CN117947118A - 一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产dha的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，包括：使用纤维素酶和褐藻胶裂解酶处理海带得到海带水解液，接种裂殖壶菌进行培养，发酵得到DHA。海带水解液能明显提高裂殖壶菌中DHA的积累水平，并且探究了海带水解液中促进多不饱和脂肪酸DHA积累的关键植物激素，与其他水解液存在明显的不同。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法。
背景技术
褐藻是一类在海洋中生长的大型藻类，其细胞壁富含大量的褐藻胶素，因而呈现出褐色外观。这种海藻内部含有丰富的纤维素和其他多糖类物质，使其成为一种有望用于绿色生物制备的重要资源。其中，海带作为褐藻门下的一种多年生大型食用海藻，不仅营养丰富，而且具备较强的保健作用。
除了作为食材外，海带富含多种物质成分，在医疗、保健和工业等领域具有重要的应用价值。随着我国水产业迅速发展，海带的养殖规模不断扩大。中国在海藻养殖领域已成为全球的领先者。海带富含多种营养成分，主要成分是褐藻胶。通过对海带的加工处理，可以充分提取有效的功能成分，这些成分能够被广泛应用于食品和工业等多个领域，从而提升其价值和利用范围。
脂肪酸在人体内充当着重要的能量来源，其中一些脂肪酸对人体健康十分有益，特别是多不饱和脂肪酸。其中，二十二碳六烯酸（DHA）是一种对人类健康产生重要影响的脂肪酸形式。DHA不仅在促进视觉神经的发育方面发挥作用，还在预防心血管疾病和促进免疫调节等多种生理功能上具有显著的效果。因此，提高人体内DHA含量成为众多研究者们关注的研究重点之一。
在众多研究对象中，海洋微藻展现出显著的生产DHA的潜力。其中，裂殖壶菌成为备受关注的研究领域之一。裂殖壶菌是一种含油量极高的海洋微藻，其脂肪酸成分简单，其中DHA占据总脂肪酸含量的35%以上。这一特性使得在处理与分离纯化时，裂殖壶菌的工艺难度和技术成本相对较低。
裂殖壶菌属于破囊壶菌科（Thraustochytriaceae），其生长方式为异养培养，生长周期短，繁殖速度快，且不受季节环境的影响，这有助于在发酵罐中进行大型培养。因此，裂殖壶菌被认为是一种极具潜力实现工业化生产DHA的微生物。裂殖壶菌作为新型生物资源，以某种改良方法得到高产量DHA成为人们研究的热点问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，对海带进行水解，得到海带水解液。将海带水解液加入裂殖壶菌的发酵培养基中，发酵生产DHA，同时可以筛选海带水解液中关键植物激素对裂殖壶菌的作用。所述方法可以显著提高裂殖壶菌中DHA的积累水平，提高DHA的产量。
本发明采用如下技术方案：
一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，包括：使用纤维素酶和褐藻胶裂解酶处理海带得到海带水解液，接种裂殖壶菌进行培养，发酵得到DHA。
在一些实施方案中，处理海带的具体操作为：新鲜海带以质量1:1的比例分散在水中；依次添加纤维素酶和褐藻胶裂解酶，在pH7.0、40℃的反应条件下，纤维素酶和褐藻胶裂解酶各反应时间4h；反应液离心得到上清液，即海带水解液。
在一些实施方案中，纤维素酶和褐藻胶裂解酶以溶液的形式加入，溶液浓度为3%(w/w)。
在一些实施方案中，接种裂殖壶菌的具体操作为：先将裂殖壶菌菌株在GPY培养基中生长，孵育24h-48h得到种子液，再将种子液加入到含有所述海带水解液的发酵培养基中。
在一些实施方案中，所述的GPY培养基配方为2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母粉、2%海盐。
在一些实施方案中，所述海带水解液的体积为发酵培养基的体积的2%-8%，优选4%。
在一些实施方案中，种子液的体积为发酵培养基的体积的10%。
在一些实施方案中，所述的发酵培养基1L中含有如下成分：Na2SO4 12g，KCI 0.5g，MgSO4 2g，K2SO4 0.65g，(NH4)2SO4 1g，CaCI2·2H20 0.17 g，KH2PO4 1g，葡萄糖40g，酵母粉8g，维生素VB1 0.1g，维生素VB6 0.1g，维生素VB12 0.001g。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
