DNA；

(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。

第5项.如第1项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(c)或(d)的DNA，

(c)由序列号37、序列号44、序列号47、序列号50、序列号53、序列号56、序列号59、序列号62、序列号65、序列号68、序列号71或序列号74的碱基序列构成的DNA；

(d)在严格的条件下与由(c)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。

第6项.如第1项～第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶(4-hydroxybenzoate hydroxylase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

第7项.如第1项～第6项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶(phenol2-monooxygenase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

第8项.如第1项～第7项中任一项所述的转化体，其中，编码具有DAHP合酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate7-phosphate(DAHP)synthase，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶)活性的酶的基因在宿主棒状细菌内高表达。

第9项.如第1项～第8项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。

第10项.如第1项～第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869。

第11项.如第1项～第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

第12项.如第1项～第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

第13项.如第1项～第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869中高表达编码具有DAHP合酶活性的酶的基因的棒状细菌。

第14项.谷氨酸棒杆菌PHE18(保藏编号：NITE BP-995)、PHE11、PHE12、PHE13、PHE14、PHE15、PHE16、PHE17、PHE19-1、PHE19-2、PHE19-3、PHE19-4、PHE19-5、PHE19-6、PHE19-7、PHE19-8、PHE19-9、PHE19-10、PHE19-11、PHE19-12、PHE20-1、PHE20-2、PHE20-3、PHE20-4、PHE20-5、PHE20-6、PHE20-7、PHE20-8、PHE20-9、PHE20-10、PHE20-11、PHE20-12、PHE20-13或PHE20-14的转化体。

第15项.一种苯酚的制造方法，其中，包括：

使第1项～第14项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤，和

回收反应液中的苯酚的步骤。

第16项.如第15项所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。

第17项.如第15项或第16项所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200～-500毫伏。

第18项.如第15项～第17项中任一项所述的苯酚的制造方法，其中，糖类为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖和甘露糖醇组成的组中的糖。

发明效果

通过使用本发明的转化体，能够由糖类以高效率制造苯酚。

一般而言，微生物的增殖会因苯酚这样的溶剂的细胞毒性而受到抑制，因此，难以使用微生物来制造苯酚，但根据本发明方法，能够使用微生物以实用上足够良好的效率制造苯酚。

附图说明

图1是实施例中使用的各种质粒的构建图。

图2是实施例中使用的各种质粒的构建图。

图3是实施例中使用的各种质粒的构建图。

图4是表示苯酚对各种微生物在需氧条件下的增殖的影响的图。

图5是表示苯酚对棒状杆菌在还原条件下的糖消耗的影响的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

(I)具有苯酚生产能力的转化体

本发明的具有苯酚生产能力的转化体是将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)活性的酶的基因和编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到的转化体。

宿主

棒状细菌为Bargey’s Manual of Determinative Bacteriology(伯杰氏系统细菌学手册),Vol.8,599(1974)中定义的一组微生物，只要是在通常的需氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。

作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、解烷棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。

其中，从安全且苯酚生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒杆菌。作为优选的菌株，可以列举：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等。其中，优选R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。

另外，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl,W.et al.,Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM20297T,“Brevibacterium flavum”DSM20411,“Brevibacterium lactofermentum”DSM20412and DSM1412,and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.Int J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等,棒状细菌的分类,发酵与工业,45:944-963(1987)]。

旧分类的乳糖发酵短杆菌ATCC13869株、黄色短杆菌的MJ-233株(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41株(FERM BP-1498)等也是优选的谷氨酸棒杆菌。

作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)(例如ATCC6872株)等。

作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)(例如ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株)等。

作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)(例如ATCC19210株、ATCC27289株)等。

作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcusfreudenreichii)(例如No.239株(FERM P-13221))、藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)(例如No.240株(FERM P-13222))、脲微球菌(Micrococcus ureae)(例如IAM1010株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764株)等。

另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高苯酚的生产率或抑制副产物的生成。

其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因的破坏株，特别是谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。

这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，WO2005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。

分支酸-丙酮酸裂解酶基因(ubiC)

分支酸-丙酮酸裂解酶是催化使丙酮酸从分支酸酯/盐脱离而生成4-羟基苯甲酸酯/盐的反应的酶。

编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，优选大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的基因、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)来源的基因、维氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)来源的基因、需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)来源的基因、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)等柠檬酸杆菌属细菌来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)来源的基因、地中海海单胞菌(Marinomonas mediterranea)来源的基因、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)来源的基因、真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)来源的基因、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)来源的基因和脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrificans)来源的基因，更优选恶臭假单胞菌来源的基因。

作为大肠埃希氏菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号31的碱基序列构成的DNA，作为恶臭假单胞菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号34的碱基序列构成的DNA，作为鲍氏不动杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号81的碱基序列构成的DNA，作为维氏固氮菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号82的碱基序列构成的DNA，作为需盐色盐杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号83的碱基序列构成的DNA，作为克氏柠檬酸杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号84的碱基序列构成的DNA，作为杨氏柠檬酸杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号85的碱基序列构成的DNA，作为阴沟肠杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号86的碱基序列构成的DNA，作为水油海杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号87的碱基序列构成的DNA，作为地中海海单胞菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号88的碱基序列构成的DNA，作为菠萝泛菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号89的碱基序列构成的DNA，作为游海假交替单胞菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号90的碱基序列构成的DNA，作为真氧产碱杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号91的碱基序列构成的DNA，作为腐败希瓦氏菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号92的碱基序列构成的DNA，作为脱氮硫杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号93的碱基序列构成的DNA。

另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号31、序列号34、序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92或序列号93的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。

本发明中，“严格的条件”是指一般的条件、例如Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验指南),第二版,1989,Vol2,p11.45中记载的条件。具体而言，是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5～10℃的温度下发生杂交的情况。

分支酸-丙酮酸裂解酶活性可以利用《Journal of Bacteriology,174,5309-5316,1992“Materials and Methods”》中记载的方法测定。简单地来说明，向试验用液中添加被测酶，制备含有50mM Tris-HCl pH7.5、5mM EDTA、10mMβ-巯基乙醇、60μM分支酸和酶的反应液，测定240nm下的吸光度的斜率(初速度)。对于不添加分支酸的体系也同样进行反应，作为背景值。将两个测定值的差作为分支酸-丙酮酸裂解酶活性。

另外，本发明中，也可以使用由与序列号31、序列号34、序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92或序列号93的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。

本发明中，碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社ゼネティックス制造)算出的值。

由序列号31、序列号34、序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92或序列号93的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过例如使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交从其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。

4-羟基苯甲酸脱羧酶基因(bsdBCD或dca)

4-羟基苯甲酸脱羧酶是催化通过4-羟基苯甲酸酯/盐的脱羧生成苯酚的反应的酶。

编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，可以列举枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)等芽孢杆菌属细菌来源的基因、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)来源的基因、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)等肠杆菌属细菌来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)等埃希氏菌属细菌来源的基因、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)来源的基因、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因等。其中，优选芽孢杆菌属细菌(特别是枯草芽孢杆菌)来源的基因、肠杆菌属细菌(特别是阴沟肠杆菌)来源的基因、埃希氏菌属细菌(特别是大肠埃希氏菌)来源的基因。

另外，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因根据来源使用各种不同的简称。例如，枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因简称为bsdBCD。本说明书中，有时无论来源如何将4-羟基苯甲酸脱羧酶基因均简称为“dca”。

作为枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号37的碱基序列构成的DNA，作为萎缩芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号44的碱基序列构成的DNA，作为枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号47的碱基序列构成的DNA，作为克氏柠檬酸杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号50的碱基序列构成的DNA，作为产气肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号53的碱基序列构成的DNA，作为阴沟肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号56的碱基序列构成的DNA，作为霍氏肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号59的碱基序列构成的DNA，作为阪崎肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号62的碱基序列构成的DNA，作为大肠埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号65的碱基序列构成的DNA，作为弗格森埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号68的碱基序列构成的DNA，作为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号71的碱基序列构成的DNA，作为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号74的碱基序列构成的DNA。

另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号37、序列号44、序列号47、序列号50、序列号53、序列号56、序列号59、序列号62、序列号65、序列号68、序列号71或序列号74的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。

4-羟基苯甲酸脱羧酶活性可以利用《Genomics,86,342-351,2005“Materials and Methods”》中记载的方法测定。简单地来说明，向试验用液中添加被测酶，制备含有100mM MES,pH6.0、1mM DTT、5mM4-羟基苯甲酸酯/盐和酶的反应液，测定270nm下的吸光度的斜率(初速度)。对于不添加4-羟基苯甲酸酯/盐的体系也同样进行反应，作为背景值。将两个测定值的差作为4-羟基苯甲酸脱羧酶活性。

另外，本发明中，也可以使用由与序列号37、序列号44、序列号47、序列号50、序列号53、序列号56、序列号59、序列号62、序列号65、序列号68、序列号71或序列号74的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。

由序列号37、序列号44、序列号47、序列号50、序列号53、序列号56、序列号59、序列号62、序列号65、序列号68、序列号71或序列号74的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过前述的方法获得。

用于转化的载体的构建

将通过PCR扩增得到的编码分支酸-丙酮酸裂解酶的DNA和编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的DNA各自克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。

作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举：乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)2256来源的pAM330[日本特开昭58-67699]、[Miwa,K.et al.,Cryptic plasmids in glutamic acid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和[Yamaguchi,R.et al.,Determination of the complete nucleotide sequence of tthe Brevibacteriumlactofermentum plasmid pAM330and the analysis of its geneticinformation.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267(1985)]、谷氨酸棒杆菌ATCC13058来源的pHM1519[Miwa,K.et al.,Cryptic plasmids inglutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和pCRY30[Kurusu,Y.et al.,Identification ofplasmid partition function in coryneform bacteria.Appl.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌T250来源的pCG4[日本特开昭57-183799]、[Katsumata,R.et al.,Protoplast transformation ofglutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭62-166890]、pEK0、pEC5、pEKEx1[Eikmanns,B.J.et al.,A family ofCorynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene,102:93-98(1991)]等。

作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒杆菌R来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(ldhA)的启动子PldhA等，其中，优选PgapA。

作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB T1T2终止子。

转化

转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu,Y.et al.,Electroporation-transformationsystem for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447(1990)]和[Vertes A.A.et al.,Presence of mrr-andmcr-like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。

转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。

作为碳源，可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为氮源，可以列举：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。

作为营养物质，可以列举例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选约5～约8。

作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui,M.et al.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate andsuccinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。

