CN112074599A - 棒状细菌的转化体和使用其的有用化合物的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可提高儿茶酚的生产率的微生物的转化体。在一个方式中，棒状细菌的转化体为在宿主棒状细菌中导入选自以下的基因而成的转化体：(1)鼠李糖乳杆菌的脱碳酸酶基因ubiD、(2)乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、埃希菌属、类芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属和泛菌属中的上述(1)的基因的种间同源基因、以及(3)编码与上述(1)或(2)的基因编码的酶的氨基酸序列的一致性为70％以上且具有脱碳酸活性的酶的基因，在宿主棒状细菌的儿茶酚‑1,2‑双加氧酶基因catA以及原儿茶酸脱氢酶基因pcaHG中导入突变，上述两基因编码的酶的功能降低或功能缺失。

Description

棒状细菌的转化体和使用其的有用化合物的制造方法
技术领域
本发明涉及棒状细菌的转化体。本发明还涉及使用该转化体的有用化合物(例如儿茶酚)的制造方法。
背景技术
以地球温暖化和化石资源的枯竭问题为背景，以可再生的资源为原料的化学品的制造与生物燃料并列作为新工业生物炼制，被认为是实现低碳社会的重要对策而受到关注。
儿茶酚被用作香料、阻聚剂、抗氧化剂、医药品、农药的合成原料。另外，被用作抗蚀剂(制造印刷基板时涂布的感光性的树脂)的剥离剂、脱氧剂(活性碳吸附剂)、镀敷处理剂的原料。
儿茶酚主要以苯酚为原料通过氧化反应来制造。但是，为了实现上述的低碳社会，迫切希望由可再生资源进行制造。
儿茶酚存在于微生物的代谢途径上。通过由苯起始的两阶段氧化或对二羟基苯甲酸的脱碳酸反应而生成儿茶酚。然后，儿茶酚通过邻位断裂或间位断裂而进行分解，整合至TCA循环。
专利文献1和2公开一种技术，其中，使用以埃希菌属或克雷伯菌属的微生物为宿主且导入了转酮酶、DAHP合酶、3-脱氢奎尼酸合酶，进一步导入来源于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸脱羧酶的转化菌由葡萄糖制造儿茶酚。
专利文献3的目的在于，利用微生物生产己二酸、顺，顺-粘康酸。专利文献3公开在其研究过程中使用与专利文献2相同构成的菌株的儿茶酚生产例。
专利文献4和5公开一种以脱氢莽草酸为前体的化合物的生产方法，其中，提出基于表达来源于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或酪酸梭菌(Clostridium butyricum)的原儿茶酸脱羧酶的儿茶酚制造法。实施例中使用在大肠杆菌中表达来源于阴沟肠杆菌的3,4-DHB脱羧酶的转化菌。
专利文献6的目的在于生产粘康酸的3种异构体。专利文献6公开在其研究过程中使用与专利文献2相同构成的菌株的儿茶酚生产例。
非专利文献1公开一种技术，其中，使用在大肠杆菌中导入肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的原儿茶酸脱碳酸酶基因而成的转化菌由葡萄糖制造儿茶酚。
非专利文献2公开一种技术，其中，使用在大肠杆菌中导入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)的邻氨基苯甲酸-1,2-双加氧酶(anthranilate 1,2-dioxygenase)基因而成的转化菌由葡萄糖制造儿茶酚。
非专利文献3公开一种技术，其中，使用在大肠杆菌中导入肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的原儿茶酸脱碳酸酶基因而成的转化菌由葡萄糖制造儿茶酚。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利第5272073号说明书
专利文献2:日本特表平9-506242号公报
专利文献3:日本特表平9-505463号公报
专利文献4:美国专利第2012-0196339号说明书
专利文献5:美国专利第2013-0252294号说明书
专利文献6:日本特表2013-516196号公报
非专利文献
非专利文献1:J.Am.Chem.Soc.(1995)117:2395-2400
非专利文献2:Microb.Cell Fact.(2014)13:136
非专利文献3:J.Am.Chem.Soc.(2005)127:2874-2882
发明内容
发明所要解决的技术问题
在利用生物学方法制造儿茶酚的方法中，为了实用化而期待进一步提高生产率。
本说明书的一个方式中，提供能够以糖类作为原料高效制造儿茶酚的微生物、以及使用该微生物高效制造儿茶酚的方法。
用于解决问题的技术方案
在本发明的一个方式中，涉及一种棒状细菌的转化体，其在宿主棒状细菌中导入选自以下的基因：
(1)鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的脱碳酸酶基因ubiD、
(2)乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、埃希菌属、类芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属和泛菌属中的上述(1)的基因的种间同源基因、以及
(3)编码与上述(1)或(2)的基因编码的酶的氨基酸序列的一致性为70％以上且具有脱碳酸活性的酶的基因，
在宿主棒状细菌的儿茶酚1,2-双加氧酶基因catA和原儿茶酸脱氢酶基因pcaHG中导入突变，上述两基因编码的酶的功能降低或功能缺失。
在本发明的另一方式中，涉及一种儿茶酚的制造方法，其包括：使本发明的棒状细菌转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液中或还原条件的反应液中进行反应的工序；以及回收反应培养基中的儿茶酚的工序。
发明的效果
根据本发明，在一各方式中，可使棒状细菌的儿茶酚制造高效化。例如，可提高儿茶酚的生产中的生产速度和/或收率。
附图说明
图1为表示CAT21株的儿茶酚生产情况的示例的图表。
图2为表示棒状细菌对儿茶酚的抗性的高度的实验例。
具体实施方式
本发明人等进行深入研究，结果发现，通过在导入抑制原儿茶酸和儿茶酚的分解的突变的棒状细菌中，表达规定的脱碳酸酶，从而可提高儿茶酚的生产率。
推定通过表达该规定的脱碳酸酶，原儿茶酸的脱碳酸反应发生亢进，儿茶酚的生产率提高。但是，本发明可以不限定于该机制。
根据本发明，在一个方式中，可提高儿茶酚的生产浓度和/或收率。
[宿主]
本发明中，导入规定的脱碳酸酶的宿主为棒状细菌。
本发明中，棒状细菌是指伯杰氏鉴定细菌学手册[Bargeys Manual of DeterminativeBacteriology，Vol.8、599(1974)]中定义的一类微生物，只要是在通常的需氧条件下增殖的微生物就没有特别限定。若举出具体例，则可举出棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节细菌属菌菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。在棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。
作为棒状杆菌属菌，可举出谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、解烷棒杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)等。其中，从安全且低聚木糖的利用能力高的角度出发，优选为谷氨酸棒状杆菌。
作为合适的菌株，可举出谷氨酸棒状杆菌R株(FERMP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等。其中，优选为R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。
这些菌株可从微生物保藏机构即NBRC(NITEBiological Resource Center)、ATCC(American Type Culture Collection)等获取。
另外，这些微生物不仅可以为自然界中存在的野生株，也可以为其突变株或基因重组株。
从提高儿茶酚的生产率的观点出发，在本发明的转化体中，在宿主棒状细菌基因组的编码具有儿茶酚-1,2-双加氧酶活性的酶的基因catA和编码具有原儿茶酸脱氢酶活性的酶的基因pcaHG中导入突变，从而这2个酶功能降低或功能缺失。上述突变例如可举出碱基序列的置换、缺失、插入等。
这些突变可以预先导入到作为宿主使用的棒状细菌中，也可以在制造本发明的转化体的过程中导入这些突变。
另外，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，作为宿主的棒状细菌，可以使用原儿茶酸的产生提高的基因改良株(例如国际公开WO2017/169399)。
[脱碳酸酶的导入]
在本发明中，导入至作为宿主的棒状细菌的脱碳酸酶优选为对原儿茶酸具有脱碳酸活性的酶。
作为在棒状细菌中导入对原儿茶酸具有脱碳酸活性的酶的方式，可举出导入以下(1)～(3)中的任一基因的方式。
(1)鼠李糖乳杆菌的脱碳酸酶基因ubiD。
(2)乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、埃希菌属、类芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属和泛菌属的上述(1)的基因的种间同源基因。
(3)编码与上述(1)或(2)的基因编码的酶的氨基酸序列的一致性为70％以上且具有脱碳酸活性的酶的基因。
在本发明中，在向宿主棒状细菌导入上述(1)～(3)的基因时，可使用常见的基因重组技术(例如Michael R.Green&Joseph Sambrook,Molecular cloning,ColdspringHarbor Laboratory Press记载的方法)来进行，可通过使用质粒载体的基因导入或整合至宿主棒状细菌染色体的方式来实施。
在本发明中，在一个或多个实施方式中，基因的导入是指以该基因能够在宿主内表达的方式导入。
例如，在宿主棒状细菌中导入ubiDX基因时，优选将合适的启动子整合至该基因的5’-侧上游，而且进一步优选将终止子整合至3’-侧下游。
[鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的脱碳酸酶基因ubiD]
在本发明中，在一个或多个实施方式中，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的脱碳酸酶基因ubiD以LGG_02656或LGG_RS12695登录于NCBI等数据库。
导入至宿主的脱碳酸酶基因可以为上述鼠李糖乳杆菌的ubiD的种间同源基因。作为鼠李糖乳杆菌的ubiD的种间同源基因，可举出乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、埃希菌属、类芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属和泛菌属的种间同源基因，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选为乳杆菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属的种间同源基因，更优选为乳杆菌属和芽孢杆菌属的种间同源基因，进一步优选为乳杆菌属的种间同源基因，进一步更优选为实施例中使用的基因。
作为鼠李糖乳杆菌的ubiD基因的乳杆菌属的种间同源基因，可举出戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus))的ubiD基因、植物乳杆菌(Lactobacillus planterum)的ubiD基因、破布子乳杆菌(Lactobacillus pobuzihii)的ubiD基因、复合乳杆菌(Lactobacilluscomposti)的ubiD基因，但可以不限于这些。
作为鼠李糖乳杆菌的ubiD基因的芽孢杆菌属的种间同源基因，可举出上述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的ubiD基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的ubiD基因、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的ubiD基因、枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)的ubiD基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillussubtilis subsp.spizizenii)的ubiD基因，但可以不限于这些。
作为鼠李糖乳杆菌的ubiD基因的肠杆菌属的种间同源基因，可举出产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的ubiD基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的ubiD基因、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的ubiD基因、霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)的ubiD基因，但可以不限于这些。
作为鼠李糖乳杆菌的ubiD基因的埃希菌属的种间同源基因，可举出大肠杆菌W(Escherichia coli W)的ubiD基因、费格森埃希菌(Escherichia fergusonii)的ubiD基因,但可以不限于这些。
作为鼠李糖乳杆菌的ubiD基因的类芽孢杆菌属的种间同源基因，可举出多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的ubiD基因，但可以不限于这些。
作为鼠李糖乳杆菌的ubiD基因的柠檬酸杆菌属的种间同源基因，可举出克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)的ubiD基因，但可以不限于这些。
作为鼠李糖乳杆菌的ubiD基因的泛菌属的种间同源基因，可举出菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的ubiD基因，但可以不限于这些。
应予说明，本发明中“种间同源基因”是指：存在于不同生物(例如不同种、不同属)的编码具有相同的功能的蛋白的类似基因。
导入至宿主的脱碳酸酶基因可以为编码以下酶的基因，具有与上述鼠李糖乳杆菌的ubiD基因或上述的其种间同源基因编码的酶的氨基酸序列的一致性为70％以上的氨基酸序列，且具有脱碳酸活性的酶。
从提高儿茶酚的生产率的观点出发，氨基酸序列的一致性为70％以上，优选为75％以上，更优选为80％以上，进一步优选为85％以上。
在本发明中，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选也将存在于与该ubiD基因相同的基因组的ubiX基因与ubiD基因一起导入宿主棒状细菌。另外，在ubiH基因存在于与该ubiD基因相同的基因组的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选也将ubiH基因与ubiD基因和ubiX基因一起导入。
鼠李糖乳杆菌的ubiD基因和ubiX基因依次构成操纵子，在这种情况下，本发明中记作ubiDX基因。作为鼠李糖乳杆菌的ubiDX基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号1的碱基序列。
在将鼠李糖乳杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiDX基因形式导入。另外，在将鼠李糖乳杆菌的ubiD基因的种间同源基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，也优选也将ubiX基因与ubiD基因一起导入至宿主棒状细菌，若基因组中存在ubiH基因，则优选也将ubiH基因与ubiD基因和ubiX基因一起导入至宿主棒状细菌。
戊糖乳杆菌的ubiX基因与ubiD基因分开，而与ubiH基因构成操纵子(ubiHX基因)。在将戊糖乳杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选将ubiHX基因与ubiD基因一起导入。作为戊糖乳杆菌的ubiXH基因和ubiD基因的一个或多个实施方式，分别可举出序列表的序列号2和3的碱基序列。
在将植物乳杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，也与戊糖乳杆菌相同，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选将ubiHX基因与ubiD基因一起导入。作为植物乳杆菌的ubiXH基因和ubiD基因的一个或多个实施方式，分别可举出序列表的序列号4和5的碱基序列。
在将破布子乳杆菌和复合乳杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，也优选以ubiDX基因形式导入。作为破布子乳杆菌和复合乳杆菌的ubiDX基因的一个或多个实施方式，分别可举出序列表的序列号6和7的碱基序列。
巨大芽孢杆菌的ubiD基因中，ubiX基因、ubiD基因和ubiH基因依次构成操纵子，在这种情况下，本发明中记作ubiXDH基因。在将巨大芽孢杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为巨大芽孢杆菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号10的碱基序列。
在将地衣芽孢杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为地衣芽孢杆菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号11的碱基序列。
在将萎缩芽孢杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为萎缩芽孢杆菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号12的碱基序列。
在将枯草芽孢杆菌枯草亚种的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为枯草芽孢杆菌枯草亚种的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号13的碱基序列。
在将枯草芽孢杆菌斯氏亚种的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为枯草芽孢杆菌斯氏亚种的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号14的碱基序列。
在将产气肠杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为产气肠杆菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号15的碱基序列。
在将阴沟肠杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为阴沟肠杆菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号16的碱基序列。
在将阪崎肠杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为阪崎肠杆菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号17的碱基序列。
在将霍氏肠杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为霍氏肠杆菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号18的碱基序列。
在将大肠杆菌W的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为大肠杆菌W的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号19的碱基序列。
在将费格森埃希菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为费格森埃希菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号20的碱基序列。
在将多粘类芽孢杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为多粘类芽孢杆菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号21的碱基序列。
在将克氏柠檬酸杆菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为克氏柠檬酸杆菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号22的碱基序列。
在将菠萝泛菌的ubiD基因导入至宿主棒状细菌的情况下，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，优选以ubiXDH基因形式导入。作为菠萝泛菌的ubiXDH基因的一个或多个实施方式，可举出序列表的序列号23的碱基序列。
[转化体]
本发明的一个方式涉及一种转化体，上述转化体在宿主棒状细菌中导入上述(1)-(3)中的任一基因，且宿主基因组的儿茶酚-1,2-双加氧酶(catA)和原儿茶酸脱氢酶(pcaHG)这2个酶的功能降低或功能缺失。
在一个或多个实施方式中，本发明的转化体可高效产生儿茶酚。
在一个或多个实施方式中，从提高儿茶酚的生产率的观点出发，本发明的转化体优选导入ubiX基因和/或ubiH基因。
为了产生或高效产生儿茶酚，本发明的转化体可以进一步导入基因，也可以使基因缺失和/或导入突变。
作为高效产生儿茶酚的一个或多个实施方式，可举出提高原儿茶酸的产生的基因的导入、破坏。作为提高原儿茶酸的产生的基因的导入的示例，可举出编码具有3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶活性的酶的基因(例如aroG)和/或编码具有3-脱氢奎尼酸合酶活性的酶的基因(例如qusB)的导入。
作为一个或多个实施方式，本发明的转化体可用于儿茶酚的产生。另外，作为另外的一个或多个实施方式，本发明的转化体可用于以儿茶酚为中间体的有机化合物的产生。
[儿茶酚的制造方法]
本发明的转化体可以在不伴有菌体增殖的反应液中以糖类为原料高效生产儿茶酚。
因此，本发明的另一方式涉及一种儿茶酚的制造方法，其包括：使本发明的棒状细菌转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液中或还原条件的反应液中反应的工序；以及，回收反应培养基中的儿茶酚的工序。
在本发明的儿茶酚的制造方法中，首先，在需氧条件下对上述的本发明的转化体进行增殖培养。
本发明的转化体的培养可使用包含碳源、氮源和无机盐等的常规营养培养基来进行。培养中，作为碳源，例如可分别单独使用或混合使用葡萄糖或废糖蜜等，并且，作为氮源，例如可分别单独使用或混合使用氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素等。另外，作为无机盐，例如可使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾或硫酸镁等。此外，还可以根据需要将蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸或者生物素或硫胺素等各种维生素等营养素适当添加至培养基中。
