CN110669685B - 一株可降解羽毛角蛋白的益生菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可降解羽毛角蛋白的益生菌及其应用，属于动物营养与饲料技术领域。本发明提供了一种可降解羽毛的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016‑01，其保藏编号为CGMCC No.15450。本发明还提供了该乳酸乳球菌KDLL2016‑01的应用。该菌株是一株可以降解羽毛角蛋白的益生菌，不仅可以通过发酵降解羽毛角蛋白，制备羽毛蛋白质饲料，避免羽毛废弃造成的蛋白质资源的浪费，具有良好的社会价值，而且可以改善羽毛角蛋白氨基酸比例不适合畜禽生长需要的客观情况，提高羽毛蛋白饲料的品质和经济价值。本发明菌株适用于降解羽毛角蛋白，同时降解后的发酵产物适用于制备蛋白饲料。
Description
技术领域
本发明涉及一株可降解羽毛角蛋白的益生菌及其应用，属于动物营养与饲料技术领域。
背景技术
目前，蛋白质饲料的缺乏是世界性的问题，没有优质的、充足的蛋白质饲料，就没有优质的、充足的肉类产品，这种情况在很大程度上限制了畜禽养殖业的快速健康发展。我国羽毛资源非常丰富，但是在很长时间内没有得到很好利用，这主要跟羽毛结构性质有关。羽毛结构非常稳固，导致其性质稳定，不溶于水、稀酸和稀碱，加工处理之前，蛋白酶不能水解羽毛，因此动物不能消化羽毛，更无法利用其中的蛋白质。因此破坏羽毛稳定的结构，提高其水溶性，提高羽毛的消化率，使其变得易于消化和吸收显得至关重要。目前常用于水解羽毛的方法如下：
高温高压水解法目前应用最广泛的一种处理方法，其成品颜色会随着原料的变化而发生变化，当原料的颜色多为白色时，成品通常呈深黄色，当原料的颜色多为黑色时，成品通常呈深褐色，一般情况下，高压水解羽毛粉成品呈浅褐色。高温高压水解法控制温度和压力比较困难，造成生产出的产品的质量不是很稳定，过高的温度会引起蛋白质变性，使羽毛粉的消化率下降。
化学水解法利用加热条件下，羽毛对酸、碱的敏感性大大提高这一特性发明的一种处理方法。但是化学水解法同样也有很多缺陷，化学水解法的生产工艺比较复杂，生产出的水解羽毛粉中含有较多的盐分，这会影响水解羽毛粉的适口性，较多的盐分也会容易吸潮，导致水解羽毛粉变质。化学水解法在生产过程中会产生大量的污水，会对环境造成严重的污染。
膨化法的原理是，羽毛粉在经过膨化通道时会受到很大的剪切作用，并且羽毛在冲出膨化出口的瞬间，外部的压力迅速消失，而羽毛粉的内部仍保持着高压状态，内外的压力差会使羽毛迅速发生膨胀。膨化时羽毛牢固的空间结构会被破坏掉，角蛋白的结构变得松散，疏水性有所下降，亲水性得到提高，蛋白酶更容易对羽毛进行水解，动物更容易消化羽毛，并从中吸收所需的营养。
微生物降解法是指自然界中的某些微生物在生长过程中可以产生能够水解角蛋白的酶将角蛋白降解成小肽或氨基酸。微生物降解法与其他处理方法相比，具有很大的优势，主要表现在微生物降解法的成本低，工艺简单，产生的废水废气较少。在以往报道的具有角蛋白降解能力的微生物主要是非益生菌，而乳酸乳球菌等益生菌降解羽毛角蛋白的研究还未见报道。然而，非益生菌虽然能够降解角蛋白，但其次级代谢产物通常含有对畜禽有害的物质，因此主要用于皮革加工等工业角蛋白制备，并不适合于作为食品、饲料添加剂的加工。农业部出于安全考虑，于2011年公布了第105号公告，其中规定了12种可以作为饲料添加剂的微生物，分别主要以乳酸菌和酵母菌为主，其中就包括乳酸乳球菌，但国内有关益生菌降解羽毛角蛋白的文章比较少见，而乳酸乳球菌降解羽毛角蛋白的研究还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术中具有角蛋白降解能力的微生物主要为非益生菌，代谢产物中通常存在有害物质，不适于制备动物饲料、加工食品等，也不符合农业部相关文件的规定，市场推广难度大，而目前关于益生菌乳酸乳球菌降解羽毛角蛋白的研究还未见报道的情况本发明提供了一株可降解羽毛角蛋白的益生菌及其应用，具体涉及一种可降解羽毛角蛋白的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01，该菌株已经于2018年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15450。
