JP7317810B2 - コリネ型細菌の形質転換体およびそれを用いる有用化合物の製造方法 - Google Patents
コリネ型細菌の形質転換体およびそれを用いる有用化合物の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7317810B2 JP7317810B2 JP2020517022A JP2020517022A JP7317810B2 JP 7317810 B2 JP7317810 B2 JP 7317810B2 JP 2020517022 A JP2020517022 A JP 2020517022A JP 2020517022 A JP2020517022 A JP 2020517022A JP 7317810 B2 JP7317810 B2 JP 7317810B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- seq
- catechol
- ubid
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 58
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 title claims description 51
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 4
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 242
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 124
- 101150085844 ubiD gene Proteins 0.000 claims description 82
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 36
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 35
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 28
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 claims description 22
- 101150003433 ubiX gene Proteins 0.000 claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 20
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 claims description 15
- 101100488070 Bacillus subtilis (strain 168) bsdC gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101100399603 Lactiplantibacillus plantarum (strain ATCC BAA-793 / NCIMB 8826 / WCFS1) lpdC gene Proteins 0.000 claims description 13
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 12
- 241000671338 Corynebacterium glutamicum R Species 0.000 claims description 9
- 241000186684 Lactobacillus pentosus Species 0.000 claims description 9
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 8
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 8
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims description 8
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 8
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims description 8
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 7
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 claims description 7
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 7
- 241000179039 Paenibacillus Species 0.000 claims description 7
- 241000193410 Bacillus atrophaeus Species 0.000 claims description 6
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 6
- 235000005744 Bacillus subtilis subsp subtilis Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000948854 Bacillus subtilis subsp. subtilis Species 0.000 claims description 6
- 108010066997 Catechol 1,2-dioxygenase Proteins 0.000 claims description 6
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 claims description 6
- 241000588917 Citrobacter koseri Species 0.000 claims description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 6
- 241000488807 Lactobacillus pobuzihii Species 0.000 claims description 6
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 claims description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 6
- 108010080376 3-Deoxy-7-Phosphoheptulonate Synthase Proteins 0.000 claims description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000933456 Lactobacillus composti Species 0.000 claims description 5
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 claims description 5
- 241000588696 Pantoea ananatis Species 0.000 claims description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 3
- 101100462570 Bacillus subtilis (strain 168) bsdB gene Proteins 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 3
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 3
- LGQKSQQRKHFMLI-SJYYZXOBSA-N (2s,3r,4s,5r)-2-[(3r,4r,5r,6r)-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)OC1 LGQKSQQRKHFMLI-SJYYZXOBSA-N 0.000 claims description 2
- 108010055053 3-dehydroshikimate dehydratase Proteins 0.000 claims description 2
- LGQKSQQRKHFMLI-UHFFFAOYSA-N 4-O-beta-D-xylopyranosyl-beta-D-xylopyranose Natural products OC1C(O)C(O)COC1OC1C(O)C(O)C(O)OC1 LGQKSQQRKHFMLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SQNRKWHRVIAKLP-UHFFFAOYSA-N D-xylobiose Natural products O=CC(O)C(O)C(CO)OC1OCC(O)C(O)C1O SQNRKWHRVIAKLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 2
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 claims 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 23
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 23
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 23
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 18
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 12