培养温度设定为约15℃～约45℃即可，培养时间设定为约1天～约7天即可。

宿主染色体基因的破坏或缺失

宿主棒状细菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因(pobA)被破坏或发生缺失，由此能够更高效地制造苯酚。

另外，宿主棒状细菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因(poxF)被破坏或发生缺失，由此，能够更高效地制造苯酚。

特别优选pobA和poxF这两者均被破坏或发生缺失。

制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有：使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。

具体而言，通过实施例1的项目中记载的方法，能够得到4-羟基苯甲酸羟化酶基因(pobA)被破坏或发生缺失的棒状细菌。另外，通过同样的方法，能够得到苯酚2-单加氧酶基因(poxF)被破坏或发生缺失的棒状细菌。

代谢基因的高表达

本发明的转化体中，优选DAHP合酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate7-phosphate(DAHP)synthase)基因(aroG)以比宿主本来的水平、即野生型宿主的水平高的水平进行表达。该高表达通过利用转化导入基因或增加宿主染色体上的基因的拷贝数来实现。

对转化进行说明，导入的DAHP合酶基因可以是与宿主的基因相同或实质上相同的DAHP合酶基因，也可以是其他的DAHP合酶基因。优选导入与宿主的基因相同或实质上相同的DAHP合酶基因。

例如，作为谷氨酸棒杆菌来源的DAHP合酶基因，可以列举由序列号28的碱基序列构成的DNA。

作为其他的棒状细菌的DHAP合酶基因，有：有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)来源的基因(序列号120，日本DNA数据库：CE2073)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)来源的基因(序列号121，日本DNA数据库：MSMEG_4244)、混浊红球菌(Rhodococcusopacus)来源的基因(序列号122，日本DNA数据库：ROP_08400)等。

另外，关于DAHP合酶基因，作为“实质上相同的基因”，可以列举编码与该基因所编码的多肽的氨基酸序列具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性且具有DAHP合酶活性的多肽的DNA。另外，关于DAHP合酶基因，作为“实质上相同的基因”，可以列举与该基因具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性且编码具有DAHP合酶活性的多肽的DNA。

DAHP合酶活性的有无可以通过以磷酸烯醇式丙酮酸和赤藻糖-4-磷酸为底物进行反应并利用使用硫代巴比妥酸的显色法对生成的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)进行定量(Appl.Environ.Microbiol.,74:5497-5503(2008).)来检测。

对提高宿主染色体上的DAHP合酶基因的拷贝数的方法进行说明，只要以多拷贝在谷氨酸棒杆菌的染色体DNA上导入该基因即可。为了在微生物的染色体DNA上以多拷贝导入基因，可以利用以多拷贝存在于染色体DNA上的序列作为标靶，并利用同源重组法(Experimentsin Molecular Genetics(分子遗传学实验),冷泉港实验室(1972))进行。作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列，可以利用重复DNA、存在于转移因子的端部的反向重复序列。另外，也可以如日本特开平2-109985号公报中公开的那样，使目的基因与转座子一同发生转移而以多拷贝导入到染色体DNA上。此外，还可以通过使用Mu噬菌体的方法(日本特开平2-109985号)将目的基因重组到宿主染色体中。

另外，也可以通过将棒状细菌的染色体上的DAHP合酶基因的启动子等表达调节序列转换成更强的表达调节序列来提高这些基因的表达。例如，作为强启动子，已知tac启动子、lac启动子、trc启动子、trp启动子等。另外，也可以如国际公开WO00/18935中公开的那样，向基因的启动子区导入数个碱基的碱基置换而将其改变成更强的启动子。启动子强度的评价方法和强启动子的例子记载在Goldstein等人的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1995,1,105-128)等中。表达调节序列的置换例如可以与使用温度敏感性质粒的基因置换同样地进行。

此外，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区、特别是紧靠起始密码子的上游的序列中的数个核苷酸的置换会给mRNA的翻译效率带来非常大的影响，通过改变这些序列，也能够提高翻译量。

作为进行上述基因置换的方法，例如有：使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号说明书或日本特开平05-007491号公报)。

(II)苯酚的制造方法

可以通过包括使上述说明过的本发明的转化体在含有糖类的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤的方法来制造苯酚。

微生物的增殖

在反应之前，优选将转化体在需氧条件下、在约25℃～约38℃的温度下培养约12小时～约48小时而使其增殖。

反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。

作为碳源，也可以使用：糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等)；甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。

碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。

作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。

作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选约6～约8。

作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui,M.et al.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactateand succinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.etal.,Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。

反应液

作为反应液，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。

作为碳源，使用糖类。作为糖类，可以列举：葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等。其中，优选单糖，更优选葡萄糖。

作为碳源，除了可以使用糖类以外，也可以使用：甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。

碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。

反应液中的糖类的浓度优选约1～约20(w/v%)，更优选约2～约10(w/v%)，进一步优选约2～约5(w/v%)。

另外，包括糖类在内的全部碳源在反应液中的浓度通常设定为约2～约5(w/v%)即可。

作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在反应液中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在反应液中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。

作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在反应液中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。

培养基的pH优选约6～约8。

作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举前述的A培养基、BT培养基等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。

反应条件

反应温度即反应中的转化体的存活温度优选约20℃～约50℃，更优选约25℃～约40℃。反应温度为上述温度范围时，能够高效地制造苯酚。

另外，反应时间优选约1天～约7天，更优选约1天～约3天。

培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。

<还原条件>

反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行。优选在还原条件下进行。在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，能够更高效地生产苯酚。

还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV～约-500mV，更优选约-250mV～约-500mV。

反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEYJAMES公司制造，ORP电极)能够准确地测定。

处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液的液体介质，反应液用水溶液的制备方法参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig,N et.al.(1981):Thedissimilatory sulfate-reducing bacteria,In The Prokaryotes,A Handbookon Habitats,Isolation and Identification of Bacteria,Ed.by Starr,M.P.et.al.p.926-940,Berlin,Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。

具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约10mmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸馏水等处理约1分钟～约60分钟、优选约5分钟～约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。

另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。

将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。

反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的pH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。

苯酚的回收

通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出苯酚。可以通过回收反应液来回收苯酚，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出苯酚。作为这种公知的方法，可以列举蒸馏法、膜透过法、有机溶剂提取法等。

实施例

实施例1苯酚生产基因的克隆和表达

(1)从微生物中提取染色体DNA

从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERM P-18976)中提取染色体DNA的操作如下进行：向A培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g溶解于1L蒸馏水中]中添加终浓度为4%的50%(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，使用铂环接种后，在33℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从大肠埃希氏菌(Escherichia coli K-12MG1655)中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到LB培养基[将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida KT2440)ATCC47054中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到LB培养基[将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)JCM6841中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到JCM Medium No.12培养基[将蛋白胨5g、牛肉提取物3g、NaCl5g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从维氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)ATCC9104中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.805培养基[将酵母提取物1g、甘露糖醇5g、K₂HPO₄0.7g、KH₂PO₄0.1g、MgSO₄·7H₂O0.2g、NaCl1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)ATCC BAA-138中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到含NaCl的营养肉汤培养基[将营养肉汤(BD公司制造，目录号234000)8g、NaCl100g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)ATCC29220中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到营养肉汤培养基[将营养肉汤(BD公司制造，目录号234000)8g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)ATCC700491的染色体DNA(目录号700491D-5)由ATCC(American Type Culture Collection，美国典型培养物保藏中心)获得。

从地中海海单胞菌(Marinomonas mediterranea)NBRC103028中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC MediumNo.340培养基[将海生菌肉汤2216(BD公司制造，目录号279110)37.4g溶解于1L蒸馏水中]中后，在25℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)NBRC102225中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRCMedium No.340培养基[将海生菌肉汤2216(BD公司制造，目录号279110)37.4g溶解于1L蒸馏水中]中后，在25℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)IAM12368中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到营养肉汤培养基[将营养肉汤(BD公司制造，目录号234000)8g溶解于1L蒸馏水中]中后，在26℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)JCM20190中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到营养肉汤培养基[将营养肉汤(BD公司制造，目录号234000)8g溶解于1L蒸馏水中]中后，在25℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)ATCC25259JCM20190中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到JCM MediumNo.91培养基[将KNO₃5g、NaHCO₃0.5g溶解于1L S6培养基(将KH₂PO₄1.8g、Na₂HPO₄1.2g、(NH₄)₂SO₄0.1g、MgSO₄·7H₂O0.1g、FeCl₃·6H₂O30mg、MnSO₄·xH₂O30mg、CaCl₂·2H₂O40mg、10%Na₂S₂O₃溶液100ml溶解于900ml蒸馏水中)]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBRC14144中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JCM9070中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到JCM Medium No.22培养基[将蛋白胨10g、牛肉提取物10g、NaCl5g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)NBRC101239中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRCMedium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)ATCC BAA-895的染色体DNA(目录号BAA-895D-5)从ATCC(American Type Culture Collection，美国典型培养物保藏中心)获得。

从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)NBRC13534中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)NBRC13535中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)ATCC49162中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到胰酪胨大豆肉汤培养基[将胰酪胨大豆肉汤(BD公司制造，目录号211825)30g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC BAA-894的染色体DNA(目录号BAA-894D-5)从ATCC(American Type Culture Collection，美国典型培养物保藏中心)获得。

从大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W NBRC13500中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)NBRC102419中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBRC15309中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO₄·7H₂O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

从菠萝泛菌(Pantoea ananatis)LMG20103中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到BCCM/LMG BacteriCulture Medium No.1培养基[将牛肉提取物1g、酵母提取物2g、蛋白胨5g、NaCl5g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。

(2)克隆载体的构建

克隆载体pCRB22的构建

通过以下的PCR法对分别包含乳酪棒杆菌JCM12072来源的质粒pCASE1的DNA复制起点(以下记作pCASE1-ori)序列和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了分别将pCASE1-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号1(pCASE1-ori序列)、序列号2(克隆载体-pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。

pCASE1-ori序列扩增用引物

(a-1)：5’-AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3’(序列号3)

(b-1)：5’-AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列号4)

另外，引物(a-1)和(b-1)上附加有BglII限制性内切酶位点。

克隆载体pHSG298扩增用引物

(a-2)：5’-AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG-3’(序列号5)

(b-2)：5’-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列号6)

另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。

模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制造)。

实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pCASE1-ori序列时使用引物(a-1)与(b-1)的组合进行，扩增克隆载体pHSG298时使用引物(a-2)与(b-2)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃ 60秒

