CN111154701A - 一种产褐藻胶裂解酶和纤维素酶的菌株及其在发酵海带中的应用 - Google Patents

一种产褐藻胶裂解酶和纤维素酶的菌株及其在发酵海带中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种能产褐藻胶裂解酶和纤维素酶的菌种，为日本希瓦氏菌NJ16‑3，保藏号为CGMCC No.18976。本发明所提供的日本希瓦氏菌NJ16‑3株可用于发酵海带。本发明所用菌种NJ16‑3具有很强的产褐藻胶裂解酶和产纤维素酶的能力，能更高效地破坏海带细胞壁的结构，更快地释放海带的营养物质。本发明所用菌种NJ16‑3，产生的纤维素酶能将分解海带中的粗纤维，特别是一些膳食纤维，发酵产物更有利于水产养殖动物的吸收。产生的褐藻胶裂解酶能分解海带中的褐藻胶多糖，使其降解为容易吸收利用的小分子物质。发酵后的海带多糖的得率高达到42％，远高于一般酶法提取海带多糖的得率。

Description

一种产褐藻胶裂解酶和纤维素酶的菌株及其在发酵海带中的 应用
技术领域
本发明具体涉及一种产褐藻胶裂解酶和纤维素酶的日本希瓦氏菌株及其在发酵海带中的应用方法，属于生物技术领域。
背景技术
刺参是我国北方海域最重要的养殖品种之一，目前刺参的养殖中主要投喂以大型海藻(鼠尾藻为主)藻粉和海泥为主要组分，再加上鱼粉、豆粕、矿物质及维生素等配制的人工配合饲料。鼠尾藻一直被认为是刺参的最佳优质饵料，目前鼠尾藻资源已遭到严重破坏，部分地区频临灭绝，由于资源匿乏，也导致鼠尾藻的价格居高不下，其供应量的不足已经成为限制刺参苗种和养殖业发展的潜在因素。因此，寻找其它价格低廉，资源丰富的鼠尾藻饲料原料替代品既是突破刺参养殖行业发展瓶颈的关键，也有非常重大的经济意义和社会效益。
海带隶属褐藻门褐藻纲海带目海带科海带属，为冷温带性大型底栖藻类。海带不仅含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质，还含有如褐藻酸、褐藻糖胶、褐藻淀粉、海带多酚、褐藻纤维、甘露醇、高不饱和脂肪酸、岩藻黄质和甾醇类化合物等丰富的生理活性物质。我国海带资源相当丰富，产量逐年上升，我国海带年产量约占世界年产量的一半。
海带与鼠尾藻同属褐藻类植物，有相似的营养价值和适口性。由于其成本低廉、产量高和营养丰富等优点经常用作鲍鱼、海胆及刺参等水产动物的饲料原料成分之一。然而海带细胞壁含有大量褐藻胶，其主要成分为多聚甘露糖醛酸和多聚古罗糖醛酸所构成的高分子化合物，而刺参体内褐藻酸酶活性处于很低的水平，因此刺参对海带等富含褐藻胶的大型海藻类消化能力较弱，饲料中多数海带成分未经充分消化，便被排出体外，严重影响了刺参对营养成分的吸收利用，不仅造成饲料的浪费，而且水体里含有大量粘性较高的褐藻胶等残渣也会污染水质。
近年来，海带的降解提取加工方法主要有化学法、物理法和生物法等。化学法和物理法存在能耗高和污染环境的缺点；而生物酶解法，酶制剂成本高，降解得率低。微生物发酵技术是利用微生物产生的褐藻胶裂解酶等来降解海带藻体，具有反应条件温和、节约能耗和绿色环保等特点，经过微生物发酵处理的海带，能促进刺参对海带饲料原料的利用率，増加海带饲料原料附加值，解决集约化养殖过程中刺参优质饵料的匿乏问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能产褐藻胶裂解酶和纤维素酶的菌种，用于发酵海带，生产用于刺参养殖用的海带饲料。使用本发明的菌株的发酵工艺简单，成本低，环境友好，过程稳定，发酵周期短，适于规模化生产。
本发明首先提供的一种具有产褐藻胶裂解酶和纤维素酶功能的日本希瓦氏菌(Shewanella japonica)NJ16-3，保藏号为CGMCC No.18976，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年11月19日。
本发明所提供的日本希瓦氏菌NJ16-3可用于发酵海带；
本发明另一个方面还提供一种发酵海带的方法，是使用上述的日本希瓦氏菌NJ16-3来发酵海带；
所述的方法，其一种具体的步骤如下：