培养通常在通气搅拌或振荡等需氧条件下，在约20℃～约60℃，优选约25℃～约35℃的温度下进行。培养时的pH例如为5～10左右，优选7～8左右的范围，培养中的pH调整可通过添加酸或碱来进行。培养开始时的碳源浓度为约1～20％(W/V)，优选为约2～5％(W/V)。另外，培养时间通常为1～7天左右。
接着，回收本发明的转化体的培养菌体。作为从如上所述得到的培养物中回收分离培养菌体的方法，没有特别限定，例如可使用离心分离、膜分离等公知的方法。
可以对回收的培养菌体施加处理，将得到的菌体处理物用于接下来的工序。作为上述菌体处理物，可举出对培养菌体施加任意处理而得到的产物，例如可举出利用丙烯酰胺或角叉菜胶等将菌体固定而得的固定化菌体等。
利用从如上所述得到的培养物中回收分离的本发明的转化体的培养菌体或其菌体处理物的儿茶酚的生成反应只要是在不伴有菌体增殖的反应液中就可以使用需氧条件和还原条件中的任一生成方式。儿茶酚生成方式还可以为间歇式、连续式中的任一生成方式。
在本发明中，不增殖包括实质上不增殖或几乎不增殖。例如，可通过使用缺少或者限制需氧条件的反应中微生物的增殖需要的化合物即生物素、硫胺素等维生素类、氮源等中的1种以上的反应液，来避免或抑制转化体的增殖。
另外，在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，因此反应液的组成不受限制。还原条件下的反应液的氧化还原电位优选为约-200mV～-500mV，更优选为约-150mV～-500mV。反应液的还原状态可简便地用刃天青指示剂(若为还原状态，则由蓝色褪色为无色)来推断，为了准确，可使用氧化还原电位差计(例如BROADLEY JAMES公司制造，ORPElectrodes)来测定。
在本发明中，优选从在反应液中添加菌体或其处理物之后不久至采取儿茶酚，维持还原条件，至少在采取儿茶酚的时刻反应液为还原状态即可。期望在反应时间的约50％以上，更优选约70％以上，进一步优选约90％以上的时间内，反应液保持在还原条件下。其中，更期望在反应时间的约50％以上，更优选约70％以上，进一步优选约90％以上的时间内，反应液的氧化还原电位保持在约-200mV～-500mV左右。
反应液包含成为儿茶酚生成的原料的有机碳源(例如糖类等)。作为有机碳源，可举出本发明的转化体在生化反应中可利用的物质。
具体而言，作为糖类，可举出：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖或甘露糖等单糖类；纤维二糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖等二糖类；或者糊精或可溶性淀粉等多糖类等。其中，优选为葡萄糖。
因此，本发明的一个方式涉及一种儿茶酚的制造方法，其包括：使本发明的棒状细菌转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液中或还原条件的反应液中反应的工序；以及回收反应培养基中的儿茶酚的工序。
最后，采取如上所述在反应培养基中生成的儿茶酚。其方法可使用生物工程中使用的公知方法。作为这样的公知方法，包括儿茶酚生成液的盐析法、重结晶法、有机溶剂提取法、酯化蒸馏分离法、色谱分离法或电渗析法等，可适当决定其分离纯化收集法。
本发明在一个或多个实施方式中可涉及以下发明；
[1]一种棒状细菌的转化体，其是在宿主棒状细菌中导入选自以下的基因而得到的：
(1)鼠李糖乳杆菌的脱碳酸酶基因ubiD、
(2)乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、埃希菌属、类芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属和泛菌属中的上述(1)的基因的种间同源基因、以及
(3)编码与上述(1)或(2)的基因编码的酶的氨基酸序列的一致性为70％以上且具有脱碳酸活性的酶的基因，
其中，在宿主棒状细菌的儿茶酚-1,2-双加氧酶基因catA和原儿茶酸脱氢酶基因pcaHG中导入突变，上述两基因所编码的酶的功能降低或功能缺失。
[2]根据[1]记载的转化体，其具有儿茶酚生产能力。
[3]根据[1]或[2]记载的转化体，其中，上述转化体进一步导入编码具有3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶活性的酶的基因和编码具有3-脱氢奎尼酸合酶活性的酶的基因中的至少一种。
[4]根据[1]～[3]中任一项记载的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌。
[5]根据[1]～[4]中任一项记载的转化体，其中，宿主的棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌R(FERMP-18976)、ATCC13032或ATCC13869。
[6]一种谷氨酸棒状杆菌CAT21株(保藏编号：NITE BP-02689)转化体。
[7]一种儿茶酚的制造方法，其包括：使[1]～[6]中任一项记载的棒状细菌转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液、或还原条件的反应液中反应的工序；以及回收反应培养基中的儿茶酚的工序。
[8]根据[7]记载的儿茶酚的制造方法，其包括：使用[1]～[6]中任一项记载的转化体，在反应液中由选自葡萄糖、果糖、纤维二糖、木二糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糊精、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和可溶性淀粉中的糖类变换为儿茶酚，并从该反应液回收儿茶酚。
实施例
以下通过实施例详细说明本发明，但是本发明不受这些实施例限定。
[实施例1]
儿茶酚生产株的构建
(1)染色体DNA的制备·获取
关于谷氨酸棒杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)(FERM P-18976)、鼠李糖乳杆菌NBRC 3425(Lactobacillus rhamnosus NBRC 3425)、戊糖乳杆菌JCM 1558(Lactobacillus pentosus JCM 1558)、植物乳杆菌NBRC 3070(Lactobacillus plantarumNBRC 3070)、破布子乳杆菌JCM 18084(Lactobacillus pobuzihii JCM 18084)、复合乳杆菌JCM 14202(Lactobacilluscomposti JCM 14202)、北海道乳杆菌JCM18461(Lactobacillus hokkaidonensis JCM18461)、清酒乳杆菌清酒亚种JCM 1157(Lactobacillus sakei subsp.sakei JCM 1157)、巨大芽孢杆菌JCM 2506(Bacillusmegaterium JCM 2506)、地衣芽孢杆菌JCM 2505(Bacillus licheniformis JCM 2505)、萎缩芽孢杆菌JCM 9070(Bacillus atrophaeus JCM 9070)、枯草芽孢杆菌枯草亚种NBRC14144(Bacillus subtilis subsp.subtilis NBRC 14144)、枯草芽孢杆菌斯氏亚种NBRC101239(Bacillus subtilis subsp.spizizenii NBRC 101239)、产气肠杆菌NBRC 13534(Enterobacter aerogenes NBRC 13534)、阴沟肠杆菌NBRC 13535(Enterobacter cloacaeNBRC 13535)、霍氏肠杆菌ATCC 49162(Enterobacter hormaechei ATCC 49162)、大肠杆菌W NBRC 13500(Escherichia coli W NBRC 13500)、费格森埃希菌NBRC 102419(Escherichia fergusonii NBRC 102419)、多粘类芽孢杆菌NBRC15309(Paenibacilluspolymyxa NBRC15309)、菠萝泛菌LMG 20103(Pantoea ananatis LMG 20103)的染色体DNA，在按照菌株取得机构的信息进行培养后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCells and Tissue DNA Isolation Kit，安玛西亚公司制造)制备。阪崎肠杆菌ATCC BAA-894D-5(Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894D-5)、克氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895D-5(Citrobacter koseri ATCC BAA-895D-5)的染色体DNA是由ATCC获取的。
(2)儿茶酚生产关联基因表达质粒的构建
将用于分离目标酶基因的引物序列示于表1。PCR使用了Veriti热循环仪(AppliedBiosystems公司制造)，作为反应试剂，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa Bio株式会社制造)。
将得到的DNA片段导入含有PgapA启动子的克隆载体(pCRB209[国际公开WO2012/033112]、pCRB210[国际公开WO2012/033112])。应予说明，戊糖乳杆菌和植物乳杆菌的ubiD基因和ubiXH基因配置在染色体上的不同位置，因此在分别进行克隆后转移到同一质粒中。
将导入的克隆载体和得到的质粒名示于表2。
[表1]
儿茶酚生产关联基因分离用引物
基因来源 酶基因 正向 反向 基因序列
Lactobacillus rhamnosus ubiDX 序列号24 序列号25 序列号1
Lactobacillus pentosus ubiXH 序列号26 序列号27 序列号2
Lactobacillus pentosus ubiD 序列号28 序列号29 序列号3
Lactobacillus plantarum ubiXH 序列号30 序列号31 序列号4
Lactobacillus plantarum ubiD 序列号32 序列号33 序列号5
Lactobacillus pobuzihii ubiDX 序列号34 序列号35 序列号6
Lactobacillus composti ubiDX 序列号36 序列号37 序列号7
Lactobacillus hokkaidonensis ubiDXH 序列号38 序列号39 序列号8
Lactobacillus sakei subsp.sakei ubiDXH 序列号40 序列号41 序列号9
Bacillus megaterium ubiXDH 序列号42 序列号43 序列号10
Bacillus licheniformis ubiXDH 序列号44 序列号45 序列号11
Bacillus atrophaeus ubiXDH 序列号46 序列号47 序列号12
Bacillus subtilis subsp.subtilis ubiXDH 序列号48 序列号49 序列号13
Bacillus subtilis subsp.spizizenii ubiXDH 序列号50 序列号51 序列号14
Enterobacter aerogenes ubiXDH 序列号52 序列号53 序列号15
Enterobacter cloacae ubiXDH 序列号54 序列号55 序列号16
Enterobacter sakazakii ubiXDH 序列号56 序列号57 序列号17
Enterobacter hormaechei ubiXDH 序列号58 序列号59 序列号18
Escherichia coliW ubiXDH 序列号60 序列号61 序列号19
Escherichia fergusonii ubiXDH 序列号62 序列号63 序列号20
Paenibacillus polymyxa ubiXDH 序列号64 序列号65 序列号21
Citrobacter koseri ubiXDH 序列号66 序列号67 序列号22
Pantoea ananatis ubiXDH 序列号68 序列号69 序列号23
[表2]
儿茶酚生产关联基因表达质粒
基因来源 酶基因 导入载体 质粒名
Lactobacillus rhamnosus ubiDX pCRB209 Pani37
Lactobacillus pentosus ubiXH pCRB209 Pani277
Lactobacillus pentosus ubiD pCRB209 Pani278
Lactobacillus pentosus ubiXH+ubiD Pani277 Pani279
Lactobacillus plantarum ubiXH pCRB209 Pani33
Lactobacillus plantarum ubiD pCRB209 Pani34
Lactobacillus plantarum ubiXH+ubiD Pani33 Pani40
Lactobacillus pobuzihii ubiDX pCRB209 Pani284
Lactobacillus composti ubiDX pCRB209 Pani283
Lactobacillus hokkaidonensis ubiDXH pCRB210 Pani282
Lactobacillus sakei subsp.sakei ubiDXH pCRB210 Pani281
Bacillus megaterium ubiXDH pCRB209 PGadi21
Bacillus licheniformis ubiXDH pCRB209 PGadi20
Bacillus atrophaeus ubiXDH pCRB209 Pani63
Bacillus subtilis subsp.subtilis ubiXDH pCRB209 pCRG34
Bacillus subtilis subsp.spizizenii ubiXDH pCRB209 Pani60
Enterobacter aerogenes ubiXDH pCRB209 Pani86
Enterobacter cloacae ubiXDH pCRB209 Pani26
Enterobacter sakazakii ubiXDH pCRB209 Pani81
Enterobacter hormaechei ubiXDH pCRB209 Pani88
Escherichia ccliW ubiXDH pCRB209 Pani80
Escherichia fergusonii ubiXDH pCRB209 Pani85
Paenibacillus polymyxa ubiXDH pCRB209 Pani84
Citrobacter koseri ubiXDH pCRB209 Pani83
Pantoea ananatis ubiXDH pCRB209 Pani82
(3)谷氨酸棒杆菌R株染色体基因破坏用质粒的构建
通过PCR法扩增以无标记方式破坏谷氨酸棒杆菌R株的染色体基因需要的DNA区域。各PCR片段可通过重叠区域连接。将得到的DNA片段导入无标记基因破坏用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]。将得到的染色体基因破坏用质粒示于表3。
[表3]
谷氨酸棒杆菌R株染色体基因破坏用质粒
Figure BDA0002745407470000191
*：包含重叠区域的引物
(4)利用染色体基因重组构建儿茶酚生产株
无标记染色体基因导入用载体pCRA725为在谷氨酸棒状杆菌R内不能复制的质粒。在导入质粒pCRA725的与染色体上的相同区域的单交换株的情况下，显示由于pCRA725上的卡那霉素抗性基因的表达而引起的卡那霉素抗性和由于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的sacR-sacB基因的表达而引起的在含蔗糖培养基中的致死性，与此相对，在双交换株的情况下，显示由pCRA725上的卡那霉素抗性基因的脱落而引起的卡那霉素敏感性和由sacR-sacB基因的脱落而引起的在含蔗糖培养基中的生长性。因此，无标记染色体基因导入株显示卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性。
通过上述方法，使用上述的儿茶酚生产关联基因染色体导入用质粒和染色体基因破坏用质粒构建PCA生产关联基因染色体导入株。作为宿主菌株，使用原儿茶酸生产型棒状细菌谷氨酸棒杆菌PCA3株(Corynebacterium glutamicum PCA3)[国际公开WO2017/169399]。另外，还使用pcaHG基因破坏用质粒pCRG3[国际公开WO2017/169399]、qsuB基因染色体导入用质粒pCRB295[国际公开WO2017/169399]和aroG(S180F)基因染色体导入用质粒pCRB285[国际公开WO2017/169399]。应予说明，将本染色体基因重组的概要汇总示于表4和表5。
[表4]
基于染色体基因重组的儿茶酚生产株的构建
Figure BDA0002745407470000201
[表5]
通过染色体基因重组得到的构建菌株的概要
Figure BDA0002745407470000202
x2.x3：表不导入染色体的基因的个数
(5)儿茶酚生产基因表达质粒导入株的构建
在上述的染色体基因重组株中导入原儿茶酸脱碳酸酶，由此构建儿茶酚生产株。另外，作为对照实验用，使用pCRB22(Appl Microbiol Biotechnol.2015Jun；99(11)：4679-89)。应予说明，将本生产株的概要汇总示于表6。
[表6]
儿茶酚生产株的概要
构建菌株名 宿主菌株名 导入质粒 原儿茶酸脱碳酸酶基因来源
CAT21 LHglc1367 Pani37 Lactobacillus rhamnosus
CAT41 LHglc1367 Pani279 Lactobacillus pentosus
CAT24 LHglc1367 Pani40 Lactobacillus plantarum
CAT42 LHglc1367 Pani284 Lactobacillus pobuzihii
CAT45 LHglc1367 Pani283 Lactobacillus composti
CAT6 LHglc1367 PGadi21 Bacillus megaterium
CAT5 LHglc1367 PGadi20 Bacillus licheniformis
CAT39 LHglc1367 Pani63 Bacillus atrophaeus
CAT2 LHglc1367 pCRG34 Bacillus subtilis subsp.subtilis
CAT38 LHglc1367 Pani60 Bacillus subtilis subsp.spizizenii
CAT37 LHglc1367 Pani86 Enterobacter aerogenes
CAT1 LHglc1367 Pani26 Enterobacter cloacae
CAT32 LHglc1367 Pani81 Enterobacter sakazakii
CAT40 LHglc1367 Pani88 Enterobacter hormaechei
CAT31 LHglc1367 Pani80 Escherichia coli W
CAT36 LHglc1367 Pani85 Escher ichia fergusonii
CAT35 LHglc1367 Pani84 Paenibacillus polymyxa
CAT34 LHglc1367 Pani83 Citrobacter koseri
CAT33 LHglc1367 Pani82 Pantoea ananatis
CAT158 LHglc1367 pCRB22 -
CAT91 ESglc1590 Pani37 Lactobacillus rhamnosus
CAT92 ESglc1609 Pani37 Lactobacillus rhamnosus
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CAT21已在日本千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8122号室(邮政编码292-0818)的国家技术评估学会专利微生物保藏中心进行了国际保藏(基于布达佩斯条约的国际保藏的保藏日：2018年4月17日，保藏编号：NITEBP-02689)。
[实施例2]
儿茶酚生产试验(试管内，10mL规模)
(原儿茶酸分解途径破坏、儿茶酚分解途径破坏的组合)
使用以谷氨酸棒状杆菌R株为基础而构建的儿茶酚生产株即CAT91株(参照表5和表6)，通过以下记载的方法进行使用试管的需氧分批反应的儿茶酚生产实验。
将CAT91株涂布于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和4％的葡萄糖的A琼脂培养基[将(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)FeSO4·7H2O、0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素检测酪蛋白氨基酸7g、琼脂15g溶解于蒸馏水1L]，在33℃下在暗处静置15小时。
在添加有含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和2％的葡萄糖的A液体培养基[将(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)FeSO4·7H2O、0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素检测酪蛋白氨基酸7g溶解于蒸馏水1L]10ml的试管中，接种一铂环在上述平板上增殖的CAT91株，在33℃下需氧振荡培养7-15小时。
将在上述条件下增殖的菌株悬浮于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和4％的葡萄糖的A液体培养基10ml，使得初期菌体浓度OD610＝0.5，添加200mg的CaCO3，在33℃下进行需氧振荡培养48小时。将48小时后的培养液离心分离(4℃,15000×g、5分钟)，得到培养上清液。通过高效液相色谱系统(Prominence HPLC装置(岛津制作所制造)、COSMOSIL填充柱5C18-AR-II、使用10％甲醇、0.1％磷酸作为流动相进行分离)分析培养上清液中的代谢物质浓度。其结果是，该菌株在48小时后生产0.1mM的儿茶酚。
[实施例3]
儿茶酚生产试验(试管内，10mL规模)
(原儿茶酸分解途径破坏、儿茶酚分解途径破坏、DAHP合酶强化、原儿茶酸合酶强化的组合)
使用以CAT91株为基础而构建的儿茶酚生产株即CAT92株(参照表5和表6)，通过以下记载的方法进行使用试管的需氧分批反应的儿茶酚生产实验。
将CAT92株涂布于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和4％的葡萄糖的A琼脂培养基[将(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)FeSO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素检测酪蛋白氨基酸7g、琼脂15g溶解于蒸馏水1L]，在33℃下在暗处静置15小时。
在添加有含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和2％的葡萄糖的A液体培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)FeSO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素检测酪蛋白氨基酸7g溶解于蒸馏水1L]10ml的试管中，接种一铂环上述平板上增殖的CAT92株，在33℃下需氧振荡培养7-15小时。