退火过程：52℃ 60秒

延伸过程：72℃

pCASE1-ori序列 150秒

克隆载体pHSG298 180秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在pCASE1-ori序列的情况下检测到约1.4-kb的DNA片段，在克隆载体pHSG298的情况下检测到约2.7-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含乳酪棒杆菌株来源的质粒pCASE1-ori序列的约1.4-kb的DNA片段10μl和包含克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段10μl分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接A液。

利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接A液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段以外，还确认到pCASE-ori序列的约1.4-kb的DNA片段。

将包含pCASE1-ori序列的克隆载体命名为pCRB22。

克隆载体pCRB11的构建

通过以下的PCR法对分别包含能够在谷氨酸棒杆菌内进行复制的质粒pCG1[(日本特开昭57-134500)]来源的DNA复制起点(以下记作pCG1-ori)序列和克隆载体pHSG398(宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了分别将pCG1-ori序列、克隆载体pHSG398克隆化，基于序列号7(pCG1-ori序列)、序列号8(克隆载体pHSG398)分别合成下述一对引物来使用。

pCG1-ori序列扩增用引物

(a-3)：5’-AT AGATCT AGCATGGTCGTCACAGAG-3’(序列号9)

(b-3)：5’-AT AGATCT GGAACCGTTATCTGCCTATG-3’(序列号10)

另外，引物(a-3)和(b-3)上附加有BglII限制性内切酶位点。

克隆载体pHSG398扩增用引物

(a-4)：5’-AT AGATCT GTCGAACGGAAGATCACTTC-3’(序列号11)

(b-4)：5’-AT AGATCT AGTTCCACTGAGCGTCAG-3’(序列号12)

另外，引物(a-4)和(b-4)上附加有BglII限制性内切酶位点。

模板DNA使用pCG1[(日本特开昭57-134500)]和克隆载体pHSG398(宝生物株式会社制造)。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pCG1-ori序列时使用引物(a-3)与(b-3)的组合进行，扩增克隆载体pHSG398时使用引物(a-4)与(b-4)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃ 60秒

退火过程：52℃ 60秒

延伸过程：72℃

pCG1-ori序列 120秒

克隆载体pHSG398 150秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在pCG1-ori序列的情况下检测到约1.9-kb的DNA片段，在克隆载体pHSG398的情况下检测到约2.2-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含质粒pCG1来源的pCG1-ori基因的约1.9-kb的DNA片段10μl和包含克隆载体pHSG398的约2.2-kb的DNA片段10μl分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接B液。

利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接B液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pHSG398的约2.2-kb的DNA片段以外，还确认到pCG1-ori序列的约1.9-kb的DNA片段。

将包含pCG1-ori序列的克隆载体命名为pCRB11。

克隆载体pCRB15的构建

通过以下的PCR法对包含克隆载体pCRB11的DNA片段和pSELECT-zeo-mcs(英杰株式会社制造)来源的博莱霉素耐性基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了分别将克隆载体pCRB11和博莱霉素耐性基因克隆化，基于序列号13(pCRB11)和序列号14(博莱霉素耐性基因)分别合成下述一对引物来使用。

克隆载体pCRB11序列扩增用引物

(a-5)：5’-AT GATATC CGAAGTGATCTTCCGTTCGA-3’(序列号15)

(b-5)：5’-AT GATATC AAGGCAGTTATTGGTGCCCT-3’(序列号16)

另外，引物(a-5)和(b-5)上附加有EcoRV限制性内切酶位点。

博莱霉素耐性基因扩增用引物

(a-6)：5’-AT GATATC TAGCTTATCCTCAGTCCTGC-3’(序列号17)

(b-6)：5’-AT GATATC CCATCCACGCTGTTTTGACA-3’(序列号18)

另外，引物(a-6)和(b-6)上附加有EcoRV限制性内切酶位点。

模板DNA使用克隆载体pCRB11和pSELECT-zeo-mcs(英杰株式会社制造)。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增克隆载体pCRB11序列时使用引物(a-5)与(b-5)的组合进行，扩增博莱霉素耐性基因时使用引物(a-6)与(b-6)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃ 60秒

退火过程：52℃ 60秒

延伸过程：72℃

pCRB11序列 200秒

博莱霉素耐性基因 45秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在克隆载体pCRB11序列的情况下检测到约3.3-kb的DNA片段，在博莱霉素耐性基因的情况下检测到约0.5-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含克隆载体pCRB11的约3.3-kb的DNA片段10μl和包含pSELECT-zeo-mcs质粒来源的博莱霉素耐性基因的约0.5-kb的DNA片段10μl分别用限制性内切酶EcoRV进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接C液。

利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接C液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有25μg/ml博莱霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶EcoRV分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB11来源的约3.3-kb的DNA片段以外，在博莱霉素耐性基因的情况下，还确认到约0.5-kb的DNA片段。

将包含博莱霉素耐性基因的克隆载体命名为pCRB15。

克隆载体pCRB207的构建

通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的gapA基因的启动子序列(以下记作PgapA)的DNA片段和包含克隆载体pKK223-3(法玛西亚公司制造)来源的rrnBT1T2双向终止子序列(以下记作终止子序列)的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了分别将PgapA序列和终止子序列克隆化，基于序列号19(PgapA序列)、序列号20(终止子序列)分别合成下述一对引物来使用

PgapA序列扩增用引物

(a-7)：5’-CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG-3’(序列号21)

(b-7)：5’-CTCT GTCGAC GGATCC CCATGGTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号22)

另外，引物(a-7)上附加有SalI限制性内切酶位点，引物(b-7)上附加有SalI、BamHI和NcoI限制性内切酶位点。

终止子序列扩增用引物

(a-8)：5’-CTCT GCATGC CCATGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGA-3’(序列号23)

(b-8)：5’-CTCT GCATGC TCATGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3(序列号24)

另外，引物(a-8)上附加有SphI和NcoI限制性内切酶位点，引物(b-8)上附加有SphI和BspHI限制性内切酶位点。

模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)的染色体DNA和pKK223-3质粒(法玛西亚公司制造)。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增PgapA序列时使用引物(a-7)与(b-7)的组合进行，扩增终止子序列时使用引物(a-8)与(b-8)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃ 60秒

退火过程：52℃ 60秒

延伸过程：72℃

PgapA序列 45秒

终止子序列 30秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在PgapA序列的情况下检测到约0.6-kb的DNA片段，在终止子序列的情况下检测到约0.4-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含谷氨酸棒杆菌R来源的PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段10μl和克隆载体pCRB22的约4.1-kb分别用限制性内切酶SalI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接D液。

利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接D液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶SalI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB22的约4.1-kb的DNA片段以外，还确认到PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段。

将包含PgapA序列的克隆载体命名为pCRB206。

将由上述PCR扩增出的包含pKK223-3质粒来源的终止子序列的约0.4-kb的DNA片段10μl用限制性内切酶NcoI和BspHI进行切割，将上述的克隆载体pCRB2062μl用限制性内切酶NcoI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接E液。

利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接E液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB206的约4.7-kb的DNA片段以外，还确认到终止子序列的约0.4-kb的DNA片段。

将包含rrnBT1T2终止子序列的克隆载体命名为pCRB207。

克隆载体pCRB209的构建

通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的gapA(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase A，甘油醛-3-磷酸脱氢酶A)基因的启动子(以下记作PgapA)序列的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将pCRB207序列克隆化，基于序列号25(pCRB207)分别合成下述一对引物来使用。

pCRB207序列扩增用引物

(a-9)：5’-CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’(序列号26)

(b-9)：5’-CTCT CATATGGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号27)

另外，引物(a-9)和(b-9)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

模板DNA使用含有gapA启动子和rrnBT1T2终止子序列的克隆载体pCRB207。

实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝酒造株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pCRB207序列时使用引物(a-9)与(b-9)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃ 60秒

退火过程：52℃ 60秒

延伸过程：72℃ 307秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到包含克隆载体pCRB207序列的约5.1-kb的DNA片段。

将由上述PCR扩增出的包含pCRB207来源基因的约5.1-kb的DNA片段10μl用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝酒造株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接F液。

利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接F液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶NdeI对该质粒进行切割，确认了限制性内切酶位点的插入。

将包含PgapA序列和rrnBT1T2终止子序列的克隆载体命名为pCRB209。

(3)苯酚生产基因的克隆

(3-1)DAHP合酶基因(aroG)

谷氨酸棒杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含谷氨酸棒杆菌来源的编码DAHP合酶的aroG基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将aroG基因克隆化，基于序列号28(谷氨酸棒杆菌aroG基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

aroG基因扩增用引物

(a-10)：5’-CTCT CATATG AATAGGGGTGTGAGTTGG-3’(序列号29)

(b-10)：5’-CTCT CATATGTTAATTACGCAGCATTTCTGCAACG-3’(序列号30)

另外，引物(a-10)和(b-10)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

(3-2)分支酸-丙酮酸裂解酶基因(ubiC)

大肠埃希氏菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含大肠埃希氏菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号31(大肠埃希氏菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-11)：5’-CTCT CATATG TCACACCCCGCGTTAA-3’(序列号32)

(b-11)：5’-CTCT CATATG TTAGTACAACGGTGACGCC-3’(序列号33)

另外，引物(a-11)和(b-11)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

恶臭假单胞菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含恶臭假单胞菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号34(恶臭假单胞菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-12)：5’-CTCT CATATG TCGTACGAATCCCCG-3’(序列号35)

(b-12)：5’-CTCT CATATG TCAGCGGTTTTCCTCCTTG-3’(序列号36)

另外，引物(a-12)和(b-12)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

鲍氏不动杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含鲍氏不动杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号81(鲍氏不动杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-29)：5’-CTCT CATATG CGTAAACGACAACCAGTAC-3’(序列号94)

(b-29)：5’-CTCT CATATGTCATAGTAATTCCTTGTCGTGCTG-3’(序列号95)

另外，引物(a-29)和(b-29)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

维氏固氮菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含维氏固氮菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号82(维氏固氮菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-30)：5’-CTCT CATATG ACCGCTGCTCCCG-3’(序列号96)

(b-30)：5’-CTCT CATATG TTATAGGGTGTCCGGGTC-3’(序列号97)

另外，引物(a-30)和(b-30)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

需盐色盐杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含需盐色盐杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号83(需盐色盐杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-31)：5’-CTCT CATATG TCTCCTGACCGCTTC-3’(序列号98)

(b-31)：5’-CTCT CATATG TTAGCGCGATGGCAGCG-3’(序列号99)

另外，引物(a-31)和(b-31)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

克氏柠檬酸杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含克氏柠檬酸杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号84(克氏柠檬酸杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-32)：5’-CTCT CATATG TCACACCCTGCGTTAAC-3’(序列号100)