本发明所述菌株是发明人以羽毛粉为单一氮源，从鸡的粪便中分离、筛选到一株可降解角蛋白的微生物，经鉴定为一株乳酸乳球菌，命名为乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)KDLL2016-01。
本发明还提供了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01在发酵降解羽毛中的应用。
本发明还提供了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01在发酵降解角蛋白中的应用。
本发明还提供了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01在发酵降解羽毛角蛋白中的应用。
本发明还提供了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01在制备含有羽毛的饲料中的应用，尤其是在制备含有羽毛的发酵饲料中的应用，所述应用是将乳酸乳球菌KDLL2016-01直接添加到饲料中或利用乳酸乳球菌KDLL2016-01发酵羽毛制备发酵饲料。
本发明还提供了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01在以羽毛为原料之一发酵制备蛋白质饲料中的应用。
本发明还提供了一种包含所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01的培养物。
本发明还提供了一种包含所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01的羽毛发酵剂。
本发明还提供了一种包含所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01的饲料。
优选地，本发明乳酸乳球菌KDLL2016-01降解由结构紧密的角蛋白所构成的羽毛纤维的条件为：以羽毛粉为单一氮源的液体MRS培养基、固液比1:4、温度30℃、pH值为6.0和水解时间24h。
本发明所述乳酸乳球菌KDLL2016-01的种子培养基组成为：牛肉膏8.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，吐温80 1.0g，硫酸锰0.05g，去离子水1000mL，121℃灭菌20min。
本发明所述乳酸乳球菌KDLL2016-01的发酵培养基组成为：牛肉膏10g，酵母膏10g，蔗糖100g，氯化钠2g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.5g，pH值为6.0，121℃灭菌20min。
本发明所述乳酸乳球菌KDLL2016-01最佳生长条件为：乳酸乳球菌的最佳生长条件为：温度为30℃，pH值为6.0，转速为200rpm，培养时间48h。
本发明所述乳酸乳球菌KDLL2016-01对羽毛角蛋白的降解条件为：在有氧，乳酸乳球菌接种量5.7％，初始pH值6.3，发酵温度32℃，转速220rpm，发酵时间36h，羽毛粉添加量为25％的条件下，羽毛粉降解率为35.3％。
本发明有益效果：
本发明首次筛选了一株可以降解羽毛角蛋白的益生菌，该菌株是以羽毛粉为单一氮源，从鸡的粪便中分离、筛选得到的，经鉴定为一株乳酸乳球菌，命名为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01，保藏编号为CGMCC No.15450，该菌株可以有效降解羽毛中的角蛋白，改善羽毛粉氨基酸组成，该菌株适用于发酵降解羽毛或羽毛粉，该菌株还能够用于制备其培养物、羽毛发酵剂以及添加到饲料中，此外该菌株还能够用于以羽毛为原料发酵制备饲料，提高羽毛蛋白饲料的品质，适度降低饲料的pH值，增加饲料的适口性。