1)制备种子液：将所述的日本希瓦氏菌NJ16-3接种至液体培养基，温度为30℃，培养24小时；
2)制备发酵液：将1)中制备的种子液，按5％接种量，接种至液体培养基，温度为30℃，培养48-72小时；
3)制备产品A：将干海带粉碎至60目筛网过筛，添加褐藻酸钠、羧甲基纤维素钠、海盐和无机盐等辅料，装入发酵罐，再加入水，并调整pH为7.5，按照料水质量比1:9，100-120℃灭菌20min，得到产品A；
4)制备产品B：将2)的发酵液加入到产品A中得到产品B，其中发酵液与产品A的质量比为20-30:100；
5)制备产品C：温度为30℃，对产品B进行发酵，时间为4-5天，得到产品C；
所述的辅料，以添加的辅料占料水总质量的百分比计，分别为：褐藻酸钠1％，羧甲基纤维素钠0.5％，海盐1-1.5％，磷酸二氢钾0.5-1％，硫酸镁0.5-1％。
所述的液体培养基为：褐藻酸钠1％，羧甲基纤维素钠0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，海盐2％，蒸馏水配制；用NaOH溶液调pH 7.5，121℃灭菌20min。
本发明具有以下几个优点：
1)本发明所用菌种NJ16-3具有很强的产褐藻胶裂解酶和产纤维素酶的能力，能更高效地破坏海带细胞壁的结构，更快地释放海带的营养物质。
2)本发明所用菌种NJ16-3，产生的纤维素酶能将分解海带中的粗纤维，特别是一些膳食纤维，发酵产物更有利于水产养殖动物的吸收。产生的褐藻胶裂解酶能分解海带中的褐藻胶多糖，使其降解为容易吸收利用的小分子物质。发酵后的海带多糖的得率高达到42％，远高于一般酶法提取海带多糖的得率。
3)本发明所用菌种NJ16-3，除了产褐藻胶裂解酶和产纤维素酶以外，还能产蛋白酶和淀粉酶，发酵后的海带粗蛋白含量升高。
4)本发明所用菌种NJ16-3，可作为刺参养殖的益生菌，该菌种分离自荣成健康的刺参养殖池海泥，属于刺参养殖池的土著菌，能很好地适应刺参养殖池的环境，用于分解刺参养殖池底泥中的藻类残渣，有利于净化养殖池水质。
5)使用本发明菌种NJ16-3发酵后的海带，喂养刺参后的生长性能指标实验表明，发酵后的海带粉比原始海带粉更能促进刺参的生长。
附图说明
图1：筛选降解海带细菌步骤流程图；
图2：菌株NJ16-3产褐藻胶裂解酶平板图；
图3：不同发酵时间菌株NJ16-3产褐藻胶裂解酶的酶活变化；
图4：菌株NJ16-3产纤维素酶平板图；
图5：不同发酵时间菌株NJ16-3产纤维素酶的酶活变化；
图6：NJ16-3菌落照片图；
图7：NJ16-3细胞照片图；
图8：基于16S rRNA基因序列的系统发育树图；
图9：菌株NJ16-3降解海带块效果图。
具体实施方式
已有的生物法降解海带，首先需要破坏海带细胞壁的结构。海带的细胞壁除了含有大量褐藻胶，还含有纤维素(纤维素含量可达海带干重的10％以上)。但目前用于降解海带的菌种，绝大部分都只产褐藻胶裂解酶。本发明从刺参养殖池海泥中筛选到了具有很强的产褐藻胶裂解酶和产纤维素酶的菌株，并将该菌株用于发酵海带来制备刺参用的饵料。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：日本希瓦氏菌NJ16-3的筛选和鉴定
筛选细菌的步骤流程如图1所示。
步骤1：首先采集荣成沿海不同地点健康的刺参养殖池海泥。分别取不同海泥样品10克，加入到90mL无菌生理盐水液体培养基中，室温150r/min转速下振荡2个小时，采用稀释涂布法分离菌株，每个样品取0.1mL，直接涂布到2216E培养基(Difco，货号：212185)上，倒置于30℃培养5天后，挑取平板上长出的单菌落，在2216E培养基平板上进行划线纯化，一共分离细菌121株。
步骤2：产褐藻胶裂解酶菌株的初筛
分离的海洋细菌，接种到产褐藻胶裂解酶筛选培养基平板上，培养置于30℃培养箱中培养4-5天，直接观察是否有透明圈产生，如果没有肉眼直接可见透明圈，则加入10％氯化钙，静置30分钟后，再观察是否有透明圈。其中NJ16-3菌株在产褐藻胶裂解酶筛选培养基平板上培养3天，不加10％氯化钙，即可观察到明显的透明圈(如图2所示)。产褐藻胶裂解酶的菌株为16株。
步骤3：产褐藻胶裂解酶菌株的复筛