(b-32)：5’-CTCT CATATG TTAATACAACGGTGATGCGGG-3’(序列号101)

另外，引物(a-32)和(b-32)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

杨氏柠檬酸杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含杨氏柠檬酸杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号85(杨氏柠檬酸杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-33)：5’-CTCT CATATG CCACACCCTGCGTTAA-3’(序列号102)

(b-33)：5’-CTCT CATATG TCAGTACAACGGCGATGCA-3’(序列号103)

另外，引物(a-33)和(b-33)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

阴沟肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含阴沟肠杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号86(阴沟肠杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-34)：5’-CTCT CATATG TCACACCCTGCGCTAA-3’(序列号104)

(b-34)：5’-CTCT CATATG TCAGTACAACGGCGATGC-3’(序列号105)

另外，引物(a-34)和(b-34)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

水油海杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含水油海杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号87(水油海杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-35)：5’-CTCT CATATG CCGTTAAAGGACTGTGAC-3’(序列号106)

(b-35)：5’-CTCT CATATG TTAACCCCGGTTGGGC-3’(序列号107)

另外，引物(a-35)和(b-35)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

地中海海单胞菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含地中海海单胞菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号88(地中海海单胞菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-36)：5’-CTCT CATATGACGTTACTCAATAAAAACGCTG-3’(序列号108)

(b-36)：5’-CTCT CATATG CTACAGCTGGCCTATGGTA-3’(序列号109)

另外，引物(a-36)和(b-36)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

菠萝泛菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含菠萝泛菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号89(菠萝泛菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-37)：5’-CTCT CATATG ACGCAAGACCCGCT-3’(序列号110)

(b-37)：5’-CTCT CATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG-3’(序列号111)

另外，引物(a-37)和(b-37)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

游海假交替单胞菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含游海假交替单胞菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号90(游海假交替单胞菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-38)：5’-CTCT CATATGATTACTTTCCCTGTTTCATTATCTGC-3’(序列号112)

(b-38)：5’-CTCT CATATGTCATGAGTACAAATACGCTCCTG-3’(序列号113)

另外，引物(a-38)和(b-38)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

真氧产碱杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含真氧产碱杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号91(真氧产碱杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-39)：5’-CTCT CATATG AGCGCGCAGTCCG-3’(序列号114)

(b-39)：5’-CTCT CATATG TCATCTCGTGGTCTCTTTCTTG-3’(序列号115)

另外，引物(a-39)和(b-39)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

腐败希瓦氏菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含腐败希瓦氏菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号92(腐败希瓦氏菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-40)：5’-CTCT CATATGAATGTGACTAGCTTAAGCTTCC-3’(序列号116)

(b-40)：5’-CTCT CATATG TCACTGGCAAATTGCTCGC-3’(序列号117)

另外，引物(a-40)和(b-40)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

脱氮硫杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含脱氮硫杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号93(脱氮硫杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

ubiC基因扩增用引物

(a-41)：5’-CTCT CATATG ATCGCCACGCGCG-3’(序列号118)

(b-41)：5’-CTCT CATATG TCATGGCGTTAATAGGGCG-3’(序列号119)

另外，引物(a-41)和(b-41)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

(3-3)4-羟基苯甲酸脱羧酶基因(bsdBCD/dca)

枯草芽孢杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含枯草芽孢杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的bsdBCD基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将bsdBCD基因克隆化，基于序列号37(枯草芽孢杆菌bsdBCD基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

bsdBCD基因扩增用引物

(a-13)：5’-CTCT CATATGAAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG-3’(序列号38)

(b-13)：5’-CTCT CATATG GATCAAGCCTTTCGTTCCG-3’(序列号39)

另外，引物(a-13)和(b-13)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

萎缩芽孢杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含萎缩芽孢杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号44(萎缩芽孢杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-16)：5’-CTCT CATATG AAACTCGTTGTCGGGATG-3’(序列号45)

(b-16)：5’-CTCT CATATG TCAGGCCTTTCTTTCC-3’(序列号46)

另外，引物(a-16)和(b-16)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号47(枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-17)：5’-CTCT CATATGAAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG-3’(序列号48)

(b-17)：5’-CTCT CATATG TCAAGCCTTTCGTTCCGG-3’(序列号49)

另外，引物(a-17)和(b-17)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

克氏柠檬酸杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含克氏柠檬酸杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号50(克氏柠檬酸杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-18)：5’-CTCT CATATG AGACTGATTGTGGGGATG-3’(序列号51)

(b-18)：5’-CTCT CATATG TTAACGCTTATCTTCCGCCAG-3’(序列号52)

另外，引物(a-18)和(b-18)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

产气肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含产气肠杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号53(产气肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-19)：5’-CTCT CATATGAAACTGATTATTGGGATGACCG-3’(序列号54)

(b-19)：5’-CTCT CATATG TTAACGCTTATCTGCCGCC-3’(序列号55)

另外，引物(a-19)和(b-19)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

阴沟肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含阴沟肠杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号56(阴沟肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-20)：5’-CTCT CATATG AGATTGATCGTGGGAATGAC-3’(序列号57)

(b-20)：5’-CTCT CATATG TTACAGCAATGGCGGAATGG-3’(序列号58)

另外，引物(a-20)和(b-20)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

霍氏肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含霍氏肠杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号59(霍氏肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-21)：5’-CTCT CATATG AGATTGATTGTGGGAATGAC-3’(序列号60)

(b-21)：5’-CTCT CATATG GAGTCTGGTTTAGTTCTCTGC-3’(序列号61)

另外，引物(a-21)和(b-21)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

阪崎肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含阪崎肠杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号62(阪崎肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-22)：5’-CTCT CATATG AGGCTAATTGTCGGAATGAC-3’(序列号63)

(b-22)：5’-CTCT CATATG TTAACGCTTACCATCCGCC-3’(序列号64)

另外，引物(a-22)和(b-22)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

大肠埃希氏菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含大肠埃希氏菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号65(大肠埃希氏菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-23)：5’-CTCT CATATG AAACTGATCGTCGGGATG-3’(序列号66)

(b-23)：5’-CTCT CATATG TTAGCGCTTACCTTCCGC-3’(序列号67)

另外，引物(a-23)和(b-23)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

弗格森埃希氏菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含弗格森埃希氏菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号68(弗格森埃希氏菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-24)：5’-CTCT CATATG AGACTGATCGTCGGGAT-3’(序列号69)

(b-24)：5’-CTCT CATATG TTAGCGCTTATCTGCCGC-3’(序列号70)

另外，引物(a-24)和(b-24)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

多粘类芽孢杆菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含多粘类芽孢杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号71(多粘类芽孢杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-25)：5’-CTCT CATATGAAGAAAATCATTGTAGGAATATCGG-3’(序列号72)

(b-25)：5’-CTCT CATATG CTATATCCGCTCTGGAATAGG-3’(序列号73)

另外，引物(a-25)和(b-25)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

菠萝泛菌来源的苯酚生产基因的克隆

通过以下的PCR法对包含菠萝泛菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。

PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号74(菠萝泛菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

dca基因扩增用引物

(a-26)：5’-CTCT CATATGAGTAGATTACTGTTAATTTCATTCGTAC-3(序列号75)

(b-26)：5’-CTCT CATATGTTACTTAGCTAACAGAGGAGGG-3’(序列号76)

另外，引物(a-26)和(b-26)上附加有NdeI限制性内切酶位点。

(3-4)条件

对于模板DNA而言，谷氨酸棒杆菌使用提取自谷氨酸棒杆菌R的染色体DNA。

大肠埃希氏菌使用提取自大肠埃希氏菌K12MG1655的染色体DNA。

恶臭假单胞菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的恶臭假单胞菌ATCC47054的染色体DNA。

鲍氏不动杆菌使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的鲍氏不动杆菌JCM6841的染色体DNA。

维氏固氮菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的维氏固氮菌ATCC9104的染色体DNA。

需盐色盐杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的需盐色盐杆菌ATCC BAA-138的染色体DNA。

杨氏柠檬酸杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的杨氏柠檬酸杆菌ATCC29220的染色体DNA。

水油海杆菌使用由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的水油海杆菌染色体DNA(目录号700491D-5)。

地中海海单胞菌使用提取自由NITE(National Institute ofTechnology and Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的地中海海单胞菌NBRC103028的染色体DNA。

游海假交替单胞菌使用提取自由NITE(National Institute ofTechnology and Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的游海假交替单胞菌NBRC102225的染色体DNA。

真氧产碱杆菌使用由应用微生物研究所培养物保藏中心(IAM)获得的真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)IAM12368的染色体DNA。

腐败希瓦氏菌使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的腐败希瓦氏菌JCM20190的染色体DNA。

脱氮硫杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的脱氮硫杆菌ATCC25259的染色体DNA。

枯草芽孢杆菌使用提取自由NITE(National Institute of Technologyand Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的枯草芽孢杆菌NBRC14144的染色体DNA。

萎缩芽孢杆菌使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的萎缩芽孢杆菌JCM9070的染色体DNA。

枯草芽孢杆菌斯氏亚种使用提取自由NITE(National Institute ofTechnology and Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的枯草芽孢杆菌斯氏亚种NBRC101239的染色体DNA。

克氏柠檬酸杆菌使用由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的克氏柠檬酸杆菌染色体DNA(目录号BAA-895D-5)。

产气肠杆菌使用提取自由NITE(National Institute of Technologyand Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的产气肠杆菌NBRC13534的染色体DNA。

阴沟肠杆菌使用提取自由NITE(National Institute of Technologyand Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的阴沟肠杆菌NBRC13535的染色体DNA。

霍氏肠杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的霍氏肠杆菌ATCC49162的染色体DNA。

阪崎肠杆菌使用由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的阪崎肠杆菌染色体DNA(目录号BAA-894D-5)。

大肠埃希氏菌W使用提取自由NITE(National Institute ofTechnology and Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的大肠埃希氏菌NBRC13500的染色体DNA。

弗格森埃希氏菌使用提取自由NITE(National Institute ofTechnology and Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的弗格森埃希氏菌NBRC102419的染色体DNA。

多粘类芽孢杆菌使用提取自由NITE(National Institute ofTechnology and Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的多粘类芽孢杆菌NBRC15309的染色体DNA。