现有技术报道的可以降解角蛋白的微生物多为非益生菌(如芽孢杆菌、霉菌、放线菌等)，由于在降解羽毛的过程中会产生对畜禽有害的次级代谢产物，因此不适用于发酵羽毛制备蛋白饲料，而本发明乳酸乳球菌KDLL2016-01是一种益生菌，在发酵过程中不产生对畜禽有害的次级代谢产物，符合农业部相关文件规定，可以直接作为蛋白饲料饲喂畜禽，并且乳球菌分泌的乳酸球肽还能够杀死对容易造成饲料腐败的霉菌和畜禽有害的致病菌，提高饲料品质，利于畜禽健康。此外该菌株还能够适度降低饲料的pH值，增加饲料的适口性。
本发明的乳酸乳球菌在以羽毛粉为唯一氮源的液体MRS培养基中(固液比1:4)，最佳生长条件为30℃，pH值为6.0，在该条件下对羽毛进行降解36h，其降解率可达35.3％。
附图说明
图1为乳球菌菌株复筛降解圈。
图2为16S rDNA系统发育树。
图3为羽毛粉(左)和发酵羽毛粉(右)表观形态。
图4为普通电子显微镜下的羽毛粉(左)和发酵羽毛粉(右)。
图5扫描电镜下的羽毛粉(左)和发酵羽毛粉(右)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例一：羽毛粉降解菌的分离、筛选和鉴定
1.实验方法
(1)样品的收集：①菌株分离样品采自2016年东北农业大学动物饲养基地所饲养肉鸡的粪便；②取5g鸡粪便样品于装有50mL无菌生理盐水的250mL锥形瓶中，搅拌混匀，制成悬浮液，取1mL悬菌液接入含富集培养基100mL的250mL锥形瓶中，30℃，220r/min富集培养48h制成富集培养液。
(2)初筛：将富集培养液按梯度稀释后各取0.1mL涂布于羽毛粉固体培养基平板，30℃恒温培养箱中倒置培养若干天并进行观察，待长出菌落后，挑选生长良好、较大单个的菌落，重新划线于LB平板，于30℃恒温培养3d，经多次划线，分离纯化出单菌落。
(3)复筛：将初蹄得到的菌株各取一环分别接种于种子培养基中，30℃，220r/min培养24h。将种子液各取1mL分别接种于装有100mL初始液体发酵培养基的250mL三角瓶中，每个菌株三个平行，培养24h。期间密切观察羽毛的降解情况。根据各菌株对羽毛的降解情况进行复筛。发酵液在4℃，8000r/min离心机中离心15min，取上清液，测定吸光度值和可溶性蛋白含量。
(4)可溶性蛋白含量测定：采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量。
(5)菌种的保存：本试验分离纯化得到的单一菌株采用甘油冷冻保存法进行长期保存，菌株接种于种子培养基中，30℃，220r/min摇床培养24h，将菌悬液与已灭菌的30％甘油-去离子水溶液1:1混合均匀，于-20℃低温保存，有效期1年。
(6)菌种的鉴定：将菌株涂布于LB固体培养基平板和羽毛粉培养基平板，30℃倒置培养，48h左右，观察单菌落形态呈白色微凸起状，表面光滑湿润，边缘比较整齐，并进行16SrDNA分子鉴定及系统发育分析。
种子培养基(MRS液体培养基)组成为：牛肉膏8.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，吐温80 1.0g，硫酸锰0.05g，去离子水1000mL，121℃灭菌20min。
2实验结果及结论
复筛菌株上清液吸光度及可溶性蛋白含量如表1所示。
表1复筛菌株上清液吸光度及可溶性蛋白含量
注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。
根据复筛结果选取一株菌，分别接种到表层涂有羽毛悬浊液的营养琼脂培养基上，48h后观察其“降解圈”产生情况。结果如图1所示，该菌落呈乳白色降解圈明显。
菌株通过PCR扩增所产生的DNA片段均为单一条带，将PCR产物进行测序，获得全长为1379bp的基因序列这与电泳图的结果一致。将两端序列在NCBI中进行Blast比对，发现该的16S rDNA与多数乳酸乳球菌Lactococcus lactis达到95％以上，利用MEGA 5.1聚类分析构建系统发育树，如图2所示。从图2的系统发育树上可进一步鉴定菌株为乳酸乳球菌。命名为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01，该乳酸乳球菌为益生菌。