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 9
- JSPANIZMKMFECH-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate dihydrate Chemical compound O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O JSPANIZMKMFECH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 9
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 9
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 9
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 9
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 9
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 9
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 7
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 101150074745 ubiH gene Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 5
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 4
- 241001135265 Cronobacter sakazakii Species 0.000 description 4
- 241000901842 Escherichia coli W Species 0.000 description 4
- 241000588720 Escherichia fergusonii Species 0.000 description 4
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108030003477 Protocatechuate decarboxylases Proteins 0.000 description 4
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 229940092534 citrobacter koseri Drugs 0.000 description 4
- 229940045505 klebsiella pneumoniae Drugs 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000043309 Enterobacter hormaechei Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 3
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019037 Bacillus subtilis subsp spizizenii Nutrition 0.000 description 2
- 241000381330 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Species 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- XNEFHYFPRJBTJF-UHFFFAOYSA-N Dehydroshikimic acid Chemical compound OC1C=C(C(O)=O)CC(=O)C1O XNEFHYFPRJBTJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108091033411 PCA3 Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100002724 Thermus thermophilus aroH gene Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 101150076125 aroG gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- TXXHDPDFNKHHGW-CCAGOZQPSA-N cis,cis-muconic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C=C\C(O)=O TXXHDPDFNKHHGW-CCAGOZQPSA-N 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- TXXHDPDFNKHHGW-UHFFFAOYSA-N muconic acid Chemical class OC(=O)C=CC=CC(O)=O TXXHDPDFNKHHGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IBGBGRVKPALMCQ-UHFFFAOYSA-N 3,4-Dihydroxybenzaldehyde Natural products OC1=CC=C(C=O)C=C1O IBGBGRVKPALMCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050006180 3-dehydroquinate synthase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 1
- 241000909293 Corynebacterium alkanolyticum Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100539304 Escherichia coli (strain K12) ubiH gene Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241001104360 Lactobacillus composti DSM 18527 = JCM 14202 Species 0.000 description 1
- 241001204812 Lactobacillus hokkaidonensis Species 0.000 description 1
- 241001104462 Lactobacillus rhamnosus DSM 20021 = JCM 1136 = NBRC 3425 Species 0.000 description 1
- 241001103835 Lactobacillus sakei subsp. sakei DSM 20017 = JCM 1157 Species 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241001440680 Pantoea ananatis LMG 20103 Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000132152 Polymyxa Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050008280 Shikimate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010036453 anthranilate 2,3-dioxygenase(deaminating) Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- -1 biotin and thiamine Natural products 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
- C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
- C12Y113/11001—Catechol 1,2-dioxygenase (1.13.11.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01054—3-Deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (2.5.1.54)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01063—Protocatechuate decarboxylase (4.1.1.63)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
- C12Y402/03004—3-Dehydroquinate synthase (4.2.3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
カテコールは香料、重合防止剤、抗酸化剤、医薬品、農薬の合成原料として使用される。また、レジスト(プリント基板製造時に塗布する感光性の樹脂)の剥離剤、脱酸素剤(活性炭吸着剤)、メッキ処理剤の原料として使用される。
カテコールは、主にフェノールを原料として酸化反応により製造されている。しかし、上述の低炭素社会実現に向け、再生可能資源からの製造が切望されている。
カテコールは、微生物の代謝経路上に存在する。ベンゼンからの2段階の酸化又はジヒドロキシ安息香酸に対する脱炭酸反応によりカテコールが生成する。その後カテコールはオルト開裂またはメタ開裂によって分解が進み、TCA回路に組み込まれる。
本開示は、一態様において、糖類を原料として、効率よくカテコールを製造できる微生物、及び、この微生物を用いて効率良くカテコールを製造する方法を提供する。