将初筛的菌株接入100mL复筛种子液体培养基(250mL三角瓶)中，30℃，150r/min培养24h，取培养至对数生长期的种子液2mL接入200mL复筛液体发酵培养基(500mL三角瓶)中发酵培养。在30℃、150r/min转速下培养3天，8000rpm,4℃离心10min，取上清测褐藻胶裂解酶酶活。
褐藻胶裂解酶酶活测定方法的具体步骤如下：
二硝基水杨酸(DNS)比色法检测褐藻胶裂解酶的活性，以反应液中还原糖的增加量作为酶活力的检测指标，还原糖的增加量利用DNS试剂测定。以葡萄糖为标准物做标准曲线，根据反应组和对照组吸光度的差值计算还原糖的生成量。1个酶活力单位定义为反应液在上述条件下，每分钟产生1μg还原糖所需要的酶量。
取0.1mL离心后的发酵上清液(粗酶液)，与0.9mL 0.3％褐藻酸溶液(溶于0.01mol/L PBS缓冲溶液中)混匀，于37℃水浴中反应40分钟，对照组中的粗酶液需煮沸10分钟灭活。在1mL反应体系中加入1mL DNS试剂终止反应，沸水浴反应5分钟，冷却定容到10mL。以蒸馏水为空白，在520nm下测定吸光度。以葡萄糖为标准物做标准曲线，根据反应组和对照组吸光度的差值计算还原糖的生成量。
产褐藻胶裂解酶筛选培养基：褐藻酸钠，20g；蛋白胨，5g；酵母膏，1g；磷酸高铁，0.1g；海盐，20.0g；琼脂，15g，蒸馏水1000mL；用NaOH溶液调pH7.0-7.2左右，121℃灭菌20min。
复筛液体种子培养基：褐藻酸钠，5g；蛋白胨，5g；酵母提取物，1g；K2HPO4，2g；海盐，20g；1000mL蒸馏水配制。用NaOH溶液调pH 7.5，121℃灭菌20min。
复筛液体发酵培养基：褐藻酸钠，10g；蛋白胨，5g；酵母提取物，1g；
(NH4)2SO4，5g；K2HPO4，2g；海盐，20g；MgSO4.7H2O，1g；1000mL蒸馏水配制。用NaOH溶液调pH 7.5，121℃灭菌20min。
其中NJ16-3菌株所产褐藻胶裂解酶具有较高活性(510U/ml)，发酵42小时后，褐藻胶裂解酶酶活达到最高。NJ16-3菌株不同发酵时间产褐藻胶裂解酶的酶活变化图，如图3所示。
步骤4：产纤维素酶菌株的初筛
分离的海洋细菌接种到产纤维素酶筛选培养基平板上，置于30℃培养箱中培养5天，加入0.5％刚果红(盖过平板)，10分钟后倒掉，再往培养皿加入1mol/L的NaCl溶液(盖过平板)脱色，有透明圈则为阳性。其中NJ16-3菌株在产纤维素酶筛选培养基平板上培养3天，加入刚果红溶液后，出现明显的透明圈(如图4所示)。
步骤5：产纤维素酶菌株的复筛
将初筛的菌株接入100mL复筛种子液体培养基(250mL三角瓶)中，30℃，150r/min培养24h，取培养至对数生长期的种子液2mL接入200mL复筛发酵培养基(500mL三角瓶)中发酵培养。在25℃、150r/min转速下培养5天，8000rpm,4℃离心10min，取上清测纤维素酶酶活。
采用DNS比色法检测纤维素酶的活性。以反应液中还原糖的增加量作为酶活力的检测指标，还原糖的增加量利用DNS试剂测定。以葡萄糖为标准物做标准曲线，根据反应组和对照组吸光度的差值计算还原糖的生成量。1个酶活力单位定义为反应液在上述条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需要的酶量。
取0.5mL离心后的发酵上清液(粗酶液)，与1.5mL 1％羧甲基纤维素钠溶液混匀，于50℃水浴中反应30分钟，对照组中的粗酶液需煮沸10分钟灭活。取出后加入1.5mL DNS试剂终止反应，沸水浴反应5分钟，冷却定容到10mL。以蒸馏水为空白，在520nm下测定吸光度。以葡萄糖为标准物做标准曲线，根据反应组和对照组吸光度的差值计算还原糖的生成量。
产纤维素酶筛选培养基：羧甲基纤维素钠，10g；蛋白胨，5g；酵母膏，1g；琼脂，20g，过滤海水1000mL；用NaOH溶液调pH 7.0-7.2左右，121℃灭菌20min。
复筛液体种子培养基：羧甲基纤维素钠，5g；蛋白胨，5g；酵母提取物，1g，K2HPO4，2g；海盐，20g；1000mL蒸馏水配制。用NaOH溶液调pH 7.0-7.2左右，121℃灭菌20min。