将在上述条件下增殖的菌株悬浮于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和4％的葡萄糖的A液体培养基10ml，使得初期菌体浓度OD610＝0.5，添加200mg的CaCO3，在33℃下进行需氧振荡培养48小时。将48小时后的培养液离心分离(4℃,15,000×g、5分钟)，得到培养上清液。通过高效液相色谱系统(Prominence HPLC装置(岛津制作所制造)、COSMOSIL填充柱5C18-AR-II、使用10％甲醇、0.1％磷酸作为流动相而进行分离)分析培养上清液中的代谢物质浓度。其结果，该菌株在24小时后生产18.4mM的儿茶酚。
[实施例4]
儿茶酚生产试验(试管内，10mL规模)
(各种生物来源的编码具有原儿茶酸脱碳酸活性的酶的基因对儿茶酚生产的影响)
为了调查利用谷氨酸棒杆菌转化体的、编码儿茶酚生产中具有原儿茶酸脱碳酸活性的酶的基因导入的效果，以原儿茶酸生产株谷氨酸棒杆菌PCA3(Corynebacteriumglutamicum PCA3)[国际公开WO/2017/169399]为基础而构建破坏编码儿茶酚分解酶的基因的菌株LHglc1367(表5)。在该菌株中导入整合有各基因的质粒，得到脱碳酸酶导入株CAT01-CAT47(表6)。比较各自的儿茶酚生产率。将各菌株涂布于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和4％的葡萄糖的上述A琼脂培养基，在33℃下在暗处静置15小时。
在添加有含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和2％的葡萄糖的上述A液体培养基10ml的试管中，接种一铂环在上述平板上增殖的各菌株，在33℃下进行需氧振荡培养7-15小时。
将在上述条件下增殖的各菌株接种于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和4％的葡萄糖的上述A液体培养基10ml，使得初期菌体浓度OD610＝0.5，添加200mg的CaCO3，在33℃下进行需氧振荡培养24小时。将24小时后的培养液离心分离(4℃,15000×g、5分钟)，对于得到的上清液，通过上述高效液相色谱系统进行儿茶酚的定量分析。将结果示于表7。
应予说明，表7中的氨基酸序列的一致性为鼠李糖乳杆菌的ubiD基因编码的氨基酸序列与其它ubiD基因编码的氨基酸序列的比较结果。
[表7]
Figure BDA0002745407470000251
根据表7的结果可知，通过导入鼠李糖乳杆菌的ubiDX及其种间同源基因，儿茶酚的生成量增大。其中，在使用鼠李糖乳杆菌的ubiDX及与其一致性高的菌株(例如CAT21株、CAT41株、CAT24株)的情况下，显示儿茶酚的生产量进一步提高。
[实施例5]
儿茶酚生产试验(发酵罐，400mL规模)
(生产最佳pH的研究)
使用CAT21株(参照表5～表7)，通过以下记载的方法进行使用发酵罐的需氧分批反应的儿茶酚生产实验。
将CAT21株接种于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和2％的葡萄糖的上述A液体培养基10ml后，在33℃下进行需氧振荡培养18小时。
将CAT21株接种于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和2％的葡萄糖的上述A液体培养基100ml后，在33℃下进行需氧振荡培养12小时。
将在上述条件下增殖的菌体通过离心分离(4℃，3000×g、10分钟)而收集菌体，将得到的菌体悬浮于1000ml容量的发酵罐培养槽内的、含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和8％的葡萄糖以及消泡剂(ADEKA NOLL126)3g/L的培养液[将(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)FeSO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液25μl、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素检测酪蛋白氨基酸7g溶解于蒸馏水1L]400ml中，使得OD610＝0.2，利用1000ml容量发酵罐在33℃下，通过添加5.0N氨水来维持控制pH，在通气量为0.4L/分钟(air、1vvm)，溶解氧浓度为(DO)10％(将大气压下饱和溶解氧浓度设为100％)的条件下通气搅拌培养24小时。通过上述的高效液相色谱系统分析培养上清液中的代谢物质浓度。将其结果示于表8。
[表8]
改变pH时的发酵罐中的儿茶酚生产量的比较
pH 儿茶酚生产浓度(mM)
6.0 39
6.5 51
7.0 60
7.5 50
8.0 0
在维持pH7.0而进行培养时，CAT21株在培养开始24小时后生成60mM的儿茶酚，在研究的pH中显示最高的浓度。另外，在维持pH8.0而培养的情况下，儿茶酚的生产浓度在24小时后的时刻为0mM。由这些结果可知，使用该菌株生产儿茶酚时，将pH设为7.0附近时显示最高的生产率。
[实施例6]
儿茶酚生产试验(发酵罐，400mL规模)
(增殖非依赖型的生产试验)
使用CAT21株(参照表5～表7)，通过以下记载的方法进行使用发酵罐的需氧分批反应的儿茶酚生产实验。
将CAT21株接种于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和2％的葡萄糖的上述A液体培养基10ml后，在33℃下进行需氧振荡培养18小时。
将CAT21株接种于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和2％的葡萄糖的上述A液体培养基100ml后，在33℃下进行需氧振荡培养12小时。
将在上述条件下增殖的菌体通过离心分离(4℃,3000×g,10分钟)而收集菌体，将得到的菌体悬浮于1000ml容量的发酵罐培养槽内的、含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和8％的葡萄糖以及消泡剂(ADEKA NOL L126)3g/L的培养液[将(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)FeSO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液25μl、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素检测酪蛋白氨基酸7g溶解于蒸馏水1L]400ml中，使得OD610＝0.2，利用1000ml容量发酵罐在33℃下、pH7.0(通过添加5.0N氨水来控制)、通气量为0.4L/分钟(air、1vvm)、溶解氧浓度(DO)为5％(将大气压下饱和溶解氧浓度设为100％)的条件下进行通气搅拌培养18小时。
将在上述条件下增殖的菌体通过离心分离(4℃,5000×g,10分钟)而收集菌体，利用0.9％氯化钠水溶液将菌体清洗1次后，以成为100g湿菌体/L(相对于培养基体积，以湿菌体重量计为5％)的方式悬浮于含有10％葡萄糖的250ml反应液[将(NH4)2SO4 7g、KH2PO40.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml溶解于蒸馏水1L]，使用1000ml容量发酵罐，在33℃、pH7.0(通过添加5.0N氨水来控制)、通气量为0.25L/分钟(air、1vvm)、DO5％的条件下进行儿茶酚生成反应。通过上述的高效液相色谱系统分析培养上清液中的代谢物质浓度。将其结果示于图1。
如图1所示，CAT21株在儿茶酚生成反应开始27.5小时后生成66mM(7.25g/l)的儿茶酚。根据该结果可知，该菌株在使用无机盐最少的培养基的不伴有菌体增殖的反应工艺中具有非常高的儿茶酚生产率。以从糖出发的发酵法的生产率计，该菌株的儿茶酚生产率大幅超过了目前为止报道的生产率高的大肠杆菌重组株的生产率38mM(4.2g/L)36小时(非专利文献3)和41mM(4.5g/L)84小时(非专利文献2)。
[实施例7]
儿茶酚生产试验(发酵罐)
(树脂吸附的利用)
使用CAT21株(参照表5～表7)，通过以下记载的方法进行使用发酵罐的将需氧分批反应和树脂吸附组合的儿茶酚生产实验。
将CAT21株接种于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和2％的葡萄糖的上述A液体培养基10ml后，在33℃下进行需氧振荡培养18小时。
将CAT21株接种于含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和2％的葡萄糖的上述A液体培养基100ml后，在33℃下进行需氧振荡培养12小时。
将在上述条件下增殖的菌体通过离心分离(4℃,3000×g,10分钟)而收集菌体，将得到的菌体悬浮于1000ml容量的发酵罐培养槽内的、含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和8％的葡萄糖及消泡剂(ADEKA NOL L126)3g/L的培养液[将(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)FeSO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液25μl、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素检测酪蛋白氨基酸7g溶解于蒸馏水1L]400ml，使得OD610＝0.2，利用1000ml容量发酵罐，在33℃、pH7.0(通过添加5.0N氨水来控制)、通气量为0.4L/分钟(air、1vvm)、溶解氧浓度(DO)为5％(将大气压下饱和溶解氧浓度设为100％)的条件下通气搅拌培养18小时。
将在上述条件下增殖的菌体通过离心分离(4℃,5000×g,10分钟)而收集菌体，利用0.9％氯化钠水溶液将菌体清洗1次后，以成为100g湿菌体/L(相对于培养基体积，以湿菌体重量计为5％)的方式悬浮于含有10％葡萄糖的300ml反应液[将(NH4)2SO4 7g、KH2PO40.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml溶解于蒸馏水1L]，使用1000ml容量发酵罐，在33℃、pH7.0(通过添加5.0N氨水来控制)、通气量为0.3L/分钟(air、1vvm)、DO5％的条件下进行儿茶酚生成反应。此时，从发酵罐开始连接预先充满反应液的流路和蠕动泵，同时开始培养液的循环。在流路中途配置错流型过滤装置(Microza Pencil型模块)和新的蠕动泵，抽取不包含菌体的过滤液。使该过滤液通过填充有60g吸附树脂(SP850)的柱子，将穿透液返送至发酵罐。48小时后结束实验，将流路所包含的反应液全部返送至发酵罐，测定体积。通过上述高效液相色谱系统分析培养上清液中的代谢物质浓度。通过通入水，接着通入100％乙醇而提取吸附于树脂的代谢物质，水提取液直接通过上述高效液相色谱系统进行分析，乙醇提取液在利用蒸发器干燥并溶解于等体积的水后通过上述高效液相色谱系统进行分析。将其结果示于表9。
[表9]
反应结束后，培养液、树脂中所包含的儿茶酚量
Figure BDA0002745407470000301
将合计的儿茶酚的物质的量除以反应液的体积，作为儿茶酚生产浓度。其结果，CAT21株在48小时内生产135mM(14.9g/L)的儿茶酚。相对于此时的消耗葡萄糖的收率为18％(摩尔比)。
作为由糖开始的利用发酵法生产儿茶酚时组合使用吸附树脂的示例，报告了使用大肠杆菌重组株的77mM(8.5g/L)、收率7％36小时(非专利文献3)，CAT21株的儿茶酚生产率在浓度、收率方面均大幅超过该示例。
[参考例1]
棒状细菌显示高于其它微生物的儿茶酚抗性的验证
对于棒状细菌即谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌即大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、酵母即酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假单胞菌即恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、红球菌即红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)，通过琼脂培养基上的交叉划线测定(Cross streak assay)比较对儿茶酚的抗性。
将谷氨酸棒杆菌R株(Corynebacterium glutamicum R)和ATCC 13032株涂布于含有4％的葡萄糖的上述A琼脂培养基，在33℃下在暗处静置15小时。在添加有含有2％的葡萄糖的上述A液体培养基10ml的试管中接种一铂环的上述平板上增殖的谷氨酸棒杆菌，在33℃下进行需氧振荡培养13小时。
将大肠杆菌K-12MG1655株(Escherichia coli K-12MG1655)涂布在LB琼脂培养基[1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、以及1.5％琼脂]上，在37℃下在暗处静置15小时。将在上述平板上增殖的大肠杆菌(Escherichia coli)接种到LB液体培养基[1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、以及0.5％氯化钠]中，在37℃下进行需氧振荡培养13小时。
将恶臭假单胞菌ATCC 700801株(Pseudomonas putida ATCC 700801)涂布于上述LB琼脂培养基，在30℃下在暗处静置15小时。将在上述平板上增殖的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)接种于上述LB液体培养基，在30℃下进行需氧振荡培养13小时。
将酿酒酵母NBRC2376株(Saccharomyces cerevisiae)涂布于YEPD琼脂培养基[2％聚蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖、以及1.5％琼脂]，在30℃下在暗处静置20小时。将在上述平板上增殖的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种于YEPD液体培养基[2％聚蛋白胨、1％酵母提取物、以及2％葡萄糖]中，在30℃下进行需氧振荡培养13小时。
将红串红球菌ATCC 27854株(Rhodococcus erythropolis ATCC 27854)涂布于上述LB琼脂培养基，在30℃下在暗处静置15小时。将在上述平板上增殖的红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)接种于上述LB液体培养基，在30℃下进行需氧振荡培养13小时。
将如上进行了预培养的各菌株在含有4％的葡萄糖的上述A琼脂培养基上分别均匀地涂布成线状，按照与其交叉的方式在平板的中心从上方放置含有25％的儿茶酚的滤纸。在30℃或26℃下在暗处静置24小时后，通过比较从滤纸开始的增殖抑制范围来进行抗性的比较。将其结果示于图2。
如图2所示，棒状细菌与其它任意的菌相比增殖抑制区域均窄，抗性比较高。另外，棒状细菌的R株和ATCC 13032株之间没有明显的差别。
产业上的可利用性
本发明例如在儿茶酚的制造中是有用的。
序列表
<110> 公益财团法人地球环境产业技术研究机构
<120> 棒状细菌的转化体和使用其的有用化合物的制造方法
<130> H4639-01
<150> JP 2018-88424
<151> 2018-05-01
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2058
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌
<400> 1
atgacagcat caccttggga cttaagaaaa gtattggatg aactaaaaca ggatccgcag 60
caatatcatg aaacagaggt gcaagtcgat cccgatgcag agcttgctgg cgtttatcgt 120
tacatcggtg ccggtgggac ggtcgaacgt ccgacacagg aaggtccggc aatgatgttt 180
aacaacgttg tcggcttccc aacgacaagg gttttgatcg gtttaatggc cagtcgcaag 240
cgggttggca agatgtttca ccaagactat cacacacttg gtcgattctt gaacaaagcg 300
gttttaaatc ctattcaacc cgttacagtc gaagaatcag cagcgcctgc gcatgaagtc 360
gttgccaagg ctagtgaccc ggactttgac attagaaaac tcgttgcagc accaaccaat 420
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aaaacaatga ctgatgtgac gattcatcgc atggttttgg aagataagga tacgcttggt 540
atttatatca tgcccggtgg tcgccacatt ggtcattttg ctgaagaata tgaaaaagcc 600
aataagccga tgccggtgac catcaacatt ggcttggatc cggccattac cattggtgcc 660
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cgccaagaac ccgtgcaact ggttcaggct gtgaccgtca atgaaaaagc cattgcgcgt 780
tcagaattta cactggaagg ctatatcatg cctaacacgc gtatccaaga agatatcaat 840
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<213> 戊糖乳杆菌
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caacggcaag ctgccttgct tgcgttctca gcctttaagg aattgaagac tgttatcctg 1200
gttgatgaag atgttgatat ttttgatatg aatgatgtga tttggacgat gaatacccgt 1260
ttccaagccg atcaggactt gatggtctta tcaggcatgc ggaatcatcc gttggaccca 1320
tcggaacgcc cacaatatga tccaaagtcg attcgtttcc gtgggatgag ttctaaacta 1380
gtgattgatg gcaccgtacc attcgatatg aaggaccaat ttgaacgggc ccaattcatg 1440
aaagtggctg actgggagaa gtatttgaag taa 1473
<210> 6
<211> 2043
<212> DNA
<213> 破布子乳杆菌
<400> 6
atgggtgaag acaaatggga tttgcgtaaa gttttgtctg agatcaaaga tgatcccaaa 60
aactatcatg aaacagatgt cgaagttgat ccagaagctg aattagccgg tgtttatcga 120
tacattggtg ctggtgggac agttgaacgt ccaacacaag aaggacctgc gatgatgttt 180
aataatgtca aaggctttcc tagtacacgt gttttgattg gcttaatggc cagtcggaga 240
cgtgtaggaa aaatgctcca tcatgattat cagacattag gtcaattctt taatgaagca 300
gtttcgaaac cggttcctcc agttttggtt gacgaaaagg atgcacctac gcatgaagtt 360
gtgcaccatg caacagataa gaattttgat attcgtaagt tagtcgctgc tcctacaaac 420
acaccccaag atgctggtcc ttatattaca gttggtgtag ttttagggtc taacatggat 480
aagacgatgt cagatgtgac tatccatcgt atgtgcattg aaggaaaaga taagttggga 540
atttatatta tgcctggcgg aagacatatt ggggcttttg ctgaagaata cgaaaaggct 600
aataagccga tgcctgttac gatcaatatt ggacttgacc cagcagtaac gattggtaca 660
acattcgagc cgccaacaac tcctcttggt tacaatgagt taggggttgc aggttcgatt 720
cgtaaccagc ctgttgaatt ggtcaatggt gtttcagtag atgaaaaagc aattgcacgg 780
gctgaatata ctttagaagg ctatattatg cctaacgaaa gaatgcaaga agatatcaat 840
actcgtacag gtaaagcaat gcccgaattt ccaggttatg atggtgatgc taatcctgca 900
gttcaagtta taaaagttac ggccgttacc catcgtaaag atccaattat gcaaagtgtg 960
atcgggccaa gtgaagaaca cgtcagcatg gcaggaattc cgactgaagc aagcatttta 1020
caattagtca ataaggctat tcctggtaag gttactaagg tttataatcc atcagcgggc 1080
ggtggcaagt tgatgactat tatgcagatt cataaagaaa acgaagcaga tgaaggtatt 1140
caacgtcaag cagctttact tgcattctct gcttttaaag aactaaagac tgtattttta 1200
gttgacgaag atgttgatat tttcgatatg aatgatgttg tttggacgat taataccagg 1260
ttccaggctg ataaagatat catggtactt tctgggatgc gtaatcatcc attggatccc 1320
tctgaacgtc ccgaatatga tccgaaatca attcgttttc gtggaatgag ttccaagtta 1380
gttgttgatg ggactgttcc attcgacatg aaagaccagt ttgaaagagc gcagtttatg 1440
aaggttccag actggaaaaa atatttggag taatcaacaa tgaaaaaaat tattattgga 1500
gtttccggag catcgggaac aatctatgca gttgatcttt tgaaaaaaac tcagcagtta 1560
tccaatgttg aaactcacct agtaatgagt aagtgggcta agcaaaatct tgcactggag 1620