菠萝泛菌使用提取自由BCCM/LMG(比利时微生物协作保藏中心/微生物实验室，根特大学)获得的菠萝泛菌LMG20103的染色体DNA。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增谷氨酸棒杆菌aroG基因时使用引物(a-10)与(b-10)的组合进行，扩增大肠埃希氏菌ubiC基因时使用引物(a-11)与(b-11)的组合进行，扩增恶臭假单胞菌ubiC基因时使用引物(a-12)与(b-12)的组合进行，扩增鲍氏不动杆菌ubiC基因时使用引物(a-29)与(b-29)的组合进行，扩增维氏固氮菌ubiC基因时使用引物(a-30)与(b-30)的组合进行，扩增需盐色盐杆菌ubiC基因时使用引物(a-31)与(b-31)的组合进行，扩增克氏柠檬酸杆菌ubiC基因时使用引物(a-32)与(b-32)的组合进行，扩增杨氏柠檬酸杆菌ubiC基因时使用引物(a-33)与(b-33)的组合进行，扩增阴沟肠杆菌ubiC基因时使用引物(a-34)与(b-34)的组合进行，扩增水油海杆菌ubiC基因时使用引物(a-35)与(b-35)的组合进行，扩增地中海海单胞菌ubiC基因时使用引物(a-36)与(b-36)的组合进行，扩增菠萝泛菌ubiC基因时使用引物(a-37)与(b-37)的组合进行，扩增游海假交替单胞菌ubiC基因时使用引物(a-38)与(b-38)的组合进行，扩增真氧产碱杆菌ubiC基因时使用引物(a-39)与(b-39)的组合进行，扩增腐败希瓦氏菌ubiC基因时使用引物(a-40)与(b-40)的组合进行，扩增脱氮硫杆菌ubiC基因时使用引物(a-41)与(b-41)的组合进行，扩增枯草芽孢杆菌bsdBCD基因时使用引物(a-13)与(b-13)的组合进行，扩增萎缩芽孢杆菌dca基因时使用引物(a-16)与(b-16)的组合进行，扩增枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因时使用引物(a-17)与(b-17)的组合进行，扩增克氏柠檬酸杆菌dca基因时使用引物(a-18)与(b-18)的组合进行，扩增产气肠杆菌dca基因时使用引物(a-19)与(b-19)的组合进行，扩增阴沟肠杆菌dca基因时使用引物(a-20)与(b-20)的组合进行，扩增霍氏肠杆菌dca基因时使用引物(a-21)与(b-21)的组合进行，扩增阪崎肠杆菌dca基因时使用引物(a-22)与(b-22)的组合进行，扩增大肠埃希氏菌W dca基因时使用引物(a-23)与(b-23)的组合进行，扩增弗格森埃希氏菌dca基因时使用引物(a-24)与(b-24)的组合进行，扩增多粘类芽孢杆菌dca基因时使用引物(a-25)与(b-25)的组合进行，扩增菠萝泛菌dca基因时使用引物(a-26)与(b-26)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：94℃ 60秒

退火过程：52℃ 60秒

延伸过程：72℃

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在谷氨酸棒杆菌aroG基因的情况下能够检测到约1.4-kb的DNA片段，在大肠埃希氏菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在恶臭假单胞菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在鲍氏不动杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在维氏固氮菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在需盐色盐杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在克氏柠檬酸杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在杨氏柠檬酸杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在阴沟肠杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在水油海杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在地中海海单胞菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在菠萝泛菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在游海假交替单胞菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在真氧产碱杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.7-kb的DNA片段，在腐败希瓦氏菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在脱氮硫杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在枯草芽孢杆菌bsdBCD基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在萎缩芽孢杆菌bsdBCD基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在克氏柠檬酸杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在产气肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在阴沟肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在霍氏肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.4-kb的DNA片段，在阪崎肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在大肠埃希氏菌W dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在弗格森埃希氏菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在多粘类芽孢杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在菠萝泛菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段。

(4)苯酚生产基因表达质粒的构建

苯酚生产基因向pCRB209中的克隆

将上述第(3)项中所示的通过PCR扩增出的包含谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因的约1.4-kb的DNA片段、包含大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含维氏固氮菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含水油海杆菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含地中海海单胞菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含菠萝泛菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因的约0.7-kb的DNA片段、包含腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因的约2.3-kb的DNA片段、包含萎缩芽孢杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含克氏柠檬酸杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含产气肠杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含阴沟肠杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含霍氏肠杆菌株来源的dca基因的约2.4-kb的DNA片段、包含阪崎肠杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含大肠埃希氏菌W株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含弗格森埃希氏菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含多粘类芽孢杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含菠萝泛菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段各10μl以及含有PgapA启动子的克隆载体pCRB2092μl分别用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其分别作为连接G液、连接H液、连接I液、连接AA液、连接AB液、连接AC液、连接AD液、连接AE液、连接AF液、连接AG液、连接AH液、连接AI液、连接AJ液、连接AK液、连接AL液、连接AM液、连接J液、连接O液、连接P液、连接Q液、连接R液、连接S液、连接T液、连接U液、连接V液、连接W液、连接X液和连接Y液。

利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的28种连接G液、连接H液、连接I液、连接AA液、连接AB液、连接AC液、连接AD液、连接AE液、连接AF液、连接AG液、连接AH液、连接AI液、连接AJ液、连接AK液、连接AL液、连接AM液、连接J液、连接O液、连接P液、连接Q液、连接R液、连接S液、连接T液、连接U液、连接V液、连接W液、连接X液和连接Y液分别转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对各培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB209的约5.1-kb的DNA片段以外，在谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因(连接G液)的情况下，还确认到长度为约1.4-kb的插入片段，在大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因(连接H液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因(连接I液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因(连接AA液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在维氏固氮菌株来源的ubiC基因(连接AB液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因(连接AC液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因(连接AD液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因(连接AE液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因(连接AF液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在水油海杆菌株来源的ubiC基因(连接AG液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在地中海海单胞菌株来源的ubiC基因(连接AH液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在菠萝泛菌株来源的ubiC基因(连接AI液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因(连接AJ液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因(连接AK液)的情况下，还确认到长度为约0.7-kb的插入片段，在腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因(连接AL液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因(连接AM液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因(连接J液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在萎缩芽孢杆菌株来源的dca基因(连接O液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在枯草芽孢杆菌斯氏亚种株来源的dca基因(连接P液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在克氏柠檬酸杆菌株来源的dca基因(连接Q液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在产气肠杆菌株来源的dca基因(连接R液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在阴沟肠杆菌株来源的dca基因(连接S液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在霍氏肠杆菌株来源的dca基因(连接T液)的情况下，还确认到长度为约2.4-kb的插入片段，在阪崎肠杆菌株来源的dca基因(连接U液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在大肠埃希氏菌W株来源的dca基因(连接V液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在弗格森埃希氏菌株来源的dca基因(连接W液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在多粘类芽孢杆菌株来源的dca基因(连接X液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在菠萝泛菌株来源的dca基因(连接Y液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段。

将包含谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因的质粒命名为pCRB209-aroG/CG，将包含大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/EC，将包含恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/PP，将包含鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/ACB，将包含维氏固氮菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/AVN，将包含需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/CSA，将包含克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/CKO，将包含杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/CIT，将包含阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/ECL，将包含水油海杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/MAQ，将包含地中海海单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/MME，将包含菠萝泛菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/PAM，将包含游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/PHA，将包含真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/REH，将包含腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/SPC，将包含脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/TBD，将包含枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因的质粒命名为pCRB209-bsdBCD/BS，将包含萎缩芽孢杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/BAE，将包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/BSS，将包含克氏柠檬酸杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/CKO，将包含产气肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/EAE，将包含阴沟肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/ECL，将包含霍氏肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/EHO，将包含阪崎肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/ESA，将包含大肠埃希氏菌W株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/ECK，将包含弗格森埃希氏菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/EFE，将包含多粘类芽孢杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/PPY，将包含菠萝泛菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/PAM。

将包含谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因的质粒pCRB209-aroG/CG、包含大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因的质粒pCRB209-ubiC/EC、包含恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因的质粒pCRB209-ubiC/PP、包含枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因的质粒pCRB209-bsdBCD/BS的构建示于图1中。

苯酚生产基因向pCRB1中的克隆

将上述的质粒pCRB209-ubiC/EC、pCRB209-ubiC/PP、pCRB209-ubiC/ACB、pCRB209-ubiC/AVN、pCRB209-ubiC/CSA、pCRB209-ubiC/CKO、pCRB209-ubiC/CIT、pCRB209-ubiC/ECL、pCRB209-ubiC/MAQ、pCRB209-ubiC/MME、pCRB209-ubiC/PAM、pCRB209-ubiC/PHA和pCRB209-ubiC/SPC用限制性内切酶SalI进行切割，琼脂糖电泳后，将利用QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社凯杰制造)从琼脂糖凝胶中回收的连接有gapA启动子、大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、维氏固氮菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、水油海杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、地中海海单胞菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、菠萝泛菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段分别与利用SalI切割后的克隆载体pCRB1[Nakata,K.et al.,Vectors for the genetics engineering of corynebacteria;in Saha,B.C.(ed.):Fermentation Biotechnology,ACS Symposium Series862.Washington,American Chemical Society:175-191(2003)]约4.1-kb在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，将得到的DNA片段混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接K液、连接L液、连接AN液、连接AO液、连接AP液、连接AQ液、连接AR液、连接AS液、连接AT液、连接AU液、连接AV液、连接AW液和连接AX液。

另外，同样地将上述的质粒pCRB209-ubiC/REH和pCRB209-ubiC/TBD用限制性内切酶BamHI进行切割，琼脂糖电泳后，将利用QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社凯杰制造)从琼脂糖凝胶中回收的连接有gapA启动子、真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.7-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段与利用BamHI切割后的克隆载体pCRB1[Nakata,K.et al.,Vectors for the geneticsengineering of corynebacteria;in Saha,B.C.(ed.):FermentationBiotechnology,ACS Symposium Series862.Washington,AmericanChemical Society:175-191(2003)]约4.1-kb在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，将得到的DNA片段混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接AY液和AZ液。

使用所得到的连接K液、连接L液、连接AN液、连接AO液、连接AP液、连接AQ液、连接AR液、连接AS液、连接AT液、连接AU液、连接AV液、连接AW液、连接AX液、连接AY液和连接AZ液，利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶SalI或BamHI对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB1的约4.1-kb的DNA片段以外，在大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因(连接K液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因(连接L液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因(连接AN液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在维氏固氮菌株来源的ubiC基因(连接AO液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因(连接AP液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因(连接AQ液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因(连接AR液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因(连接AS液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在水油海杆菌株来源的ubiC基因(连接AT液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在地中海海单胞菌株来源的ubiC基因(连接AU液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在菠萝泛菌株来源的ubiC基因(连接AV液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因(连接AW液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因(连接AY液)的情况下，还确认到长度为约1.7-kb的插入片段，在腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因(连接AX液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因(连接AZ液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段。

