CN105349465A - 一种潮间带微小杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体公开了一种潮间带微小杆菌及其应用。本发明菌株为潮间带微小杆菌（<i>Exiguobacterium？aestuarii</i>）CAMT25481，所述菌株于2015年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏号为CGMCC？NO.？11512。菌株CAMT25481对T-2毒素降解率最高可达73.80%，可有效降解T-2毒素，解决了饲料、原料虾受T-2毒素污染无法利用，并严重污染环境的重大问题，为确保原料虾深加工产品的食品安全性奠定基础。

Description

一种潮间带微小杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种潮间带微小杆菌及其应用。

背景技术

T-2毒素是由多种镰刀菌(Fusarium)产生的一种倍半萜类真菌毒素，是单端孢霉烯族毒素类中毒性最强的毒素，其毒性官能团为环氧环、C₉-C₁₀间双键、羟基、乙酰氧基，毒性主要表现为细胞毒性和免疫系统毒性，具有致畸、致癌、致突变的“三致”作用，对人畜健康具有潜在的致癌威胁。T-2毒素普遍存在于水产饲料中，而对虾对真菌毒素具有很强的耐受性，T-2毒素极易在对虾中蓄积。此外，T-2毒素纯品为白色针状晶体，难溶于水，易溶于甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮等极性有机溶剂，性质稳定，有很强的耐热性和紫外线耐受性。有研究报道T-2毒素常温放置6～7年或高温至200℃毒力仍无减弱，不容易清除。因此，养殖对虾中T-2毒素的残留已经严重影响对虾产业链的健康发展。如何有效消解对虾中残留T-2毒素的危害成为亟待解决的问题。目前常见的真菌毒素消除技术有物理法、化学法和生物法。因物理和化学方法降毒不仅收效甚微，且增加不安全性，所以生物降解真菌毒素具有诱人的前景。国内有程波财对抑制镰刀菌及降解两种真菌毒素的益生菌筛选和机理进行了研究，施琦等人从对虾养殖环境中分离到的5株镰孢菌作为试验菌种，在其产毒培养过程中分离出弯曲假单胞菌和尼泊尔葡萄球菌，对T-2毒素的降解率分别为90.9％和85.5％。国外有研究者报道灌木酒神菊属(Baccharisspp.)能将T-2毒素氧化成3'-OHT-2或3'-OHHT-2，降低了其毒性。ChristopherYoung发现鸡肠道混合微生物可清除包括T-2毒素在内的各种单端孢霉烯族化合物。传统发酵虾酱中存在大量有益的发酵微生物，连鑫对传统虾酱中呈味优势菌进行分离鉴定，分离出一株产香季氏毕赤氏酵母(Pichiagilliermondii)，一株产蛋白酶黑曲霉(Aspergillusniger)；孙业盈等人从蜢子虾酱中分离鉴定出一株中度嗜盐菌MKY20，经初步鉴定为枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)中的盐脱氮枝芽孢杆菌(Virgibacillushalodenitrificans)；杜云建等人用米曲霉发酵生产虾酱；袁三平利用乳酸菌发酵虾酱，不仅提高了虾酱的口味，而且降低了虾酱中亚硝酸盐的含量；刘树青利用酵母菌并结合酶解发酵虾酱，不仅增加了虾酱产品的浓香度，更提高了产品的营养成分；孟凌玉采用混合微生物发酵法改良虾头酶解产物风味和发酵工艺。但目前利用虾酱中微生物降解T-2毒素没有报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种潮间带微小杆菌ExiguobacteriumaestuariiCAMT25481，所述菌株具有降解T-2毒素的能力。

本发明的另一目的在于提供上述菌株的应用。

本发明的另一目的在于提供一种T-2毒素的降解剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种潮间带微小杆菌(Exiguobacteriumaestuarii)CAMT25481，所述菌株于2015年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCCNO.11512。

所述菌株CAMT25481的16srRNA的序列结果如SEQIDNO:1所示。

菌株CAMT25481的培养特性为：幼龄培养物为杆菌，老培养物为球状，1.1～1.2μm×1.4～3.2μm，革兰氏阳性；以周生鞭毛运动，兼性厌氧；在营养琼脂上菌落平坦，淡橙色，色素不扩散；不生孢，不抗酸，耐盐；嗜碱，能在pH6.5～11.5生长；化能异养菌，发酵代谢。

菌株CAMT25481的生化性质：产β-葡萄糖苷酸酶、α-葡萄糖苷酶、吡咯烷基芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶，分解蔗糖、D-甘露醇，不产H₂S。

本发明还提供上述潮间带微小杆菌(Exiguobacteriumaestuarii)CAMT25481在降解T-2毒素中的应用。

优选地，所述菌株CAMT25481的浓度为10⁵-10⁷CFU/mL。

优选地，所述T-2毒素的浓度为15-25ng/mL。

本发明还提供一种T-2毒素的降解剂：所述降解剂中含有10⁵-10⁷CFU/mL所述菌株CAMT25481。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：菌株CAMT25481对T-2毒素降解率达73.80％，可有效降解T-2毒素，解决了饲料、原料虾受T-2毒素污染无法利用，并严重污染环境的重大问题，为确保原料虾深加工产品的食品安全性奠定基础。

附图说明

图1为菌株CAMT25481的系统发育树。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1T-2毒素降解微生物的分离纯化

传统虾酱的制备：市售鲜虾经挑选后洗净沥干，打浆后加入虾重30％的食盐，搅拌均匀后分成两部分，一部分作为鲜虾酱样品，另一部分浸没入发酵罐中进行自然发酵，日晒夜露，每天搅拌2次，每次20min，发酵20d后作为发酵虾酱样品。

分别取上述鲜虾酱和发酵虾酱样品2.00g，将两批样品均分为4组，分别加入0、10、20、30ng的T-2毒素，在同等条件下进行微量发酵，在每组发酵1d、5d、10d、15d、20d后，采用LC-MS/MS检测发酵液中的T-2毒素残留量。

T-2毒素的降解率(％)＝[(标准T-2毒素加入量-T-2毒素检测浓度)/标准T-2毒素加入量]×100％。

选择T-2毒素降解率最大的发酵液为目标样本。10倍系列稀释目标发酵液，取1mL3个合适的连续稀释度的样液倾注营养琼脂(NA)平板，每个稀释度做2个平行，37℃培养48h。计算菌落数量，观察并记录各菌落形态特征。根据菌落形态、大小、颜色、形状等选择有代表性的单菌落，编号后用三段划线法划线，将平板倒置于30±1℃培养箱中恒温培养48h。革兰氏染色镜检观察，筛选出样品中的优势菌株为可能的降毒菌株，其中，将分离纯化得到一株菌株编号为CAMT25481。保存待用。

实施例2分离的菌株的鉴定

将实施例1分离得到的菌株CAMT25481用VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡进行生化特征分析，并参考《伯杰细菌鉴定手册》。用16SrRNA分析方法对其进行系统发育分析及菌种鉴定。

菌株CAMT25481的培养特性为：幼龄培养物为杆菌，老培养物为球状，1.1～1.2μm×1.4～3.2μm，革兰氏阳性；以周生鞭毛运动，兼性厌氧；在营养琼脂上菌落平坦，淡橙色，色素不扩散；不生孢，不抗酸，耐盐；嗜碱，能在pH6.5～11.5生长；化能异养菌，发酵代谢。

菌株CAMT25481的生化性质：产β-葡萄糖苷酸酶、α-葡萄糖苷酶、吡咯烷基芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶，分解蔗糖、D-甘露醇，不产H₂S等；具体见表1的鉴定结果。

表1菌株CAMT25481的生化特性

注：+为阳性，－为阴性

菌株CAMT25481的16srRNA测序结果如SEQIDNO:1所示。将获得的序列输入GenBank进行BLAST比对，将相似性相近的序列采用邻接法进行聚类分析并构建系统发育树，结果见图1。初步确定本发明菌株CAMT25481在分类学中的种、属的位置，结果发现本发明的菌株CAMT25481与ExiguobacteriumaestuariiTF-16相似性为99％。

通过形态学特征、生理生化特性及16SrRNA序列分析，菌株CAMT25481鉴定为潮间带微小杆菌(Exiguobacteriumaestuarii)。将所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期是2015年10月19日，菌种保藏号为CGMCCNO.11512，所述菌株分类命名为潮间带微小杆菌株Exiguobacteriumaestuarii。菌株的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例3潮间带微小杆菌CAMT25481对T-2毒素降解能力的测试

将上述菌株CAMT25481的纯培养物接种到含5、10、15、20、25ng/mLT-2毒素的营养肉汤NB中，其中菌株CAMT25481的浓度为10⁵-10⁷CFU/mL；漩涡60s，于30±1℃、180r/min全温摇瓶柜中培养，72h后，分别吸取2mLNB增菌液于离心管中，加入2mL乙酸乙酯，漩涡60s，超声10min，取上层液于另一离心管中(如分层不明显需在离心机下4000r/min离心5min)，重复提取3次，合并提取液。将提取液在60℃氮吹仪下吹干。吸取2mL甲醇水溶液(V/V:3/7)溶解，漩涡30s，超声5min。过0.22μm滤膜，通过LC-MS/MS检测其中T-2毒素含量，记录实验数据。

结果显示，菌株CAMT25481对浓度为5、10、15、20、25ng/mLT-2毒素降解率依次为40.27％，43.56％，56.19％，73.80％，59.41％。当T-2毒素的浓度为15-25ng/mL，所述菌株CAMT25481降解能力较强，最高降解率可达73.80％。

SEQUENCELISTING

<110>广东海洋大学

<120>一种潮间带微小杆菌及其应用

<130>

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>944

<212>DNA

<213>ExiguobacteriumaestuariiCAMT25481

<400>1

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Claims (6)

1.一种潮间带微小杆菌（Exiguobacteriumaestuarii）CAMT25481，其特征在于，所述菌株于2015年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏号为CGMCCNO.11512。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株CAMT25481的16srRNA的序列结果如SEQIDNO:1所示。

3.权利要求1所述的潮间带微小杆菌（Exiguobacteriumaestuarii）CAMT25481在降解T-2毒素中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌株CAMT25481的浓度为10⁵-10⁷CFU/mL。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述T-2毒素的浓度为15-25ng/mL。

6.一种T-2毒素的降解剂，其特征在于，所述降解剂中含有10⁵-10⁷CFU/mL权利要求1所述菌株CAMT25481。