(1)Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ubiD、
(2)Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属における前記(1)の遺伝子のオーソログ、及び
(3)前記(1)又は(2)の遺伝子がコードする酵素とのアミノ酸配列の同一性が70%以上であり、かつ、脱炭酸活性を有する酵素がコードされた遺伝子
からなる群から選択される遺伝子が導入された形質転換体であって、
宿主コリネ型細菌のカテコール1,2-ジオキシゲナーゼ遺伝子catA、及び、プロトカテク酸ジオキシナーゼ遺伝子pcaHGに変異が導入され、前記2遺伝子がコードする酵素が機能低下又は機能欠損している、コリネ型細菌の形質転換体に関する。
本開示は、その他の一態様において、本開示に係るコリネ型細菌形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも1つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中のカテコールを回収する工程とを含むカテコールの製造方法に関する。
該所定の脱炭酸酵素を発現させることでプロトカテク酸の脱炭酸反応が亢進し、カテコールの生産性が向上すると推定される。ただし、本開示はこのメカニズムに限定されなくてもよい。
本開示によれば、一態様において、カテコールの生産濃度及び/又は収率を向上させうる。
本開示において、所定の脱炭酸酵素を導入する宿主は、コリネ型細菌である。
本開示において、コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔BargeysManual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599(1974)〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacteriumglutamicum)、コリネバクテリウム エフィシェンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム ハロトレランス(Corynebacterium halotolerance)、コリネバクテリウム アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)等が挙げられる。中でも、安全でかつキシロオリゴ糖の利用能が高い点で、コリネバクテリウム グルタミカムが好ましい。
好適な菌株として、コリネバクテリウム グルタミカムR株(FERMP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等が挙げられる。中でも、R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
これらの菌株は、微生物保存機関であるNBRC(NITEBiological Resource Center)、ATCC(American Type Culture Collection)などで入手可能である。
また、これら微生物は、自然界に存在する野生株だけでなく、その変異株、又は遺伝子組換え株であってもよい。
これらの変異は、宿主として使用するコリネ型細菌にあらかじめ導入されていてもよく、本開示に係る形質転換体を製造する過程でこれらの変異を導入してもよい。
また、カテコールの生産性を向上する観点から、宿主のコリネ型細菌として、プロトカテク酸の産生が向上するような遺伝子改変株を使用してもよい(例えば、国際公開 WO2017/169399)。
本開示において、宿主であるコリネ型細菌に導入される脱炭酸酵素は、プロトカテク酸に対する脱炭酸活性を有する酵素であることが好ましい。
コリネ型細菌にプロトカテク酸に対する脱炭酸活性を有する酵素を導入する形態として、下記(1)~(3)の遺伝子のいずれかを導入することが挙げられる。
(1)Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ubiD。
(2)Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属における前記(1)の遺伝子のオーソログ。
(3)前記(1)又は(2)の遺伝子がコードする酵素とのアミノ酸配列の同一性が70%以上であり、かつ、脱炭酸活性を有する酵素がコードされた遺伝子。
本開示において、遺伝子の導入とは、一又は複数の実施形態において、該遺伝子が宿主内で発現可能に導入することをいう。
例えば、宿主コリネ型細菌にubiDX遺伝子を導入するには、適当なプロモーターを該遺伝子の5’-側上流に組み込むことが好ましく、加えてターミネーターを3’-側下流に組み込むことがさらに好ましい。
本開示において、Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ubiDは、一又は複数の実施形態において、LGG_02656若しくはLGG_RS12695としてNCBIなどのデータベースに登録される。
アミノ酸配列の同一性は、カテコールの生産性を向上する観点から、70%以上であって、75%以上が好ましく、80%以上がより好ましく、85%以上がさらに好ましい。
Lactobacillus rhamnosusのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiDX遺伝子として導入することが好ましい。 また、Lactobacillus rhamnosusのubiD遺伝子のオーソログを宿主コリネ型細菌に導入する場合も、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiD遺伝子とともにubiX遺伝子も宿主コリネ型細菌に導入されることが好ましく、ゲノムにubiH遺伝子があればubiD遺伝子及びubiX遺伝子とともにubiH遺伝子も宿主コリネ型細菌に導入されることが好ましい。
Lactobacillus plantarumのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合も、Lactobacillus pentosusと同様に、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiD遺伝子とともにubiHX遺伝子を導入することが好ましい。Lactobacillus plantarumのubiXH遺伝子及びubiD遺伝子の一又は複数の実施形態として、それぞれ、配列表の配列番号4及び5の塩基配列が挙げられる。
Lactobacillus pobuzihii及びLactobacilluscompostiのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合も、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiDX遺伝子として導入することが好ましい。Lactobacillus pobuzihii及びLactobacilluscompostiのubiDX遺伝子の一又は複数の実施形態として、それぞれ、配列表の配列番号6及び7の塩基配列が挙げられる。
Bacillus licheniformisのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Bacillus licheniformisのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号11の塩基配列が挙げられる。
Bacillus atrophaeusのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Bacillus atrophaeusのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号12の塩基配列が挙げられる。
Bacillus subtilis subsp. subtilisのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Bacillus subtilis subsp. subtilisのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号13の塩基配列が挙げられる。
Bacillus subtilis subsp. spizizeniiのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Bacillus subtilis subsp. spizizeniiのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号14の塩基配列が挙げられる。
Enterobacter cloacaeのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Enterobacter cloacaeのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号16の塩基配列が挙げられる。
Enterobacter sakazakiiのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Enterobacter sakazakiiのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号17の塩基配列が挙げられる。
Enterobacter hormaecheiのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Enterobacter hormaecheiのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号18の塩基配列が挙げられる。
Escherichia fergusoniiのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Escherichia fergusoniiのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号20の塩基配列が挙げられる。