acaaattatc agttaaatga aatcaactct ttggctgatt atgtatacga cgagcgagat 1680
caagctgcca aaattgctag cggttctttt ttagttgatg gtatggtcgt tgttcccgca 1740
agtatgaaaa ctatcgcagg tatagccaat ggatttgctg ataatttggt tggtcgggca 1800
gccgatgtca tacttaagga acaacgaaaa cttgtgatag ttcctcgtga atcgccttta 1860
agcgtgatcc atcttgaaaa tttaactaaa ttagctaaaa ttggggccca gatcattccc 1920
ccgattccag ccttttataa ccatccttct tctattcaag accttgtgga ccatcagacg 1980
atgaaaacct tagatgcatt gggaatcaac aatgatatat cttcacgttg ggatggcaga 2040
tga 2043
<210> 7
<211> 2055
<212> DNA
<213> 复合乳杆菌
<400> 7
atgtcagatt attatgattt gagacgggtc ttaaaggaat tagcagctga ggcccctaag 60
caatatcacg ccaccgatga attggtggac cctaatgcgg aattagctgg agtttaccgc 120
tacattggcg ctgggggcac ggtcaagcgg cccactcaag caggaccggc attgatgttc 180
aacaacgtca agggctttgc cggcacccgg gtcttgattg gcttattggc cagtcgcaag 240
cgggtgggtt tgctatttca tcacgattac catacgctag gccaatttct aaatgatgca 300
gtggaccatc ccctaaaccc ggtgacagtt tctgaagctg acgccccggc ccatgaagtc 360
atccacaaag tcgacgaccc tgattttgat atccgcaaac tcatcgccgc ccccaccaat 420
accgaatacg acgcagggcc ttacatcacc atgggcttag tttatgggtc taatcgggcc 480
aaaaccaaaa gtgatgtgac cattcatcgc atggttttag aggataaaga taccattggc 540
atctacatca tgcctggggg ccggcatatc ggcgcttttg ctgaagaata tgagcaagcc 600
aacgaaccca tgcccattac tgtgaacatc ggcttagatc cggccatcac gttgggggcc 660
acctttgaac cgcctacaac gcccttaggt tataacgaat tgggagttgc cggggctatt 720
cgccaagaac ccgtccagct ggtagacgct atcaccgttg ccgaaaaggc catcgcccgt 780
tctgaattca ccatcgaagg ctacatcatg ccccaccaac gcatgcaaga agacatcaac 840
accaacacgg gtaaagccat gccagaattt cctggctatg acggtgatgc taatcccgcc 900
gtgcaggtca tcaaagtaac ggcggtcacc catcgtcaag accagcccat tatgcagaca 960
gtgattggtc ccagcgaaga acatgtgaac ttagccggaa ttcccacgga agctagcatt 1020
ctagaactca ccaataaagc catccccggt aaagtcttaa atgtctacaa tccccctgct 1080
ggcggcggta aattgatgac gattctccag atccacaaaa ctaatcccgc tgatgaaggc 1140
atccagcgtc aggccgccct cttagccttt gcggctttta aagaattgaa gacagtgatt 1200
ttagtggacg aggatgtgga cattttcgac atgaacgatg tgatatggac tgtcaatacc 1260
cgttttcagg ccgaccagga cattgtggtg ctgccgggga tgcgcaatca tcccctggac 1320
ccttcagagc ggcccgctta tgacccgaag tctattcgag ttcaggggat gtccagcaag 1380
ttgattttag atggcaccgt cccctgggac atgaaggctc agttcatccg agcccggttt 1440
aaagaagttc aagactggcg caagtatttg caataggagg tctgttaaac tatgaagaaa 1500
attgtcgttg ctatgaccgg cgcgtcaggc gtgatttacg gccttgattt attgcgccat 1560
ttgcaggcca ttccgtcggt tgaaacccac ctggtgctca gtccctgggc taaaaagaat 1620
attcaactag aaaccgatct gaccttgcag caggtccaag atttgtccga tgtggtctac 1680
cacgacaatg accaaggggc ggcgattgcc agtggttctt tcctgcacga tggcatggtg 1740
atcgtcccgg ccagcatgaa gaccgtggcc gaaatcgcct acggcttcgg ggaaaatctg 1800
attggccggg cggctgatgt gaccattaaa gaatgccgac cgctgatcat cgtacctaga 1860
gaaacgccct tgagcgtgat tcatttggaa aatctcacca agctggccaa attaggagct 1920
caaatcattc cccctattcc cagtttttat acccagccta agaccatcgc cgatttggtg 1980
accaaacaaa ccatgcactt attagacgct ctaaagatcc ccaacgactt ggctcaacgc 2040
tggacgggag ggtaa 2055
<210> 8
<211> 2517
<212> DNA
<213> 北海道乳杆菌
<400> 8
atgacagaac aaccatatga tttaagaaaa gtacttgcag aaattaaaga tgaccccatg 60
caataccacg aaacaaatcg agaaatcgat ccaaatgcag atttagctgg tgtctatcga 120
tatattggtg cgggtggaac cgttaagcgt cccaccactg aagggccaac aatgatgttt 180
aataatgtta aaggatttcc aggtagtcgg gtgctgattg gattacaagc ctctcgtaaa 240
cgggttggta agatcttgca tcatgattac aaaacgttgg gtcaaatgct aaacgaggct 300
gtttcaaatc ctgtcaaacc agtagaagtt aaaagagaag atgcacctgc tcaagaagta 360
gtacacctag cgtcagattc taactttgat attcgtaaat tactagctgc gccgacgaat 420
actcctgagg acgcaggtcc atatatcaca atgggggttg tgtatggtca tagcgtggat 480
ggtaagcaaa gtgatgttac aattcaccga atggttttag aagataaaga tacaatcggt 540
atgtatatca tgccaggtgg ccgccacatt ggtgcatttt taaaagacta tgagcaacaa 600
aacaagccaa tgccgatcac aattaatatt ggtttagatc ccgcagttac gattggggca 660
acctttgagc caccgacgac accactgggc tacaatgagc ttcaggtagc tggtgcattg 720
agaaatgagc cagtacaagt ggttcccgga gttgcagtaa acgcgttagg tattgcgcgc 780
tcagaatgga ttattgaggc tgaaattcaa cctaatcaaa caatgcaaga agacatcaat 840
acaaataccg gttacgcaat gcctgaattt cctggctaca atggaaccgc gaatccagcc 900
gttaatgtcg ttaaaattaa ggctgtgacg caccggaaag ataatccaat cgtccaaaca 960
actattgggc catctgaaga gcatgtttcc atggctggaa ttccaactga agcttcaatt 1020
ttaagtttag ttgatcgtgc cattccgggt aaagttttga atgtttataa cgctcccgct 1080
ggtggtggta aattaatgac catcatgcaa atccataagg ataatgaagc ggatgaagga 1140
attcaacgac aagcagcatt attagcattt tcagcgttta aagaattaaa aacggtcatt 1200
ttagttgacg aagatgttga tatttttgac tggaacgatg taatgtggac gatcaatacg 1260
agattccaag ctgatcgtga cattatggta ctcgagggga tgcggaatca tccgcttgac 1320
ccatcagaac tgccggaata tgatcctgct cgaatccgag tgaagggaat gagttctaaa 1380
ttagtccttg atggtacctt cccttatgat atgcgtgaca aatttaaacg ggcagaattt 1440
aaagaaattc cggattggaa gaaatatttg gattaattaa ggaggggcaa atgaaaaagg 1500
ttgtcgttgg aattactggt gctagtggaa caatctacgg gattcgttta ttagaagttt 1560
tgcacgcaat gccaaatgtg gagacacacc tagtgatgag tcagtgggcc aaggaaaatt 1620
tagcagtaga agatactggt tatacggaaa ctcaagtcaa agcactggct gatttgactt 1680
attctgagca aaatatgggt gccaaaattg ctagtggcag ctttattcat gatggaatgg 1740
ttattattcc agctagtatg aagactgttg catcgattgc tactggtgta ggagaaaact 1800
taattgcacg agcagccgac gtgactctaa aagaacagcg acaattgatc attgtgcctc 1860
gtgagtcgcc gtttaaccaa attcatttgg agaatatgct caaactttcc aaaatgggtg 1920
tgggtattat tccaccaatt ccggcatttt ataataatcc aaaaacggta gatgacatta 1980
tcaatcattc cgtgatgaag atcttggatc atttacagat tgagaattct gttagtacac 2040
gatgggaggg attggctcat gcccgcaaag atgcccaaaa caaataacga gattccgaac 2100
acttttaaag tagatgtaac aaaaagtggt tatacgatgg ttgccatttt ggaacgtcaa 2160
aatcaagatg tgctgatcca attaattgga ggcgatgtgc cgcactacgg ggttgtgatg 2220
tcgattgata atacaggcaa tactgagaca attcggttgc ctagccgccc aggacatgta 2280
catcaggaaa agattctgat tgaacaagtt gctggcgcca tcaaaccagt tttgcaaaat 2340
aatgcgatca ttgtttctgg aatgcatgtc aatgatatct ccacagaaca gatgcatgcc 2400
gctattccaa tggcgcaaaa gttgggcgca cgactagcag tttggttaaa acaaaatccg 2460
gttgatccat taccgatgag tttcgctaag aaaaacagtg tgaacaaccg cgtttag 2517
<210> 9
<211> 2491
<212> DNA
<213> 清酒乳杆菌清酒亚种
<400> 9
atgagtgaac aaccttatga tttacgtaaa gtattggctg aaatcaaaga tttaccaggc 60
caatatcatg aaacggatgt tgaaattgat cccaatgctg atttagcggg tgtctatcgt 120
tatattggtg ctggcgggac agtcatgcgg ccaacaaccg aaggcccaac aatgatgttt 180
aataatgtta aaggcttccc tggaagtcgt gttttaattg gcttgcaagc ttcacgccaa 240
cgggtcgcaa cgattttaca tcatgactac aaaacgctgg gtcaaatgtt aaacgaagcg 300
gtaaccaaac cagttgcccc cgtcgaagtg acacgcgaac aagcaccagc acaagaagtc 360
gttcatttag cgagcgatgc tgattttgat atccgcaaat tattagcagc accaaccaat 420
acggaagacg atgctggtcc atacatcaca atgggtgtcg tgtatggtca tagcgtggat 480
caccaacaaa gcgacgttac gattcaccga atggttcttg aagataaaga tacaattggg 540
atgtatatca tgcccggtgg tcgccatatc ggtgcgttct taaaagaata tgaagcaatc 600
aacgaaccaa tgccaattac cattaacatt ggtttggacc cagcgattac cattggggct 660
acttttgaac cacctacaac gccacttggt tataatgaac tccaaattgc cggtgcttta 720
agaaatgaag ccgttcaagt agtgcctggt gtcgctgttg atgccttagg gattgcccgt 780
gctgaatgga ttatcgaagc cgaaatttta ccaaaccaat caatgcaaga agatattaat 840
acgaattctg ggtatgcgat gccagaattc cctggttata acggctcagc aaatcctgcc 900
gtgaatgtga ttaaagttaa agcggtcact catcgtcaag ataatccaat tgttcaaaca 960
acaattggtc cttcagaaga acacgtttcg atggccggta ttccaactga agcatcaatt 1020
ttgagcttag tggagcgcgc tattccaggt aaagtattga acgtctataa cgcccctgct 1080
ggtggtggga aattaatgac tatcatgcaa attcataagg ataacgaagc cgatgaaggg 1140
attcaaagac aagcagcatt gctcgccttt tctgccttca aagaattaaa gacggtcatc 1200
ttagtggatg aagatgttga tatcttcgat tggaacgacg tgatgtggac catcaataca 1260
cggttccaag ccgatcggga catcatggtc ttagaaggtt tacggaatca tccattagat 1320
ccatctgaat taccagaata cgatccagct cggattcgtg tgcgtgggat gagttctaag 1380
ttagtattag acgggacttt cccatatgac atgcaaaaga gtttcaagcg tgcgcaattt 1440
aaagaaatcg cagattggca aaaatattta aattaattag aagaaaaggg gaataatatg 1500
cgtaaaatag tcgtcggtat ttcgggtgcc agtgggacaa tttatgggat tcgtttgcta 1560
gaggcattac accaagtgcc ggatgttgaa acacatctgg tcatgagtcg ctgggccaaa 1620
gaaaatttag ccatcgaaaa aactgggtac actgaaaagc aagtcgtggc gctagctgat 1680
tttgtccatc cagagcaaaa tatgggcgca acaattgcca gcggtagttt caaacacgat 1740
gggatggtga ttgtacccac tagcatgaaa actttagctt cgattgcaac cggtctgggc 1800
gaaaacttga ttgccagagc tgccgatgtt actttgaaag aacgacgacc attaattatt 1860
gtgccccgtg aatctccttt taatcagatt caccttgaaa atatgttgaa gttggcccaa 1920
atgggtgtgg cgattgtacc gccgattcca gctttttata atcaaccaca aacgatagat 1980
gatatcgtca atcatacggt aatgaaatta ttggatcaac tgcatatcga gaccaacctt 2040
ggttcacgtt gggaggggtt agctaatgca cgtcaaaacg ctcgctagta ccgaacaaac 2100
cgtacaattt gcggtcactg aaacggatta tacaatgcac ttaaaattag agcgccaaac 2160
gtctgattta ttaattcaga ttatcggtgg cgacgtgccc cattacggcg tcatcacgac 2220
ggtcgataaa acgggtaagg cattgaccac ggcacttcct agccgcccag gacatgtcca 2280
tcaagaaaaa gtattaattg atcaggtttt aaaaactgtt aagccactga ttacgaataa 2340
tgcggtctta gtgtctggga tgcacgtcaa tgagattaca ccggcgcaaa tgcgcgcggc 2400
aatgctaatg gcacatgaac taggagtcgc tttagccaaa tggttaaaag cacatccaga 2460
tcaaacccaa gtggttacct atgctaaata a 2491
<210> 10
<211> 2247
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌
<400> 10
atgaaaatag ctgtaggaat cacaggagcc acgggagcta ttttaggtat tcgaatttta 60
gagctgttaa agaaggcttc tgttgaaacg catttagtca tgtcgccttg ggctcatgcc 120
acaattaagc tggaaacatc ctatagcgtt cagcaagtag aagcgctagc agattattgt 180
tattcatatc aagaccaagc agcaaaaatt tcgagcggct cttttcgtat agatggaatg 240
attgttagtc cttgcagtat gaaaacatta gcatctattc gaatgggact agcagataac 300
ttaatagcga gaacggcaga tgtgatgtta aaagagagaa agccacttgt gctacttcct 360
cgcgaaacgc ctttaaatac gattcattta gaaaacatgc tggatctttc aaaaatggga 420
gctatcctgg tgccgcctat gccggctttt tataacaaac ctaagacgat cgacgatatt 480
gtcacacata ttgctgttcg aacgttagat cagttgggaa ttgagcttcc tgaagcaaaa 540
agatggcaag gaattaaaca tttatcacaa ggaggaaaat aaaaatggct tataaagact 600
ttagagattt ccttgatacg ctacataaag aagggcagct gctgacgatt actgatgaag 660
tgcagcctga tcctgatttg ggttcagcag gtcaagccat cagtaattta ggagatcaaa 720
cgccgggatt attgtttact aatatttatg gatatcacaa tgcaaaggta gctctaaacg 780
taatgggttc ctggtcaaat cacgcgttaa tgatggggct gcctaaatcg actcctgtaa 840
aagaacagtt ctttgagttt gctcggagat atgaaaaatt tcctgtcaaa gtgaaaagag 900
aagagacagc gccgtttcat gagtgtgaaa taacagacga tattaactta ttcgatcttt 960
tgccgttgtt tcgcttaaat caaggagacg gaggctatta tctagataaa gcgtgtgtta 1020
tttctcgtga tcagcatgat aaggagaact tcggtaaaca aaatgtaggg atataccgta 1080
tgcaggtcaa agggaaagat cgtctaggca ttcagcccgt gccacagcat gatattgcca 1140
ttcatttaaa acaagccgaa gaaaaaggtg aaaacctccc tgtatcaatt gctttaggat 1200
gtgaacctgc gattgttaca gcagccgcta cgccgcttca ttacgatcaa tctgagtatg 1260
aaatggcagg agctattcaa ggtgagccgt acagaattgt gaagtctcag ctttctgatt 1320