复筛液体发酵培养基：羧甲基纤维素钠，10g；蛋白胨，1g；酵母提取物，1g，K2HPO4，2g；海盐，20g；1000mL蒸馏水配制。用NaOH溶液调pH 7.0-7.2左右，121℃灭菌20min。
其中NJ16-3菌株所产纤维素酶具有较高活性(46U/ml)，发酵48小时后，纤维素酶酶活达到最高。NJ16-3菌株不同发酵时间产纤维素酶的酶活变化图，如图5所示。
本发明从荣成沿海不同地点健康的刺参养殖池海泥样品共分离细菌121株，其中产褐藻胶裂解酶的菌株为16株，产纤维素酶的菌株7株，同时产褐藻胶裂解酶和纤维素酶的菌株共3株。进一步通过复筛的方法，通过测定褐藻胶裂解酶和纤维素酶的酶活筛选，降解海带能力最优的菌株。最终确定NJ16-3为筛选菌株，其余2株为弧菌，考虑其为条件致病菌，故放弃。
步骤6：对NJ16-3菌株进行分类鉴定
1)形态学特征：在2216E培养基上，30℃培养24h后，菌落直径大小为1-2mm，淡黄色，圆形，边缘整齐(如图6所示)。革兰氏阴性菌，严格好氧，镜检结果显示，细胞形态为短杆状(0.5-1×1.2-2.2μm)(如图7所示)，运动，不产芽孢。
2)表型特征鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》，生长盐度范围为0.5％-5％(w/v)(最适2％)，生长pH范围为5.0-8.5(最适6.5-7.0)，生长温度范围为4℃-45℃(最适25-30℃)。能降解明胶，能产蛋白酶、卡拉胶酶、淀粉酶、脂肪酶、褐藻胶裂解酶和纤维素酶，氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶为阳性，β-半乳糖苷酶，柠檬酸盐利用实验、产硫化氢实验、脲酶、吲哚试验、VP实验结果均为阴性。不能利用葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁甙和阿拉伯糖发酵产酸。
3)化学特性：细胞脂肪酸的主要成分是summed feature 3(C16:1ω7c and/or C16:1ω6c)(32.5％)，iso-C15:0(18.9％)和C16:0(20.3％)。
4)16S rRNA基因分子鉴定
16S rRNA基因模板的制备：使用天根细菌DNA提取试剂盒(DP302-02)。按照该试剂盒说明书进行操作，得到NJ16-3菌体的DNA样品。
PCR扩增：所用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR反应体系40μL：2×Taq Mix20μL，引物：27F，1541R各1μL，DNA模板2μL，无菌水补足至40μL。PCR反应条件：94℃，5min；94℃，45s；55℃，1min；72℃，1min 30s，30个循环；72℃，10min。将PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司进行双向测序，确定其序列为SEQ ID NO:1。
将测序好的序列通过NCBI的BLAST与Genbank序列数据库进行同源性序列对比分析，发现菌株NJ16-3属于希瓦氏菌属，与其16S rRNA基因序列相似性最高的正式发表种是Shewanella japonica。利用MEGA7.0软件，选取希瓦氏菌属目前已正式发表的种，以邻接法(neighbour-joining)构建系统发育树(图8)，发现菌株NJ16-3与Shewanella japonica聚类在一个分支上，表明菌株NJ16-3与Shewanella japonica系统发育关系最近；因此该菌最终被命名为日本希瓦氏菌NJ16-3。
该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.18976，保藏日期为2019年11月19日。
菌种的保藏：长期保存可以将菌液加入到含甘油终浓度为20％的甘油管里，放入-80℃冰箱保存备用；短期保存：划线到2216E斜面上，在4℃保存。
实施例2：日本希瓦氏菌NJ16-3溶血实验