Citrobacter koseriのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Citrobacter koseriのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号22の塩基配列が挙げられる。
Pantoea ananatisのubiD遺伝子を宿主コリネ型細菌に導入する場合、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiXDH遺伝子として導入することが好ましい。Pantoea ananatisのubiXDH遺伝子遺伝子の一又は複数の実施形態として、配列表の配列番号23の塩基配列が挙げられる。
本開示は、一態様において、宿主コリネ型細菌に上記(1)-(3)のいずれかの遺伝子が導入され、かつ、宿主ゲノムのカテコール1,2-ジオキシゲナーゼ(catA)及びプロトカテク酸デヒドロゲナーゼ(pcaHG)の2つの酵素が機能低下又は機能欠損している形質転換体に関する。
本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、カテコールを効率よく産生できる。
本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、カテコールの生産性を向上する観点から、ubiX遺伝子及び/又はubiH遺伝子が導入されていることが好ましい。
本開示に係る形質転換体は、カテコールの産生又はその効率化のために、さらなる遺伝子が導入されてもよく、遺伝子の欠失及び/又は変異が導入されもよい。
カテコール産生の効率化の一又は複数の実施形態として、プロトカテク酸の産生を向上する遺伝子の導入や破壊が挙げられる。プロトカテク酸の産生を向上する遺伝子の導入の一例として、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子(例えば、aroG)、及び/又は、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子(例えば、qusB)の導入が挙げられる。
本開示に係る形質転換体は、菌体増殖を伴わない反応液中で、糖類を原料として、カテコールを高効率で生産できる。
よって、本開示は、その他の一態様において、本開示に係るコリネ型細菌形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも1つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中のカテコールを回収する工程とを含むカテコールの製造方法に関する。
本開示に係る形質転換体の培養は、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。培養には、炭素源として、例えばグルコース又は廃糖蜜等を、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム又は尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出来る。また、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸ニ水素カリウム又は硫酸マグネシウム等を使用することが出来る。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸又はビオチンもしくはチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することも出来る。
培養は、通常、通気攪拌又は振盪等の好気的条件下、約20℃~約60℃、好ましくは、約25℃~約35℃の温度で行うことが出来る。培養時のpHは例えば5~10付近、好ましくは7~8付近の範囲であり、培養中のpH調整は酸又はアルカリを添加することにより行うことが出来る。培養開始時の炭素源濃度は、約1~20%(W/V)、好ましくは約2~5%(W/V)である。また、培養期間は通常1~7日間程度である。
回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いてもよい。前記菌体処理物としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものが挙げられ、例えば、菌体をアクリルアミド又はカラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。
本開示において、増殖しないことには、実質的に増殖しないこと、又は殆ど増殖しないことが含まれる。例えば、好気条件の反応では微生物の増殖に必須の化合物であるビオチン、チアミンなどのビタミン類、窒素源などの1種以上を欠乏、或いは制限させた反応液を用いることにより、形質転換体の増殖を回避又は抑制できる。
本開示においては、反応液に菌体又はその処理物を添加した直後からカテコールを採取するまで、還元条件を維持していることが好ましいが、少なくともカテコールを採取する時点で反応液が還元状態であればよい。反応時間の約50%以上、より好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約90%以上の時間、反応液が還元条件下に保たれていることが望ましい。なかでも、反応時間の約50%以上、より好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約90%以上の時間、反応液の酸化還元電位が約-200mV~-500mV程度に保たれていることがより望ましい。
具体的には、糖類としては、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトースもしくはマンノースなどの単糖類、セロビオース、ショ糖、ラクトースもしくはマルトースなどの二糖類、又はデキストリンもしくは可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。なかでも、グルコースが好ましい。
[1] 宿主のコリネ型細菌に、
(1)Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ubiD、
(2)Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属における前記(1)の遺伝子のオーソログ、及び
(3)前記(1)又は(2)の遺伝子がコードする酵素とのアミノ酸配列の同一性が70%以上であり、かつ、脱炭酸活性を有する酵素がコードされた遺伝子
からなる群から選択される遺伝子が導入された形質転換体であって、
宿主コリネ型細菌のカテコール1,2-ジオキシゲナーゼ遺伝子catA、及び、プロトカテク酸ジオキシナーゼ遺伝子pcaHGに変異が導入され、前記2遺伝子がコードする酵素が機能低下又は機能欠損している、コリネ型細菌の形質転換体。
[2] カテコール生産能を有する、[1]に記載の形質転換体。
[3] さらに、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、及び、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入された、[1]又は[2]に記載の形質転換体。
[4] 宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、[1]から[3]のいずれかに記載の形質転換体。
[5] 宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムR(FERMP-18976)、ATCC13032、又はATCC13869である、[1]から[4]のいずれかに記載の形質転換体。
[6] コリネバクテリウム グルタミカムCAT21株(受託番号:NITE BP-02689)。
[7] [1]から[6]のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも1つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中のカテコールを回収する工程とを含む、カテコールの製造方法。
[8] [1]から[6]のいずれかに記載の形質転換体を用いて、反応液中で、グルコース、フルクトース、セロビオース、キシロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトース、デキストリン、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース及び可溶性澱粉からなる群より選ばれる糖類からカテコールへ変換し、該反応液よりカテコールを回収することを含む、[7]に記載のカテコールの製造方法。
カテコール生産株の構築
(1) 染色体DNAの調製・入手
Corynebacterium glutamicum R(FERM P-18976)、Lactobacillus rhamnosus NBRC 3425、Lactobacilluspentosus JCM 1558、Lactobacillus plantarum NBRC 3070、Lactobacillus pobuzihii JCM 18084、Lactobacilluscomposti JCM 14202、Lactobacillus hokkaidonensis JCM18461、Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157、Bacillus megaterium JCM 2506、Bacilluslicheniformis JCM 2505、Bacillus atrophaeus JCM 9070、Bacillus subtilis subsp. subtilis NBRC 14144、Bacillus subtilis subsp. spizizenii NBRC 101239、Enterobacter aerogenes NBRC 13534、Enterobactercloacae NBRC 13535、Enterobacter hormaechei ATCC 49162、Escherichia coli W NBRC 13500、Escherichiafergusonii NBRC 102419、Paenibacillus polymyxa NBRC15309、Pantoea ananatis LMG 20103の染色体DNAは、菌株入手機関の情報に従って培養した後、DNAゲノム抽出キット(商品名:GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて調製した。Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894D-5、Citrobacterkoseri ATCC BAA-895D-5の染色体DNAは、ATCCより入手した。