tagatgtacc ttggggagca gaagtgattt tagagggaga aattttagct ggtgaacgtg 1380
aatatgaagg tccttttggc gaatttacag gtcattactc aggcggcaga agcatgcctg 1440
ttatcaaaat caatcatgta taccatcgca aagatcctat ttttgaaagt ttatatatcg 1500
gtatgccttg gacagaaaca gattatttaa ttggaattaa tacaagcgtt cctttatatc 1560
agcagctaaa agaagcatat cctgaagaga ttgaagctgt gaatgcgatg tatactcatg 1620
gtctcgttgc tatcatttca acgaaaagcc gatacggagg atttgctaag gcggttggta 1680
tgagggcatt gactacgccg catggattag gatattgcaa gctagttatt ttagtagacg 1740
aagatgtgga tccgtttaat ttaccgcaag tcatgtgggc gctatcaaca aaaatgcacc 1800
caaaacacga tgttataaca gtgcctaatc tttcagttct gccacttgat ccaggatctg 1860
agccggctgg tattacagat aaaatgattt tggatgctac aacaccagtt gcaccggaaa 1920
caagaggcca ctattctcag cctttagata caccacttga aactgaaaaa tgggaaaaaa 1980
tcttaacgaa tatgatgcaa aaataaacaa ggaggaatcg acatgcatac ttgtccaaga 2040
tgtgaagcca aacaagcgaa cttagtatct aaatcaccag ttgaaggagc ctgggagatt 2100
tacttatgca acgtgtgttt gtttacctgg cgttcttctg aacctgagac catcaccaat 2160
cctgaaaaat accctcgacc atttaaagtc aatccaaaag acgtaccgct ggcaacgcac 2220
gtgcctcctg tgccaccccg atcttaa 2247
<210> 11
<211> 2252
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 11
atgaacatca tcgtcggaat cacgggcgcg accggcgcgg tatttggcgt gcggatgctg 60
gagtggctga agaaaaccga cgcagagaca caccttgtca tctctccgtg ggcagcggca 120
acgatcctgc acgaaacggg atatacgatg aaagacgtgg aaaagctcgc atcttttacg 180
tattcccaca aagaccaggc ggcccgcatt tcaagcggtt cctttcaaac ggacggaatg 240
attgtcgcac cgtgcagtat gaagacgttg gcgggcatcc gcaccggtat ggcggataac 300
ctcttgaccc gttcggcgga cgtcatgctg aaggaacgga aaaagctcgt tctgttaaca 360
agggagacgc cgctgaacca gattcatctt gaaaacatgc ttgagctgac aaaaatgggg 420
gcggtgatcc tgccgccgat gccggctttt tataatcatc cccaaaatct gaccgaaatg 480
gtcgatcata tcgtatttcg gacgctggac caatttggca tccatctgtc tgaagcgaag 540
cgctgggaag gtatgaaaca ggagaaataa ggaggataac agaatggctt atcaagattt 600
tagagatttt ttaaatacgc tgaaaaaaga aggacagctt cttgaagtcc aggaagaggt 660
gaagccggaa cccgatttgg gagcagctgc acgcgccgcc aacaacctcg gagacaaatc 720
acccgctctt ttattcaaca acatttacgg ctataacaat gcccaaatcg cgctgaatgt 780
aatcggctcc tggccgaacc acgcattaat gctcggcctt ccaaaagaca cgccggttaa 840
agaacaattc tttgagttcg cgcgccgtta taatcagttt ccagtaaaag tgcaaagaga 900
ggagacagcg ccgtttcacg aaaacgaaat cacagaagac atcaacctgt ttgacattct 960
gccgctcttc cgcatcaatc agggcgacgg cggcttttat ttagacaagg catgcgtcat 1020
ttcgagagat gtcgaggatc cggaccactt cggcaagcaa aacgtcggca tgtacagatt 1080
gcaggtaaaa ggcaaagacc gcctcggcat tcagcccgtc ccgcagcatg acattgcgat 1140
ccacctgcgt caggctgaag agcgcggcga aaacctgcct gtcacgattg cgctcggctg 1200
cgaaccggtt attgcaacgg cggcatccac accgctctta tacgatcaat cagaatacga 1260
gatggcaggg gccctgcaag gcgaaccata taaaatcgtc aaatcaaaac tgtctaactt 1320
agatatccca tggggcgcag aagtggttct cgaaggtgag atccttgcgg gcgaacgcga 1380
gtatgaaggt ccgttcggcg agtttaccgg ccactattca ggcggacgaa gcatgccgat 1440
catcaaaatc aagcgcgtct gccaccgcaa caatccgatt tttgaacacc tgtatttagg 1500
catgccttgg actgaggttg actatatggt cggcattaat acatgtgtgc cgctttacca 1560
gcagcttaaa gaggcgtatc cgaatgaaat tgtcgcggta aacgcgatgt atacgcacgg 1620
cttgatcgcc attgtatcaa cgaaaagccg ctacggcgga ttcgccaaag ccgtcggcat 1680
gcgcgcgctg acaactccgc acggcctcgg ctactgcaaa atggtgatcc tcgttgacga 1740
agacgtcgat ccgtttaacc tcccgcaagt gatgtgggca atctcaacga aaatgcatcc 1800
gaaacacgat gcagtcatca tcccggattt atccgttttg gcgctagatc caggttctga 1860
accggcggga atcacccaca aaatgatatt ggacgcgaca acgccggctg caccggaaac 1920
aaggggacac tattcacagc cgctcgattc ccctatagga acgaaagagt gggaagcaaa 1980
attaatgaat ctgctaaatc aataaaagag gagagtgttt catcatgcat acatgtccgc 2040
gctgcgactt aaaaaaagcg gaaaccgtca gcaaatcacc cgttgaagga gcctgggaag 2100
tctatcaatg ccagcactgc tttttcactt ggaggtcatc agagccggag acgatcacaa 2160
atcctgaaaa atacaatccg gcctttaaaa tcgatcccgc tgaagttgaa acagctgtac 2220
aagtgccggc gattccagac cggaaaatct aa 2252
<210> 12
<211> 2249
<212> DNA
<213> 萎缩芽孢杆菌
<400> 12
atgaaactcg ttgtcgggat gaccggagct acaggggcta ttttcggagt caggctttta 60
gaatggctga aggccgcagg agcggaaact caccttgtcg tttctccttg ggctcatgtc 120
acaatcaaac atgaaacagg ttatagctta aaagaagttg aagagcttgc ctcatatacg 180
tactctcata aggatcaggc ggctgccatt tcaagcgggt cttttcaaac ggacggcatg 240
atcgtcgccc cgtgcagtat gaagtcgctc gcaagcattc gcacggggat ggcggacaat 300
ctgttgaccc gggctgcaga tgtcatgctg aaagagagaa aaaagcttgt cctgctgacg 360
agagaaacgc cgcttaacca gattcattta gagaatatgc tcgcattaac aaagatggga 420
accattattc ttccgccaat gccggctttt tataatcagc cggcaagtct ggatgaaatg 480
gtggaccata ttgtattcag aacgctggat caattcggca ttcgccttcc tgaggcaaaa 540
cgctggaatg gaattgaaaa agaaaaagga ggagcttgat catggcttat caagatttca 600
gagaatttct cgctgccctg gaaaaagagg gacagctatt aaaagtggat gaagaggtga 660
agccggagcc ggatttagga gccgcagccc gcgcagccaa caacctcggc gataaaagcc 720
cggctctttt atttaacaat atttacggct acaacaatgc acaaatcgcg atgaatgtca 780
tcggttcttg gccgaaccac gcgatgatgc ttggcttgcc gaaagataca ccggtgaaag 840
agcagttttt tgaatttgcg aagcgatatg aacagtttcc gatgccggtc aaacgcgaag 900
aaactgcacc atttcatgaa aatgaaatca cagaggacat caacctgttc gatctattgc 960
ctcttttcag aattaaccag ggtgacggcg gctattattt agataaagcg tgtgtcattt 1020
cccgtgatct ggatgaccct gacaatttcg gcaagcagaa cgtcggaatt taccggatgc 1080
aggtaaaagg gaaagaccgc ctcggcattc agccagttcc gcagcatgac atcgcgattc 1140
atcttcgcca agcagaagaa cgcggcgtca atcttccggt cactatcgcg cttggctgtg 1200
agcctgtcat tacgaccgcg gcgtcaactc cgctcctata tgaccaatca gaatacgaaa 1260
tggcgggagc gatccaaggc gaaccgtata gaatcgtcaa atcaaacctg tctgaccttg 1320
atattccttg gggcgcagaa gtcgtgcttg aaggagaaat cattgccgga gaacgggaat 1380
atgaaggacc gttcggcgaa tttaccggcc attattcagg cggacgcagc atgccgatta 1440
tcaaaatcaa acgcgtatct catagaaatc atccggtatt tgaacattta tatctcggca 1500
tgccttggac agagtgcgat tacatgatcg gcattaatac atgcgtgccg ctttatcagc 1560
agctgaaaga agcatatccg agtgaaattg tcgctgtgaa cgcaatgtac acacatggct 1620
taatcgccat tgtatctgca aaaacccgtt acggaggatt tgcaaaagct gtcggaatga 1680
gagccctgac tacaccgcac ggactcggct actgtaagat ggtgatcgtc gtggatgaag 1740
atgttgatcc gttcaacctc ccgcaagtca tgtgggcgct ttcaacaaag atgcatccga 1800
agcatgatgc cgtaaccatt cctgatttat ccgtgctgcc gcttgatccg ggatcagacc 1860
catccggcat tactcataaa atgattctcg atgccacaac gcctgttgcg ccggaaacaa 1920
gaggccatta ttcacagccg cttgactctc ctttaacaac aaaagaatgg gaacaaaaac 1980
taatggactt gatgaataaa taagagaaag gatgatctga catgcataca tgtcctcgat 2040
gtgattcaaa aaagggagaa atcatgagca aatcgcctgt agaaggcgct tgggaagtct 2100
accaatgtca aacgtgtttc ttcacatgga gatcatgtga accggaaagc attacaaacc 2160
cgaaaaaata caatccatca tttaagatcg atccgaagga aacagaaaca gctgttgaag 2220
tgccggctgt tccggaaaga aaggcctga 2249
<210> 13
<211> 2283
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌枯草亚种
<400> 13
atgaaagcag aattcaagcg taaaggaggg ggcaaagtga aactcgttgt cggaatgaca 60
ggggcaacag gggccatttt cggggtcagg ctgctgcagt ggctgaaggc cgccggagtg 120
gaaacccatc tcgttgtgtc tccttgggca aacgtcacga tcaaacacga aacaggctat 180
acgttacaag aagtagaaca actggccaca tacacttact cacataagga tcaggcggca 240
gccatttcaa gcgggtcgtt tgataccgat ggaatgattg ttgcgccgtg cagcatgaaa 300
tctctcgcaa gcattcgcac aggaatggcg gataatctgc tgacacgtgc ggcggatgtc 360
atgctcaagg agagaaaaaa actcgtcctc ttaacgagag agacgccttt gaaccaaatt 420
catctcgaaa atatgctagc gcttacgaaa atgggcacca tcattcttcc tccgatgccg 480
gcattttata atcggccgag aagcttagag gaaatggttg accatattgt ttttagaacg 540
ttggaccaat tcggcattcg gcttcctgaa gcgaagcgct ggaatgggat tgaaaaacaa 600
aaaggaggag cttgatcatg gcttatcaag atttcagaga atttctcgct gcccttgaaa 660
aagaaggaca gctgcttaca gtgaatgaag aggtaaagcc ggaaccggat ttaggggcct 720
ccgcacgggc agccagcaat cttggcgata aaagccctgc gctcttattt aacaacattt 780
acggctatca taacgcgcga attgcgatga atgtcatcgg ctcttggcca aaccatgcca 840
tgatgctggg catgccgaaa gacacaccgg taaaagaaca gttttttgaa ttcgcaaagc 900
gttatgacca gtttccgatg ccggtcaaac gtgaggaaac agcgccattt catgaaaatg 960
aaatcacaga agatatcaat ttgttcgata tactgcctct tttcagaatt aaccagggtg 1020
atggaggcta ctatttagac aaagcatgtg tcatttcccg tgatcttgag gaccctgaca 1080
acttcggcaa acaaaatgtc ggcatttaca gaatgcaagt caaaggaaaa gaccgccttg 1140
gcattcagcc tgtcccgcag cacgatattg caatccatct gcgccaagct gaagaacgcg 1200
gcatcaacct tccggtcact attgcgctcg gctgtgagcc ggtcattaca acggcggcat 1260
cgactccgct tctctatgat caatcagaat acgaaatggc aggtgcgatt caaggcgaac 1320
catatcgcat cgtcaaatca aagctgtctg atcttgatgt tccgtggggc gctgaagtgg 1380
tgcttgaagg tgagattatt gccggagagc gcgaatatga agggccgttc ggtgaattca 1440
caggccatta ttccggcgga cgcagcatgc cgattatcaa aattaaacgc gtctatcaca 1500
gaaacaatcc gatctttgaa catttatact taggcatgcc ttggacagaa tgcgattaca 1560
tgatcggcat taacacatgc gtgccgcttt atcagcagtt aaaagaagcg tatccgaacg 1620
aaattgtggc agtgaacgcc atgtacacac acggtttaat cgcgattgtt tccacaaaaa 1680
cccgctatgg cggatttgcg aaagcggtcg gcatgcgcgc actcacaacg ccgcacggac 1740
tcggctactg caaaatggtc atagtcgttg atgaggatgt cgatccattc aaccttccgc 1800
aggtcatgtg ggcgctttcg accaaaatgc atccgaaaca tgatgcggtc atcattccgg 1860
acttatctgt cctgccgctt gatccgggat ccaatccatc aggaatcact cacaaaatga 1920
ttctcgacgc cactacaccg gttgcgccgg aaacaagagg ccattattca cagccgcttg 1980
attctccgct aacaacgaaa gaatgggaac aaaaactaat ggacttaatg aataaataag 2040
gaaaggatgt tcgaaatgca tacatgtcct cgatgcgact caaaaaaggg agaagtcatg 2100
agcaaatcgc ctgtagaagg cgcatgggaa gtttatcagt gccaaacatg cttttttaca 2160
tggagatcct gtgaaccgga aagcattaca aatcccgaaa aatacaatcc agcgtttaaa 2220
attgatccaa aggaaacaga aacagcaatt gaagttccgg cggtgccgga acgaaaggct 2280
tga 2283
<210> 14
<211> 2283
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌斯氏亚种
<400> 14
atgaaagcag aattcaagcg taaaggaggg ggcaaagtga aactcgttgt cggaatgaca 60
ggggcaacag gggctatttt cggggtcagg ctgctggagt ggctgaaggc ggccgaagta 120
gaaacccatc tcgtcgtgtc tccttgggct aacgtcacga tcaaacacga aacaggctat 180
accttaaaag aagtagaaca acttgccaca tacacgtatt cgcataagga ccaggcggca 240
gccatttcaa gcgggtcgtt tgataccgat ggcatgattg ttgcgccatg cagcatgaaa 300
tctctcgcaa gcattcgcac cgggatggcg gataatctgc tgacgcgtgc ggcggatgtc 360
atgctcaagg agagaaaaaa actcgtcctc ttaacgagag agacgccttt gaaccagatt 420
catctcgaaa atatgctagc gcttacgaaa atgggtacca tcattcttcc tccgatgccg 480
gcattttata atcagccgag cagcttagag gaaatggttg accatattgt attcagaacg 540
ttggaccaat tcggcattcg ccttcctgaa gcgaaacgct ggaatgggat tgaaaaacaa 600
aaaggaggag cttgatcatg gcttatcaag atttcagaga atttctcgct gcccttgaaa 660
aagaaggaca gctgctaaca gtgaatgaag aggtaaagcc ggagccggat ataggggctg 720
cagcacgcgc agccagcaat cttggcgata aaagccccgc gctcttattt aataacattt 780
atggctatca caacgcgcaa attgcgatga atgtgatcgg ctcctggccg aaccatgcaa 840
tgatgctggg catgccgaaa gacacgccgg tgaaagaaca gttttttgaa tttgcgaaac 900
gttatgacca gtttccgatg ccagtcaaac gtgaggaatc agcgccgttt catgaaaatg 960
aaatcacaga agatatcaat ttgttcgata tactgcctct tttcagaatt aaccaaggag 1020