实施例二：乳球菌发酵降解羽毛粉条件的优化
1实验方法
1.1培养基
(1)发酵培养基：牛肉膏10g，酵母膏10g，蔗糖100g，氯化钠2g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.5g，pH值为6.0，121℃灭菌20min。
(2)MRS液体培养基(种子培养基)：牛肉膏8.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，吐温80 1.0g，硫酸锰0.05g，去离子水1000mL，pH值为5.7，121℃灭菌20min。
1.2发酵条件的优化
利用单因素试验研究影响乳球菌发酵羽毛的因素：有无氧、时间、转速、温度、接种量和pH值对羽毛降解率的影响，逐个探索出较优水平。
(1)将400目的尼龙袋(6cm×5cm)，用铅笔做好标记后在105℃下烘干至恒重，称量每个尼龙袋重量，记为M1；
(2)将羽毛清洗后烘干，粉碎后，过40目筛，获得羽毛粉；称取5g羽毛粉，置于的尼龙袋中，封口后105℃烘干至恒重，称量重量，记为M2；
(3)配制MRS液体培养基，在厌氧、30℃、pH值为6.0、转速为180rpm的条件下对乳球菌培养24h；
(4)配制发酵培养基，在250mL三角瓶中加入发酵培养基50mL，将灭菌后的装有羽毛的尼龙袋置于培养基中，分别在有氧和厌氧条件下，接种量4％(体积比)、30℃、pH值6.0、转速200rpm、发酵时间30h为基础条件，设置不同梯度，保持其它因素不变，设置5个重复，对有无氧、时间(18h、24h、30h、36h、42h)、转速(180rpm、200rpm、220rpm、240rpm、260rpm)、温度(26℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、接种量(3％、4％、5％、6％、7％)和pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)等影响羽毛角蛋白降解率的因素进行研究。
(5)发酵完成后将尼龙袋捞出，用自来水清洗掉培养基，再用蒸馏水反复清洗三次后，105℃烘干至恒重，称量发酵后的尼龙袋和其内部羽毛的总重量，记为M3。计算公式如下：
2实验结果
2.1有无氧对乳球菌羽毛粉降解率的影响
表2有无氧对乳球菌降解羽毛粉效率的影响
在有氧状态下，乳球菌对羽毛的降解率可达23.1％，高于无氧状态的13.7％，因此本试验采用有氧发酵降解羽毛，制备羽毛蛋白饲料。
2.2转速对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响
表3转速对乳球菌羽毛降解效率的影响
在不同转速毛降解率呈先增加后降低的趋势，在转速为220rpm时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到25.8％。因此，本试验选择发酵转速为220rpm。
2.3温度对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响
表4温度对乳球菌羽毛降解效率的影响
在不同温度时羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在温度30℃时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到28.2％。
2.4接种量对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响
表5接种量对乳球菌羽毛降解效率的影响
在不同接种量时羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在接种量为5％时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到24.4％。