将包含大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/EC，将包含恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/PP(图2)。将包含鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/ACB，将包含维氏固氮菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/AVN，将包含需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/CSA，将包含克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/CKO，将包含杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/CIT，将包含阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/ECL，将包含水油海杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/MAQ，将包含地中海海单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/MME，将包含菠萝泛菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/PAM，将包含游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/PHA，将包含真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/REH，将包含腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/SPC，将包含脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB1-ubiC/TBD。

苯酚生产基因向pCRB15中的克隆

将上述的质粒pCRB209-aroG/CG用限制性内切酶BamHI进行切割，琼脂糖电泳后，将利用QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社凯杰制造)从琼脂糖凝胶中回收的连接有gapA启动子、谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因和终止子序列的约2.4-kb的DNA片段与利用BamHI切割后的上述质粒pCRB15的约3.8-kb在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，将得到的DNA片段混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接M液。

使用所得到的连接M液，利用氯化钙法[Journal of MolecularBiology,53,159(1970)]转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有25μg/ml博莱霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶BamHI对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB15的约3.8-kb的DNA片段以外，在谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因(连接M液)的情况下，还确认到长度为约2.4-kb的插入片段。

将包含谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因的质粒命名为pCRB15-aroG/CG(图3)。

(5)谷氨酸棒杆菌的染色体基因破坏用质粒的构建

谷氨酸棒杆菌株pobA基因破坏用质粒的构建

通过以下的PCR法对用于构建谷氨酸棒杆菌株的染色体上pobA基因的无痕破坏用质粒所需要的DNA片段进行扩增。

PCR时，基于谷氨酸棒杆菌R的序列，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

pobA-1区扩增用引物

(a-14)：5’-CTCT TCTAGA GAAACGATCAAGTGCACCAG-3’(序列号40)

(b-14)：5’-GACACGAGCGTTTATACCTCTAATTGCCACTGGTACGTGG-3’(序列号41)

另外，引物(a-14)上附加有XbaI限制性内切酶位点。

pobA-2区扩增用引物

(a-15)：5’-GAGGTATAAACGCTCGTGTC-3’(序列号42)

(b-15)：5’-CTCT GAGCTC GAGAACACGAACCATACGAG-3(序列号43)

另外，引物(b-15)上附加有SacI限制性内切酶位点。

模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R的染色体DNA。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pobA-1区时使用引物(a-14)与(b-14)的组合进行，扩增pobA-2区时使用引物(a-15)与(b-15)进行。

PCR循环：

变性过程：94℃ 60秒

退火过程：52℃ 60秒

延伸过程：72℃

pobA-1区 60秒

pobA-2区 60秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在谷氨酸棒杆菌pobA-1区的情况下能够检测到约1.0-kb的DNA片段，在pobA-2区的情况下能够检测到约1.0-kb的DNA片段。

接着，将由上述PCR扩增出的pobA-1区片段与pobA-2区片段各1μl混合，通过PCR进行两种片段的结合反应。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)使用pobA-1区片段与pobA-2区片段进行。

PCR循环：

变性过程：95℃ 20秒

退火过程：52℃ 5秒

延伸过程：72℃ 50秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

进而，以所得到的pobA-1与pobA-2的结合片段为模板，通过PCR进行pobA缺失片段的扩增。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增pobA缺失片段时使用引物(a-14)与(b-15)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：95℃ 20秒

退火过程：52℃ 5秒

延伸过程：72℃ 97秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到约2.0的pobA缺失片段。

将由上述PCR扩增出的谷氨酸棒杆菌R来源的pobA缺失序列的约2.0的DNA片段10μl与约4.4-kb的无痕染色体基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]2μl分别用限制性内切酶XbaI和SacI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接N液。

利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接N液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶XbaI和SacI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRA725的约4.4-kb的DNA片段以外，在谷氨酸棒杆菌株来源的pobA缺失基因(连接N液)的情况下，还确认到长度为约2.0-kb的插入片段。

将包含谷氨酸棒杆菌株来源的pobA缺失基因的质粒命名为pCRA725-pobA/CG。

谷氨酸棒杆菌株poxF基因破坏用质粒的构建

通过以下的PCR法对用于构建谷氨酸棒杆菌株的染色体上poxF基因的无痕破坏用质粒所需要的DNA片段进行扩增。

进行PCR时，基于谷氨酸棒杆菌R的序列，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。

poxF-1区扩增用引物

(a-27)：5’-CTCT TCTAGA TACGTCCTAAACACCCGAC-3’(序列号77)

(b-27)：5’-GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC-3’(序列号78)

另外，引物(a-27)上附加有XbaI限制性内切酶位点。

poxF-2区扩增用引物

(a-28)：5’-CAAGTCAGCAATGGTTGGTC-3’(序列号79)

(b-28)：5’-CTCT TCTAGA TGATCAGTACCAAGGGTGAG-3’(序列号80)

另外，引物(b-28)上附加有XbaI限制性内切酶位点。

模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R的染色体DNA。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增poxF-1区时使用引物(a-27)与(b-27)的组合进行，扩增poxF-2区时使用引物(a-28)与(b-28)进行。

PCR循环：

变性过程：94℃ 60秒

退火过程：52℃ 60秒

延伸过程：72℃

poxF-1区 50秒

poxF-2区 50秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在谷氨酸棒杆菌poxF-1区的情况下能够检测到约0.8-kb的DNA片段，在poxF-2区的情况下能够检测到约0.8-kb的DNA片段。

接着，将由上述PCR扩增出的poxF-1区片段与poxF-2区片段各1μl混合，通过PCR进行两种片段的结合反应。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)使用poxF-1区片段与poxF-2区片段进行。

PCR循环：

变性过程：95℃ 20秒

退火过程：52℃ 5秒

延伸过程：72℃ 50秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

进而，以所得到的poxF-1与poxF-2的结合片段为模板，通过PCR进行poxF缺失片段的扩增。

反应液：

将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增poxF缺失片段时使用引物(a-27)与(b-28)的组合进行。

PCR循环：

变性过程：95℃ 20秒

退火过程：52℃ 5秒

延伸过程：72℃ 97秒

将以上过程作为一个循环，进行30个循环。

利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到约1.6-kb的poxF缺失片段。

将由上述PCR扩增出的谷氨酸棒杆菌R来源的poxF缺失序列的约1.7-kb的DNA片段10μl与约4.4-kb的无痕染色体基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]2μl分别用限制性内切酶XbaI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接Z液。

利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接Z液转化大肠杆菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶XbaI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRA725的约4.4-kb的DNA片段以外，在谷氨酸棒杆菌株来源的pheA缺失基因(连接Z液)的情况下，还确认到长度为约1.7-kb的插入片段。

将包含谷氨酸棒杆菌株来源的poxF缺失基因的质粒命名为pCRA725-poxF/CG。

(6)与4-羟基苯甲酸酯/盐分解相关的基因破坏株的构建

无痕染色体基因导入用载体pCRA725是不能在谷氨酸棒杆菌R内复制的质粒。使用pCRA725-pobA/CG，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[A液体培养基和1.5%琼脂]上。将使用上述培养基得到的一重交叉株涂布到含有10%(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml溶解在1L蒸馏水中，并加入1.5%琼脂]上。

在质粒pCRA725-pobA/CG为与染色体上的同源区的一重交叉株的情况下，由于pCRA725-pobA/CG上的卡那霉素耐性基因的表达而显示出卡那霉素耐性，并且由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sacR-sacB基因的表达而显示出在含蔗糖培养基中的致死性，相对于此，在质粒pCRA725-pobA/CG为二重交叉株的情况下，由于pCRA725-pobA/CG上的卡那霉素耐性基因的脱落而显示出卡那霉素敏感性，并且由于sacR-sacB基因的脱落而显示出在含蔗糖培养基中的生长性。因此，无痕染色体基因破坏株显示出卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性。

因此，选择出显示卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性的菌株。将该谷氨酸棒杆菌R株pobA基因无痕破坏株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ΔpobA。

谷氨酸棒杆菌株pobA、poxF基因破坏株的构建

无痕染色体基因导入用载体pCRA725是不能在谷氨酸棒杆菌R内复制的质粒。使用pCRA725-poxF/CG，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌ΔpobA株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[A液体培养基和1.5%琼脂]上。将使用上述培养基得到的一重交叉株涂布到含有10%(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml溶解在1L蒸馏水中，并加入1.5%琼脂]上。

在质粒pCRA725-poxF/CG为与染色体上的同源区的一重交叉株的情况下，由于pCRA725-poxF/CG上的卡那霉素耐性基因的表达而显示出卡那霉素耐性，并且由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sacR-sacB基因的表达而显示出在含蔗糖培养基中的致死性，相对于此，在质粒pCRA725-poxF/CG为二重交叉株的情况下，由于pCRA725-poxF/CG上的卡那霉素耐性基因的脱落而显示出卡那霉素敏感性，并且由于sacR-sacB基因的脱落而显示出在含蔗糖培养基中的生长性。因此，无痕染色体基因破坏株显示出卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性。

因此，选择出显示卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性的菌株。将该谷氨酸棒杆菌ΔpobA株poxF基因无痕破坏株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ΔpobAΔpoxF。

(7)苯酚生产基因导入株的构建

(7-1)谷氨酸棒杆菌野生株和ΔpobA株的转化

使用上述的质粒pCRB1-ubiC/EC和pCRB209-bsdBCD/BS，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R株和谷氨酸棒杆菌ΔpobA株，并涂布到含有5μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。另外，这两种质粒是能够在谷氨酸棒杆菌内共存的质粒。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB1-ubiC/EC和pCRB209-bsdBCD/BS的导入。将导入到R株而得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE11，将导入到ΔpobA株而得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE13。

使用上述的质粒pCRB1-ubiC/EC、pCRB209-bsdBCD/BS和pCRB15-aroG/CG，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R株和谷氨酸棒杆菌ΔpobA株，并涂布到含有5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A琼脂培养基上。另外，这三种质粒是能够在谷氨酸棒杆菌内共存的质粒。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB1-ubiC/EC、pCRB209-bsdBCD/BS和pCRB15-aroG/CG的导入。将导入到R株而得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE12，将导入到ΔpobA株而得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE14。

使用上述的质粒pCRB1-ubiC/PP和pCRB209-bsdBCD/BS，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R株和谷氨酸棒杆菌ΔpobA株，并涂布到含有5μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。另外，这两种质粒是能够在谷氨酸棒杆菌内共存的质粒。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB1-ubiC/PP和pCRB209-bsdBCD/BS的导入。将导入到R株而得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE15，将导入到ΔpobA株而得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE17。