acggcggtta ctatctagac aaagcatgtg tcatttcccg cgatcttgaa gatcctgaga 1080
atttcggcaa acaaaacgtc gggatttaca gaatgcaggt caaaggaaaa gaccgccttg 1140
gcattcagcc tgtgccgcag cacgatattg cgatccatct gcgtcaagct gaagaacgcg 1200
gcatcaatct tccggtcacc attgcgctcg gctgtgagcc ggtcataaca acggcggcat 1260
cgactccgct tctttatgat caatcagaat acgaaatggc aggcgcaatt caaggtgaac 1320
catatcgcat cgtgaaatct aagctgtctg atcttgatgt tccatggggc gctgaagtag 1380
tgcttgaagg tgaaatcatt gccggagagc gtgaatatga aggcccgttc ggtgagttca 1440
caggccatta ttccggcgga cgcagcatgc cgattattaa aattaaacga gtgtatcata 1500
gaaacaatcc gatttttgaa catttatact taggcatgcc ttggacagaa tgcgattaca 1560
tgattggcat taacacttgt gtgccgcttt atcagcagtt aaaagaagcg tatccgaatg 1620
aaattgtggc tgtgaacgcc atgtacacac acggtttgat cgcgattgtt tccacaaaaa 1680
cacgctatgg cggatttgcg aaagcagtcg gcatgcgcgc gctcacaaca ccgcacggac 1740
tcggctactg caaaatggtc attgtcgttg acgaggatgt cgatccattc aatctgccgc 1800
aggtcatgtg ggcgctttcg accaaaatgc atccgaagca cgatgcggtc atcattccag 1860
acttatctgt cctgccgctt gacccgggat ctaatccatc aggaatcact cacaaaatga 1920
ttcttgacgc cactacaccg gttgcgccgg aaacaagagg ccattattca cagccgcttg 1980
attcaccatt aacaacgaaa gaatgggaac aaaaactaat ggacttaatg aataaataag 2040
aaaaggatga tcgaaatgca tatatgtcct cgttgcgatt cgaaaaaggg agaagtcatg 2100
agcaaatcgc ctgtagaagg cgcatgggaa gtttatcagt gtcaaacatg ttttttcaca 2160
tggagatcct gtgagccgga aagtattaca aatccggcga aatacaatcc agcgtttaaa 2220
attgatccga aggaaacaga aacagcaatt gaagttccgg ctgtgccgga acgaaaggct 2280
tga 2283
<210> 15
<211> 2268
<212> DNA
<213> 产气肠杆菌
<400> 15
atgaaactga ttattgggat gaccggggcg accggcgcgc cgttaggcgt cgcgctgtta 60
caggcgctga atgaaatgcc ggatgtggaa acgcatctgg tcatgtcgaa atgggcaaaa 120
accaccattg agctggaaac gccctatagc gctcgtgatg tcgccgcgct ggcggacttc 180
tgccatagcc ctgcggatca ggccgcgacc atctcatcag gatcgtttcg taccgacggc 240
atgattgtta tcccctgcag catgaaaacg ctggcgggta ttcgcgctgg ctatgcggaa 300
gggttagtcg gccgcgcggc ggacgtggtg ctgaaagagg ggcgcaagct ggttctggtg 360
ccgcgtgaaa tgccgctgag caccattcat ctggagaaca tgctggcgct gtcgcgcatg 420
ggcgtggcga tggtgccgcc catgcctgcc tattacaacc acccggaaac ggtagaggat 480
atcaccaacc atatcgtgac ccgggtgctg gatcagtttg gtctcgaata tcacaaagcg 540
cgccgctgga acggcctgcg cgcggtcgag aatttatcac aggagaatta atcatggctt 600
ttgatgattt acgcagcttt ttgcaggcgc ttgatgagca ggggcaactg ctaaaaatta 660
gcgaagaggt gaatgccgag ccggatctcg ccgctgccgc taacgccaca gggcgcatcg 720
gtgacggcgc gccagcgttg tggtttgata acattcgcgg ctttaccgac gcccgtgtcg 780
ccatgaacac catcggttcc tggcaaaacc acgcgatttc gctggggctg ccgccaaaca 840
cgccggtgaa aaagcagatt gatgaattta ttcgccgctg ggataaattc ccggtaacgc 900
cggagcgtcg cgctaatcca gcgtgggcgg aaaacaccgt tgatggcgac gatatcaacc 960
tgttcgatat tctgccgctg ttccgcctga acgatggcga cggtggtttc tatctcgaca 1020
aagcctgtgt ggtttcgcgc gatccgcttg acccggacca ctttggcaaa cagaacgtcg 1080
gtatttaccg gatggaagtg aaaggcaagc gcaagctggg cctgcagccg gtaccgatgc 1140
acgatatcgc gctgcatctg cataaagcgg aagagcgcgg tgaggatctg cccattgcca 1200
tcaccctggg taacgacccg attattaccc tgatgggcgc gacgccgctg aaatatgacc 1260
agtcagaata tgagatggcg ggcgcgctgc gcgaaagccc gtatcccatc gccaccgcgc 1320
cgctgaccgg ctttgacgtt ccctggggct cagaggtgat ccttgaaggg gtgattgaag 1380
ggcgcaagcg tgaaatcgaa gggccgttcg gcgagttcac cggccactac tcaggcggcc 1440
gcaatatgac ggtggtgcgt atcgataaag tctcttatcg cacaaaaccg atttttgaat 1500
cgttgtatct cggaatgccg tggaccgaaa tcgactatct gatgggcccg gcgacctgcg 1560
tgccgctgta ccagcagctg aaggcggagt tcccggaggt gcaggcggtc aatgccatgt 1620
acacccatgg tctgctggcg attatctcca ccaaaaaacg ctacggcggt tttgcccgcg 1680
cggtgggatt acgggcaatg actaccccgc acggcctcgg ttacgtgaaa atggtgatca 1740
tggtcgatga agatgtcgat ccgttcaacc tgccgcaggt gatgtgggcg ctctcctcga 1800
aggtcaaccc ggcgggcgac ctggtacagt tgccgaacat gtcggtgctg gagcttgacc 1860
ctggttccag tccggcgggg atcaccgaca aactgattat cgacgccacc accccggttg 1920
cgcctgacct tcgcggtcac tacagccagc cggttcagga tttaccggaa accaaagcct 1980
gggctgaaaa actgaccgcc atgttggcca accgtaaata aggagaagaa gatgatttgt 2040
ccacgttgcg ctgatgagca gattgaagtg atggcgacgt cgccggtaaa aggggtgtgg 2100
atcgtttacc agtgccagca ctgcctctat acctggcgta ataccgaacc gctgcgtcgt 2160
accagccgcg aacattatcc ggaagcgttc cgcatgacgc agaaagatat tgatgaggcg 2220
ccgcaggtgc cgcatattcc accgctgttg gcggcagata agcgttaa 2268
<210> 16
<211> 2252
<212> DNA
<213> 阴沟肠杆菌
<400> 16
atgagattga tcgtgggaat gacgggagca acaggtgctc cgctgggtgt ggctttactg 60
caggcgttac gtgacatgcc agaggttgaa acccatctgg tgatgtcgaa atgggcgaaa 120
accaccattg agctggaaac gccttatacc gcgcaggatg tcgccgccct ggcagatgtc 180
gttcacagtc ctgccgatca ggctgccacc atctcctccg gctcgtttcg taccgacggc 240
atgatcgtca ttccctgcag catgaaaacg ctggcgggta tccgcgcggg ctatgccgaa 300
gggctggtgg gccgtgcggc agacgtggtg ctgaaagagg ggcgcaagct ggtgctggtc 360
ccgcgtgaaa cgccgctcag caccattcat ctggagaaca tgctcgcgct ttcccgcatg 420
ggggtggcga tggtgccgcc catgcctgcg tattacaacc acccgcaaac cgccgatgat 480
atcacccagc atatcgtgac ccgcgtactc gaccagtttg gtctggagca caaaaaggcg 540
cgtcgctgga acggcctgca ggcggcgaaa catttttcac aggagaataa cgatggcatt 600
tgatgatttg agaagcttcc tgcaggcgct agatgagcaa gggcaactgc tgaaaattga 660
agaagaggtc aatgcggagc cggatctggc ggcggccgct aacgcgacgg gacgtatcgg 720
tgatggtgcg cctgcgctgt ggttcgataa cattcgcggg tttaccgatg ccagggtggt 780
gatgaacacc atcggctcct ggcagaacca cgccatttcg atggggctgc cggcgaatac 840
cccggtcaaa aagcagatcg atgagtttat tcgccgctgg gataaattcc cggtcgcacc 900
ggagcgccgg gccaaccccg catgggcgca gaatacggtg gacggtgagg agattaacct 960
gttcgacatc ctgccgctgt ttcgcctgaa cgacggggac ggcggttttt atctcgacaa 1020
agcgtgcgtt gtctcgcgcg atccgctcga cccggaccat ttcggcaagc agaacgtcgg 1080
tatttaccgc atggaagtga agggcaaacg taagctcggc ctgcagccgg tgccgatgca 1140
tgatatcgcc ctgcatctgc ataaagccga agagcgtggt gaagacctgc cgattgcgat 1200
tacgttgggc aacgatccga tcatcaccct gatgggcgca acgccgctga aatacgatca 1260
gtccgagtat gaaatggccg gggcgctgcg tgaaagcccg tacccgattg cgaccgcgcc 1320
gttgaccggc ttcgatgtgc cgtgggggtc tgaagtgatc ctggaagggg tgattgaagg 1380
ccgtaaacgt gaaattgaag ggccgttcgg tgagtttacc gggcactatt cgggcggacg 1440
caatatgacg gtggtccgta ttgataaagt ctcgtaccgc accaaaccga ttttcgaatc 1500
cctctatctc gggatgccct ggaccgagat cgactacctg atggggccag ccacctgtgt 1560
gccgctttac cagcaactga aagcggagtt ccctgaagtg caggcggtga acgcgatgta 1620
tacccacggt ctgctggcga tcatctccac caaaaaacgc tacggtggtt ttgcccgcgc 1680
ggtcggttta cgcgccatga ccacgccgca tggcctgggc tatgtgaaga tggtgattat 1740
ggtggatgaa gatgtcgatc cgttcaacct gccgcaggtg atgtgggcgc tgtcatcaaa 1800
agtgaacccg gcaggggatc tggtgcagct gccgaacatg tcggttcttg agcttgatcc 1860
tgggtccagc ccggcaggca tcaccgacaa gctgattatt gatgccacca cgcctgttgc 1920
gccggataac cgcggtcact acagccagcc ggtgcaggat ttacctgaaa ccaaagcctg 1980
ggctgaaaag ctgactgcga tgctggcagc acgccaataa ggaggaaaag atgatttgtc 2040
cacgttgtgc cgatgagcaa attgaggtga tggccacatc accggtgaaa gggatctgga 2100
cggtttatca gtgccagcat tgcctgtata cctggcgcga tactgagccg ctgcgtcgta 2160
ccagccgcga acattaccct gaagcgttcc gcatgacgca gaaggatatt gatgaggcgc 2220
cgcaggtacc gaccattccg ccattgctgt aa 2252
<210> 17
<211> 2284
<212> DNA
<213> 阪崎肠杆菌
<400> 17
atgaggctaa ttgtcggaat gacgggcgca accggcgcgc cgcttggggt cgcgctgttg 60
caggcgctga aagcgatgcc tgaggtggaa acccatctgg tgatgtcaaa gtgggcgaaa 120
accacgatcg aactggaaac gccgttctcc tggcaggatg tcgcggggct ggcagatgtg 180
gtgcacagcc cggcggatca ggccgcgacg atctcctcag gatcgtttcg caccgacggc 240
atggtgatca ttccgtgcag catgaaaacc ctggcgggca tccgcgcggg ctacgccgac 300
gggctggtgg gccgcgccgc tgatgtggtg ctgaaagaga accgtaaact ggtgctggtg 360
ccgcgcgaaa caccgcttag caccattcat ctggaaaacc tgctggcgct ctcgaagatg 420
ggcgtggcca tcgtgccgcc catgcccgcc tggtacaacc atcccgcgac gatcgacgac 480
atcatcaacc atatcgtcgc gcgcgtgctc gatcagttcg ggctcgatgc ccgcaacgcc 540
cgccgctggc aggggctaaa tcctgcgaaa acagccgaca cccattcatc acgaggagga 600
aacacgcatg gcgtttgacg atctgcgcag ctttttgcag gcgcttgaag agcaggggca 660
actgctgagg atcagcgaag aggtgcaggc ggagccggat atcgcggcgg ccgccaacgc 720
gaccggacgc atcggcgaag gcgcgcccgc gctctggttt gacaatatcc gcggctttac 780
tgacgcgcgg gtggcgatga acaccattgg ttcatggccg aaccacgcga tctcgctcgg 840
tctgccgcct gccacaccgg taaagcagca gatagaagaa tttattcgcc gctgggatac 900
cttcccggtc gcgccggaac gccgcgataa tccgccatgg gcggaaaaca gcgtcgacgg 960
cgacgacatt aacctgttcg acattctgcc gctgtttcgc ttaaacgacg gcgacggcgg 1020
gttctacctt gataaagcgt gtgtggtctc gcgcgatccg ctcgatcccg aacacttcgg 1080
caagcagaat gtcggcatct accggatgga agtgaaaggc aagcgcaagc tcgggctgca 1140
accggtgccg atgcatgaca tcgcgctgca tctgcataag gccgaagagc gtggcgagga 1200
tttgccggtt gcgattacgc ttggcaacga tccgatcatc acgctgatgg gcgccacgcc 1260
gctgaaatac gatcagtcgg aatatgaaat ggcgggcgcg ctgcgcgaaa gcccgtaccc 1320
gatagccacc gcgccgctga ccggtttcga cgtgccgtgg gggtcggaag tgatccttga 1380
aggggtgatt gaaggacgca agcgcgagat agaagggccg ttcggcgagt ttaccgggca 1440
ctactccggc gggcgtaaca tgaccgtggt gcgtatcgat aaagtctctt atcgcaccaa 1500
accgattttc gaatcgctct atctcggcat gccgtggacc gaaatcgact acctgattgg 1560
cccggcgacc tgcgtgccgc tttaccagca gcttaaagcg gagttcccgg aagtgcaggc 1620
ggtgaacgcg atgtataccc acgggctgct cgcgattatc tccaccaaga aacgctacgg 1680
cggtttcgcc cgcgcggtgg gcctgcgtgc gatgaccacg ccgcacgggc ttggctacgt 1740
gaagatggtg attatggtgg atgaggatgt cgatccgttc gatctgccgc aggtgatgtg 1800
ggcgctgtcg tcaaaagtga acccggcggg cgatctggtg cagttgccga atatgtcggt 1860
gctggagctt gatcctggct caagcccggc ggggattacc gacaagctga ttatcgacgc 1920
cactacgccg gttgcgccgg ataaccgcgg gcattacagc cagccggtga aagacctgcc 1980
ggaaaccccg cagtgggtag agaagctgac cgccatgctg gctaaccgta aaaaataagg 2040
agacgagatg atttgtccac gttgtgccga tgaaaccatc gaaatcatgg cgacgtcgcc 2100
ggtgaaaggc gtctggacgg tgtatcagtg ccagcattgt ttgtacacct ggcgcgacac 2160
cgagccgctg cgccgtacca gccgcgagca ttaccccgag gcgttccgga tgacgcaggc 2220
cgatatcgat aacgcgccgg aagtgccaac ggtgccgccg ctgctggcgg atggtaagcg 2280
ttaa 2284
<210> 18
<211> 2252
<212> DNA
<213> 霍氏肠杆菌
<400> 18
atgagattga ttgtgggaat gacgggcgcg acgggtgcgc cattaggcgt ggcgttgttg 60
caggcgctgc gggaaatgcc ggaggtggaa acgcacctgg tgatgacgaa gtgggcaaaa 120
accacgattg agctggaaac gcccttcact gcgcatgacg ttgctgcact ggcggatgtc 180
gtccacagtc cggccgatca ggctgccacc atctcctccg gctcgtttcg caccgacggc 240
atgatcgtca tcccgtgcag catgaaaacg ctggcgggga tccgcgcggg ctacgccgaa 300
gggctggtag ggcgtgcggc agacgtggtg ctgaaagagg gacgcaagct ggtgctggtt 360
ccccgcgaga cgccgctcag caccattcat cttgagaaca tgcttgccct ttcccgcatg 420
ggcgtggcga tggtgccgcc tatgcctgcg tactacaacc acccgcaaac cgccgatgac 480
attacccagc atatcgtgac ccgcgttctc gaccagtttg gtctggagca taaaaaagcc 540
cgacgctggg aaggtttgca ggcagcgaaa catttttcac aggagaataa agatggcatt 600
tgatgatttg agaagcttct tgcaggcgct cgatgagcaa gggcagctgc tgaaaattga 660
ggaagaggta aacgcggagc cggatttagc ggcggccgcc aacgctaccg ggcgcattgg 720