是否具有产溶血素能力是剔除致病菌和保留益生菌的重要筛选方法。将菌株NJ16-3接种到山羊血平板，30℃培养箱恒温培养24h后观察，如果菌落周围产生溶血环，表明该菌有溶血能力，是潜在致病菌；如果不产生溶血环，表明该菌没有溶血能力。
菌株NJ16-3溶血实验结果为阴性，说明菌株NJ16-3可作为潜在水产益生菌。
实施例3：日本希瓦氏菌NJ16-3降解海带块实验
将菌株NJ16-3接种于海带降解液体种子培养基，培养温度为30℃，置摇床上以150r/min的转速培养48h，按接种量10％接入海带块降解液体培养基，培养温度为30℃，150r/min，培养3天，观察海带块降解情况。
海带降解液体种子培养基：褐藻酸钠，10g；羧甲基纤维素钠，5g；蛋白胨，5g；酵母膏，1g；海盐，10g；蒸馏水1000mL；用NaOH溶液调pH 7.5，121℃灭菌20min。
海带块降解液体培养基的一种组成如下：海带块(每块长约10cm，宽约4cm)20g；海盐2g，蒸馏水200mL,121℃灭菌20min。
发酵第一天和第三天，降解海带块结果如图9所示，菌株NJ16-3经过3天发酵，将海带块基本降解完。
实施例4：日本希瓦氏菌NJ16-3发酵海带中褐藻多糖和蛋白含量
步骤1：将干海带粉碎至60目筛网过筛，4℃保存。
步骤2：将菌株NJ16-3接种于海带降解液体种子培养基(见实施例3)，培养温度为30℃，置摇床上以150r/min的转速培养48h后，制备菌株NJ16-3发酵液。
步骤3：称取海带粉100g，海盐15g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁5g，再加入800毫升水，搅拌均匀，并调整pH7.5，121℃灭菌20min。再加入100毫升菌株NJ16-3发酵液。对照组不加菌液，用100毫升无菌海带降解液体种子培养基替代。
步骤4：温度为30℃，进行发酵，时间为4天。
步骤5：测定发酵后海带的褐藻多糖含量。主要参照SNT 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》。
葡萄糖标准曲线的绘制：称取105℃下干燥至恒重的分析纯葡萄糖0.06克，加水定容至100mL，配置成浓度为600μg/mL的葡萄糖。分别吸取置于10mL具塞试管中，加蒸馏水补至1mL，再加6％的苯酚溶液1mL，摇匀，马上加入浓硫酸5mL，摇匀，100℃加热40min，在490nm下测定吸光度，绘制葡萄糖标准曲线。
样品多糖提取液的制备：吸取发酵上清液样品200μL于50mL离心管，用5mL水浸润样品，缓慢加入20mL无水乙醇，使用涡旋振荡器振摇，混合均匀，置于超声波提取器中超声提取30min。提取结束后，4000r/min离心10min后，弃去上清液。用水将洗涤、离心后得到的不溶物转移入圆底烧瓶，置于超声波提取器中超声提取30min，重复2次。冷却至室温，过滤，将上清液转移至200mL容量瓶中，残渣洗涤2次～3次，洗涤液转至容量瓶，加水定容。此溶液为样品测定液。
吸取1mL样品测定液，加6％的苯酚溶液1mL，摇匀，马上加入浓硫酸5mL，摇匀，100℃加热40min，在490nm下测定吸光度，根据标准曲线计算多糖含量。
海带多糖的得率/％＝多糖提取液中多糖的质量/原始海带粉的质量×100％，
步骤6：测定发酵后海带的粗蛋白含量
粗蛋白含量采用微量凯氏定氮法测定，主要参照GB5009.5-1985《食品中蛋白质的测定》，氮对蛋白的转换系数为6.25。
测定结果：发酵后海带的多糖的得率为42％，而目前文献报道的采用复合酶(褐藻胶裂解酶，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶等)法提取海带多糖的得率一般在10％-20％之间。发酵后海带的蛋白含量为18％，而本实施例的海带原料的蛋白含量为12％。因此结果说明，海带经日本希瓦氏菌NJ16-3发酵后，海带多糖的得率明显提升，蛋白含量进一步增加。
实施例5：日本希瓦氏菌NJ16-3发酵海带饲料对刺参生长性能的影响