使用上述的质粒pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-bsdBCD/BS和pCRB15-aroG/CG，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R株和谷氨酸棒杆菌ΔpobA株，并涂布到含有5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A琼脂培养基上。另外，这三种质粒是能够在谷氨酸棒杆菌内共存的质粒。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-bsdBCD/BS和pCRB15-aroG/CG的导入。将导入到R株而得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE16，将导入到ΔpobA株而得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE18。

(7-2)谷氨酸棒杆菌ΔpobAΔpoxF株的转化

分别使用上述的质粒pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY、pCRB209-dca/PAM和pCRB15-aroG/CG，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌ΔpobAΔpoxF株，并涂布到含有5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A琼脂培养基上。另外，这三种质粒(pCRB1、pCRB209和pCRB15)是能够在谷氨酸棒杆菌内共存的质粒。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY、pCRB209-dca/PAM和pCRB15-aroG/CG的导入。

将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-bsdBCD/BS和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-1，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/BAE和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-2，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/BSS和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-3，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/CKO和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-4，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/EAE和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-5，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-6，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/EHO和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-7，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/ESA和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-8，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/ECK和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-9，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/EFE和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-10，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/PPY和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-11，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PP、pCRB209-dca/PAM和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE19-12。

使用上述的质粒pCRB1-ubiC/EC、pCRB1-ubiC/ACB、pCRB1-ubiC/AVN、pCRB1-ubiC/CSA、pCRB1-ubiC/CKO、pCRB1-ubiC/CIT、pCRB1-ubiC/ECL、pCRB1-ubiC/MAQ、pCRB1-ubiC/MME、pCRB1-ubiC/PAM、pCRB1-ubiC/PHA、pCRB1-ubiC/REH、pCRB1-ubiC/SPC、pCRB1-ubiC/TBD、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌ΔpobAΔpoxF株，并涂布到含有5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A琼脂培养基上。另外，这三种质粒(pCRB1、pCRB209和pCRB15)是能够在谷氨酸棒杆菌内共存的质粒。

通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB1-ubiC/EC、pCRB1-ubiC/ACB、pCRB1-ubiC/AVN、pCRB1-ubiC/CSA、pCRB1-ubiC/CKO、pCRB1-ubiC/CIT、pCRB1-ubiC/ECL、pCRB1-ubiC/MAQ、pCRB1-ubiC/MME、pCRB1-ubiC/PAM、pCRB1-ubiC/PHA、pCRB1-ubiC/REH、pCRB1-ubiC/SPC、pCRB1-ubiC/TBD、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入。

将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/EC、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-1，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/ACB、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-2，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/AVN、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-3，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/CSA、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-4，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/CKO、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-5，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/CIT、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-6，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/ECL、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-7，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/MAQ、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-8，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/MME、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-9，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PAM、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-10，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/PHA、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-11，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/REH、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-12，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/SPC、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-13，将ΔpobAΔpoxF株中确认到pCRB1-ubiC/TBD、pCRB209-dca/ECL和pCRB15-aroG/CG的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE20-14。

将上述的基因重组的概要归纳示于以下的表1中。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE18保藏于日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8(邮政编码292-0818)的独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心(保藏日：2010年10月21日，保藏编号：NITE BP-995)。

表1

苯酚生产基因导入株

<基因起源缩写>

BS：枯草芽孢杆菌

EC：大肠埃希氏菌

PP：恶臭假单胞菌

CG：谷氨酸棒杆菌

BAE：萎缩芽孢杆菌

BSS：枯草芽孢杆菌斯氏亚种

CKO：克氏柠檬酸杆菌

EAE：产气肠杆菌

ECL：阴沟肠杆菌

EHO：霍氏肠杆菌

ESA：阪崎肠杆菌

ECK：大肠埃希氏菌W

EFE：弗格森埃希氏菌

PPY：多粘类芽孢杆菌

PAM：菠萝泛菌

ACB：鲍氏不动杆菌

AVN：维氏固氮菌

CSA：需盐色盐杆菌

CIT：杨氏柠檬酸杆菌

MAQ：水油海杆菌

MME：地中海海单胞菌

PHA：游海假交替单胞菌

REH：真氧产碱杆菌

SPC：腐败希瓦氏菌

TBD：脱氮硫杆菌

<基因名称>

ubiC：分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)基因

bsdBCD：4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)基因

aroG：DAHP合酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate7-phosphate(DAHP)synthase)基因

pobA：4-羟基苯甲酸羟化酶(4-hydroxybenzoate hydroxylase)基因

dca：4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)基因

poxF：苯酚2-单加氧酶(phenol2-monooxygenase)基因

实施例2谷氨酸棒杆菌苯酚生产基因导入株和副产物途径破坏株的苯酚生成实验

对实施例1中制作的谷氨酸棒杆菌苯酚基因导入株PHE11-PH18进行苯酚的生产比较。

将各谷氨酸棒杆菌苯酚基因导入株(PHE11-PH18)涂布到含有表2所示的抗生素的A琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在28℃下于暗处静置20小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌苯酚基因导入株接种到装有10ml含有表2所示的各抗生素的A液体培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g溶解于1L蒸馏水中]的试管中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。

将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌苯酚生产基因导入株接种到10ml含有各抗生素的A液体培养基中，在33℃下在需氧条件下进行24小时的振荡培养。

苯酚的定量通过如下方法进行：将24小时后取样得到的反应液离心分离(4℃、15000g、10分钟)，利用液相色谱法对所得到的上清液进行分析。

另外，对于谷氨酸棒杆菌野生株也利用同样的方法尝试了苯酚生产，但未检测到苯酚生成。

各菌株的苯酚生产量示于下表2中。

表2

苯酚基因导入株的苯酚生成实验

<基因起源缩写>

BS：枯草芽孢杆菌

EC：大肠埃希氏菌

PP：恶臭假单胞菌

CG：谷氨酸棒杆菌

<培养基添加的抗生素>

A：氯霉素 5μg/ml

B：卡那霉素 50μg/ml

C：博莱霉素 25μg/ml

<基因名称>

ubiC：分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)基因

bsdBCD：4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)基因

pobA：4-羟基苯甲酸羟化酶(4-hydroxybenzoate hydroxylase)基因

如表2所示，谷氨酸棒杆菌PHE11在培养液中生产出0.4mM的苯酚，谷氨酸棒杆菌PHE12在培养液中生产出0.9mM的苯酚，谷氨酸棒杆菌PHE13在培养液中生产出0.8mM的苯酚，谷氨酸棒杆菌PHE14在培养液中生产出1.8mM的苯酚，谷氨酸棒杆菌PHE15在培养液中生产出1.1mM的苯酚，谷氨酸棒杆菌PHE16在培养液中生产出3.5mM的苯酚，谷氨酸棒杆菌PHE17在培养液中生产出1.6mM的苯酚，谷氨酸棒杆菌PHE18在培养液中生产出6.3mM的苯酚。

由该结果导出以下事项。

(1)通过将ubiC基因和bsdBCD基因导入谷氨酸棒杆菌中，首次使实用性的由葡萄糖生成苯酚成为可能。

(2)使用恶臭假单胞菌来源的基因作为ubiC基因时，比使用大肠埃希氏菌来源的基因作为ubiC基因时的苯酚生产率高。

(3)通过在导入ubiC基因和bsdBCD基因的基础上导入aroG基因，使苯酚生成量增大。

(4)通过破坏pobA基因，使苯酚生产率进一步提高。

实施例3谷氨酸棒杆菌苯酚生产基因导入株和副产物途径破坏株的苯酚生成实验

对实施例1中制作的谷氨酸棒杆菌苯酚基因导入株PHE19-1～PHE19-12进行苯酚的生产比较。

将各谷氨酸棒杆菌苯酚基因导入株(PHE19-1～PHE19-12)涂布到含有作为抗生素的5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在28℃下于暗处静置20小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌苯酚基因导入株接种到装有10ml含有作为抗生素的5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A液体培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g溶解于1L蒸馏水中]的试管中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。

将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌苯酚生产基因导入株接种到10ml含有作为抗生素的5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A液体培养基中，在33℃下在需氧条件下进行24小时的振荡培养。

各菌株的苯酚生产量示于下表3中。

表3

苯酚基因导入株的苯酚生成实验

<基因起源缩写>

BS：枯草芽孢杆菌

EC：大肠埃希氏菌

PP：恶臭假单胞菌

CG：谷氨酸棒杆菌

BAE：萎缩芽孢杆菌

BSS：枯草芽孢杆菌斯氏亚种

CKO：克氏柠檬酸杆菌

EAE：产气肠杆菌

ECL：阴沟肠杆菌

EHO：霍氏肠杆菌

ESA：阪崎肠杆菌

ECK：大肠埃希氏菌W

EFE：弗格森埃希氏菌

PPY：多粘类芽孢杆菌

PAM：菠萝泛菌

<基因名称>

ubiC：分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)基因

bsdBCD：4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)基因

pobA：4-羟基苯甲酸羟化酶(4-hydroxybenzoate hydroxylase)基因

dca：4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)基因

poxF：苯酚2-单加氧酶(phenol2-monooxygenase)基因

通过将表3的结果与表2的PHE18的苯酚生产率结果进行比较可知，在破坏pobA基因的基础上叠加破坏poxF基因时，生产率进一步提高。

此外，代替枯草芽孢杆菌来源的bsdBCD基因，将萎缩芽孢杆菌来源的dca基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的dca基因、克氏柠檬酸杆菌来源的dca基因、产气肠杆菌来源的dca基因、阴沟肠杆菌来源的dca基因、霍氏肠杆菌来源的dca基因、阪崎肠杆菌来源的dca基因、大肠埃希氏菌来源的dca基因、弗格森埃希氏菌来源的dca基因、多粘类芽孢杆菌来源的dca基因或菠萝泛菌来源的dca基因与ubiC基因和aroG基因一起导入谷氨酸棒杆菌ΔpobAΔpoxF株时，也观察到同等或更高的苯酚生产率。

实施例4谷氨酸棒杆菌苯酚生产基因导入株和副产物途径破坏株的苯酚生成实验

对实施例1中制作的谷氨酸棒杆菌苯酚基因导入株PHE19-6和PHE20-1～PHE20-14进行苯酚的生产比较。

将各谷氨酸棒杆菌苯酚基因导入株(PHE19-6和PHE20-1～PHE20-14)涂布到含有作为抗生素的5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在28℃下于暗处静置20小时。