2.5 pH值对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响
表6pH值对乳球菌羽毛降解效率的影响
在pH值为6.5时羽毛降解最高可达到27.2％。
2.6发酵时间对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响
表7发酵时间对乳球菌羽毛降解效率的影响
在有氧条件下，以转速220rpm、温度为30℃、接种量为5％、pH值为6.5条件下，从18～36h阶段，羽毛的降解率呈快速增长状态，降解率从18h时的17.4％增长到36h的35.3％，而到42h时其降解率仅增长了不到0.5％，所以本试验最佳发酵时间为36h。
3讨论和结论
本试验采用“尼龙袋称重”的方法，分别对有无氧、转速、温度、接种量、pH值和发酵时间等影响羽毛角蛋白降解率的因素对乳球菌发酵羽毛条件进行优化分析。由于随着装液量减少，培养基中溶氧量增大，对于降解率影响不显著，从成本考虑本研究在发酵生产时，依据文献确定装液量为20％。
有无氧对乳球菌降解羽毛粉效率影响的结果表明，在有氧状态下，乳球菌对羽毛的降解率可达23.08％，高于无氧状态的13.61％。乳球菌为兼性厌氧微生物，在无氧条件下会产生乳酸等酸性物质。研究表明，在有氧条件下，氧气可以提高兼性厌氧菌的生长速率，菌种的生长数量相对提高。因此可分析羽毛角蛋白的降解率提高的原因为乳球菌数量增加，提高了羽毛的分解速率。
高转速可以提高液体培养基溶氧，但转速过快则会降低菌与发酵底物的接触几率，研究表明，通过试验分别探讨了10种搅拌桨叶对细菌发胶原纤维素的影响，结果表明菌体细胞的生长和发酵效果是同步偶联的，转速步控缩短了菌体生长的延迟期，使对数期提前、增殖速度加快，最高菌浓得到一定提升，与转速未控制时相比，生长曲线未出现明显的衰亡期。因此，转速对菌体发酵速率有一定的提升，最大菌体浓度也会随之增加。在本试验中，不同转速对羽毛降解效率的影响结果表明，在转速在180～260rpm之间，随转速的提高，羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在转速为220rpm时，降解率最高，可达到25.78％。这说明增加发酵液中的溶氧率确实可以提高乳球菌的生长速度，进而提高羽毛角蛋白的降解率，这也与前面有无氧的研究结果相吻合。但是当转速高于220rpm时，羽毛降解率下降，这可能是因为过大的转速降低了乳球菌与羽毛接触的几率，降低了乳球菌在羽毛表面的附着，从而导致羽毛降解率下降。
在微生物发酵羽毛粉的过程中，温度对羽毛粉降解率的影响主要有两个因素。一是微生物生命活动都由生物化学组成，受温度影响极其明显，温度是影响微生物生长繁殖的重要因素；二是温度可通过影响酶促反应速度或活性酶蛋白结构影响酶活。研究表明，乳球菌的最大生长速率随温度的升高而增加，而延滞期随温度的升高而降低，在超过最适温度时，延滞期延长明显，速率降低。在本试验中，不同温度对羽毛降解效率影响结果表明，在不同温度时羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在温度30℃时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到28.15％，与菌种最适生长温度一致，说明菌的生长数量与降解率存在一定的正比例关系。
在生产实践中，接种量少，将使发酵过程延长，拖延发酵时间，增加能耗，造成发酵成本升高，增加杂菌污染的机会，造成发酵效果下降，如将种子液的接种量扩大，将缩短发酵期，虽对发酵有利，但过大的接种量反而可能会引起在发酵开始的时候微生物浓度较高，大量消耗发酵底物，易造成降解阶段必须的营养物质无法满足微生物生长需要，促使菌体“早衰”、“自溶”。在本试验中，不同接种量对羽毛降解效率影响的结果表明，在不同接种量时羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在接种量为5％时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到24.36％。