目的の酵素遺伝子を単離するために用いたプライマー配列を表1に示す。PCRは、Veritiサーマルサイクラー(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ株式会社製)を用いた。
得られたDNA断片を、PgapAプロモーターを含有するクローニングベクター(pCRB209[国際公開 WO2012/033112]、pCRB210[国際公開 WO2012/033112])に導入した。尚、Lactobacillus pentosusおよびLactobacillusplantarumのubiD遺伝子とubiXH遺伝子は染色体上で異なる位置に配置されているため、別々にクローニングを行った後、同一プラスミドに乗せ換えた。
導入したクローニングベクターと得られたプラスミド名を表2に示す。
Corynebacterium glutamicum R株の染色体遺伝子をマーカーレスで破壊するために必要なDNA領域をPCR法により増幅した。各PCR断片はオーバーラップ領域により連結可能である。得られたDNA断片をマーカーレス遺伝子破壊用プラスミドpCRA725[J. Mol.Microbiol. Biotechnol. 8:243-254(2004)、(特開2006-124440)]に導入した。得られた染色体遺伝子破壊用プラスミドを表3に示す。
マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。プラスミドpCRA725に導入した染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチルス サブチリス(Bacillus subtilis)のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
上記方法により、上述したカテコール生産関連遺伝子染色体導入用プラスミド及び染色体遺伝子破壊用プラスミドを用いてPCA生産関連遺伝子染色体導入株を構築した。宿主菌株としてプロトカテク酸生産性コリネ型細菌Corynebacterium glutamicum PCA3株[国際公開 WO2017/169399]を使用した。また、pcaHG遺伝子破壊用プラスミドpCRG3[国際公開 WO2017/169399]、qsuB遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB295[国際公開 WO2017/169399]及びaroG(S180F)遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB285[国際公開 WO2017/169399]も使用した。尚、本染色体遺伝子組換えの概要は、表4および表5にまとめて示した。
上述の染色体遺伝子組換え株にプロトカテク酸脱炭酸酵素を導入することによりカテコール生産株を構築した。また、対照実験用としてpCRB22(Appl Microbiol Biotechnol. 2015Jun;99(11):4679-89)を使用した。尚、本生産株の概要は、表6にまとめて示した。
カテコール生産試験(試験管内、10mLスケール)
(プロトカテク酸分解経路破壊、カテコール分解経路破壊の組み合わせ)
コリネバクテリウム グルタミカムR株をベースとして構築した、カテコール生産株である、CAT91株(表5及び表6参照)を用いて、試験管を用いた好気バッチ反応におけるカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
CAT91株を終濃度50μg/mL カナマイシンと4%のグルコースを含んだA寒天培地[(NH2)2CO2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4・7H2O0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O、0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 1ml、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7g、寒天 15gを蒸留水1Lに溶解]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
上記のプレート上で増殖したCAT91株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだA液体培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O、0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 1ml、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
上記条件で増殖した株を、終濃度50μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだA液体培地10mlに初期菌体濃度OD610=0.5となるように懸濁し、200mgのCaCO3を加え33℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離(4℃,15,000×g、5分)し、培養上清液を得た。培養上清液中の代謝物質濃度は、高速液体クロマトグラフィーシステム(Prominence HPLC装置(島津製作所製)、COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II、移動相に10%メタノール、0.1%リン酸を用いて分離)により分析した。その結果、同株は48時間後、0.1mMのカテコールを生産した。
カテコール生産試験(試験管内、10mLスケール)
(プロトカテク酸分解経路破壊、カテコール分解経路破壊、DAHP合成酵素強化、プロトカテク酸合成酵素強化の組み合わせ)
CAT91株をベースとして構築した、カテコール生産株である、CAT92株(表5及び表6参照)を用いて、試験管を用いた好気バッチ反応におけるカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
CAT92株を終濃度50μg/mL カナマイシンと4%のグルコースを含んだA寒天培地[(NH2)2CO2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4・7H2O0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 1ml、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7g、寒天 15gを蒸留水1Lに溶解]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
上記のプレート上で増殖したCAT92株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだA液体培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 1ml、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
上記条件で増殖した株を、終濃度50μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだA液体培地10mlに初期菌体濃度OD610=0.5となるように懸濁し、200mgのCaCO3を加え33℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離(4℃,15,000×g、5分)し、培養上清液を得た。培養上清液中の代謝物質濃度は、高速液体クロマトグラフィーシステム(Prominence HPLC装置(島津製作所製)、COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II、移動相に10%メタノール、0.1%リン酸を用いて分離) により分析した。その結果、同株は24時間後、18.4mMのカテコールを生産した。
カテコール生産試験(試験管内、10mLスケール)
(様々な生物由来プロトカテク酸脱炭酸活性を持つ酵素をコードする遺伝子のカテコール生産に対する影響)
Corynebacterium glutamicum形質転換体によるカテコール生産におけるプロトカテク酸脱炭酸活性を持つ酵素をコードする遺伝子導入の効果を調べるため、プロトカテク酸生産株Corynebacterium glutamicum PCA3[国際公開WO/2017/169399]をベースとしてカテコール分解酵素をコードする遺伝子を破壊した株LHglc1367を構築した(表5)。この株に各遺伝子を組み込んだプラスミドを導入し、脱炭酸酵素導入株CAT01-CAT47を得た(表6)。それぞれのカテコール生産性を比較した。各株を終濃度50μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
上記のプレート上で増殖した各株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
