CN103614325B

CN103614325B - 一株戊糖片球菌及其应用

Info

Publication number: CN103614325B
Application number: CN201310610427.9A
Authority: CN
Inventors: 李崎; 朱林江; 蒯辉; 王金晶; 田金凤; 李永仙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: CN103614325A

Abstract

本发明公开了一株戊糖片球菌及其应用，属于发酵技术领域。该戊糖片球菌已于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8322，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株具有较高的耐渗透压能力，将该菌株应用于蚕豆酱传统发酵生产过程，具有耐高盐、缩短蚕豆酱发酵周期的特点。

Description

一株戊糖片球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株戊糖片球菌及其应用，属于发酵技术领域。

背景技术

片球菌属拉丁学名为Pediococcus Claussen，细胞球形且永不延长，直径1.2～2.0μm。在适宜条件下，分裂以水平垂直二个方向形成四联，有时也可出现成对排列，单个细胞罕见，不形成链状。革兰氏染色阳性，不运动，不产芽孢。兼性厌氧，有的菌株在有氧时会抑制生长。化能异养，细胞需要丰富营养的培养基，发酵糖类(主要是单糖和双糖类)。

戊糖片球菌属于片球菌属，菌落圆形、乳白色、光滑、凸起、边缘整齐、不透明、革兰氏染色阳性。戊糖片球菌为美国食品药物管理局认为安全的40种益生菌之一。戊糖片球菌现已被广泛应用于多种传统发酵食品和饮料的生产中，常用于发酵豆奶等的研究。

蚕豆酱是以蚕豆等为原料发酵酿制而成的保持蚕豆酱原形的半流动粘稠体或半固态调味品。蚕豆酱在我国有着悠久的历史，营养丰富，味道鲜美，有助消化，增进食欲，因此深受广大消费者的欢迎。本发明涉及的戊糖片球菌从蚕豆酱传统发酵酱醅中筛选，明显缩短了传统发酵豆瓣酱的发酵周期。

发明内容

本发明提供了一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。

所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），已于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8322，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述的戊糖片球菌分离自安徽某知名酱品的传统方法酿制酱醅，该菌株具有典型特征的M13-PCR指纹，即菌株专一性的特征指纹，如图1所示；测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上比对结果显示，该菌与一株戊糖片球菌（序列ID:gb|JX477168.1|）有最高匹配度。

所述戊糖片球菌能抑制传统豆瓣酱发酵过程中好氧菌的生长、缩短豆瓣酱的发酵周期、耐受20%NaCl。

所述戊糖片球菌为从风味口感较佳的传统方法酿制的豆瓣酱酱醅中筛选所得，平板菌落计数达到5×10⁴CFU/g，其保藏条件如下：从MRS培养基厌氧管中取少量生长良好的菌液移入新鲜的MRS培养基中，37℃厌氧静置培养24h，取0.75mL移入盛有0.25mL无菌甘油40%（v/v）的甘油管中，放-70℃冰箱保存。

所述MRS培养基为：Tryptone10g/L，Yeast Extract5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温-800.1g/L，pH6.2～6.6。

所述戊糖片球菌培养条件为：将甘油管保藏的戊糖片球菌接入MRS液体培养基中，在37℃厌氧静置培养24h至对数中后期，作为种子液。以2%（v/v）接种量将种子液转接至新鲜的MRS培养基中，37℃厌氧静置培养8h至对数期。

本发明还提供了一种所述戊糖片球菌的应用，是将戊糖片球菌种子液在豆瓣酱传统发酵过程的中前期添加到酱醅中，抑制枯草芽孢杆菌等好氧菌的生长，缩短豆瓣酱的发酵周期。

本发明提供了一株戊糖片球菌，该菌可应用于高盐浓度传统发酵豆瓣酱，抑制某些好氧菌的生长，改善豆瓣酱的风味，缩短豆瓣酱的发酵周期。

生物材料保藏

本发明所提供的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），已于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8322，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1Rep-PCR(M13-PCR)扩增指纹图谱，M：DS5000，1：样品。

图2戊糖片球菌盐度耐受性柱形图

具体实施方式

实施例1戊糖片球菌的筛选

从传统发酵豆瓣酱30天至50天酱醅中取1g样品加入到9mL无菌水中，轻微振荡制成悬浊液，将悬浊液梯度稀释，涂布于MRS平板，32℃厌氧培养60h。挑取乳白色单菌落反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。

鉴定主要通过：1)菌落特征观察：用肉眼直接观察，挑选菌落直径在1-1.5mm之间，圆形，表面光滑，乳白色等符合乳杆菌菌落特征的菌株。2)个体形态观察：用光学显微镜革兰氏染色观察。挑选革兰氏阳性、无芽孢的菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。

以2%接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃厌氧静置培养24h。取适量培养液离心2min（4000rpm，4℃），弃尽上清液，得到适量菌体，用天根的细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取基因组DNA。用细菌通用引物对上游引物27F(序列：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物L1401R（5’-GCGTGTGTACAAGACCC-3’）扩增基因组DNA，反应条件为：94℃预变性3min后进入以下循环：94℃变性40s，56℃退火35s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸10min。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将扩增产物寄送上海华大基因测序，如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，确定为戊糖片球菌。

实施例2NaCl耐受性实验

戊糖片球菌NaCl耐受性实验所使用的培养基为不同NaCl终浓度的MRS培养基。MRS培养基为：Tryptone10g L^-1，Yeast Extract5g L^-1，牛肉膏10g L^-1，葡萄糖20g L^-1，乙酸钠5g L^-1，柠檬酸氢二铵2g L^-1，硫酸镁0.58g L^-1，硫酸锰0.25g L^-1，吐温-800.1g L^-1，pH6.2～6.6。NaCl浓度分别为：10%、14%、16%、18%、20%。厌氧管装液量均为15mL每管。培养基灭菌条件为115℃，15min。

以2%接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃厌氧静置培养24h。以10%接种量转接至不同NaCl终浓度的MRS培养基中，37℃厌氧管静置培养20天，如图2所示，戊糖片球菌在NaCl终浓度10%、12%、14%、16%、18%、20%（%：g/100mL）条件下均能生长，其中NaCl终浓度10%、12%条件下生长速度较快，其余条件生长相对缓慢。

实施例3应用于高盐浓度传统发酵蚕豆酱

CGMCC No.8322Pediococcus pentosaceus LBST-L2菌株在MRS液体培养基中厌氧培养2天，作为种子液。将种子液接种至盐度为14%的酱醅，对照为未接种种子液的盐度为14%的酱醅，发酵周期有明显的变化，未接种戊糖片球菌的酱体在约110天后成熟，而接种戊糖片球菌的酱体在约80天后成熟，且好氧杂菌从10⁸CFU/g（未接种戊糖片球菌）降至10⁷CFU/g（接种戊糖片球菌）。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)LBST-L2，于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8322，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.培养权利要求1所述戊糖片球菌的方法，是将甘油管保藏的戊糖片球菌接入MRS液体培养基中，在37℃厌氧静置培养24h至对数中后期，作为种子液。

3.根据权利要求所述2的方法，其特征在于，所述MRS液体培养基组分为：Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温-800.1g/L，pH6.2～6.6。

4.应用权利要求1所述戊糖片球菌于豆瓣酱发酵的方法，是将戊糖片球菌种子液在豆瓣酱传统发酵过程的中前期添加到酱醅中。