（1）本发明提供了首次将海带水解液作为裂殖壶菌的培养基，能明显提高裂殖壶菌中DHA的积累水平，同时原材料海带易获取且常见，有利于实现大规模的开发与利用。
（2）本发明还探究了海带水解液中所存在的部分植物激素对裂殖壶菌中DHA的积累产生了一定效果，证明了海带水解液能够提高DHA的积累水平的原因，与其他水解液存在明显的不同。
附图说明
图1为MYA-1381发酵3天不同浓度海带水解液对其油脂含量变化曲线；
图2为MYA-1381发酵第三天不同浓度海带水解液对其油脂含量影响；
图3为MYA-1381发酵第三天不同浓度海带水解液对其DHA含量影响；
图4为MYA-1381发酵第三天关键植物激素筛选生物量指标水平。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围。
本发明各种指标的测定方法如下：
生物量测定：每隔12h取样1mL于2ml离心管中。离心管需提前放置在烘箱中烘干并称量管体重量。9000×g离心6min，弃上清液。菌体连同离心管一同放入80℃烘箱烘干至恒重，离心管重量的增加量即为菌株的生物量。
油脂提取：将发酵培养基中发酵液的40ml收集于离心管中，8000×g离心5 min，弃上清液，离心管中加入10 ml的50%（v/v）HCl，在80℃下酸解4 h。然后加入8ml的萃取液（甲醇：氯仿=1:1），上下颠倒混匀，使之充分萃取。转移到摇床，20min，加入50%体积的0.1MNaCl溶液，涡旋混匀并8000×g离心5 min，将下层转移到烧瓶，使用旋转蒸发仪在80 ℃下蒸干，即可测定所产油脂的重量。
脂肪酸成分分析：油脂甲酯化之后然后进行GC-MS分析。仪器型号：Agilent7890A/5975C色谱柱：Agilent HP-INNOWax Polyethylene Glyco （30 m×250μm×0.25 μm）。初始温度为100℃，然后以15℃/min的速率升温到240℃至10 min。每一个峰引入质谱，进行分析，然后将质谱图在数据库中比对，得到与每一个峰中物质最接近的结构。
实施例1 裂殖壶菌种子液的培养
裂殖壶菌（Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381）菌株是从藻种库获得，保存环境温度为-80℃。活化的Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381菌株以GPY培养基为基础，进行种子液的培养。其GPY液体培养基配方是：2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母粉、2%海盐。固体培养基：2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母粉、2%海盐、3%琼脂粉。115℃灭菌30min。使用接种环挑取生长状态良好的裂殖壶菌划线平板单菌落接种于含60mlGPY液体培养基的锥形瓶中。所有步骤均在超净工作台中进行，培养条件为28℃、180rpm，培养时间2d。
实施例2 海带水解液的制备
以1:1(w/v)的比例将新鲜的海带溶解在蒸馏水中。然后向溶液中添加纤维素酶，将其在40℃下孵育4小时。随后，加入褐藻胶裂解酶 Alyw201，并在40℃和pH7.0的条件下继续孵育4小时。通过对反应液进行8000×g的离心操作，得到上清液，即海带水解液。
实施例3 裂殖壶菌的培养
通过显微镜观察，选取生长健康且无污染的菌株作为种子液进行传代培养，以保证裂殖壶菌处于良好健康的生长状态。
选取生长状态良好且无污染的种子液进行裂殖壶菌MYA-1381的发酵培养。发酵培养基1L中含有如下成分：Na2SO4 12g，KCI 0.5g，MgSO4 2g，K2SO4 0.65g，(NH4)2SO4 1g，CaCI2·2H20 0.17 g，KH2PO4 1g，葡萄糖40g，酵母粉8g，维生素VB1 0.1g，维生素VB6 0.1g，维生素VB12 0.001g。为探究海带水解液浓度对裂殖壶菌的影响，海带水解液浓度分别以0、2%、4%、6%和8%加入发酵培养基中，接入种子液，接入量为培养基体积10%。培养菌株的干重变化曲线如图1所示，第3天油脂含量如图2所示，在以海带水解液作为裂殖壶菌的发酵培养基时，观察到裂殖壶菌正常且快速的生长。得出实验结论，海带水解液浓度为4%，发酵3d时，生物量达到高水平。并对其进行油脂中DHA含量的测定，如图2所示，得到0%海带水解液（对照组）DHA浓度6.14g/L，4%海带水解液DHA浓度为8.24g/L，明显高于无海带水解液的组。