上記条件で増殖した各株を、終濃度50μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlに初期菌体濃度OD610=0.5となるように植菌し、200mgのCaCO3を加え33℃にて24時間、好気的に振とう培養を行った。24時間後の培養液を遠心分離し(4℃,15000×g、5分)、得られた上清液について前記高速液体クロマトグラフィーシステムによりカテコールの定量分析を行った。結果を表7に示す。
なお、表7におけるアミノ酸配列の同一性は、LactobacillusrhamnosusのubiD遺伝子がコードするアミノ酸配列と、その他のubiD遺伝子がコードするアミノ酸配列との比較の結果である。
カテコール生産試験(ジャーファーメンター、400mLスケール)
(生産至適pHの検討)
CAT21株(表5~表7参照)を用いて、ジャーファーメンターを用いた好気バッチ反応におけるカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlに植菌後、33℃で18時間、好気的に振盪培養を行った。
CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地100mlに植菌後、33℃で12時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で増殖した菌体を遠心分離(4℃,3000×g,10分)により集菌し、得られた菌体を、1000ml容量のジャーファーメンター培養槽内の、終濃度50μg/mLカナマイシンと8%のグルコース、及び消泡剤(アデカノール L126)3g/Lを含有する培養液[(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 25μl、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]400mlにOD610=0.2となるように懸濁し、1000ml容量ジャーファーメンターにより33℃、5.0Nアンモニア水の添加によるpH維持制御、通気量0.4L/min(air、1vvm)、溶存酸素濃度(DO)10%(大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として)の条件において24時間通気撹拌培養を行った。培養上清液中の代謝物質濃度は、前記の高速液体クロマトグラフィーシステムにより分析した。その結果を表8に示す。
カテコール生産試験(ジャーファーメンター、400mLスケール)
(増殖非依存型の生産試験)
CAT21株(表5~表7参照)を用いて、ジャーファーメンターを用いた好気バッチ反応におけるカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlに植菌後、33℃で18時間、好気的に振盪培養を行った。
CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地100mlに植菌後、33℃で12時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で増殖した菌体を遠心分離(4℃,3000×g,10分)により集菌し、得られた菌体を、1000ml容量のジャーファーメンター培養槽内の、終濃度50μg/mLカナマイシンと8%のグルコース、及び消泡剤(アデカノール L126)3g/Lを含有する培養液[(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 25μl、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]400mlにOD610=0.2となるように懸濁し、1000ml容量ジャーファーメンターにより33℃、pH7.0(5.0Nアンモニア水の添加により制御)、通気量0.4L/min(air、1vvm)、溶存酸素濃度(DO)5%(大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として)の条件において18時間通気撹拌培養を行った。
カテコール生産試験(ジャーファーメンター)
(樹脂吸着の利用)
CAT21株(表5~表7参照)を用いて、ジャーファーメンターを用いた好気バッチ反応と樹脂吸着を組み合わせたカテコール生産実験を以下に述べる方法によって行った。
CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlに植菌後、33℃で18時間、好気的に振盪培養を行った。
CAT21株を終濃度50μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地100mlに植菌後、33℃で12時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で増殖した菌体を遠心分離(4℃,3000×g,10分)により集菌し、得られた菌体を、1000ml容量のジャーファーメンター培養槽内の、終濃度50μg/mLカナマイシンと8%のグルコース、及び消泡剤(アデカノール L126)3g/Lを含有する培養液[(NH4)2SO47g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、0.06%(w/v)FeSO4・7H2O + 0.042%(w/v)MnSO4・2H2O 1ml、0.02%(w/v)biotinsolution 25μl、0.01%(w/v)thiamin solution 2ml、yeast extract 2g、vitamin assay casamino acid7gを蒸留水1Lに溶解]400mlにOD610=0.2となるように懸濁し、1000ml容量ジャーファーメンターにより33℃、pH7.0(5.0Nアンモニア水の添加により制御)、通気量0.4L/min(air、1vvm)、溶存酸素濃度(DO)5%(大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として)の条件において18時間通気撹拌培養を行った。
コリネ型細菌が他の微生物より高いカテコール耐性を示すことの検証
コリネ型細菌Corynebacterium glutamicum,大腸菌Escherichia coli,酵母Saccharomyces cerevisiae,シュードモナスPseudomonas putida, ロドコッカスRhodococcus erythropolisについて、寒天培地上でのクロスストリークアッセイによりカテコールへの耐性を比較した。
Corynebacterium glutamicum R株およびATCC 13032株を4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃で15時間暗所に静置した。上記のプレート上で増殖したコリネバクテリウムグルタミカムを2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて13時間、好気的に振とう培養を行った。
Escherichia coli K-12 MG1655株をLB寒天培地[1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム、及び1.5%寒天]に塗布し、37℃、15時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したEscherichia coliをLB液体培地[1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、及び0.5%塩化ナトリウム]に植菌し、37℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
Saccharomyces cerevisiae NBRC2376株をYEPD寒天培地[2%ポリペプトン、1%酵母エキス、2%グルコース、及び1.5%寒天]に塗布し、30℃、20時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したSaccharomyces cerevisiaeをYEPD液体培地[2%ポリペプトン、1%酵母エキス、及び2%グルコース]に植菌し、30℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
Rhodococcus erythropolis ATCC 27854株を前記LB寒天培地に塗布し、30℃、15時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したRhodococcus erythropolisを前記LB液体培地に植菌し、30℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
Claims (9)
- 宿主のコリネ型細菌に、
(1)Lactobacillus rhamnosusの脱炭酸酵素遺伝子ubiD及びubiX、並びに
(2)Lactobacillus属、Bacillus属、Enterobacter属、Escherichia属、Paenibacillus属、Citrobacter属、及びPantoea属における前記(1)の遺伝子のオーソログ、
からなる群から選択される遺伝子が導入された形質転換体であって、
該形質転換体は、カテコール1,2-ジオキシゲナーゼ遺伝子catA及びプロトカテク酸ジオキシナーゼ遺伝子pcaHGがコードする酵素が機能欠損しており、
前記ubiD遺伝子のオーソログは、Lactobacillus pentosusのubiD遺伝子、Lactobacillus plantarumのubiD遺伝子、Lactobacillus pobuzihiiのubiD遺伝子、Lactobacillus compostiのubiD遺伝子、Bacillus megateriumのubiD遺伝子、Bacillus licheniformisのubiD遺伝子、Bacillus atrophaeusのubiD遺伝子、Bacillus subtilis subsp. subtilisのubiD遺伝子、Bacillus subtilis subsp. spizizeniiのubiD遺伝子、Enterobacter aerogenesのubiD遺伝子、Enterobacter cloacaeのubiD遺伝子、Enterobacter sakazakiiのubiD遺伝子、Enterobacter hormaecheiのubiD遺伝子、Escherichia coli WのubiD遺伝子、Escherichia fergusoniiのubiD遺伝子、Paenibacillus polymyxaのubiD遺伝子、Citrobacter koseriのubiD遺伝子、及びPantoea ananatisのubiD遺伝子からなる群から選択される、いずれかの遺伝子がコードする酵素のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子であり、