cgatggcgcg cctgcgctgt ggttcgataa tattcgcggc ttcaccgatg cccgagtggt 780
gatgaacacc atcggctcgt ggcaaaacca cgccatttcg atggggctgc cagcgaatac 840
ttcggtgaaa aaacagatcg acgagtttat tcgtcgctgg gacaaattcc ccgtcacgcc 900
agagcgtcgt gccaatcctg cctgggcgca gaacacggtg gacggagaag atatcaacct 960
gttcgacatt ttgccgctgt tccgcctgaa cgacggtgac gggggctttt atctcgataa 1020
agcgtgcgtt gtctcccgcg atccgctcga ccccgaccac ttcggcaagc agaacgtcgg 1080
catttaccgt atggaagtga agggcaagcg taagctcggc ctgcaaccgg tgccgatgca 1140
tgatattgcg ctgcatctgc ataaggcaga agagcgtggc gaagacctgc ccattgccat 1200
tacgctgggt aacgatccga tcatcaccct gatgggcgcc acgccgctga aatacgatca 1260
atccgagtat gagatggctg gcgcgctacg cgaaagcccg tatccgattg cgacggctcc 1320
gctgaccggt tttgatgtgc cgtgggggtc ggaagtgatc ctggaagggg tgattgaagg 1380
ccggaaacgt gaaattgaag gaccattcgg tgagtttacc ggacactact ctggcgggcg 1440
caacatgacc gttgtgcgca ttgataaagt ctcttaccgc accaaaccca ttttcgaatc 1500
tctctacctg gggatgcctt ggaccgagat tgattatctg atgggacccg ccacctgcgt 1560
gccgctctat cagcaactga aggcggaatt cccggaagtg caggcggtaa acgccatgta 1620
cacccacggt ctgctggcaa ttatctccac taaaaagcgt tacggcggtt ttgcccgtgc 1680
ggtcgggcta cgcgccatga ccacaccgca cggtctgggt tacgtgaaga tggtgattat 1740
ggtggatgaa gatgtcgatc cgtttaacct gccgcaggtc atgtgggcgc tttcatcgaa 1800
ggttaatccg gcgggcgatc tggtgcagct tccgaatatg tctgtgctgg aacttgaccc 1860
tggctccagc ccggcgggga tcaccgacaa gctgatcatt gatgccacca cccctgttgc 1920
cccggacaac cgtggtcact acagccagcc ggtacaggac ctccctgaaa ccaaagcctg 1980
ggccgaaaaa ctgaccgcga tgctggcagc acgtcaataa ggaggaaaaa atgatttgtc 2040
cacgttgtgc cgatgaacat attgaagtaa tggcaacatc accggtgaaa ggtgtctgga 2100
cggtatatca gtgccagcac tgtctgtata cctggcgcga taccgaaccg ctacgccgta 2160
ccagccgcga gcattacccg gaagccttcc gcatgacgca gaaggatatt gatgaggcgc 2220
cgcaggtgcc aacaatcccg ccgctgctgt aa 2252
<210> 19
<211> 2268
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 19
atgaaactga tcgtcgggat gacaggggct accggtgcgc ctcttggtgt ggcattactg 60
caagcgctgc gggagatgcc gaatgtcgag actcatctgg tgatgtcgaa gtgggcgaaa 120
accaccattg aactggaaac gccttacagc gctcgcgatg ttgctgccct cgcagacttc 180
agccataacc cggcggatca ggcggcgatc atctcatccg gttcttttcg taccgacggc 240
atgatcgtta ttccgtgcag tatgaaaacg ctcgccggta tccgcgctgg ttacgccgat 300
ggcctggtag ggcgcgcggc ggacgtcgtg ctcaaagaag gccgcaaact ggtgctggtg 360
ccgcgtgaaa tgccgcttag caccatccat ctcgaaaata tgctcgcact ttcacgcatg 420
ggcgtggcga tggtgccgcc gatgcctgcc ttttataacc atcccgaaac ggtagatgac 480
attgtccacc atgtggtagc ccgcgtgctg gatcaatttg gcctcgaaca tccccacgcc 540
aggcgctggc aaggattgcc gcaggcccgg aatttttctc aggagaatga ataatggcat 600
ttgatgattt acgcagcttt ttacaggcgc ttgatgacca cggccagtta ctgaaaatca 660
gcgaagaagt gaacgccgag ccggatctgg cagcagcagc taacgccacc gggcgtatcg 720
gcgacggcgc gcccgcgctg tggtttgata atattcgcgg ctttaccgat gcccgcgtgg 780
cgatgaacac catcggttcc tggcagaacc acgcgatttc cctcggcctg ccgccaaatg 840
ccccggttaa aaagcagatt gatgagttta tccgccgctg ggataacttc ccgattgccc 900
cggagcgccg cgccaatcca gcctgggcgc agaacaccgt tgatggcgac gagatcaacc 960
tgttcgatat cctgccgctg tttcgtttaa acgatggcga tggcggtttc tatctcgaca 1020
aagcgtgcgt ggtttcccgc gatccgctcg acccggataa cttcggcaag cagaacgtcg 1080
gcatctaccg catggaagtg aagggcaagc gtaagctcgg cctgcaaccg gtgccgatgc 1140
acgatatcgc cctgcatctg cataaagcag aagagcgcgg tgaagatctg ccgattgcga 1200
tcacgctcgg taacgatccg atcatcacgc tgatgggggc cacgccgctg aaatatgatc 1260
agtccgagta cgaaatggca ggcgcgctgc gtgaaagccc gtacccgatc gccaccgccc 1320
cgttgaccgg ttttgatgtg ccgtggggtt cagaagtgat cctcgaaggg gtcatcgaaa 1380
gccgtaaacg cgaaatcgaa gggccgttcg gtgagtttac cgggcactac tccggcgggc 1440
gtaacatgac cgtggtgcgc atcgataaag tctcttaccg caccaggccg attttcgaat 1500
cgctgtacct cggtatgccg tggaccgaaa tcgactacct gatggggcca gccacctgcg 1560
tgccgctgta tcagcagctg aaagccgagt tccctgaagt gcaggcggta aacgccatgt 1620
acacccatgg cctgctggcg attatctcca ccaaaaaacg ctacggcggc tttgcccgcg 1680
cggtgggcct gcgcgcaatg accacgccgc atggtctggg ctacgtgaag atggtgatta 1740
tggtcgatga agacgttgac ccgttcaacc tgccgcaggt gatgtgggcg ctctcctcga 1800
aagtgaaccc ggcaggggat ttggtgcagt tgccgaatat gtccgtgctg gaactcgatc 1860
caggctcaag ccctgcgggg atcaccgaca agctgattat cgacgccact acgcctgtcg 1920
ccccggacaa ccgtggtcac tacagccaac cggtggtgga tttaccggaa accaaagcct 1980
gggctgaaaa actgaccgct atgctggctg cacgtaaata aggagaagaa gatgatttgt 2040
ccacgttgtg ccgatgaaca gattgaagtg atggcgaaat cgccggtgaa agatgtctgg 2100
acggtatatc agtgccagca ttgcctttat acctggcgcg ataccgaacc gctgcgccgt 2160
accagccgcg aacattatcc cgaagcgttc cgcatgacgc agaaagatat tgatgacgcg 2220
ccaatggtgc cgagcatccc gccgctgctg gtggaaggta agcgctaa 2268
<210> 20
<211> 2268
<212> DNA
<213> 费格森埃希菌
<400> 20
atgagactga tcgtcgggat gacaggggcc accggagcgc ctcttggtgt ggcattactg 60
caagcgctgc gggagatgcc gaatgtcgag actcatctgg tgatgtcgaa gtgggcgaaa 120
accaccattg aactggaaac gccttacaac gcccgcgatg ttgctgccct cgcagacttc 180
tgccataacc cggcggatca ggccgcaacc atctcctcag gttcctttcg taccgacggt 240
atgatcgtta ttccgtgcag tatgaaaacg ctcgccggta tccgcgctgg ttacgccgat 300
ggcctggtag ggcgcgcggc ggacgtcgtg ctcaaagaag gccgcaaact ggtgctggtg 360
ccgcgtgaaa tgccgcttag caccatccat ctcgaaaata tgctcgcact ttcgcgcatg 420
ggcgtggcga tggtgccgcc gatgcctgcc ttttataacc atcccgaaac ggtagatgac 480
attgtccacc acgtggtagc ccgcgtgctg gatcaatttg gcctcgaaca tcctcacgcc 540
aggcgctggc aaggattgcc gcaggcccgg aatttttccc aggagaatga ataatggcat 600
ttgatgattt acgcagcttt ttacaggcgc ttgatgacta cggtcagtta ctgaaaatca 660
gtgaagaagt gaacgccgag ccggatctgg cagccgctgc caacgccacc gggcgtatcg 720
gcgacggtgc accggcgctg tggtttgaca atattcgcgg ctttaccgat gcccgcgtgg 780
caatgaacac catcggctcc tggcagaacc acgcgatttc cctcggcctg ccgccaaaca 840
ccccggttaa aaaacagatt gatgagttta tccgccgctg ggataacttt cccattgccc 900
cggagcgccg tgcgaatccg gtctgggcgc agaacaccgt cgatggcgac gagattaatt 960
tgttcgatat tctgccgctg tttcgtttaa acgatggcga tggcggtttc tatctcgaca 1020
aagcgtgcgt ggtttcccgc gatccgctcg acccggataa tttcggcaag cagaatgtcg 1080
gcatctaccg catggaagtg aagggcaagc gtaagctcgg cctgcaaccg gtgccgatgc 1140
acgatatcgc cctgcatctg cataaagcag aagagcgcgg tgaagatctg ccgattgcga 1200
tcacgctcgg taacgatccg atcatcaccc tgatgggggc caccccgctg aaatacgatc 1260
aatcagagta cgaaatggct ggcgcactac gcgaaagccc gtacccgatc gccaccgccc 1320
cgctgaccgg ttttgatgtg ccgtggggct cagaagtgat cctcgaaggc gttatcgaaa 1380
gccgtaaacg cgagattgaa gggccgttcg gtgaatttac cggccactac tccggcgggc 1440
gcaacatgac cgtagtgcgc atcgataaag tctcttaccg caccaaaccg atttttgaat 1500
cgctctatct cggtatgccg tggaccgaaa tcgactacct gatggggcca gccacctgtg 1560
tgccgctgta tcagcaactg aaagccgagt tcccggaagt gcaggcggtg aacgccatgt 1620
acacccacgg cctgctggcg attatctcca ccaaaaaacg ctacggcggc tttgcccgcg 1680
cggtgggcct gcgtgcgatg accacgccgc acggtctggg ctacgtgaag atggtgatta 1740
tggtcgatga agacgttgat ccgttcaacc tgccgcaggt gatgtgggcg ctttcgtcga 1800
aagtgaaccc ggcaggggat ctggtgcagt tgccgaatat gtcagtactg gaactcgacc 1860
ctggctcaag cccggcgggg atcaccgata agctgattat cgacgccact acgcctgtcg 1920
ccccggacaa ccgtggtcac tacagccagc cggtggtgga cttaccggaa accaaagcct 1980
gggctgaaaa actgaccgct atgctggccg cacgtaaata aggagaacaa gatgatttgt 2040
ccacgttgtg ccgatgaaca gattgaagtg atggcgaaat cgccggtgaa agatgtctgg 2100
acggtctacc agtgccagca ttgcctttat acctggcgcg atactgaacc gctacgccgc 2160
accagccgcg aacattaccc gcaagcgttc cgtatgactc aaaaagatat tgatgacgcg 2220
ccaatggtgc cgagcattcc gccgctgctg gcggcagata agcgctaa 2268
<210> 21
<211> 2304
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌
<400> 21
atgaagaaaa tcattgtagg aatatcggga gcgacagggt caatctttgg tatccgtata 60
ttgcaaaaat tacgggaggc tggagtccaa agccatctgg tgctatcccc gtgggctatt 120
gccaacattc cctatgagac aggctacacg gtgaaggatg tgaaggcaat ggcggatgca 180
gtctactcgt ataaggatca ggccgcacgt atttctagcg gctccttccg ggtagatggt 240
atggtcgtcg ctccttgcag tatgaagact cttgcctcta ttcgtatcgg tatggcggac 300
aacctgctta cccgatcagc ggatgtgata ctgaaggagc gaaagaagct gctgctcatg 360
accagagaaa caccattaag cagtatccat ctggaaaata tgctggagct gtcacgtatg 420
ggcgtgatga tcctgccgcc gatgcctgcc ttttataatc atcctgcaag tatcgaggaa 480
ttagtggatc atattgtttt tcgcgcattg gatcagttcg gtattgtcac aaccgcagcc 540
aaacgctggg atgggatgaa gcagaatgac tccaggctgc accagaattg agaaatcgaa 600
agacgaagga gaatgaatga tggcttataa agactttcgc gattttctac acaccttgga 660
aaaggaggga caattactca cgatcagcga tgaggtaaag ccggagccgg acctcgcagc 720
agctaacaga gcattaaaca atcttggaga taagacgcct gctctctttt tcaacaacat 780
ctatggatat acggatgctc gtattgcaat gaatgtgatg ggctcctggc ccaatcatgc 840
cctcatgatg ggaatgccca aaaatacgcc gctcaaggag cagttttttg aatttgccag 900
acgctatgaa caatttccgg tgcccgtgaa gcgggaagaa gccgctcctt ttcatgaagt 960
cgaaattacg gagaatatta atttgtttga tattttgccg ttgtttcgtt tgaatcaggg 1020
ggacggaggg ttttatttgg ataaagcaat tctaatttca cgcgatctgg atgacccgga 1080
cacctacggt aagcaaaatg tcggcttata ccggatgcag gtgaaaggca agaaccgttt 1140
gggcatccag cctgtaccac agcatgatat tgcgatccat atccgtcagg ctgaggagcg 1200
tggcgaaaat ctgaaggtgg ctattgccct cggatgtgag cctgtgatta caacggctgc 1260
ttctacgcca ctgctgtacg atcaatccga atatgagatg gcgggcgcca ttcagggcga 1320
gccttatcgt gtggtcaaag cgaaggatgc agatctggat ctgccttggg gagccgaggt 1380
cattttggaa ggcgaagtgt tagcaggtga acgtgagtat gaaggtccat tcggtgaatt 1440
cacaggtcac tattccggcg gtcgcgcgat gccagtcatt cagattaatc gtgtatatca 1500
ccgcaaacag cctatctttg agcatctgta catcgggatg ccttggacgg aaacggatta 1560
tatgatcggt gtgaatacaa gtgtaccgtt gtttcagcag cttaaggatg cttttcctaa 1620
tgaaatcgta gctgttaatg ccatgtatac gcatgggctg gtcgctatta tttccacgaa 1680
aacccggtat ggcggctttg cgaaggctgt gggaatgcgt gcgttaacga ctccgcatgg 1740
attggggtat tgcaagctgg tgattgtggt ggacgaggag gtcgatccgt tcaatctgcc 1800
gcaagtcatg tgggctttat ccaccaagct tcatccaaag catgatgctg tcattgttcc 1860
tggcttgtct attttaccgc ttgaccccgg ctctgatccg gcaggtatga cgcacaaaat 1920
gatactggat gcgacgacac ctgtagcacc ggatattaga ggccattact cgcagccgct 1980
cgattccccg ctgggtgtag cggaatggga gaaaaagttg agccaaatgc ttcgctaaat 2040
atttttaaaa acaaagaaaa tttaaaggag tgctgacaga tgcatatttg tccccgttgt 2100
gagtccaatc gttcagaagt cgtttcccat tcgccggtta aaggtgcctg ggaggttttg 2160
ttgtgccctg tatgcctgtt cacatggcga acctcagaac cggatagcat tactgatcca 2220
gcaaagtata aatcggcgtt caaggtaaac ccccaagata ttccggatgc tgctcatgtt 2280
cctcctattc cagagcggat atag 2304
<210> 22
<211> 2268
<212> DNA
<213> 克氏柠檬酸杆菌
<400> 22
atgagactga ttgtggggat gaccggcgca acgggggcgc cgctaggcat tgcgctgcta 60
caggcgctgc ggcaaatgcc gacagtagaa acacacctgg taatgtctaa gtgggccaaa 120
acgaccattg agctggaaac gccttacagt gcgcgagatg ttgccggact ggctgattac 180
tgccataacc cggcggatca ggcggcgacg atctcttccg gctcatttcg caccgacggc 240
atgatcatta tgccttgcag tatgaaaacg ctggcgggga ttcgcgcagg atatgccgag 300
gggttagttg gccgtgccgc cgatgtggtg ctgaaagaag ggcgcaaact ggtgctggtg 360