实施例4 海带水解液中关键植物激素筛选
近年来，植物激素已被证明是促进各种微藻类胡萝卜素和多不饱和脂肪酸积累的有效方法。本发明考虑到可能是海带水解液中所存在的部分植物激素对裂殖壶菌中DHA的积累产生了一定效果。进而探究海带水解液中不同植物激素对裂殖壶菌的影响。植物激素分别是脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚甲醛（ICA）和水杨酸（SA），以海带水解液（1.5mg/L）浓度计算应加入植物激素含量，培养条件3d、28℃、180rpm。每隔12h取样并进行指标测定。
如图3所示，五种植物激素中ICA、GA3、IAA和ABA均能有效刺激Aurantiochytriumlimacinum ATCC MYA-1381菌株的生长，但只有增加ICA、GA3和ABA才能显著促进多不饱和脂肪酸DHA的积累。在添加ICA、GA3和ABA的培养基中，DHA产量分别为7.36g/L、7.78 g/L和8.16g/L。结果表明，ICA、GA3和ABA是海带水解液中促进多不饱和脂肪酸DHA积累的关键植物激素。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
最后说明的是，以上的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，包括：使用纤维素酶和褐藻胶裂解酶处理海带得到海带水解液，接种裂殖壶菌进行培养，发酵得到DHA。
2.如权利要求1所述的一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，所述处理海带的具体操作为：新鲜海带以质量1:1的比例分散在水中；依次添加纤维素酶和褐藻胶裂解酶，在pH7.0、40℃的反应条件下，纤维素酶和褐藻胶裂解酶各反应时间4h；反应液离心得到上清液，即海带水解液。
3.如权利要求2所述的一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，纤维素酶和褐藻胶裂解酶以溶液的形式加入，溶液浓度为3%(w/w)。
4.如权利要求1所述的一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，所述接种裂殖壶菌的具体操作为：先将裂殖壶菌菌株在GPY培养基中生长，孵育24h-48h得到种子液，再将种子液加入到含有所述海带水解液的发酵培养基中。
5.如权利要求4所述的一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，所述的GPY培养基配方为2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母粉、2%海盐。
6.如权利要求4所述的一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，所述海带水解液的体积为发酵培养基的体积的2%-8%。
7.如权利要求4所述的一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，所述海带水解液的体积为发酵培养基的体积的4%。
8.如权利要求4所述的一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，所述种子液的体积为发酵培养基的体积的10%。
9. 如权利要求4所述的一种利用海带水解液培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其特征在于，所述的发酵培养基1L中含有如下成分：Na2SO4 12g，KCI 0.5g，MgSO4 2g，K2SO4 0.65g，(NH4)2SO4 1g，CaCI2·2H20 0.17 g，KH2PO4 1g，葡萄糖40g，酵母粉8g，维生素VB1 0.1g，维生素VB6 0.1g，维生素VB12 0.001g。
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