各菌株的苯酚生产量示于下表4中。

表4

苯酚基因导入株的苯酚生成实验

<基因起源缩写>

PP：恶臭假单胞菌

ECL：阴沟肠杆菌

CG：谷氨酸棒杆菌

EC：大肠埃希氏菌

ACB：鲍氏不动杆菌

AVN：维氏固氮菌

CSA：需盐色盐杆菌

CKO：克氏柠檬酸杆菌

CIT：杨氏柠檬酸杆菌

MAQ：水油海杆菌

MME：地中海海单胞菌

PAM：菠萝泛菌

PHA：游海假交替单胞菌

REH：真氧产碱杆菌

SPC：腐败希瓦氏菌

TBD：脱氮硫杆菌

<基因名称>

ubiC：分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)基因

pobA：4-羟基苯甲酸羟化酶(4-hydroxybenzoate hydroxylase)基因

dca：4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)基因

poxF：苯酚2-单加氧酶(phenol2-monooxygenase)基因

由表4的结果可知，代替恶臭假单胞菌来源的ubiC基因，将大肠埃希氏菌来源的ubiC基因、鲍氏不动杆菌来源的ubiC基因、维氏固氮菌来源的ubiC基因、需盐色盐杆菌来源的ubiC基因、克氏柠檬酸杆菌来源的ubiC基因、杨氏柠檬酸杆菌来源的ubiC基因、水油海杆菌来源的ubiC基因、地中海海单胞菌来源的ubiC基因、菠萝泛菌来源的ubiC基因、游海假交替单胞菌来源的ubiC基因、真氧产碱杆菌来源的ubiC基因、腐败希瓦氏菌来源的ubiC基因或脱氮硫杆菌来源的ubiC基因与dca基因和aroG基因一起导入谷氨酸棒杆菌ΔpobAΔpoxF株时，也观察到显著的苯酚生产率。

实施例5使用谷氨酸棒杆菌PHE18的还原条件下的苯酚生成实验

将实施例1中创制的谷氨酸棒杆菌PHE18苯酚生成株涂布到含有5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A琼脂培养基上，在28℃下于暗处静置20小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌PHE18苯酚生成株接种到装有10ml含有5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A液体培养基中，在28℃下在需氧条件下进行10小时的振荡培养。

将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌PHE18苯酚生成株接种到装有500ml含有5μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml博莱霉素的A液体培养基的容量2L的三角烧瓶中，在33℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。

通过离心分离(4℃、5000g、15分钟)回收以上述方式培养增殖后的各菌体。将所得到的菌体悬浊到BT(-尿素)液体培养基[0.7%硫酸铵、0.05%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钾、0.05%硫酸镁七水合物、0.0006%硫酸铁七水合物、0.00042%硫酸锰水合物、0.00002%生物素、0.00002%硫胺素盐酸盐]中以使菌体终浓度OD₆₁₀为60。将60ml该各菌体悬浊液装入容量100ml的培养瓶中，在还原条件下(氧化还原电位：-450mV)添加初始为5%的葡萄糖，12小时后再添加5%的葡萄糖，在33℃下搅拌的同时进行反应。此时，在使用2.5N的氨水并利用pH控制器(エイブル株式会社制造，型号：DT-1023)进行控制以使反应液的pH不低于7.0的同时进行反应。

对取样得到的反应液进行离心分离(4℃、15000g、10分钟)，使用所得到的上清液进行苯酚的定量。

结果，谷氨酸棒杆菌PHE18苯酚生成株在还原条件下的反应中在24小时后生成了9.2mM的苯酚。

由此可知，本发明的转化体在还原条件下更高效地生成苯酚。

实施例6作为苯酚生产用宿主的适性试验

(1)苯酚对需氧增殖的影响

对谷氨酸棒杆菌、大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌进行需氧培养中的苯酚的生长抑制试验。另外，本试验中使用的恶臭假单胞菌S12作为耐溶剂性菌进行了报道，并公开了迄今为止唯一作为苯酚生产的宿主使用的技术。

将谷氨酸棒杆菌R涂布在A琼脂培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置15小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有10mlA液体培养基[将(NH₂)₂CO2g、(NH₄)₂SO₄7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O0.5g、0.06%(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042%(w/v)MnSO₄·2H₂O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g溶解于1L蒸馏水中]的试管中，在33℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。

将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌R接种到100ml A液体培养基中以使初始菌体浓度OD₆₁₀为0.05，同时添加苯酚使终浓度为0mM、0.16mM、0.2mM、0.24mM、0.32mM，并在33℃下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD₆₁₀的吸光度来进行。

将大肠埃希氏菌JM109涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在37℃下于暗处静置15小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的大肠埃希氏菌JM109接种到装有10ml LB液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%氯化钠]的试管中，在37℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。

将上述条件下生长的大肠埃希氏菌JM109接种到100ml LB液体培养基中以使初始菌体浓度OD₆₁₀为0.05，同时添加苯酚使终浓度为0mM、0.16mM、0.20mM，并在37℃下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD₆₁₀的吸光度来进行。

将恶臭假单胞菌F1和S12涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在30℃下于暗处静置15小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的恶臭假单胞菌F1和S12接种到装有10ml LB(+葡萄糖)液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和0.4%葡萄糖]的试管中，在30℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。

将上述条件下生长的恶臭假单胞菌F1和S12株接种到100ml LB(+葡萄糖)液体培养基中以使初始菌体浓度OD₆₁₀为0.05，同时添加苯酚使终浓度为0mM、0.10mM、0.20mM，并在30℃下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD₆₁₀的吸光度来进行。

向培养基中添加苯酚对需氧增殖的影响的分析结果示于图4中。

对于大肠埃希氏菌而言，在0.16%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。

恶臭假单胞菌F1和作为耐溶剂性菌被报道的恶臭假单胞菌S12显示出基本相同的倾向，在0.10%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。

与此相对，谷氨酸棒杆菌即使在使大肠埃希氏菌的增殖受到显著抑制的0.16%的苯酚存在下对增殖也几乎没有影响，即使在使大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌的增殖完全被抑制的0.20%的苯酚存在下也显示出良好的生长。而且在0.24%的苯酚存在下能够增殖。

由此表明，谷氨酸棒杆菌与大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌相比对苯酚具有高耐性，作为苯酚生产的宿主具有高适性。

(2)苯酚对还原条件下的糖代谢的影响

将谷氨酸棒杆菌R涂布到A琼脂培养基上，在33℃下于暗处静置20小时。

将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有10mlA液体培养基的试管中，在33℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。

将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有500ml A液体培养基的容量2L的三角烧瓶中，在33℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。

通过离心分离(4℃、5000g、15分钟)回收以上述方式培养增殖后的菌体。将所得到的菌体悬浊到BT(-尿素)液体培养基[0.7%硫酸铵、0.05%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钾、0.05%硫酸镁七水合物、0.0006%硫酸铁七水合物、0.00042%硫酸锰水合物、0.00002%生物素、0.00002%硫胺素盐酸盐]中以使其为10w/v%。将60ml该各菌体悬浊液装入容量100ml的培养瓶中，在还原条件下(氧化还原电位：-450mV)进行添加以使葡萄糖为8%、苯酚浓度为0mM、0.24mM、0.38mM、0.46mM，在保持于33℃的水浴中搅拌的同时进行反应。此时，在使用2.5N的氨水并利用pH控制器(エイブル株式会社制造，型号：DT-1023)进行控制以使反应液的pH不低于7.0的同时进行反应。

对苯酚给谷氨酸棒杆菌R的还原条件下的糖代谢带来的影响进行研究的结果示于图5中。

在还原条件下，即使在需氧培养中观察到增殖抑制的0.24%的苯酚存在下，也完全未观察到苯酚带来的影响，显示出与未添加苯酚时同等的糖消耗。

此外，即使在0.38%的苯酚存在下也观察到糖消耗，即使在0.46%的苯酚存在下也显示出少量的糖消耗。

由此表明，与需氧培养相比，在还原条件下对苯酚显示出高耐性，还原条件下的以谷氨酸棒杆菌为宿主的苯酚生产比需氧条件下的生产更有优势。

产业上的可利用性

根据本发明方法，能够使用微生物以实用的效率制造苯酚。

Claims

1.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因和编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。

2.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的基因、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)来源的基因、维氏固氮菌(Azotobactervinelandii)来源的基因、需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)来源的基因、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)等柠檬酸杆菌属细菌来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)来源的基因、地中海海单胞菌(Marinomonas mediterranea)来源的基因、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)来源的基因、真氧产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)来源的基因、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)来源的基因或脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)来源的基因。

3.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌来源的基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的基因、克氏柠檬酸杆菌来源的基因、产气肠杆菌来源的基因、阴沟肠杆菌来源的基因、霍氏肠杆菌来源的基因、阪崎肠杆菌来源的基因、大肠埃希氏菌来源的基因、弗格森埃希氏菌来源的基因、多粘类芽孢杆菌来源的基因或菠萝泛菌来源的基因。

4.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA，

5.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(c)或(d)的DNA，

6.如权利要求1～5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

7.如权利要求1～6中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

8.如权利要求1～7中任一项所述的转化体，其中，编码具有DAHP合酶即3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶活性的酶的基因在宿主棒状细菌内高表达。

9.如权利要求1～8中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。

10.如权利要求1～5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌是保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869。

11.如权利要求1～5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌是存在于保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

12.如权利要求1～5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌是存在于保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。

13.如权利要求1～5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌是保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869中高表达编码具有DAHP合酶活性的酶的基因的棒状细菌。

14.保藏编号为NITE BP-995的谷氨酸棒杆菌PHE18、PHE11、PHE12、PHE13、PHE14、PHE15、PHE16、PHE17、PHE19-1、PHE19-2、PHE19-3、PHE19-4、PHE19-5、PHE19-6、PHE19-7、PHE19-8、PHE19-9、PHE19-10、PHE19-11、PHE19-12、PHE20-1、PHE20-2、PHE20-3、PHE20-4、PHE20-5、PHE20-6、PHE20-7、PHE20-8、PHE20-9、PHE20-10、PHE20-11、PHE20-12、PHE20-13或PHE20-14的转化体。

15.一种苯酚的制造方法，其中，包括：

使权利要求1～14中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤，和

回收反应液中的苯酚的步骤。

16.如权利要求15所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。

17.如权利要求15或16所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200～-500毫伏。

18.如权利要求15～17中任一项所述的苯酚的制造方法，其中，糖类为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖和甘露糖醇组成的组中的糖。