环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。研究表明，pH值会影响细胞膜的电荷状态，引起膜的渗透性发生改变进而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成，同时还能影响产物的稳定性。在本试验中，不同pH值对羽毛降解效率影响的结果表明，在pH值为6.5时羽毛降解最高可达到27.24％，在其最适生长条件pH范围内，但与最适生长pH有一定的偏差，这可能是因为该乳球菌在酸性条件下，会加速生成乳酸，而影响羽毛的降解效率。
发酵时间的选取通常选择发酵过程中快速增长与平缓增长的节点，既节约成本，又能提高效率，本试验结果表明，乳球菌在发酵36h前的羽毛粉降解率呈上升趋势，36h之后则上升缓慢，有持平迹象，因此本试验中乳球菌发酵羽毛粉的最适发酵时间为36h。
实施例三：发酵羽毛粉理化性质分析
1实验方法
1.1发酵羽毛粉形态结构的分析
从市场中收集当天的羽毛废弃物，用自来水洗净，再用蒸馏水洗3次，于65℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过40目筛制成羽毛粉。将羽毛粉发酵产物及尼龙袋一同用自来水洗净，再用蒸馏水洗3次，取出羽毛粉先于120℃烘箱中灭菌15min，后65℃烘干至恒重，粉碎过40目筛，用实施例二的方法制成发酵羽毛粉，具体方法为如下：
(1)将羽毛清洗后与水、琼脂混合并搅拌均匀(羽毛重量与水的重量之比为10:1；琼脂的重量与羽毛的重量之比为1:200)，烘干后粉碎后置于400目的尼龙布上，流动水清洗去除琼脂后烘干，再过60目筛；灭菌后按照羽毛粉的添加量为：羽毛粉重量与发酵培养基重量之比为1:4向发酵培养基中加入羽毛粉；
(2)将乳酸乳球菌KDLL2016-01进行复苏培养后接种至液体种子培养基中在温度为30℃、pH值为6.0和转速为200rpm的条件下进行种子培养48h，得乳酸乳球菌KDLL2016-01的种子培养液，将所得乳酸乳球菌KDLL2016-01的种子培养液按照5.7％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，进行发酵培养；其中：发酵培养的条件为：有氧，初始pH值6.3，发酵温度32℃，转速220rpm，发酵时间为36h；液体种子培养基的配方为：牛肉膏8.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，吐温80 1.0g，硫酸锰0.05g，去离子水1000mL，121℃灭菌20min；发酵培养基配方为：牛肉膏10g，酵母膏10g，蔗糖100g，氯化钠2g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.5g，pH值为6.0，121℃灭菌20min。
(3)发酵完成后将发酵产物进行干燥是将发酵产物进行过滤得发酵液和固体，将所得发酵液进行喷雾干燥，并将所得固体烘干，然后将烘干后的固体粉末与喷雾干燥后的固体粉末合并，获得蛋白饲料。
进行如下实验：
(1)羽毛粉发酵前后表观形态观察。通过视觉直接观察羽毛粉和发酵羽毛粉的表观形态、颜色等表观性状。
(2)羽毛粉发酵前后光学显微镜观察。利用光学微镜(AMG Auto FL)观察羽毛粉的粉碎程度、颗粒大小及形态。
(3)羽毛粉发酵前后扫描电镜观察。将羽毛粉放入配制好的乙醚和乙醇(95％)1：1混合脱脂液中，超声清洗2min后于操作台中自然干燥，用小镊子将干燥样品放在样品台上，轻轻展平，Eiko IB-3离子溅射仪导电处理90s，用扫描电镜(HITACHI S-3400N)观察液体发酵前后羽毛粉的微观结构变化。
1.2发酵羽毛粉常规营养成分及氨基酸组成分析
(1)羽毛粉及发酵羽毛粉常规营养成分测定。粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量采用乙醚抽提法测定；能量采用Parr 6300型氧弹量热仪测定；Ca和P分别采用高锰酸钾法和比色法测定。