ccgcgtgaaa tgccgctcag cacgatccat ctggaaaaca tgctcgccct ttcccgcatg 420
ggggtcgcga tggtgccgcc catgcctgct ttctacaacc atccgcaaac tattgatgat 480
attacgcagc atattgtggc gcgtgtgctg gatcagtttg gtctggagca tccgcgtgcc 540
cggcgctggc aggggttgca gcaggcgcag aatttttcac aggagaatga ataatggcat 600
ttgatgactt acgcagcttt ttgcaggcgc tcgacgagca ggggcaactg ctgaaaatca 660
gtgaagaagt gaatgcagag ccggatctgg ctgctgcggc taacgcaacc gggcgcattg 720
gcgacggcgc gcctgcgctg tggttcgata atatccgtgg cttcacggat gcgcgcgtgg 780
cgatgaacac cattggttcc tggcagaacc atgccatctc tttaggcttg ccgcctaatg 840
cgccagtaaa aaagcaaatt gatgaattta tccgccgctg ggacacgttc cccgtcgccc 900
ccgagcgccg agccaacccg gcgtgggcgg aaaacaccgt tgatggcgag gcgatcaacc 960
tgtttgatat tctgccgctg tttcgcctca acgatggcga tggcggcttc tatctggata 1020
aagcctgtgt cgtctcccgc gatccgctcg acccggatca cttcggcaag cagaatgtgg 1080
gtatctaccg gatggaagtg aaaggcaagc gcaagctggg cctgcaaccg gtgccaatgc 1140
acgatatcgc gctgcatctg cataaggcgg aagagcgtgg cgaagatctg ccgattgcta 1200
ttacgctcgg taacgatccg atcatcactc tgatgggcgc cacgccgctg aaatacgatc 1260
agtctgagta tgaaatggcg ggcgcgctgc gcgaaagccc atacccgatc gccaccgcgc 1320
cgctgaccgg ctttgatgtg ccgtggggtt cagaagtgat ccttgaaggg gtgatcgaaa 1380
gccgtaagcg tgaaattgaa gggccgtttg gcgagtttac cggccactat tctggtgggc 1440
gcaatatgac ggtggtgcgc atcgacaaag tgtcttatcg cactaaaccg atttttgaat 1500
cactctatct ggggatgccg tggactgaaa tcgactacct gatggggcca gcgacctgtg 1560
tgccgctgta tcagcagttg aaagcggaat tcccggaagt gcaggcggtt aacgccatgt 1620
atacccacgg tctgctggcg attatctcga ccaaaaaacg ctacggcgga tttgcccgcg 1680
cgatcggcct gcgggcaatg accacgccgc acggtctggg ctatgtgaag atggtgatta 1740
tggttgatga ggatgtcgat ccgttcaacc tgccgcaggt gatgtgggcg ctgtcgtcga 1800
aggtcaaccc ggcaggcgat ctggtgcagc tgccgaacat gtcggtgctg gaactggacc 1860
caggctcaag cccggcgggg atcactgaca aactgatcat cgacgccaca acgccggttg 1920
cgccggataa tcgcggccac tacagccagc cggtatgtga tttaccggaa accaaagcct 1980
gggctgaaaa gctgactgcc atgctggcca accgtaaata aggagtagca gatgatttgt 2040
ccacgttgtg ctgatgaaca tattgaattg atggcgacct ctccggtcaa agggatctgg 2100
acggtgtatc agtgccagca ttgtctgtac acctggcgtg ataccgagcc gctacgccgt 2160
accagccgtg aacattatcc gcaagcgttt cgcatgacgc agaaagatat tgatcaagcg 2220
ccgatggtgc cgggcattcc accgctgctg gcggaagata agcgttaa 2268
<210> 23
<211> 2318
<212> DNA
<213> 菠萝泛菌
<400> 23
atgagtagat tactgttaat ttcattcgta cacgaacgtt atttgcaagg aagtcagatg 60
agaattgtaa tcggtatgac gggagcaaca ggtgcccctt taggggtggc tctgctcagc 120
attttgcagg aaatcaaaga ggttgaaact catctgattt tgagcaagtg ggctaaaacc 180
acaattgaac tcgaaacgcc tttttcatcg cgtgaggtga tgagcatggc tgatgttgtg 240
tatggcccgt ccgaccaggc cgctactctc tcgtcaggtt cttttcacac cgatgggatg 300
gtcattattc cttgcagtat gaaaacctta gcgggaattc gcatgggata cgcggaaggc 360
cttattggac gggctgctga tgtcgtcatt aaagaaggca gaaaacttgt gctggtcccc 420
agagagacgc ctctcagcac cattcacctg gaaaatatgc tagccctttc ccgtcttggc 480
gtatccatgg ttccgcccat gcccgctttt tataaccacc ccgcagtaat tgatgatgtg 540
atcgatcatg tcgtttctcg tgttctcgac cagtttggga ttgcctcgcc aaaggcaaat 600
cgctggaaag gcctgaacaa ttctaagaaa tccctgagta tggagagtaa ataatggctt 660
ttgatgacct acgtagcttc cttaaggctc tggacgagca ggggcagctt cttgagattg 720
atgaagaggt tttacccgaa cctgatattg ccgcggccgc taatgctaca ggccgaattg 780
gtgaaggtgc accggcaatc tcattcaaaa aaataaaggg gttcaatcat gctcatgttg 840
tgatgaacac tattggttcc tggcaaaacc atgcaatttc actgggcctc ccaatgaata 900
ccccagtgaa acagcagata gatgaattca ttcgtcgctg ggacactttt cctgtggcac 960
cagagcggcg cgacaatgcg ccctggtcag aaaataccgt tgattgtgaa gagatcaatc 1020
tcttcgacat ccttcccctg ttccgcctga acgacggcga cggcggtttc tatcttgata 1080
aggcctgcgt agtatcacgt gacccgcttg atccagaaca tttcggtaag caaaacgtcg 1140
gcatttaccg gatggaggtg aaaggtaaac gtaaactcgg gctccagccc gtgccgatgc 1200
atgacattgc acttcatctc cataaggccg aagaacgcgg cgacgatctg ccagtggcta 1260
ttacgctggg caatgacccc attattacat tgatgggcgc cacgccgctg aaatacgacc 1320
agtcagaata tgagatggca ggtgcgctgc gtgaaagccc gtaccccatc gcctccgcgc 1380
ctctgaccgg ctttgatgtg ccgtggggat cggaagtcat tcttgaaggc gtgatagaag 1440
ggcgcaaacg tgagattgaa ggaccgtttg gcgaattcac cggccattat tccggcggtc 1500
gcaatatgac cgttgtgcgg attgataagg tctcctaccg cactaagcca atattcgagt 1560
cattgtatct gggaatgccc tggaccgaaa ttgattatct gatgggcccg gcaacctgtg 1620
tccctttgta tcaacagctg aaagcggatt tccctgaggt gcaggctgta aatgcaatgt 1680
atacacacgg attactggcc attatttcta caaagaaacg ttatggtgga tttgcccgtg 1740
ctgtaggcgt acgggcgatg acaaccccgc atggtctggg ctacgtcaag atggtgatca 1800
tggtcgatga ggatgtcgat ccctttaacc tgcctcaggt gatgtgggcg ctgtcttcaa 1860
aggtcaatcc gcaaggcgat ctcgttcaac tgccaaacat gtccgtactg gaactggacc 1920
cgggttccag ccctgcggga atcacggata aacttgtgat cgatgcgacg actcccgtgg 1980
caccggatac ccgcggccac tacagtcagc cggtaaaaga cctgccagaa acttcaatct 2040
gggttgagaa gttaacgtcc ctgttatcaa atcgcggtta aggagaaagt atgatttgtc 2100
cacgttgtgc tgatgaacac attgaaatca tggcaacatc cccagttgag gggatatgga 2160
cggtgcatca gtgtcagcat tgcctgtaca catggcgcaa tacagagcca gcccgaagaa 2220
cggagcggga acattatcct gaagccttcc ggatgactca acgtgatatt gataatgcgc 2280
cggaagtccc gtctgtccct cctctgttag ctaagtaa 2318
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 24
ctctcatatg acagcatcac cttggg 26
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
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ctctcatatg tcatcttaac gacgctccat tc 32
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<212> DNA
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ggaattccat atggacggca taactaatcg catc 34
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<212> DNA
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<223> 扩增引物
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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ttattttaca tatgtcatct gccatcccaa cgtg 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgtggcgca tatggtcatc attaccctcc cgtc 34
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<211> 44
<212> DNA
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<223> 扩增引物
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gaggcccggg atgacagaac aaccatatga tttaagaaaa gtac 44
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<212> DNA
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<400> 39
actccccggg ctaaacgcgg ttgttcacac 30
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<212> DNA
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<223> 扩增引物
<400> 40
aggcagtact atgagtgaac aaccttatga tttacgtaaa g 41
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<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
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atgaagtact ttatttagca taggtaacca cttggg 36
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
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ctctcatatg ttaagatcgg ggtggcaca 29
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<400> 48
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<212> DNA
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<400> 49
acatacagtt catatggatc aagcctttcg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctctcatatg aaagcagaat tcaagcgtaa ag 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
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ctctcatatg tcaagccttt cgttccgg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 52
ctctcatatg aaactgatta ttgggatgac cg 32
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<212> DNA
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<400> 53
ctctcatatg ttaacgctta tctgccgcc 29
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<213> 人工序列
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ctctcatatg ttacagcaat ggcggaatgg 30
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<212> DNA
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<400> 56
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<212> DNA
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<400> 57
ctctcatatg ttaacgctta ccatccgcc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 58
ctctcatatg agattgattg tgggaatgac 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 59
ctctcatatg gagtctggtt tagttctctg c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 60
ctctcatatg aaactgatcg tcgggatg 28
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 61
ctctcatatg ttagcgctta ccttccgc 28
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 62
ctctcatatg agactgatcg tcgggat 27
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
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<400> 63
ctctcatatg ttagcgctta tctgccgc 28
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 64
ctctcatatg aagaaaatca ttgtaggaat atcgg 35
<210> 65
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 65
ctctcatatg ctatatccgc tctggaatag g 31
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 66
ctctcatatg agactgattg tggggatg 28
<210> 67
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 67
ctctcatatg ttaacgctta tcttccgcca g 31
<210> 68
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 68
ctctcatatg agtagattac tgttaatttc attcgtac 38
<210> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 69
ctctcatatg ttacttagct aacagaggag gg 32
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 70
ctctctgcag catcgttgct gaatgtccag 30
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 71
gatcaacgat ctgttcagct g 21
<210> 72
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 扩增引物
<400> 72
agctgaacag atcgttgatc agaactgatc ctgcaccctg 40
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 73
ctctgagctc gttgatgtca atgcgcagag 30
PCT/RO/134表
Figure 0000011

Claims (7)

1.一种棒状细菌的转化体，其特征在于，是在宿主棒状细菌中导入选自以下的基因而得到的：
(1)鼠李糖乳杆菌的脱碳酸酶基因ubiD、
(2)乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、埃希菌属、类芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属和泛菌属中的所述(1)的基因的种间同源基因、以及
(3)编码与所述(1)或(2)的基因编码的酶的氨基酸序列的一致性为70％以上且具有脱碳酸活性的酶的基因，
其中，在宿主棒状细菌的儿茶酚-1,2-双加氧酶基因catA和原儿茶酸脱氢酶基因pcaHG中导入突变，所述两基因编码的酶的功能降低或功能缺失。
2.根据权利要求1所述的转化体，其具有儿茶酚生产能力。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的转化体，其中，
所述转化体进一步导入有编码具有3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶活性的酶的基因和编码具有3-脱氢奎尼酸合酶活性的酶的基因中的至少一种。
4.根据权利要求1～权利要求3中任一项所述的转化体，其中，
宿主棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869。
5.一种谷氨酸棒状杆菌CAT21株(保藏编号：NITEBP-02689)转化体。
6.一种儿茶酚的制造方法，其特征在于，包括：
使权利要求1～权利要求5中任一项所述的转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液、或还原条件的反应液中反应的工序；以及
回收反应培养基中的儿茶酚的工序。
7.根据权利要求6所述的儿茶酚的制造方法，其中，包括：
使用权利要求1～权利要求5中任一项所述的转化体，在反应液中由选自葡萄糖、果糖、纤维二糖、木二糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糊精、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和可溶性淀粉中的糖类变换为儿茶酚，并从该反应液回收儿茶酚。
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