步骤1：饲喂试验共分为2组，分别投喂对照组和实验组饲料，每组设3个重复。对照组饲料为70％配合饲料加30％海带粉，实验组为70％配合饲料加30％发酵海带粉。刺参配合饲料主要为鼠尾藻粉、海泥、鱼粉、豆粕、粗纤维、鱼油、包膜复合多维和免疫增强因子等，营养组成见表1。
步骤2：发酵海带的制备，按照实施例4中步骤1-4完成。发酵后的海带粉30℃鼓风干燥，与配合饲料按上述比例称量后置于搅拌机中混匀，制成饲料。对照组的海带粉，直接与配合饲料按上述比例称量后置于搅拌机中混匀，制成饲料。
步骤3：刺参的饲喂试验
刺参苗购自威海海宽海洋生物科技有限公司。实验开始前暂养2周以适应环境。实验开始前对刺参实施48小时饥饿处理，以排空其消化道残渣，然后挑选体表无损伤、体色正常、个体健康、大小相对均匀的刺参。饲喂试验按照投喂的饲料不同，共分为2组，每组水箱中随机放入20只健康海参，分别投喂对照组和实验组饲料，每组设3个重复。实验设计为60天，每天下午4点固定时间投喂饲料一次，初次投喂量为刺参体重的4％，其后根据摄食情况加以具体调整，次日上午10时吸污并换水，换水率100％，所有养殖箱24小时曝气，避光，整个实验过程中，水温维持15-18℃，pH为7.5-8.0，溶解氧为5-6mg/L，盐度为24-30g/L。
表1：配合饲料营养成分表
Figure BDA0002390738840000111
步骤4：测定对照组和实验组饲料喂养刺参后的生长性能指标，结果如表2所示。
根据表2结果显示，发酵后的海带粉作为饲料成分之一，喂养刺参后的生长性能指标明显高于对照组的海带粉，因此采用日本希瓦氏菌NJ16-3发酵海带作为饲料原料，能加快刺参的生长，促进刺参对海带饲料原料的利用率，増加海带饲料原料附加值。
表2：实施例5喂养刺参后的生长性能指标
Figure BDA0002390738840000112
序列表
<110> 荣成市泓派海洋生物科技有限公司
<120> 一种产褐藻胶裂解酶和纤维素酶的菌株及其在发酵海带中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1382
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtaacagaa agtagcttgc tactttgctg acgagcggcg gacgggtgag taatgcctag 60
ggatctgccc agtcgagggg gataacagtt ggaaagactg ctaataccgc atacgcccta 120
cgggggaaag gaggggacct tcgggcgttt cgcgattgga tgaacctagg tgggattagc 180
tagttggtaa ggtaatggct taccaaggcg acgatcccta gctgttctgt gaggaagatc 240
agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt 300
gcacaatggg ggaaaccctg atgcagccat gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg 360
taaagcactt tcagtaggga ggaaaggtag cagcttaata cgttgttgct gtgacgttac 420
ctacagaaga aggaccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga ggggtccaag 480
cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt acgcaggcgg ttcattaagc cagatgtgaa 540
atccccgggc tcaacctggg aattgcattt ggaactggtg aactagagtc ttgtagaggg 600
gggtagaatt tcaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tgaaggaata ccggtggcga 660
aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc atgtacgaaa gcgtggggag ccaacaggat 720
tagatatcct ggtagtccac gccgtaaacg atgtctactc ggagtttggt gccttgagca 780
ctgggctccc aagctaacgc attaagtaga ccgcctgggg agttcggccg ccaggataaa 840
actccaatga aatgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca 900
acgcgaagaa ccttacctac tcttgacatc cagagaactt ttcagagatg aattggtgcc 960
ttcgggaact ctgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg 1020
gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat ccttatttgc cagcgcgtaa tggcgggaac 1080
tctagggaga ctgccggtga taatccggat gaaggtcggg acgacgtcaa atcatcaagg 1140
gccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcgagt acagagggtt gcaaagccgc 1200
aaggtctagc taatctcata aagctcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc 1260
catgaagtcg gtatcggtag caatcgtaga tcagaatgct acggtgaata cgttccgggg 1320
ccttgaacac accgcccgtc acaccatggg agtgggctgc accagaagta gatagtctaa 1380
cc 1382

Claims (6)

1.一种日本希瓦氏菌，其特征在于，所述的菌株的保藏号为CGMCC No.18976。
2.权利要求1所述的日本希瓦氏菌在发酵海带中的应用。
3.一种发酵海带的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的日本希瓦氏菌来发酵海带。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)制备种子液：将所述的日本希瓦氏菌NJ16-3接种至液体培养基，温度为30℃，培养24小时；
2)制备发酵液：将1)中制备的种子液，按5％接种量，接种至液体培养基，温度为30℃，培养48-72小时；
3)制备产品A：将干海带粉碎至60目筛网过筛，添加褐藻酸钠、羧甲基纤维素钠、海盐和无机盐等辅料，装入发酵罐，再加入水，并调整pH为7.5，按照料水质量比1:9，100-120℃灭菌20min，得到产品A；
4)制备产品B：将2)的发酵液加入到产品A中得到产品B，其中发酵液与产品A的质量比为20-30:100；
5)制备产品C：温度为30℃，对产品B进行发酵，时间为4-5天，得到产品C。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的辅料，以添加的辅料占料水总质量的百分比计，分别为：褐藻酸钠1％，羧甲基纤维素钠0.5％，海盐1-1.5％，磷酸二氢钾0.5-1％，硫酸镁0.5-1％。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基为：褐藻酸钠1％，羧甲基纤维素钠0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，海盐2％，蒸馏水配制；用NaOH溶液调pH 7.5，121℃灭菌20min。
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