(2)羽毛粉及发酵羽毛粉氨基酸成分测定。羽毛粉和发酵羽毛粉样品先用6mol/L盐酸水解24h(110℃)，转移定容后0.45μm滤膜过滤，在日立L-8900型氨基酸自动分析仪上测定氨基酸含量。
2实验结果
2.1发酵羽毛粉结构分析
图3中左图为正常羽毛粉，右图为发酵羽毛粉，由图3可知：与正常羽毛粉相比，发酵羽毛粉质地相对较致密，羽毛形态保留程度低，粉碎程度较大，颜色稍深。
图4中左图为普通电子显微镜下的羽毛粉，右图为发酵羽毛粉，由图4可知：正常羽毛粉碎后多为条状短节，羽轴结构清楚，羽小枝部分呈片状；而发酵羽毛粉颗粒更小，小段羽轴与羽小枝粉碎效果明显。
图5中左图为扫描电镜下的羽毛粉，右图为发酵羽毛粉，由图5可知：正常羽毛经过粉碎后虽破碎程度发生了变化，羽毛各部分结构完整，表面光滑，形态规律，羽轴与羽小枝表面髓鞘未被破坏，内部结构未打开。经发酵培养后的羽毛粉，羽轴断裂，断面不规则层度加深，髓鞘分解，内部结构多暴露，形成团状或者散条状。
2.2发酵羽毛粉常规营养成分及氨基酸组成分析
由表8可知：乳球菌发酵使羽毛粉能量降低了2％；粗脂肪含量升高了0.3％；粗蛋白含量降低了6.95％；粗灰分含量升高了78.26％；钙含量降低了4.44％；磷含量升高了200％。
表8发酵羽毛粉常规营养成分
由表9可知：乳球菌发酵使羽毛粉蛋氨酸含量升高了2.44％；酪氨酸含量升高了7.25％；其余15种氨基酸含量均有所降低，其中半胱氨酸含量降低了22.38％。
表9发酵羽毛粉氨基酸组成
3讨论与结论
本试验通过视觉观察、光学显微镜和扫描电镜，以三个层次从宏观到微观研究乳球菌发酵对羽毛粉形态结构的改变。本试验宏观观察结果表明，与正常羽毛粉相比，发酵羽毛粉质地相对较致密，羽毛形态保留程度低，粉碎程度较大，颜色稍深。这可能是乳球菌发酵羽毛过程中分解羽毛表面物质，使得内部颜色较深的部分外露，也可能是发酵培养基中葡萄糖经高温高压灭菌后颜色发黄，羽毛粉在其中发酵一段时间颜色随之发生变化。
本试验通过光学显微镜观察乳球菌降解前后羽毛粉的结构结果表明，正常羽毛粉碎后多为条状短节，羽轴结构清楚，羽小枝部分呈片状而发酵羽毛粉颗粒较小，小段羽轴与羽小枝粉碎效果明显，进一步说明乳球菌发酵分解了羽毛表面不同位置，致其断裂，增大了粉碎程度。根据本试验电镜观察中羽轴破碎程度，可以证明本研究乳球菌对羽毛角蛋白的降解作用。
与光学显微镜相比，扫描电镜能直接观察样品表面的结构，制备过程简单，观察过程中，可进行三维空间的平移和旋转，从各种角度对样品进行观察，景深较光学显微镜大几百倍，分辨率也比较高，图像富有立体感，放大范围广，可放大十几倍到几十万倍。本试验扫描电镜观察结果表明，羽毛各部分结构由其表面光滑的完整形态变为团状或者散条状。羽轴与羽小枝表面髓鞘分解明显，原因可能是羽毛结构中二硫键及化学键断裂，使表面粗糙，结构松散。由本试验电镜图片还可以看出部分羽毛结构由排列整齐的条状变为质地疏松的块状，与经过膨化的羽毛粉结构相似，有利于动物体的消化和吸收。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种可降解羽毛的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01，其保藏编号为CGMCC No.15450。
2.权利要求1所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01在发酵降解羽毛中的应用。
3.权利要求1所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01在发酵降解羽毛角蛋白中的应用。
4.一种包含权利要求1所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01的羽毛发酵剂。
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| 羽毛粉加工及应用的研究进展;陈盈霖等;《黑龙江畜牧兽医》;20171010(第19期);第86-90页 * |
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