前記ubiX遺伝子のオーソログは、Lactobacillus pentosusのubiX遺伝子、Lactobacillus plantarumのubiX遺伝子、Lactobacillus pobuzihiiのubiX遺伝子、Lactobacillus compostiのubiX遺伝子、Bacillus megateriumのubiX遺伝子、Bacillus licheniformisのubiX遺伝子、Bacillus atrophaeusのubiX遺伝子、Bacillus subtilis subsp. subtilisのubiX遺伝子、Bacillus subtilis subsp. spizizeniiのubiX遺伝子、Enterobacter aerogenesのubiX遺伝子、Enterobacter cloacaeのubiX遺伝子、Enterobacter sakazakiiのubiX遺伝子、Enterobacter hormaecheiのubiX遺伝子、Escherichia coli WのubiX遺伝子、Escherichia fergusoniiのubiX遺伝子、Paenibacillus polymyxaのubiX遺伝子、Citrobacter koseriのubiX遺伝子、及びPantoea ananatisのubiX遺伝子からなる群から選択される、いずれかの遺伝子がコードする酵素のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子である、コリネ型細菌の形質転換体。 - 宿主のコリネ型細菌に、下記(a)に記載されたプロトカテク酸に対する脱炭酸活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体であって、
該形質転換体は、カテコール1,2-ジオキシゲナーゼ遺伝子catA及びプロトカテク酸ジオキシナーゼ遺伝子pcaHGがコードする酵素が機能欠損している、コリネ型細菌の形質転換体。
(a)下記からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子、
配列番号1の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号2の塩基配列及び配列番号3の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号4の塩基配列及び配列番号5の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号6の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号7の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号10の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号11の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号12の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号13の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号14の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号15の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号16の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号17の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号18の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号19の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号20の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号21の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号22の塩基配列を有する遺伝子;
配列番号23の塩基配列を有する遺伝子。 - カテコール生産能を有する、請求項1又は請求項2に記載の形質転換体。
- さらに、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、及び、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入された、請求項1から請求項3のいずれかに記載の形質転換体。
- 宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、請求項1から請求項4のいずれかに記載の形質転換体。
- 宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムR(FERM P-18976)、ATCC13032、又はATCC13869である、請求項1から請求項5のいずれかに記載の形質転換体。
- コリネバクテリウム グルタミカムCAT21株(受託番号:NITE BP-02689)。
- 請求項1から請求項6のいずれかに記載の形質転換体又は請求項7に記載の株を、増殖に必要な因子の少なくとも1つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中のカテコールを回収する工程とを含む、カテコールの製造方法。
- 請求項1から請求項6のいずれかに記載の形質転換体又は請求項7に記載の株を用いて、反応液中で、グルコース、フルクトース、セロビオース、キシロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトース、デキストリン、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース及び可溶性澱粉からなる群より選ばれる糖類からカテコールへ変換し、該反応液よりカテコールを回収することを含む、請求項8に記載のカテコールの製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018088424 | 2018-05-01 | ||
JP2018088424 | 2018-05-01 | ||
PCT/JP2019/005902 WO2019211937A1 (ja) | 2018-05-01 | 2019-02-18 | コリネ型細菌の形質転換体およびそれを用いる有用化合物の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019211937A1 JPWO2019211937A1 (ja) | 2021-05-13 |
JP7317810B2 true JP7317810B2 (ja) | 2023-07-31 |
Family
ID=68386011
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020517022A Active JP7317810B2 (ja) | 2018-05-01 | 2019-02-18 | コリネ型細菌の形質転換体およびそれを用いる有用化合物の製造方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11359217B2 (ja) |
EP (1) | EP3789481A4 (ja) |
JP (1) | JP7317810B2 (ja) |
CN (1) | CN112074599B (ja) |
WO (1) | WO2019211937A1 (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120196339A1 (en) | 2011-01-31 | 2012-08-02 | Los Alamos National Security Llc | Production of industrially relevant compounds in prokaryotic organisms |
WO2017169399A1 (ja) | 2016-03-28 | 2017-10-05 | 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 | 形質転換体及びそれを用いるプロトカテク酸又はその塩の製造方法 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5272073A (en) | 1992-06-30 | 1993-12-21 | Purdue Research Foundation | Biocatalytic synthesis of catechol from glucose |
US5629181A (en) | 1993-09-16 | 1997-05-13 | Purdue Research Foundation | Synthesis of catechol from biomass-derived carbon sources |
US5487987A (en) | 1993-09-16 | 1996-01-30 | Purdue Research Foundation | Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources |
JP3860189B2 (ja) | 2004-10-27 | 2006-12-20 | 株式会社興人 | 非結晶性ポリエステル樹脂の製造方法 |
EP2521770B1 (en) | 2010-01-08 | 2015-11-25 | Amyris, Inc. | Methods for producing isomers of muconic acid and muconate salts |
WO2012033112A1 (ja) | 2010-09-08 | 2012-03-15 | グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合 | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法 |
JP5996434B6 (ja) * | 2010-11-10 | 2018-06-27 | グリーンフェノール開発株式会社 | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法 |
US20130302860A1 (en) * | 2010-12-28 | 2013-11-14 | Sumitomo Rubber Industries, Ltd. | Coryneform Bacterium Transformant and Process for Producing Aniline Using The Same |
WO2015069847A2 (en) | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Co-culture based modular engineering for the biosynthesis of isoprenoids, aromatics and aromatic-derived compounds |
WO2016036915A1 (en) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Coffa Gianguido | Genetically modified microbes for the biological conversion of carbonaceous materials to protocatechuic acid |
WO2016207403A1 (en) | 2015-06-24 | 2016-12-29 | Deinove | Method of producing muconic acid |
CN109153986B (zh) | 2016-02-26 | 2022-08-12 | 公益财团法人地球环境产业技术研究机构 | 棒状型细菌转化体及使用其的4-氨基苯甲酸或其盐的制造方法 |
-
2019
- 2019-02-18 US US17/051,514 patent/US11359217B2/en active Active
- 2019-02-18 CN CN201980029026.XA patent/CN112074599B/zh active Active
- 2019-02-18 EP EP19796525.4A patent/EP3789481A4/en active Pending
- 2019-02-18 JP JP2020517022A patent/JP7317810B2/ja active Active
- 2019-02-18 WO PCT/JP2019/005902 patent/WO2019211937A1/ja unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120196339A1 (en) | 2011-01-31 | 2012-08-02 | Los Alamos National Security Llc | Production of industrially relevant compounds in prokaryotic organisms |
WO2017169399A1 (ja) | 2016-03-28 | 2017-10-05 | 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 | 形質転換体及びそれを用いるプロトカテク酸又はその塩の製造方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
SHEN, X. et al.,Genomic Analysis and Identification of Catabolic Pathways for Aromatic Compounds in Corynebacterium,Microbes and Environments,2005年,Vol. 20, No. 3,pp. 160-167,図1、2、表2、第162頁右欄第2段落 |
SHEN, X. et al.,Key enzymes of the protocatechuate branch of the β-ketoadipate pathway for aromatic degradation in,Science in China Ser. C Life Sciences,2005年,Vol. 48, No. 3,pp. 241-249,第242頁1.3欄 |
前田淳哉 ほか,コリネ型細菌由来phenol 2-monooxygenaseの機能解析,日本農芸化学会2016年度大会講演要旨集(オンライン),2016年,2F201,目的欄 |
辻正男 ほか,Corynebacterium glutamicum変異株の性質と安息香酸よりのカテコール蓄積機構,J. Ferment. Technol.,1976年,Vol. 54, No. 11,pp. 789-794,緒論、要約欄 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3789481A4 (en) | 2022-02-16 |
WO2019211937A1 (ja) | 2019-11-07 |
EP3789481A1 (en) | 2021-03-10 |
US11359217B2 (en) | 2022-06-14 |
JPWO2019211937A1 (ja) | 2021-05-13 |
US20210222211A1 (en) | 2021-07-22 |
CN112074599A (zh) | 2020-12-11 |
CN112074599B (zh) | 2024-09-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10738296B2 (en) | Transformant for producing 4-hydroxybenzoic acid or salt thereof | |
KR102323473B1 (ko) | 코리네형 세균 형질 전환체 및 이를 이용하는 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 제조 방법 | |
KR19990077974A (ko) | L-글루타민산을생산하는박테리아및l-글루타민산을생산하는방법 | |
CN101688176A (zh) | 具有羧基的酸性物质的生产方法 | |
JP6564929B2 (ja) | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる4−アミノ安息香酸又はその塩の製造方法 | |
CN100510092C (zh) | 生产l-谷氨酸的方法 | |
JP7171759B2 (ja) | コリネ型細菌形質転換体およびそれを用いる2-フェニルエタノールの製造方法 | |
US10717999B2 (en) | Method for the fermentative production of L-lysine using C. glutamicum strains with a mutated kup transporter | |
JP7317810B2 (ja) | コリネ型細菌の形質転換体およびそれを用いる有用化合物の製造方法 | |
US20200017893A1 (en) | Method for the fermentative production of L-lysine | |
EP3887533B1 (en) | Method for the fermentative production of l-lysine | |
US11459574B2 (en) | Transformant having Entner-Doudoroff pathway and production method for organic compound using same | |
WO2021049616A1 (ja) | 形質転換体及びそれを用いる1,3-ブタンジオールの製造方法 | |
JP7112218B2 (ja) | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる2,3-ブタンジオールの製造方法 | |
CN101506347B (zh) | 产l-谷氨酸细菌和产生l-谷氨酸的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221206 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230201 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230509 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230511 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230711 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230719 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7317810 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |