JP2022159411A - アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントおよび使用の方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントを提供する。【解決手段】本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントのポリペプチドおよびコード核酸を提供する。本発明はまた、当該バリアントを発現する細胞も提供する。本発明は、3-ヒドロキシブチルアルデヒド（3-HBal）および／もしくは1,3-ブタンジオール（1,3-BDO）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントを発現する細胞を培養する工程、またはそのような細胞の溶解物を使用する工程を含む方法をさらに提供する。本発明は、4-ヒドロキシブチルアルデヒド（4-HBal）および／もしくは1,4-ブタンジオール（1,4-BDO）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントを発現する細胞を培養する工程、またはそのような細胞の溶解物を使用する工程を含む方法をさらに提供する。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４８０，１９４号に対する利益を主張し、その全体の内容が本明細書に参考として援用される。
以下の仮国際出願について参照がなされ、それらはその全体が参照により本明細書に組み込まれている：（１）２０１７年３月３１日出願の「３－ＨＹＤＲＯＸＹＢＵＴＹＲＹＬ－ＣＯＡ ＤＥＨＹＤＲＯＧＥＮＡＳＥ ＶＡＲＩＡＮＴＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ」という表題の米国仮出願第６２／４８０，２０８号（代理人整理番号１２９５６－４０９－８８８）；（２）２０１７年３月３１日出願の「ＰＲＯＣＥＳＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＯＢＴＡＩＮＩＮＧ １，３－ＢＵＴＡＮＥＤＩＯＬ ＦＲＯＭ ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＢＲＯＴＨＳ」という表題の米国仮出願第６２／４８０，２７０号（代理人整理番号１２９５６－４０７－８８８）；（３）本出願と同日付出願の「３－ＨＹＤＲＯＸＹＢＵＴＹＲＹＬ－ＣＯＡ ＤＥＨＹＤＲＯＧＥＮＡＳＥ ＶＡＲＩＡＮＴＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ」という表題の国際特許出願第＿号（代理人整理番号１２９５６－４０９－２２８）；および（４）本出願と同日付出願の「ＰＲＯＣＥＳＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＯＢＴＡＩＮＩＮＧ １，３－ＢＵＴＡＮＥＤＩＯＬ ＦＲＯＭ ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＢＲＯＴＨＳ」という表題の国際特許出願第＿号（代理人整理番号１２９５６－４０７－２２８）。
本出願は、２０１８年３月２７日に作成された「１２９５６－４０８－２２８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という表題の、４９８，０６１バイトのサイズを有する、ＡＳＣＩＩテキストファイルとしての配列表を参照により本明細書に組み込む。
本発明は一般に、所望の生成物を生成するように工学的に操作された生物体、所望の生成物の生成を促進する工学的に操作された酵素に、より具体的には３－ヒドロキシブチルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、４－ヒドロキシブチルアルデヒド、１，４－ブタンジオールなどの所望の生成物ならびに関連する生成物およびそれに由来する生成物を生成する酵素および細胞に関する。
様々な大量生産型化学製品が、商業的用途のための所望の製品を製造するために用いられる。大量生産型化学製品の多くは、石油に由来する。そのような大量生産型化学製品は、溶媒、樹脂、ポリマー前駆体および特殊化学品としての用途を含む、様々な用途を有する。所望の大量生産型化学製品としては、４炭素分子、例として、上流前駆体および下流生成物である１，４－ブタンジオールおよび１，３－ブタンジオールが挙げられる。石油ベースの製品のための再生可能な供給源を提供するための、ならびにより低いエネルギーおよび資本集約的なプロセスを提供するための、大量生産型化学製品の生成のための方法を開発することは望ましい。
したがって、所望の生成物の生成を促進する方法の必要性が存在している。本発明は、この必要性を満たし、関連する利点も提供する。
本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントのポリペプチドおよびコード核酸を提供する。本発明はまた、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントを発現する細胞も提供する。本発明は、３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントを発現する細胞を培養する工程、またはそのような細胞の溶解物を使用する工程を含む方法をさらに提供する。本発明は、４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントを発現する細胞を培養する工程、またはそのような細胞の溶解物を使用する工程を含む方法をさらに提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列をコードする核酸分子であって、前記アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を含む、核酸分子；
（ｂ）高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）の前記核酸にハイブリダイズし、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数をコードする核酸配列を含む核酸分子；
（ｃ）ループＡ（配列番号５）および／またはループＢ（配列番号６）のコンセンサス配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子であって、前記アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を含む、核酸分子；ならびに
（ｄ）（ａ）または（ｂ）に相補的な核酸分子
から選択される単離された核酸分子。
（項目２）
前記１つまたは複数のアミノ酸置換以外の前記アミノ酸配列が、配列番号１、２もしくは３でまたは表４で参照されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するか、またはこれと同一である、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３）
前記アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個を含む、項目１または２に記載の核酸。
（項目４）
項目１から３のいずれか一項に記載の核酸分子を含有するベクター。
（項目５）
発現ベクターである、項目４に記載のベクター。
（項目６）
二本鎖ＤＮＡを含む、項目４または５に記載のベクター。
（項目７）
配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を含む、単離されたポリペプチド。
（項目８）
ループＡ（配列番号５）および／またはループＢ（配列番号６）のコンセンサスアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
（項目９）
配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を含み、前記１つまたは複数のアミノ酸置換以外の前記アミノ酸配列が、配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するか、またはこれと同一である、単離されたポリペプチド。
（項目１０）
前記アミノ酸配列が、１～１００個のアミノ酸位置における保存的アミノ酸置換をさらに含み、前記位置が、表１、２および／または３で示される前記１つまたは複数のアミノ酸置換以外である、項目９に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１１）
前記アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示される前記１つまたは複数のアミノ酸置換以外に、親配列と比較して２～３００個のアミノ酸位置で改変を含まず、前記位置が、配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照される前記アミノ酸配列のうちの２、３、４または５つと同一である位置から選択される、項目７から１０のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１２）
前記アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個を含む、項目７から１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１３）
アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、項目７から１２のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１４）
３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換し得る、項目７から１３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１５）
４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換し得る、項目７から１３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１６）
親ポリペプチドと比べてより高い活性を有する、項目７から１５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１７）
３－ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチリルＣｏＡよりも３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチリルＣｏＡについてより高い活性を有する、項目７から１４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１８）
アセチルＣｏＡよりも３－ヒドロキシブチリルＣｏＡについてより高い特異性を有する、項目７から１４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１９）
アセチルＣｏＡよりも４－ヒドロキシブチリルＣｏＡについてより高い特異性を有する、項目７から１３または１５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目２０）
細胞または細胞抽出物における副産物の生成を低減する、項目７から１５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目２１）
前記副産物が、エタノールまたは４－ヒドロキシ－２－ブタノンである、項目２０に記載の単離されたポリペプチド。
（項目２２）
親ポリペプチドと比べてより高いｋｃａｔを有する、項目７から１５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
（項目２３）
項目４から６のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
（項目２４）
項目１から３のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
（項目２５）
前記核酸分子が、前記細胞の染色体に組み込まれている、項目２４に記載の細胞。
（項目２６）
前記組込みが、部位特異的である、項目２５に記載の細胞。
（項目２７）
前記核酸分子が発現される、項目２３から２６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２８）
項目７から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む細胞。
（項目２９）
微生物体である、項目２３から２８のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３０）
前記微生物体が、細菌、酵母または真菌である、項目２９に記載の細胞。
（項目３１）
単離された真核細胞である、項目２３から２８のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３２）
３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成する経路を含む、項目２３から３１のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３３）
４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成する経路を含む、項目２３から３１のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３４）
発酵することができる、項目２３から３３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３５）
前記ポリペプチドについての少なくとも１つの基質をさらに含む、項目２３から３４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３６）
前記基質が、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡである、項目３５に記載の細胞。
（項目３７）
前記基質が、３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチリルＣｏＡである、項目３６に記載の細胞。
（項目３８）
３－ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチリルＣｏＡよりも３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチリルＣｏＡについてより高い活性を有する、項目３６または３７に記載の細胞。
（項目３９）
前記基質が、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡである、項目３５に記載の細胞。
（項目４０）
生物触媒としての、項目７から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
（項目４１）
項目７から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび前記ポリペプチドについての少なくとも１つの基質を含む組成物。
（項目４２）
前記ポリペプチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で前記基質と反応することができる、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記基質が、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡである、項目４１または４２に記載の組成物。
（項目４４）
前記基質が、３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチリルＣｏＡである、項目４３に記載の組成物。
（項目４５）
前記基質が、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡである、項目４１または４２に記載の組成物。
（項目４６）
項目２３から３９のいずれか一項に記載の細胞を含む培地。
（項目４７）
項目４から６のいずれか一項に記載のベクターを、発酵することができる細胞に導入する工程を含む、宿主株を構築する方法。
（項目４８）
３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、項目２３から３９のいずれか一項に記載の細胞を培養して、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたはそのエステルもしくはアミドを生成する工程を含む方法。
（項目４９）
４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、項目２３から３９のいずれか一項に記載の細胞を培養して、４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯまたはそのエステルもしくはアミドを生成する工程を含む方法。
（項目５０）
前記細胞が、実質的に嫌気性の培地中にある、項目４８または４９に記載の方法。
（項目５１）
前記３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは前記４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯ、またはそのエステルもしくはアミドを単離または精製する工程をさらに含む、項目４８から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記単離または精製する工程が、蒸留を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
生物由来３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを含む培地であって、前記生物由来３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯが、大気二酸化炭素取り込み供給源を反映する炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の同位体比を有し、前記生物由来３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯが、項目２３から３９のいずれか一項に記載の細胞または項目４８から５２のいずれか一項に記載の方法によって生成される、培地。
（項目５４）
前記細胞から分離されている、項目５３に記載の培地。
（項目５５）
大気二酸化炭素取り込み供給源を反映する炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の同位体比を有する、３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）または４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）であって、項目２３から３９のいずれか一項に記載の細胞または項目４８から５２のいずれか一項に記載の方法によって生成される、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯ。
（項目５６）
少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のＦｍ値を有する、項目５５に記載の３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯ。
（項目５７）
項目２３から３９のいずれか一項に記載の細胞または項目４８から５２のいずれか一項に記載の方法によって生成された３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）または４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）。
（項目５８）
大気二酸化炭素取り込み供給源を反映する炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の同位体比を有する３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／または１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）であって、項目２３から３９のいずれか一項に記載の細胞または項目４８から５２のいずれか一項に記載の方法によって生成され、Ｒ形態のエナンチオマーが富化されている３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯ。
（項目５９）
少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のＦｍ値を有する、項目５８に記載の３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯ。
（項目６０）
項目２３から３９のいずれか一項に記載の細胞または項目４８から５２のいずれか一項に記載の方法によって生成された３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／または１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）であって、Ｒ形態のエナンチオマーが富化されている３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯ。
（項目６１）
前記Ｒ形態が、前記３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯの９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％を超える、項目６０に記載の３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯ。
（項目６２）
項目５８から６１のいずれか一項に記載の３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯ、ならびにそれぞれ、前記３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ以外の化合物を含む組成物。
（項目６３）
前記３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは前記４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯ以外の前記化合物が、それぞれ、前記３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは前記４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを生成するか、または項目７から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞の部分である、項目６２に記載の組成物。
（項目６４）
項目５５から６１のいずれか一項に記載の３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯ、または前記３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは前記４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを生成する細胞の細胞溶解物もしくは培養上清を含む組成物。
（項目６５）
項目５５から６１のいずれか一項に記載の３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを含む製品であって、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリエステル、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマー、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンまたはブタジエンベースの製品である製品。
（項目６６）
化粧品または食品添加物である、項目６５に記載の製品。
（項目６７）
少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％の生物由来３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは生物由来４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを含む、項目６５または６６に記載の製品。
（項目６８）
繰返し単位として、生成された３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは生成された４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯの部分を含む、項目６５から６７のいずれか一項に記載の製品。
（項目６９）
項目６５、６７または６８のいずれか一項に記載の製品を成型することによって得られた成型製品。
（項目７０）
項目６５から６８のいずれか一項に記載の製品を生成するためのプロセスであって、前記製品を生成する反応において、前記３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは前記４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを、それ自体または別の化合物と化学反応させる工程を含むプロセス。
（項目７１）
項目６９に記載の製品を生成するためのプロセスであって、前記製品を生成する反応において、前記３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは前記４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを、それ自体または別の化合物と化学反応させる工程を含むプロセス。
（項目７２）
３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、基質を項目７から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドに提供する工程と、前記基質を３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯに転換する工程とを含み、前記基質が、１，３－ヒドロキシブチリルＣｏＡのラセミ混合物である、方法。
（項目７３）
前記３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯは、Ｒ形態のエナンチオマー的が富化されている、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、基質を項目７から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドに提供する工程と、前記基質を４－ＨＢａｌおよび／または１，４－ＢＤＯに転換する工程とを含み、前記基質が、１，４－ヒドロキシブチリルＣｏＡである、方法。
（項目７５）
前記ポリペプチドが、細胞中、細胞溶解物中に存在するか、または細胞もしくは細胞溶解物から単離される、項目７２から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを生成するための方法であって、項目２３から３９のいずれか一項に記載の細胞の溶解物をインキュベートして、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを生成する工程を含む方法。
（項目７７）
前記細胞溶解物が、第２の細胞溶解物と混合され、前記第２の細胞溶解物が、項目７から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドの基質、または３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯの下流生成物を生成する酵素活性を含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
項目７から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成するための方法であって、細胞において前記ポリペプチドを発現する工程を含む方法。
（項目７９）
項目７から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成するための方法であって、項目１から３のいずれか一項に記載の核酸または項目４から６に記載のベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳して、前記ポリペプチドを生成する工程を含む方法。
図１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む例示的な１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）経路を示す。図１は、アセトアセチルＣｏＡから１，３－ブタンジオールへの経路を示す。酵素は：（Ａ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存型、アルデヒド形成）；（Ｂ）３－オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）；（Ｃ）１，３－ブタンジオールデヒドロゲナーゼとも本明細書で呼ばれる３－ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；（Ｄ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存型、アルコール形成）；（Ｅ）３－オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）；（Ｆ）４－ヒドロキシ，２－ブタノンレダクターゼ；（Ｇ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；（Ｈ）３－ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼとも本明細書で呼ばれる３－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；および（Ｉ）３－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）である。
図２は、アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む例示的な１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）経路を示す。生合成反応を触媒する酵素は：（１）スクシニルＣｏＡシンテターゼ；（２）ＣｏＡ非依存型コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（３）α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ；（４）グルタミン酸：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ；（５）グルタミン酸デカルボキシラーゼ；（６）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（７）４－ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ（４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼとも呼ばれる）；（８）α－ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；（９）４－ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ；（１０）酪酸キナーゼ（４－ヒドロキシ酪酸キナーゼとも呼ばれる）；（１１）ホスホトランスブチリラーゼ（ホスホ－トランス－４－ヒドロキシブチリラーゼとも呼ばれる）；（１２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（４－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼとも呼ばれる）；（１３）アルコールデヒドロゲナーゼ（４－ヒドロキシブタナールレダクターゼまたは４－ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼとも呼ばれる）である。
図３は、ＡＬＤ－１、ＡＬＤ－２およびＡＬＤ－３の配列アラインメントを示す。配列は、それぞれ、配列番号１、２および３に対応する。図中の下線部は、２つのループ領域であり、第１番目はＡと名付けられ、第２番目はＢと名付けられ、両方とも、本明細書で決定されるように基質特異性およびエナンチオマー特異性に関与する。ＡＬＤ－１のループＡは、配列ＬＱＫＮＮＥＴＱＥＹＳＩＮＫＫＷＶＧＫＤ（配列番号１２４）であり、ＡＬＤ－２のループＡは、配列ＩＧＰＫＧＡＰＤＲＫＦＶＧＫＤ（配列番号１２５）であり、ＡＬＤ－３のループＡは、配列ＩＴＰＫＧＬＮＲＮＣＶＧＫＤ（配列番号１２６）である。ＡＬＤ－１のループＢは、配列ＳＦＡＧＶＧＹＥＡＥＧＦＴＴＦＴＩＡ（配列番号１２７）であり、ＡＬＤ－２のループＢは、配列ＴＹＣＧＴＧＶＡＴＮＧＡＨＳＧＡＳＡＬＴＩＡ（配列番号１２８）であり、ＡＬＤ－３のループＢは、配列ＳＹＡＡＩＧＦＧＧＥＧＦＣＴＦＴＩＡ（配列番号１２９）である。ＡＬＤ－２由来の基質特異性ループＡおよびＢの配列および長さは、ＡＬＤ－１およびＡＬＤ－３の配列および長さとは異なる；それにもかかわらず、アラインメントは、本明細書に記載するように置換についての対応する位置の特定を容易にするのに十分な保存を示し、とりわけ、図６に示されるように３Ｄモデリングと組み合わせた場合、十分な保存を示す。ＡＬＤ－３を、結晶構造のモデリングについての鋳型として用いた；とりわけ、本明細書に記載するように例示的な置換で改変した場合、基質特異性およびエナンチオマー特異性に影響を及ぼすように相互作用する２つのループ領域を示す図６を参照されたい。ＡＬＤ－１およびＡＬＤ－３は、５１．９％同一である。ＡＬＤ－１およびＡＬＤ－２は、３５．９％同一である。ＡＬＤ－３およびＡＬＤ－２は、４０％同一である。ＡＬＤ－１、ＡＬＤ－２およびＡＬＤ－３のアラインメントに基づいたループＡについての一致は、ＩＸＰＫＧ－－－－－ＸＸＮＲＫＸＶＧＫＤ（配列番号５）である。ＡＬＤ－１、ＡＬＤ－２およびＡＬＤ－３のアラインメントに基づいたループＢについての一致は、ＳＹＡＧＸＧＸＸＸＥ－－－－ＧＦＸＴＦＴＩＡ（配列番号６）である。コンセンサス配列中の具体的に特定されたアミノ酸は保存残基であり、一方で、「Ｘ」で印をつけた位置は可変であり、本明細書で所望され、開示されるように、任意のアミノ酸に対応し得ることが理解される。「－－－－－」は、可変数のアミノ酸残基の存在または非存在に対応し得ることがさらに理解される。そのような可変数のアミノ酸残基の例は、図３および４Ａ～４Ｃで示される。さらに、コンセンサス配列中の保存残基は、例えば、本明細書に記載するように、保存的アミノ酸により置換され得ることが理解される（例えば図４Ａ～４Ｃを参照）。
図４Ａ～４Ｃは、例示的なアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ：ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のアラインメントを示し、その代表的なアラインメントは、本発明の置換が行われ得る代表的な鋳型ＡＬＤ配列中の位置に対応する、ＡＬＤ中の位置を特定することを示す。図３と同様に、下線部は、２つのループ領域であり、第１番目はＡと名付けられ、第２番目はＢと名付けられ、両方とも、本明細書で決定されるように基質特異性およびエナンチオマー特異性に関与する。図４Ａは、ＡＬＤ－１と比較して４０～５５％カットオフでの例示的なＡＬＤ配列のアラインメントを示す。配列は、図４Ａに示されるように配列番号１（ＡＬＤ－１）、１３、２０および２４に対応する。図４Ｂは、ＡＬＤ－１と比較して７５～９０％カットオフでの例示的なＡＬＤ配列のアラインメントを示す。配列は、図４Ｂに示されるように配列番号１（ＡＬＤ－１）、３０、３３および３７に対応する。ループＡおよびＢを下線で示す。図４Ｃは、ＡＬＤ－１と比較して９０％カットオフでの例示的なＡＬＤ配列のアラインメントを示す。配列は、図４Ｃに示されるように配列番号１（ＡＬＤ－１）、３８、４０および４４に対応する。ＡＬＤ－１は、配列番号３８、４０および４４と、それぞれ、９９％、９７％および９５％同一である。図４Ａ～４Ｃは、本明細書で教示される置換についての対応する位置が、ＡＬＤ－１と少なくとも４０％同一性を有するＡＬＤ、とりわけループＡおよびＢ領域、とりわけ非常に保存されているループＢ領域において特定され得ることを示す。 同上 同上
図５Ａおよび５Ｂは、様々な例示的なアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性を示す。図５Ａは、３ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチルアルデヒド（バーの組の左のバー）および３ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチルアルデヒド（バーの組の右のバー）に対するＡＬＤ－２、ＡＬＤ－１およびＡＬＤ－１バリアントの比活性を示す。図５Ｂは、３－ヒドロキシブチルアルデヒドのＲ形態のＳ形態に対する活性の比を示す。 図５Ａおよび５Ｂは、様々な例示的なアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性を示す。図５Ａは、３ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチルアルデヒド（バーの組の左のバー）および３ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチルアルデヒド（バーの組の右のバー）に対するＡＬＤ－２、ＡＬＤ－１およびＡＬＤ－１バリアントの比活性を示す。図５Ｂは、３－ヒドロキシブチルアルデヒドのＲ形態のＳ形態に対する活性の比を示す。
図６Ａ～６Ｃは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ９５９の構造のリボン図を示す。図は、３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチルアルデヒド（図６Ａ）または３－ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチルアルデヒド（図６Ｂ）の、９５９の構造へのドッキングを示す。図６Ｃは、３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチルアルデヒド（Ｒ３ＨＢ）と同じ向きを示す。
本発明は、望ましい特性を有し、所望の生成物を生成するのに有用な酵素バリアントに関する。特定の実施形態では、本発明は、天然に存在する野生型酵素と比較して顕著に異なる構造および／または機能特徴を有する酵素バリアントである、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントに関する。したがって、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、天然に存在する酵素ではない。本発明のそのようなアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、工学的に操作された細胞、例として、所望の生成物を生成するように工学的に操作された微生物体（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）において有用である。例えば、本明細書で開示されるように、代謝経路を有する細胞、例として、微生物体は、所望の生成物を生成し得る。望ましい特徴を有する本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素活性を用いて所望の生成物を生成する代謝経路を有する細胞、例として、微生物体に導入することができる。そのようなアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の反応を行うための生物触媒としてさらに有用である。したがって、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、工学的に操作された細胞、例として、微生物体において利用して所望の生成物を生成するか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ生物触媒として利用して所望の生成物を生成することができる。
本明細書で用いる場合、本発明の細胞、微生物体または微生物に関して用いられる場合、用語「天然に存在しない」は、その細胞が、その参照種の野生型株を含むその参照種の天然株で通常見られない、少なくとも１つの遺伝的変化を有することを意味するものとする。遺伝的変化には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸の付加、核酸欠失および／または細胞遺伝物質の他の機能的破壊が含まれる。そのような改変には、例えば、参照種の異種の、同種の、または異種および同種のポリペプチドのコード領域およびその機能的断片が含まれる。追加の改変には、例えば、その改変が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が含まれる。例示的な代謝ポリペプチドには、所望の生成物を生成するための生合成経路内の酵素またはタンパク質が含まれる。
代謝改変は、その天然の状態から変更された生化学反応を指す。したがって、天然に存在しない細胞は、代謝ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸に対する遺伝子改変を有することができる。例示的な代謝改変が、本明細書で開示される。
本明細書で用いる場合、細胞または微生物体に関して用いられる場合、用語「単離された」は、そのような細胞が天然に見出される場合に、参照の細胞が天然で見られるような少なくとも１つの成分を実質的に含まない細胞を意味するものとする。本用語は、その天然環境で見られるような一部または全ての成分が除去されている細胞を含む。本用語は、その細胞が天然に存在しない環境で見られるような一部または全ての成分が除去されている細胞も含む。したがって、単離された細胞は、それが天然で見られるか、またはそれが天然に存在しない環境で増殖され、保存されるか生存するような他の物質から一部または完全に分離される。単離された細胞の具体例には、部分的に純粋な細胞、実質的に純粋な細胞、および天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。
本明細書で用いる場合、用語「微生物の」、「微生物体」または「微生物」は、古細菌、細菌または真核生物のドメインに含まれる、微視的細胞として存在する任意の生物体を意味するものとする。したがって、本用語は、顕微鏡的大きさを有する原核生物または真核生物の細胞または生物体を包含するものとし、全ての種の細菌、古細菌および真正細菌、ならびに酵母および真菌類などの真核生物の微生物を含む。本用語は、生化学物質の生成のために培養することができる、任意の種の細胞培養物も含む。
本明細書で用いる場合、用語「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」は、活性酵素系を形成するためにその存在が多くの酵素（アポ酵素）の活性のために必要とされる、有機コファクターまたは補欠分子族（酵素の非タンパク部分）を意味するものとする。補酵素Ａは、特定の縮合酵素で機能し、アセチルまたは他のアシル基転移、ならびに脂肪酸合成および酸化、ピルベート酸化ならびに他のアセチル化で作用する。
本明細書で用いる場合、培養または増殖条件に関して用いられる場合、用語「実質的に嫌気性」は、酸素の量が、液体培地中の溶存酸素の飽和量の約１０％未満であることを意味するものとする。本用語は、約１％未満の酸素の雰囲気で維持される、液体または固体培地の密封チャンバー、も含むものとする。
本明細書で用いる「外因性」は、参照分子または参照活性が宿主の細胞に導入されることを意味するものとする。分子は、例えば、宿主染色体への組込みなどによる宿主遺伝物質へのコード核酸の導入によって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して用いられる本用語は、細胞への発現可能な形でのコード核酸の導入を指す。生合成活性に関して用いられる場合、本用語は、宿主参照生物体に導入される活性を指す。供給源は、例えば、宿主の微生物体への導入の後に参照活性を発現する、同種または異種のコード核酸であってよい。したがって、用語「内因性」は、宿主に存在する参照分子または活性を指す。同様に、コード核酸の発現に関して用いられる場合、本用語は、細胞に含まれるコード核酸の発現を指す。用語「異種の」は、参照種以外の供給源に由来する分子または活性を指し、「同種の」は、宿主細胞に由来する分子または活性を指す。したがって、本発明のコード核酸の外因性の発現は、異種または同種のコード核酸のいずれかまたは両方を利用することができる。
２つ以上の外因性核酸が微生物体に含まれる場合、こうした２つ以上の外因性核酸は、上記で論じた参照のコード核酸または生合成活性を指すことが理解される。本明細書で開示されるように、そのような２つ以上の外因性核酸は、宿主細胞の別個の核酸分子上に、ポリシストロニック核酸分子上に、またはそれらを組み合わせて宿主細胞に導入することができ、そしてそれは依然として、２つ以上の外因性核酸とみなすことができることがさらに理解される。例えば、本明細書で開示されるように、細胞を工学的に操作して、所望の酵素またはタンパク質、例えば、経路の酵素またはタンパク質をコードする２つ以上の外因性核酸を発現させることができる。所望の活性をコードする２つの外因性核酸が宿主細胞に導入される場合、こうした２つの外因性核酸は、単一の核酸として、例えば、単一のプラスミド上にもしくは別個のプラスミド上に導入することができ、宿主染色体の単一の部位もしくは複数の部位へと組み込むこともでき、そしてそれは依然として、２つの外因性核酸とみなすことができることが理解される。同様に、３つ以上の外因性核酸は、任意の所望の組合せで、宿主の生物体へと、例えば、単一のプラスミド上にもしくは別個のプラスミド上に導入することができ、宿主染色体の単一の部位もしくは複数の部位へと組み込むことができ、そしてそれは依然として、２つ以上の外因性核酸、例えば、３つの外因性核酸とみなすことができることが理解される。したがって、参照される外因性の核酸または生合成活性の数は、宿主生物体へと導入された別々の核酸の数ではなく、コード核酸の数または生合成活性の数を指す。
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子破壊」またはその文法的均等物は、コードされた遺伝子生成物を不活性化または減弱させる遺伝的変化を意味するものとする。遺伝的変化は、例えば、全遺伝子の欠失、転写もしくは翻訳に必要な調節配列の欠失、トランケートされた遺伝子生成物をもたらす遺伝子の一部の欠失またはコードされた遺伝子生成物を不活性化もしくは減弱させる様々な変異戦略のいずれかによるものであり得る。完全遺伝子破壊は、本発明の天然に存在しない細胞において遺伝子復帰変異の発生を低下または排除するので、それは、遺伝子欠失の１つの特に有用な方法である。遺伝子破壊はまた、ヌル変異も含み、これは、ＲＮＡに転写されない、かつ／または機能的遺伝子生成物に翻訳されない遺伝子をもたらす、遺伝子または遺伝子を含有する領域内の変異を指す。そのようなヌル変異は、例えば、不活性化点変異、遺伝子の一部の欠失、全遺伝子欠失または染色体セグメントの欠失を含む、多くの種類の変異から生じ得る。
本明細書で用いる場合、生化学生成物の生成に関して用いられる場合、用語「増殖連結型の」は、参照の生化学生成物の生合成が微生物の増殖期の間に生成されることを意味するものとする。特定の実施形態では、増殖連結型の生成は、必須である場合があり、これは、参照の生化学物質の生合成が、微生物の増殖期の間に生成される必須の生成物であることを意味する。
本明細書で用いる場合、用語「減弱させる」またはその文法的均等物は、酵素またはタンパク質の活性または量を弱めるか、低下させるか、または減少させることを意味するものとする。酵素またはタンパク質の活性または量の減弱は、減弱のために活性または量が所与の機能に必要とされる臨界レベル未満に落ちる場合、完全な破壊を模倣し得る。しかしながら、完全な破壊、例えば、１つの経路についての完全な破壊を模倣する酵素またはタンパク質の活性または量の減弱は、それでも、別の経路が機能し続けるのに十分であり得る。例えば、内因性酵素またはタンパク質の減弱は、本発明の所望の生成物の生成のための同じ酵素またはタンパク質の完全な破壊を模倣するのに十分であり得るが、酵素またはタンパク質の残りの活性または量は、それでも、他の経路、例として、宿主細胞が生存、再生または増殖するのに重要な経路を維持するのに十分であり得る。酵素またはタンパク質の減弱はまた、本発明の所望の生成物の収率を増大するのに十分な量の酵素またはタンパク質の活性または量を弱めるか、低下させるか、または減少させることであり得るが、酵素またはタンパク質の完全な破壊を必ずしも模倣しない。
本発明の天然に存在しない細胞は安定した遺伝的変化を含むことができ、それは変化を失わずに５世代を超えて培養することができる細胞を指す。一般に、安定した遺伝的変化には、１０世代を超えて存続する改変が含まれ、特に安定した改変は約２５世代を超えて存続し、より詳しくは、安定した遺伝子改変は無期限を含めて５０世代を超える。
遺伝子破壊の場合、特に有用な安定な遺伝的変化は、遺伝子欠失である。安定な遺伝的変化を導入するための遺伝子欠失の使用は、遺伝的変化前の表現型への復帰変異の可能性を低下させるために特に有用である。例えば、安定な増殖連結型の生化学物質の生成は、例えば、１組の代謝改変内の１つまたは複数の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の欠失によって達成され得る。増殖連結型の生化学物質の生成の安定性は、複数の欠失を通して、各破壊した活性について発生する複数の代償的復帰変異の可能性を顕著に低下させ、さらに増強させることができる。
当業者は、本明細書で例示される代謝改変を含む遺伝的変化が、Ｅ．ｃｏｌｉなどの適切な宿主細胞または生物体およびそれらの対応する代謝反応、または所望の遺伝物質、例えば所望の代謝経路の遺伝子に適する供給源細胞または生物体に関して記載されることを理解するであろう。しかし、多種多様な生物体の完全なゲノム配列決定およびゲノミクスの領域における高レベルの技術を考慮して、当業者は、本明細書で提供される教示および指針を事実上他の全ての生物体に適用することが容易にできる。例えば、本明細書で例示したＥ．ｃｏｌｉの代謝改変は、参照種以外の種からの同じであるか類似したコード核酸を組み込むことによって、他の種に容易に適用することができる。そのような遺伝的変化には、例えば、一般には種のホモログの遺伝的変化、より詳細には、オルソログ、パラログまたは非オルソロガスな遺伝子置換が含まれる。
オルソログは、垂直伝達（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｄｅｓｃｅｎｔ）が関係し、異なる生物体での実質的に同じか同一の機能の役割を担う１つまたは複数の遺伝子である。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼおよびヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能のためのオルソログと考えることができる。遺伝子は、例えば、それらが同種であるか共通祖先からの進化によって関係していることを示すのに十分な量の配列類似性をそれらが共有する場合、垂直伝達が関係している。それらが、一次配列類似性が識別可能でない程度までそれらが共通祖先から進化したことを示すのに十分な量の三次元構造を共有するが必ずしも配列類似性を共有しない場合にも、遺伝子はオルソログと考えることができる。オルソロガスである遺伝子は、約２５％～１００％アミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードすることができる。それらの三次元構造も類似性を示す場合、２５％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子も、垂直伝達によって生じたと考えることができる。組織プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼを含む、酵素のセリンプロテアーゼファミリーのメンバーは、共通祖先から垂直伝達によって生じたと考えられる。
オルソログには、例えば進化を通して構造または全体的活性が異なった、遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子生成物が含まれる。例えば、１つの種が２つの機能を示す遺伝子生成物をコードし、そのような機能が第２の種の異なる遺伝子に分離されている場合、３つの遺伝子およびそれらの対応する生成物はオルソログであるとみなされる。生化学生成物の生成については、当業者は、天然に存在しない細胞の構築のために、導入または破壊される代謝活性を抱えているオルソロガス遺伝子が選択されるべきであることを理解するであろう。分離できる活性を示すオルソログの例は、異なる活性が２つ以上の種の間で、または単一の種の中で異なる遺伝子生成物に分離されている場合である。具体例は、セリンプロテアーゼ活性の２つの型であるエラスターゼタンパク質分解およびプラスミノーゲンタンパク質分解の、プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼのような異なる分子への分離である。第２の例は、マイコプラズマ５’－３’エキソヌクレアーゼおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。第１の種からのＤＮＡポリメラーゼは、第２の種からのエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼの一方または両方にオルソログであると、またはその逆とみなすことができる。
対照的に、パラログは、例えば複製とそれに続く進化的分岐によって関係があるホモログであり、類似または共通しているが、同一でない機能を有する。パラログは、例えば、同じ種または異なる種を起源とするかそれに由来することができる。例えば、ミクロソームのエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩ）および可溶性のエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩＩ）は、同じ種で異なる反応を触媒し、異なる機能を有する、共通祖先から共進化した２つの異なる酵素を表すので、パラログと考えることができる。パラログは、かなりの相互に配列類似性を有する同じ種からのタンパク質であり、共通祖先からの共進化を通してそれらが相同であるか関係することを示唆している。パラロガスのタンパク質ファミリー群には、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼなどが含まれる。
非オルソロガス遺伝子置換は、異なる種の参照遺伝子機能の代わりになることができる、１つの種からの非オルソロガス遺伝子である。置換には、例えば、異なる種での参照機能と比較して、起源種で実質的に同じかまたは類似した機能を発揮することができるものが含まれる。一般に、非オルソロガス遺伝子置換は、参照機能をコードする公知の遺伝子に構造的に関係することを確認することが可能であるが、より構造的に関係しないが機能的に類似した遺伝子およびそれらの対応する遺伝子生成物も、本明細書で用いられるような用語の意味の範囲内である。例えば、機能的類似性は、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比較して、非オルソロガス遺伝子生成物の活性部位または結合性領域において少なくとも多少の構造類似性を要求する。したがって、非オルソロガス遺伝子には、例えばパラログまたは無関係な遺伝子が含まれる。
したがって、所望の生成物の生合成能力を有する本発明の天然に存在しない細胞を特定し、構築することにおいて、特定の種に本明細書で提供される教示および指針を適用することで、当業者は、代謝改変の特定にはオルソログの特定および組入れまたは不活化を含めることができることを理解する。パラログおよび／または非オルソロガスな遺伝子置換が、類似したか実質的に類似した代謝反応を触媒する酵素をコードする参照細胞に存在する範囲内において、当業者はこれらの進化関係の遺伝子を利用することもできる。遺伝子破壊についてと同様に、また、進化的に関係する遺伝子は、破壊の標的となった酵素活性の機能的冗長性を低下または排除するために宿主細胞において破壊または欠失され得る。
オルソログ、パラログおよび非オルソロガスな遺伝子置換は、当業者に周知である方法によって決定することができる。例えば、２つのポリペプチドのための核酸またはアミノ酸配列の検査は、比較される配列間の配列の同一性および類似性を明らかにする。そのような類似性に基づいて、タンパク質が共通祖先からの進化を通して関係していることを示すのにその類似性が十分に高いかどうか、当業者は決定することができる。当業者に周知であるアルゴリズム、例えばＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗなどは、生の配列の類似性または同一性を比較、決定し、さらに、重みまたはスコアを割り当てることができる配列中のギャップの存在または重要性を決定する。そのようなアルゴリズムは当技術分野でも公知であり、ヌクレオチド配列の類似性または同一性を決定することに同様に適用できる。関連性を決定するのに十分な類似性のパラメータは、統計的類似性、またはランダムなポリペプチド中で類似したマッチを見出す可能性、および決定されるマッチの有意性を計算するための周知の方法に基づいて計算される。所望により、２つ以上の配列のコンピュータによる比較を、当業者が視覚的に最適化することもできる。関係する遺伝子生成物またはタンパク質は、高い類似性、例えば２５％～１００％の配列同一性を有すると予想することができる。無関係であるタンパク質は、十分なサイズのデータベースをスキャンする場合に偶然に起こることが予想されるのと事実上同じである同一性を有することができる（約５％）。５％から２４％の間の配列は、比較する配列が関係していると結論するのに十分な相同性を表すことができるか、表すことができない。これらの配列の関連性を決定するために、データセットのサイズを前提とするそのようなマッチの有意性を決定する追加の統計分析を実施することができる。
例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２つ以上の配列の関連性を決定するための例示的なパラメータは、下に示すようなものでよい。簡単に述べると、アミノ酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．８（１９９９年１月５日）および以下のパラメータを用いて実施することができる：マトリックス：０ ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１１；ギャップ伸長：１；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワードサイズ：３；フィルター：オン。核酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）および以下のパラメータを用いて実施することができる：マッチ：１；ミスマッチ：－２；ギャップオープン：５；ギャップ伸長：２；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワードサイズ：１１；フィルター：オフ。当業者は、例えば、比較のストリンジェンシーを増加または低減させ、２つ以上の配列の関連性を決定するために、どのような改変を上記のパラメータに加えることができるかを知るであろう。
一実施形態では、本発明は、野生型または親アルデヒドデヒドロゲナーゼのバリアントであるアルデヒドデヒドロゲナーゼを提供する。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに転換する。そのような酵素は、アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに転換するオキシドレダクターゼとも呼ばれ得る。そのような本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、反応１．２．１．ｂのオキシドレダクターゼ（アシルＣｏＡからアルデヒド）として分類することができ、最初の３桁は、基質特異性に依存しない変換の一般型を示す酵素番号の最初の３桁に対応する。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼの例示的な酵素的転換としては、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌとも呼ばれる）への転換（図１を参照）、および４－ヒドロキシブチリルＣｏＡの４－ヒドロキシブチルアルデヒドへの転換（図２を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、好適な代謝経路を含有する細胞、例として、微生物体において、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、所望の生成物、例として、３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）、１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）、４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）、１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）または他の所望の生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを含む下流生成物を生成するために用いることができる。例えば、１，３－ＢＤＯは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、例えば、リパーゼを用いて酸と反応させて、エステルに転換することができる。そのようなエステルは、栄養補助食品、医薬品および食品用途を有する場合があり、１，３－ブタンジオールのＲ－形態が用いられる場合、それは（アセトアルデヒド化学合成経路によって石油からまたはエタノールから製造されるＳ－形態またはラセミ混合物と比較すると）エネルギー供給源として動物およびヒトの両方によって最もよく利用される形態であるので、有利である（例えば、ケトンエステル、例として、（米国でＧｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）承認を有する）（Ｒ）－３－ヒドロキシブチル－Ｒ－１，３－ブタンジオールモノエステルおよび（Ｒ）－３－ヒドロキシ酪酸グリセロールモノエステルまたはジエステル）。ケトンエステルは、経口で送達することができ、エステルは、身体によって用いられるＲ－１，３－ブタンジオールを放出する（例えば、ＷＯ２０１３１５０１５３を参照）。したがって、本発明は、高度に富化されたまたは本質的にエナンチオマー的に純粋な、かつ副産物について純度の質の改善をさらに有する、１，３－ブタンジオール、つまりＲ－１，３－ブタンジオールの改善された組成物を提供するための改善された酵素経路および微生物を提供するために特に有用である。
１，３－ブタンジオールは、ブチレングリコールとも呼ばれ、直接的に食品供給源、食品成分、香味料、香味料のための溶媒または可溶化剤、安定剤、乳化剤ならびに抗菌剤および保存剤としての用途を含む、さらなる食品関連用途を有する。１，３－ブタンジオールは、非経口薬物溶媒として医薬産業で用いられる。１，３－ブタンジオールは、皮膚軟化薬、保水剤である成分、不溶性成分の結晶化を予防する成分、芳香剤などのより水溶性でない成分のための可溶化剤として、ならびに抗菌剤および保存剤として化粧品における用途を見出す。例えば、それは、とりわけヘアスプレーおよびセッティングローション中で、保水剤として用いることができる；それは、精油からの芳香の喪失を低下させ、微生物による変質に対して保存し、ベンゾエートのための溶媒として用いられる。１，３－ブタンジオールは、０．１パーセントまたはそれ未満～５０パーセントまたはそれより高い濃度で用いることができる。それは、毛髪および入浴製品、眼および顔面化粧品、芳香剤、身体の清潔のための製品ならびに剃毛およびスキンケア調製物で用いられる（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄの報告書：「Ｆｉｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｕｔｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ， Ｈｅｘｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ， Ｅｔｈｏｘｙｄｉｇｌｙｃｏｌ， ａｎｄ Ｄｉｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、４巻、５号、１９８５年を参照）。この報告書は、化粧品における１，３－ブタンジオール（ブチレングリコール）の特定の用途および濃度を提供するものであり、例えば、「Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄａｔａ」という表題のその中の報告の表２を参照されたい。
一実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列をコードする核酸分子であって、アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を含む、核酸分子；（ｂ）高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）の核酸にハイブリダイズし、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数をコードする核酸配列を含む核酸分子；（ｃ）ループＡ（配列番号５）および／またはループＢ（配列番号６）のコンセンサス配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子であって、アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を含む、核酸分子；ならびに（ｄ）（ａ）または（ｂ）に相補的な核酸分子から選択される単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換以外の、核酸分子によってコードされたアミノ酸配列は、配列番号１、２もしくは３でまたは表４で参照されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するか、またはこれと同一である。アミノ酸配列は、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６個またはそれよりも多く、例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２もしくは４３個、すなわち、最大で置換を有するアミノ酸位置の全てを含み得る。
本発明はまた、本発明の核酸分子を含有するベクターも提供する。一実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。一実施形態では、ベクターは、二本鎖ＤＮＡを含む。
本発明はまた、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸も提供する。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子は、配列番号、ＧｅｎＢａｎｋおよび／もしくはＧＩ番号によって本明細書で開示される核酸にハイブリダイズする核酸分子、または配列番号、ＧｅｎＢａｎｋおよび／もしくはＧＩ番号によって本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子も含み得る。ハイブリダイゼーション条件には、本明細書に記載する条件などの、当業者に周知の、高度にストリンジェントな、中程度にストリンジェントなまたはストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件が含まれ得る。同様に、本発明で用いることができる核酸分子は、配列番号、ＧｅｎＢａｎｋおよび／もしくはＧＩ番号によって本明細書で開示される核酸、または配列番号、ＧｅｎＢａｎｋおよび／もしくはＧＩ番号によって本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子とある特定の配列同一性パーセントを有すると説明することができる。例えば、核酸分子は、本明細書に記載する核酸と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するか、またはこれと同一であり得る。
ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドが安定である条件を指す。当業者に公知のように、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）において反映される。一般に、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの安定性は、塩濃度、例えば、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて様々な、しかし、より高いストリンジェンシーで洗浄され得る。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーについての言及は、そのような洗浄条件に関する。本明細書で企図されるように、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションには、０．０１８ＭのＮａＣｌ中で６５℃にて安定なハイブリダイズしたポリヌクレオチドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを許容する条件が含まれ、例えば、ハイブリッドが０．０１８ＭのＮａＣｌ中で６５℃にて安定でない場合、それは高ストリンジェンシー条件下で安定ではない。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中の４２℃でのハイブリダイゼーション、それに続く０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中の６５℃での洗浄によって提供することができる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件以外のハイブリダイゼーション条件を、本明細書で開示される核酸配列を説明するために用いることもできる。例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションという句は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中の４２℃でのハイブリダイゼーション、それに続く０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中の４２℃での洗浄と同等の条件を指す。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションという句は、１０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中の２２℃でのハイブリダイゼーション、それに続く１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中の３７℃での洗浄と同等の条件を指す。デンハルト溶液は、１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ポリビニルピロリドンおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウムおよび０．０２５Ｍ（ＥＤＴＡ）を含有する。他の好適な低、中程度および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液および条件は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９年）に記載されている。
本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子は、本明細書で開示されるヌクレオチド配列と少なくともある特定の配列同一性を有し得る。したがって、本発明のいくつかの態様では、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子は、配列番号、ＧｅｎＢａｎｋおよび／もしくはＧＩ番号によって本明細書で開示される核酸、または配列番号、ＧｅｎＢａｎｋおよび／もしくはＧＩ番号によって本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子と少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性もしくは少なくとも９９％の同一性のヌクレオチド配列を有するか、またはこれと同一である。
配列同一性（相同性または類似性としても公知）は、２つの核酸分子間または２つのポリペプチド間の配列類似性を指す。同一性は、比較の目的のためにアラインされ得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合には、分子は、その位置で同一である。配列間の同一性の程度は、配列によって共有される整合位置または相同位置の数の関数である。２つの配列の配列同一性パーセントを決定するためのそれらのアラインメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９年）に記載されているソフトウェアプログラムなどの当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。好ましくは、デフォルトパラメータが、アラインメントのために用いられる。用いられ得る当技術分野で周知の１つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；分類＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、米国国立バイオテクノロジー情報センターで見出すことができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．」２１５巻：４０３～４１０頁（１９９０年）も参照）。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、単離された核酸分子である。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、参照ポリペプチドのバリアントをコードする核酸分子であって、（ｉ）参照ポリペプチドが、配列番号１、２もしくは３または表４の配列のアミノ酸配列（配列番号７～１２３）を有し、（ｉｉ）バリアントが、配列番号１、２もしくは３または表４の配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸置換が、表１～３で示されるアミノ酸置換から選択される、核酸分子である。表１～３は、配列番号１、２もしくは３または表４の配列の例示的なバリアントの非限定的なリストを提供する。一実施形態では、表１～３の各バリアントについて、示される位置を除く、全ての位置は、配列番号１、２もしくは３または表４の配列と同一である。アミノ酸置換は、元のアミノ酸の同一性を示す文字、それに続く配列番号１、２もしくは３または表４の配列における置換されたアミノ酸の位置を示す数字、それに続く置換されたアミノ酸の同一性を示す文字によって示される。例えば、「Ｄ１２Ａ」は、配列番号１または２の１２位のアスパラギン酸が、アラニンで置き換えられていることを示す。アミノ酸を特定するために用いられる１文字コードは、当業者に公知の標準コードである。表１～３のいくつかのバリアントは、置換のリストによって示される、２個またはそれよりも多い置換を含む。１つまたは複数のアミノ酸置換は、表１～３で列挙されるバリアントのうちのいずれか１つから、または表１～３で列挙される２つもしくはそれよりも多いバリアントの任意の組合せから選択され得る。表１～３の単一のバリアントから選択する場合、得られたバリアントは、示される置換の全てまたは示される置換の全てより少ない置換を含む、任意の組合せの選択されたバリアントの置換のうちの１つまたは複数を含み得る。置換が、表１～３の２つまたはそれよりも多いバリアントの置換から選択される場合、得られたバリアントは、任意の組合せの、２つまたはそれよりも多い選択されたバリアントのそれぞれからの、示される置換の全てまたは示される置換の全てより少ない置換を含む、選択されたバリアントの置換のうちの１つまたは複数を含み得る。例えば、得られたバリアントは、表１～３の単一のバリアントからの１、２、３または４個の置換を含み得る。さらなる例として、得られたバリアントは、表１～３の１、２、３、４、５つまたはそれよりも多い選択されたバリアントから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２５個またはそれよりも多い置換を含み得る。いくつかの実施形態では、得られたバリアントは、表１～３の選択されたバリアントの示される置換の全てを含む。いくつかの実施形態では、得られたバリアントは、配列番号１、２もしくは３または表４の配列とは少なくとも１個のアミノ酸置換だが、２５、２０、１０、５、４または３個未満のアミノ酸置換によって異なる。いくつかの実施形態では、得られたバリアントは、表１～３から選択されるバリアントによって示される配列を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなり、示されるアミノ酸置換でのみ配列番号１、２もしくは３または表４の配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、参照ポリペプチド（配列番号１、２もしくは３または表４の配列のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチド）のバリアントをコードする単離された核酸分子であって、バリアントが、（ｉ）表１～３から選択される対応するバリアントの１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、（ｉｉ）対応するバリアントと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、単離された核酸分子である。第２のバリアントが、対応するバリアントと１００％の配列同一性を有する場合、第２のバリアントは、表１～３から選択されるバリアントによって示される配列を含み、アミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかまたは両方で１つまたは複数の追加のアミノ酸を有してもよく、有さなくてもよい。いくつかの実施形態では、得られたバリアントは、表１～３から選択される対応するバリアントと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し；いくつかの場合、同一性は、少なくとも９０％またはそれよりも高い。得られたバリアントが、表１～３から選択される対応するバリアントと１００％未満同一である場合、対応するバリアントについて示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数の位置は、（例えば、１つまたは複数のアミノ酸の挿入または欠失の場合）移動するが、それでも得られたバリアント内に含有され得る。例えば、「Ｄ１２Ａ」（配列番号１または２に対する１２位での）に対応するアスパラギン酸からアラニンへの置換は、得られたバリアントにおいて存在するが、異なる位置に存在し得る。異なる位置にもかかわらず、アミノ酸が示される置換に対応するかどうかは、当技術分野で周知であるように、配列アラインメントによって決定することができる。一般に、隣接する配列が別のポリペプチドの相同配列とアラインしていると考えられるような、置換されるアミノ酸に隣接するアミノ酸の同一性または類似性を示すアラインメントは、置換されるアミノ酸を表１～３の対応するバリアントについて局所的に位置付けて、所与のポリペプチド鎖においては移動した数字位置にもかかわらず、置換を行う対応する位置を決定することを可能にする。一実施形態では、置換される位置を含む、少なくとも３～１５個のアミノ酸を含む領域は、対応するバリアント配列に沿った置換されるアミノ酸の位置を含んで、比較的高い同一性パーセントで、対応するバリアント配列と局所的にアラインする（例えば９０％、９５％または１００％の同一性）。いくつかの実施形態では、表１～３から選択される対応するバリアントによって示される１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、全てまたは全てより少ないアミノ酸置換）は、ポリペプチド鎖に沿った異なる物理的位置で起こる場合でさえも、比較されるポリペプチドの配列が、ＢＬＡＳＴＰアラインメントアルゴリズムをデフォルトパラメータで用いたとき対応するバリアント配列に沿った示される位置で同一の整合または類似のアミノ酸を有する対応するバリアントとアラインした場合、所与のバリアントにおいて存在すると考えられ、類似のアミノ酸とは、アラインメントアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いた目的のバリアント位置とのアラインメントに十分な化学特性を有すると考えられるアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、本明細書の様々な実施形態のいずれかと関係して記載される核酸と相補的である。
本発明の核酸または本発明のポリペプチドは、野生型親配列、例えば、配列番号１、２もしくは３または表４で開示される配列などの親配列を除外し得ると理解される。当業者は、当技術分野で周知のことに基づいて親野生型配列の意味を容易に理解する。そのような本発明の核酸は、自然界に見出されるような天然に存在するアミノ酸配列をコードする核酸配列を除外し得るとさらに理解される。同様に、本発明のポリペプチドは、自然界に見出されるようなアミノ酸配列を除外し得る。したがって、特定の実施形態では、本発明の核酸またはポリペプチドは、コードされたアミノ酸配列が野生型親配列もしくは天然に存在するアミノ酸配列ではなく、かつ／または核酸配列が野生型もしくは天然に存在する核酸配列ではないという条件で、本明細書で示される通りである。天然アミノ酸または核酸配列は、自然界に見出されるような天然に存在する生物体において見られる配列に関連することが当業者により理解される。したがって、天然に存在する生物体における状態と同じ状態で見出されない、または天然に存在する生物体と同じヌクレオチドもしくはコードされたアミノ酸配列を有さない核酸またはアミノ酸配列は、本発明の核酸および／またはアミノ酸配列の意味に含まれる。例えば、本明細書に記載するバリアントを含む、親配列から１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸位置で変更された核酸またはアミノ酸配列は、天然に存在しない本発明の核酸またはアミノ酸配列の意味に含まれる。本発明の単離された核酸分子は、核酸配列を含有する天然に存在する染色体を除外し、天然に存在する細胞で見出される他の分子、例として、ＤＮＡ結合タンパク質、例えば真核細胞内で染色体に結合するヒストンなどのタンパク質をさらに除外し得る。
したがって、本発明の単離された核酸配列は、天然に存在する核酸配列と比較して物理的および化学的相違を有する。本発明の単離されたまたは天然に存在しない核酸は、自然界に見出されるような天然に存在する核酸配列の共有または非共有結合のいずれかの化学結合のいくつかまたは全てを含有しないか、または必ずしも有さない。本発明の単離された核酸は、したがって、例えば、染色体に見出される天然に存在する核酸配列とは異なる化学構造を有することによって、天然に存在する核酸とは異なる。異なる化学構造は、例えば、天然に存在する染色体から単離された核酸配列を放出するホスホジエステル結合の切断によって起こり得る。本発明の単離された核酸はまた、原核細胞または真核細胞のいずれかにおいて染色体ＤＮＡに結合するタンパク質から核酸を単離または分離し、それによって異なる非共有結合によって天然に存在する核酸とは異なることによって、天然に存在する核酸とは異なり得る。原核生物起源の核酸について、本発明の天然に存在しない核酸は、染色体の天然に存在する化学結合、例えば、ポリメラーゼもしくは染色体構造タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質への結合のいくつかもしくは全てを必ずしも有さないか、またはスーパーコイルなどのより高次の構造で存在しない。真核生物起源の核酸について、本発明の天然に存在しない核酸はまた、クロマチンに見出されるのと同じ内部核酸化学結合も含有せず、構造タンパク質との化学結合も含有しない。例えば、本発明の天然に存在しない核酸は、ヒストンにも骨格タンパク質にも化学結合しておらず、セントロメアにもテロメアにも含有されていない。したがって、本発明の天然に存在しない核酸は、自然界に見出されるような核酸とは異なるファンデルワールス相互作用、水素結合、イオンもしくは静電結合および／または共有結合を欠くか、または含有するので、天然に存在する核酸とは化学的に別個である。そのような結合の相違は、核酸の別々の領域内で内部にて起こってもよく（すなわちシス）、あるいはそのような結合の相違は、例えば、染色体タンパク質とのトランスの相互作用で起こってもよい。真核生物起源の核酸の場合、ｃＤＮＡ内の化学結合は、染色体ＤＮＡ上の遺伝子の共有結合、すなわち配列とは異なるので、ｃＤＮＡは、単離されたまたは天然に存在しない核酸と考えられる。したがって、単離されたまたは天然に存在しない核酸は天然に存在する核酸とは別個であることが、当業者により理解される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を含む、単離されたポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、ループＡ（配列番号５）および／またはループＢ（配列番号６）のコンセンサスアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を含み、１つまたは複数のアミノ酸置換以外のアミノ酸配列が、配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するか、またはこれと同一である、単離されたポリペプチドを提供する。一実施形態では、アミノ酸配列は、１～１００個のアミノ酸位置における保存的アミノ酸置換をさらに含み、位置は、表１、２および／または３で示される１つまたは複数のアミノ酸置換以外である。別の実施形態では、アミノ酸配列は、表１、２および／または３で示される１つまたは複数のアミノ酸置換以外に、親配列と比較して２～３００個のアミノ酸位置での改変を含まず、位置は、配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列のうちの２、３、４または５つと同一である位置から選択される。一実施形態では、アミノ酸配列は、表１、２および／または３で示されるアミノ酸置換のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６個またはそれよりも多く、例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３個、すなわち、最大で置換を有するアミノ酸位置の全てを含む。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。一実施形態では、ポリペプチドは、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換し得る。一実施形態では、ポリペプチドは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換し得る。一実施形態では、ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてより高い活性を有する。一実施形態では、ポリペプチドは、３－ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチリルＣｏＡよりも３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチリルＣｏＡについてより高い活性を有する。一実施形態では、ポリペプチドは、アセチルＣｏＡよりも３－ヒドロキシブチリルＣｏＡについてより高い特異性を有する。一実施形態では、ポリペプチドは、アセチルＣｏＡよりも４－ヒドロキシブチリルＣｏＡについてより高い特異性を有する。一実施形態では、ポリペプチドは、細胞または細胞抽出物における副産物の生成を低減する。特定の実施形態では、副産物は、エタノールまたは４－ヒドロキシ－２－ブタノンである。一実施形態では、ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてより高いｋｃａｔを有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で開示されるアミノ酸配列、例として、配列番号１、２もしくは３または表４で参照される配列を有する単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列が、表１、２および／または３で示される１つまたは複数のバリアントアミノ酸位置を含む、単離されたポリペプチドを提供する。特に、そのようなポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、これは、アシルＣｏＡを対応するアルデヒドに、例えば、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチルアルデヒドに、または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換し得る。いくつかの態様では、本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するか、またはこれと同一である、表１、２および／または３で示される１つまたは複数のバリアントアミノ酸位置以外のアミノ酸配列を含む。バリアントアミノ酸位置は、２０個の天然に存在するアミノ酸、バリアントアミノ酸位置の対応する位置での野生型もしくは親配列の保存的置換、または表１、２および／もしくは３で本明細書に開示されるアミノ酸などのバリアントアミノ酸位置での特定のアミノ酸のうちのいずれか１つを含み得ることが理解される。バリアントアミノ酸位置のいずれかを組み合わせて、さらなるバリアントを生成することができることがさらに理解される。２つまたはそれよりも多いバリアントアミノ酸位置の組合せを有するバリアントは、野生型より大きな活性を示した。したがって、本明細書で例示されるように、活性バリアントアミノ酸位置を組み合わせることによって酵素バリアントを生成すると、改善された特性を有する酵素バリアントが得られた。当業者は、当業者に周知の方法を用いて、単一のバリアント位置またはバリアント位置の組合せを有するポリペプチドを容易に生成して、本明細書に記載するように、活性の増大、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは３－ヒドロキシブチルアルデヒドのＳ形態に優るＲ形態についての特異性の増大、アセチルＣｏＡに優る３－ヒドロキシブチリルＣｏＡおよび／または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡについての特異性の増大、エタノールまたは４－ヒドロキシ－２－ブタノンなどの副産物形成の低減、ｋｃａｔの増大、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性の増大などを含む、所望の特性を有するポリペプチドを生成することができる。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的のためにアラインされ得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合には、分子は、その位置で同一である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される整合位置または相同位置の数の関数である。ポリペプチドまたはポリペプチド領域（またはポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域）が、別の配列とある特定のパーセンテージ（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有することは、アラインさせた場合、２つの配列を比較すると、アミノ酸（またはヌクレオチド塩基）のパーセンテージが同じであることを意味する。
特定の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される任意の組合せの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多いバリアントを含む、アミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。バリアントは、表１、２および／または３で示されるバリアントの任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、参照ポリペプチドのバリアントであり、参照ポリペプチドは、配列番号１、２もしくは３または表４の配列のアミノ酸配列を有し、ポリペプチドバリアントは、表１～３から選択され、配列番号１、２もしくは３または表４の配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、参照ポリペプチドのバリアントであり、参照ポリペプチドは、配列番号１、２もしくは３または表４の配列のアミノ酸配列を有し、ポリペプチドバリアントは、配列番号１、２もしくは３または表４の配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、１つまたは複数のアミノ酸置換は、表１～３から選択され、ポリペプチドバリアントは、表１～３から選択される対応するバリアントと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。１つまたは複数のアミノ酸置換は、表１～３で列挙されるバリアントのうちのいずれか１つから、または表１～３で列挙される２つもしくはそれよりも多いバリアントの任意の組合せから選択され得る。表１～３の単一のバリアントから選択する場合、得られたバリアントは、示される置換の全てまたは示される置換の全てより少ない置換を含む、任意の組合せの選択されるバリアントの置換のうちの１つまたは複数を含み得る。置換が、表１～３の２つまたはそれよりも多いバリアントの置換から選択される場合、得られたバリアントは、任意の組合せの、２つまたはそれよりも多い選択されるバリアントのそれぞれからの、示される置換の全てまたは示される置換の全てより少ない置換を含む、選択されるバリアントの置換のうちの１つまたは複数を含み得る。例えば、得られたバリアントは、表１～３の単一のバリアントからの１、２、３または４個の置換を含み得る。さらなる例として、得られたバリアントは、本明細書で開示されるように、最大で置換される全ての位置を含む、表１～３の１、２、３、４、５つまたはそれよりも多い選択されるバリアントから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２５個またはそれよりも多い置換を含み得る。いくつかの実施形態では、得られたバリアントは、表１～３の選択されるバリアントの示される置換の全てを含む。いくつかの実施形態では、得られたバリアントは、配列番号１、２もしくは３または表４の配列とは少なくとも１個のアミノ酸置換だが、２５、２０、１０、５、４または３個未満のアミノ酸置換によって異なる。いくつかの実施形態では、得られたバリアントは、表１～３から選択されるバリアントによって示される配列を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなり、示されるアミノ酸置換でのみ配列番号１、２もしくは３または表４の配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、得られたバリアントは、表１～３から選択される対応するバリアントと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し；いくつかの場合、同一性は、少なくとも９０％またはそれよりも高い。得られたバリアントが、表１～３から選択される対応するバリアントと１００％未満同一である場合、対応するバリアントについて示されるアミノ酸置換のうちの１つまたは複数の位置は、（例えば、１つまたは複数のアミノ酸の挿入または欠失の場合）移動するが、それでも得られたバリアント内に含有され得る。例えば、「Ｄ１２Ａ」（配列番号１または２に対する１２位での）に対応するグリシンからグルタミン酸への置換は、得られたバリアントにおいて存在するが、異なる位置に存在し得る。異なる位置にもかかわらず、アミノ酸が示される置換に対応するかどうかは、上記のように、および当技術分野で周知であるように、配列アラインメントによって決定することができる。いくつかの実施形態では、表１～３から選択される対応するバリアントによって示される１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、全てまたは全てより少ないアミノ酸置換）は、ポリペプチド鎖に沿った異なる物理的位置で起こる場合でさえも、比較されるポリペプチドの配列が、ＢＬＡＳＴＰアラインメントアルゴリズムをデフォルトパラメータで用いたとき対応するバリアント配列に沿った示される位置で同一の整合または類似のアミノ酸を有する対応するバリアントとアラインした場合、所与のバリアントにおいて存在すると考えられ、類似のアミノ酸とは、アラインメントアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いた目的のバリアント位置とのアラインメントに十分な化学特性を有すると考えられるアミノ酸である。
単独または組合せのバリアントは、参照ポリペプチド、例えば、野生型（ネイティブ）酵素と比べて活性を保持または改善する酵素を生成し得る。いくつかの態様では、本発明のポリペプチドは、表１、２および／または３で示されるバリアントの任意の組合せを有し得る。いくつかの態様では、表１、２および／または３で示されるバリアントの任意の組合せを有する本発明のポリペプチドは、アシルＣｏＡを対応するアルデヒドに、例えば、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチルアルデヒドに、または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換し得る。そのようなポリペプチドを生成およびアッセイする方法は、当業者に周知である。
いくつかの実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、１～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって２～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって３～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって４～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって５～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって６～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって７～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって８～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって９～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって１０～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって１５～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって２０～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって３０～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって４０～１００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって５０～１００個のアミノ酸位置、またはその中の任意の整数個のアミノ酸位置における保存的アミノ酸置換をさらに含む場合があり、位置は、表１、２および／または３で示されるバリアントアミノ酸位置以外である。いくつかの態様では、保存的アミノ酸配列は、化学的保存的または進化的保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸を特定する方法は、当業者に周知であり、そのうちのいずれか１つは、本発明の単離されたポリペプチドを生成するために用いることができる。
いくつかの実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、親（野生型）配列と比較して、２～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって３～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって４～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって５～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって１０～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって２０～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって３０～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって４０～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって５０～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって６０～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって８０～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって１００～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって１５０～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって２００～３００個のアミノ酸位置、またはそれに代わって２５０～３００個のアミノ酸位置、またはその中の任意の整数個のアミノ酸位置での改変を含まない場合があり、位置は、配列番号１、２もしくは３としてまたは表４で参照されるアミノ酸配列のうちの２、３、４または５つと同一である位置から選択される。
本明細書で開示されるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼのポリペプチドバリアントなどのバリアントポリペプチドは、例えば、アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに転換する、例として、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換するか、または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換する、親ポリペプチドと同様の酵素反応を行うことができることが理解される。アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素のポリペプチドバリアントは、活性の増大、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは３－ヒドロキシブチルアルデヒドのＳ形態に優るＲ形態についての特異性の増大、アセチルＣｏＡに優る３－ヒドロキシブチリルＣｏＡおよび／または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡについての特異性の増大、エタノールまたは４－ヒドロキシ－２－ブタノンなどの副産物形成の低減、ｋｃａｔの増大、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性の増大などを含むが、これらに限定されない、ポリペプチドに特徴的な利益を提供するバリアントを含み得ることがさらに理解される（実施例を参照）。特定の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、野生型または親ポリペプチドと少なくとも同じか、またはこれよりも高い、すなわち、バリアントアミノ酸位置を有さない親ポリペプチドより高い活性を示し得る。例えば、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、野生型または親ポリペプチドより１．２、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０倍またはさらにそれよりも高い活性のバリアントポリペプチドを有し得る（実施例を参照）。活性は、同じアッセイ条件下の野生型または親ポリペプチドと比べた、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼの、基質を生成物に転換する能力を指すと理解される。
別の特定の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは３－ヒドロキシブチルアルデヒドのＳ形態に優るＲ形態についての特異性の増大、例えば、約２～４０倍高い、例えば、２～３５、２～３０、２～２５、２～２０、２～１５、２～１０または２～５、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０倍またはさらにそれよりも高い活性を示し得る。そのような特異性の増大は、例えば、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは３－ヒドロキシブチルアルデヒドのＲ形態についてのＳ形態に対する活性の比によって測定することができる。
別の特定の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、アセチルＣｏＡに優る３－ヒドロキシブチリルＣｏＡおよび／または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡについての特異性の増大、例えば、１．５～１００、１．５～９５、１．５～９０、１．５～８５、１．５～８０、１．５～７５、１．５～７０、１．５～６５、１．５～６０、１．５～５５、１．５～５０、１．５～４５、１．５～４０、１．５～３５、１．５～３０、１．５～２５、１．５～２０、１．５～１５、１．５～１０または１．５～５、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００倍を示し得る。そのような特異性の増大は、例えば、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは４－ヒドロキシブチリルＣｏＡについてのアセチルＣｏＡに対する活性の比によって測定することができる。特異性は、アセチルＣｏＡについての活性で割った３ＨＢ－ＣｏＡまたは４ＨＢ－ＣｏＡについての活性により示される。
別の特定の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、エタノールおよび／または４－ヒドロキシ－２－ブタノンなどの副産物形成の低減、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の副産物形成の低減を示し得る。そのようなアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、野生型または親ポリペプチド、すなわち、バリアントアミノ酸位置を有さない親ポリペプチドと比べて、上記のように、副産物形成の低減を有する活性を示し得る。
別の特定の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、野生型または親ポリペプチド、すなわち、バリアントアミノ酸位置を有さない親ポリペプチドと比べて、例えば、１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０倍またはそれよりも高い、ｋｃａｔの増大を示し得る。ｋｃａｔは、ターンオーバー数の酵素学におけるその周知の意味を指すと理解され、ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［ＥＴ］であり、Ｖｍａｘは、飽和基質での酵素反応速度であり、［ＥＴ］は、全酵素濃度である（Ｓｅｇｅｌ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ： Ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒａｐｉｄ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｎｄ Ｓｔｅａｄｙ－Ｓｔａｔｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５年）を参照）。そのようなアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、野生型または親ポリペプチド、すなわち、バリアントアミノ酸位置を有さない親ポリペプチドと比べて、ｋｃａｔの増大を有する活性を示し得る。
別の特定の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、野生型または親ポリペプチド、すなわち、バリアントアミノ酸位置を有さない親ポリペプチドと比べて、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかまたは両方での、安定性の増大を示し得る。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、細胞溶解物中でｉｎ ｖｉｔｒｏにて安定性の増大を示し得る。
特定の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、上記の特徴のうちの２つまたはそれよりも多く、例えば、任意の組合せの、（１）活性の増大、（２）３－ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは３－ヒドロキシブチルアルデヒドのＳ形態に優るＲ形態についての特異性の増大、（３）アセチルＣｏＡに優る３－ヒドロキシブチリルＣｏＡおよび／または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡについての特異性の増大、（４）エタノールおよび／または４－ヒドロキシ－２－ブタノンなどの副産物形成の低減、（５）ｋｃａｔの増大、（６）ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性の増大などの特徴のうちの２つまたはそれよりも多くを示し得ることが理解される。そのような組合せとしては、例えば、特徴１および２；１および３；１および４；１および５；１および６；２および３；２および４；２および５；２および６；３および４；３および５；３および６；４および５；４および６；５および６；１、２および３；１、２および４；１、２および５；１、２および６；１、３および４；１、３および５；１、３および６；１、４および５；１、４および６；１、５および６；２、３および４；２、３および５；２、３および６；２、４および５；２、４および６；２、５および６；３、４および５；３、４および６；３、５および６；４、５および６；１、２、３および４；１、２、３および５；１、２、３および６；１、２、４および５；１、２、４および６；１、２、５および６；１、３、４および５；１、３、４および６；１、３、５および６；１、４、５および６；２、３、４および５；２、３、４および６；２、３、５および６；３、４、５および６；１、２、３、４および５；１、３、４、５および６；１、２、４、５および６；１、２、３、５および６；１、２、３、４および６；２、３、４、５および６；１、２、３、４、５および６が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、当技術分野で周知の様々な方法、例えば、組換え発現系、沈殿、ゲル濾過、イオン交換、逆相および親和性クロマトグラフィーなどによって単離することができる。他の周知の方法は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、（１９９０年））に記載されている。あるいは、本発明の単離されたポリペプチドは、周知の組換え法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、１９９９年を参照）を用いて得ることができる。本発明のポリペプチドの生化学精製のための方法および条件は、当業者によって選択され、精製は、例えば、機能アッセイによってモニタリングすることができる。
本発明のポリペプチドを調製するための方法の１つの非限定的な例は、本明細書に記載するように、当技術分野で周知の方法を用いて、好適な宿主細胞、例として、細菌細胞、酵母細胞または他の好適な細胞においてポリペプチドをコードする核酸を発現すること、およびここでもまた周知の精製法を用いて発現したポリペプチドを回収することである。本発明のポリペプチドは、本明細書に記載するように発現ベクターで形質転換した細胞から直接的に単離することができる。また、本発明の組換えにより発現されたポリペプチドは、所望により、適切な親和性タグ、例として、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリＨｉｓ、ストレプトアビジンなどを伴う融合タンパク質として発現し、親和性精製することができる。本発明のポリペプチドは、所望により、親和性タグを保持してもよく、または必要に応じて親和性タグは、親和性タグを除去するための周知の方法を用いて、例えば、適切な酵素もしくは化学切断を用いてポリペプチドから除去してもよい。したがって、本発明は、親和性タグを伴わないか、または必要に応じて伴う本発明のポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で開示される本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。本発明のポリペプチドはまた、当業者に周知のポリペプチド合成の方法を用いて化学合成によって生成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５巻：２１４９頁（１９６４年）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ， Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、１９８４年）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８２巻：５１３１頁（１９８５年）；Ｇｒａｎｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ． Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（１９９２年）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ ＭおよびＴｒｏｓｔ Ｂ．編 Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ（１９９３年））。
いくつかの実施形態では、本発明は、生物触媒として本明細書で開示されるポリペプチドを用いることを提供する。「生物触媒」は、本明細書で用いる場合、化学反応を開始するか、またはその速度を改変する生物学的物質を指す。生物触媒は、酵素であり得る。本発明のポリペプチドは、本明細書で開示されるように基質の生成物への転換の速度を増大させるために用いることができる。産業的反応に関連して、本発明のポリペプチドは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて、ポリペプチドを発現する宿主細胞なしで、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する反応を改善するために用いることができる。一実施形態では、本発明は、生物触媒としての本発明のポリペプチドの使用を提供する。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞の細胞溶解物として提供される。このような場合、細胞溶解物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応において、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの３－ヒドロキシブチルアルデヒドへの、もしくは４－ヒドロキシブチリルＣｏＡの４－ヒドロキシブチルアルデヒドへの転換、または逆反応を行うためのアルデヒドデヒドロゲナーゼの供給源として働く。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、部分的に精製された形態、例えば、部分的に細胞溶解物から精製された形態で提供することができる。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼが、他の構成成分、例として、細胞抽出物の構成成分から実質的に精製されている、実質的に精製された形態で提供することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリペプチドを部分的に精製または実質的に精製するための方法は、本明細書に記載するように、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、固体支持体、例えば、ビーズ、プレートまたは膜に固定化される。特定の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、親和性タグを含み、親和性タグは、アルデヒドデヒドロゲナーゼを固体支持体に固定化するために用いられる。そのような親和性タグとしては、本明細書に記載するように、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリＨｉｓ、ストレプトアビジンなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で開示されるポリペプチドおよびポリペプチドについての少なくとも１つの基質を有する組成物を提供する。本明細書で開示されるポリペプチドのそれぞれについての基質は、本明細書に記載され、図で例示されている。本発明の組成物内のポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で基質と反応することができる。この関係において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件は、本発明の細胞を含む、細胞の非存在下または細胞外での反応を指す。
一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドおよびポリペプチドについての少なくとも１つの基質を含む組成物を提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で基質と反応することができる。一実施形態では、基質は、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡである。一実施形態では、基質は、３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチリルＣｏＡである。一実施形態では、基質は、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡである。
いくつかの実施形態では、本発明は、他のステップの中でも、本明細書で開示されるベクターを、例えば、ベクターによってコードされたアミノ酸配列を発現することができ、かつ／または発酵することができる宿主細胞に導入する工程を含み得る、宿主株を構築する方法を提供する。本発明のベクターは、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学的変換、形質導入、トランスフェクションおよび超音波形質転換を含むが、これらに限定されない、当技術分野で周知の技術を用いて宿主細胞に安定にまたは一過的に導入することができる。追加の方法は、本明細書で開示され、そのうちのいずれか１つは、本発明の方法で用いることができる。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチド、すなわち、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む細胞を提供する。したがって、本発明は、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリペプチドを含む天然に存在しない細胞を提供する。必要に応じて、細胞は、３－ＨＢａｌもしくは１，３－ＢＤＯ経路、または４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路を含む場合があり、さらに必要に応じて、それに関連する下流生成物、例として、そのエステルまたはアミドを生成する経路を含む。いくつかの実施形態では、天然に存在しない細胞は、アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに転換するアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。当業者は、これらが単に例であり、所望の生成物を生成するのに好適な、および適切な活性が基質の生成物への転換のために利用可能である、本明細書で開示される基質－生成物対のいずれも、本明細書中の教示に基づいて当業者によって容易に決定することができることを理解する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する細胞、特に天然に存在しない細胞であって、アルデヒドデヒドロゲナーゼが、図１および２で示される経路などの３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌまたは１，４－ＢＤＯ経路で機能する、細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、本発明の核酸を含む本発明のベクターを含む細胞を提供する。本発明はまた、本発明の核酸を含む細胞も提供する。一実施形態では、核酸分子は、細胞の染色体に組み込まれる。特定の実施形態では、組込みは、部位特異的である。本発明の一実施形態では、核酸分子が発現される。一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む細胞を提供する。
一実施形態では、ベクター、核酸またはポリペプチドを含む細胞は、微生物体である。特定の実施形態では、微生物体は、細菌、酵母または真菌である。特定の実施形態では、細胞は、単離された真核細胞である。
一実施形態では、細胞は、３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成する経路を含む。別の実施形態では、細胞は、４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成する経路を含む。一実施形態では、細胞は、発酵することができる。一実施形態では、細胞は、細胞内で発現される本発明のポリペプチドについての少なくとも１つの基質をさらに含む。特定の実施形態では、基質は、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡである。特定の実施形態では、基質は、３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチリルＣｏＡである。一実施形態では、細胞は、３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチリルＣｏＡについて３－ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチリルＣｏＡより高い活性を有する。別の特定の実施形態では、基質は、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡである。本発明はまた、本発明の細胞を含む培地も提供する。
本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに転換する経路で利用することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯについての例示的な経路は、例えば、ＷＯ２０１０／１２７３１９、ＷＯ２０１３／０３６７６４、米国特許第９，０１７，９８３号、ＵＳ２０１３／００６６０３５に記載されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。
例示的な３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯ経路は、図１に示され、ＷＯ２０１０／１２７３１９、ＷＯ２０１３／０３６７６４、米国特許第９，０１７，９８３号およびＵＳ２０１３／００６６０３５に記載されている。そのようなアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯ経路は、例えば、（Ｇ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；（Ｈ）３－ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ）とも本明細書で呼ばれる３－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；および（Ｃ）１，３－ＢＤＯデヒドロゲナーゼとも本明細書で呼ばれる３－ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼを含む（図１を参照）。アセトアセチルＣｏＡは、チオラーゼを利用して、アセチルＣｏＡの２つの分子をアセトアセチルＣｏＡの１つの分子に転換することによって形成することができる。アセトアセチルＣｏＡチオラーゼは、アセチルＣｏＡの２つの分子をアセトアセチルＣｏＡおよびＣｏＡの１つの分子それぞれに転換する（ＷＯ２０１３／０３６７６４およびＵＳ２０１３／００６６０３５を参照）。
例示的な１，３－ＢＤＯ経路は、ＷＯ２０１０／１２７３１９の図２に示されている。簡潔には、アセトアセチルＣｏＡは、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）（ＥＣ１．１．１．ａ）によって３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる（図１のステップＧ）。３－ヒドロキシブチリルＣｏＡは、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、３－ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼとも本明細書で呼ばれる３－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）（ＥＣ１．２．１．ｂ）によって３－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換することができる（図１のステップＨ）。３－ヒドロキシブチルアルデヒドは、１，３－ＢＤＯデヒドロゲナーゼとも本明細書で呼ばれる３－ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．ａ）によって１，３－ブタンジオールに転換することができる（図１のステップＣ）。
本明細書で開示されるように、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換する経路で機能し得る。３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換するアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む上記の経路では、経路は、アセトアセチルＣｏＡを３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換する（図１を参照）。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼはまた、経路の基質／生成物として３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを含む他の３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯ経路で用いることができる。当業者は、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを容易に利用して、そのような反応を含む任意の所望の経路で３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換することができる。
例示的な４－ＨＢａｌおよび／または１，４－ＢＤＯ経路は、図２に示され、ＷＯ２００８／１１５８４０、ＷＯ２０１０／０３０７１１、ＷＯ２０１０／１４１９２０、ＷＯ２０１１／０４７１０１、ＷＯ２０１３／１８４６０２、ＷＯ２０１４／１７６５１４、米国特許第８，０６７，２１４号、米国特許第７，８５８，３５０号、米国特許第８，１２９，１６９号、米国特許第８，３７７，６６６号、ＵＳ２０１３／００２９３８１、ＵＳ２０１４／００３０７７９、ＵＳ２０１５／０１４８５１３およびＵＳ２０１４／０３７１４１７に記載されている。そのようなアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む４－ＨＢａｌおよび／または１，４－ＢＤＯ経路は、例えば、（１）スクシニルＣｏＡシンテターゼ；（２）ＣｏＡ非依存型コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（３）α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ；（４）グルタミン酸：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ；（５）グルタミン酸デカルボキシラーゼ；（６）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（７）４－ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ；（８）α－ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；（９）４－ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ；（１０）酪酸キナーゼ（４－ヒドロキシ酪酸キナーゼとも呼ばれる）；（１１）ホスホトランスブチリラーゼ（ホスホ－トランス－４－ヒドロキシブチリラーゼとも呼ばれる）；（１２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（４－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼとも呼ばれる）；（１３）アルコールデヒドロゲナーゼ、例として、１，４－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（４－ヒドロキシブタナールレダクターゼまたは４－ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼとも呼ばれる）を含む（図２を参照）。
図２と同様に、例示的な１，４－ＢＤＯ経路は、ＷＯ２０１０／１４１９２０の図８Ａに示されている。簡潔には、スクシニルＣｏＡは、スクシニルＣｏＡレダクターゼ（またはコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）（ＥＣ１．２．１．ｂ）によってコハク酸セミアルデヒドに転換することができる。コハク酸セミアルデヒドは、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．ａ）によって４－ヒドロキシブチレートに転換することができる。あるいは、スクシニルＣｏＡは、スクシニルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）（ＥＣ１．１．１．ｃ）によって４－ヒドロキシブチレートに転換することができる。４－ヒドロキシブチレートは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．ａ）によって、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．ａ）によってまたは４－ヒドロキシブチリルＣｏＡリガーゼ（または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼ）（ＥＣ６．２．１．ａ）によって４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる。あるいは、４－ヒドロキシブチレートは、４－ヒドロキシ酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．ａ）によって４－ヒドロキシブチリル－ホスフェートに転換することができる。４－ヒドロキシブチリル－ホスフェートは、ホスホトランス－４－ヒドロキシブチリラーゼ（ＥＣ２．３．１．ａ）によって４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる。あるいは、４－ヒドロキシブチリル－ホスフェートは、４－ヒドロキシブタナールデヒドロゲナーゼ（リン酸化）（ＥＣ１．２．１．ｄ）によって４－ヒドロキシブタナールに転換することができる。４－ヒドロキシブチリルＣｏＡは、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントによるものを含む、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（または４－ヒドロキシブタナールデヒドロゲナーゼ）（ＥＣ１．２．１．ｂ）によって４－ヒドロキシブタナールに転換することができる。あるいは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）（ＥＣ１．１．１．ｃ）によって１，４－ブタンジオールに転換することができる。４－ヒドロキシブタナールは、１，４－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．ａ）によって１，４－ブタンジオールに転換することができる。
例示的な１，４－ＢＤＯ経路はまた、ＷＯ２０１０／１４１９２０の図８Ｂにも示されている。簡潔には、アルファ－ケトグルタレートは、アルファ－ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．ａ）によってコハク酸セミアルデヒドに転換することができる。あるいは、アルファ－ケトグルタレートは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．ａ）によってグルタメートに転換することができる。４－アミノブチレートは、４－アミノ酪酸オキシドレダクターゼ（脱アミノ化）（ＥＣ１．４．１．ａ）または４－アミノ酪酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．ａ）によってコハク酸セミアルデヒドに転換することができる。グルタメートは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．ａ）によって４－アミノブチレートに転換することができる。コハク酸セミアルデヒドは、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．ａ）によって４－ヒドロキシブチレートに転換することができる。４－ヒドロキシブチレートは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．ａ）によって、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．ａ）によってまたは４－ヒドロキシブチリルＣｏＡリガーゼ（または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼ）（ＥＣ６．２．１．ａ）によって４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる。４－ヒドロキシブチレートは、４－ヒドロキシ酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．ａ）によって４－ヒドロキシブチリル－ホスフェートに転換することができる。４－ヒドロキシブチリル－ホスフェートは、ホスホトランス－４－ヒドロキシブチリラーゼ（ＥＣ２．３．１．ａ）によって４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる。あるいは、４－ヒドロキシブチリル－ホスフェートは、４－ヒドロキシブタナールデヒドロゲナーゼ（リン酸化）（ＥＣ１．２．１．ｄ）によって４－ヒドロキシブタナールに転換することができる。４－ヒドロキシブチリルＣｏＡは、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼによるものを含む、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（または４－ヒドロキシブタナールデヒドロゲナーゼ）（ＥＣ１．２．１．ｂ）によって４－ヒドロキシブタナールに転換することができる。４－ヒドロキシブチリルＣｏＡは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）（ＥＣ１．１．１．ｃ）によって１，４－ブタンジオールに転換することができる。４－ヒドロキシブタナールは、１，４－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．ａ）によって１，４－ブタンジオールに転換することができる。
本明細書で開示されるように、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換する経路で機能し得る。４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換するアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む上記の経路では、経路は、４－ヒドロキシブチレートを４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに、または４－ヒドロキシブチリル－ホスフェートを４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換する（図２を参照）。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼはまた、経路の基質／生成物として４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを含む他の４－ＨＢａｌおよび／または１，４－ＢＤＯ経路で用いることもできる。当業者は、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを容易に利用して、そのような反応を含む任意の所望の経路で４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチルアルデヒドに転換することができる。例えば、４－オキソブチリルＣｏＡは、ＷＯ２０１０／１４１２９０、図９Ａに記載され、示されるように、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる。加えて、５－ヒドロキシ－２－オキソペンタン酸は、ＷＯ２０１０／１４１２９０、図１０および１１に記載され、示されるように、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる。また、アセトアセチルＣｏＡ、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡおよび／またはビニルアセチルＣｏＡは、ＷＯ２０１０／１４１２９０、図１２に記載され、示されるように、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる。加えて、４－ヒドロキシブタ－２－エノイルＣｏＡは、ＷＯ２０１０／１４１２９０、図１３に記載され、示されるように、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる。したがって、当業者は、所望により、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡの４－ヒドロキシブチルアルデヒドへの転換を含む４－ＨＢａｌおよび／または１，４－ＢＤＯ経路で、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをどのように用いるかを容易に理解する。
通常の中心的な代謝中間体を１，３－ＢＤＯまたは１，４－ＢＤＯに転換するために必要とされる酵素型は、代表的な酵素（ＥＣ）番号を伴って上記に示される（ＷＯ２０１０／１２７３１９、ＷＯ２０１３／０３６７６４、ＷＯ２００８／１１５８４０、ＷＯ２０１０／０３０７１１、ＷＯ２０１０／１４１９２０、ＷＯ２０１１／０４７１０１、ＷＯ２０１３／１８４６０２、ＷＯ２０１４／１７６５１４、米国特許第９，０１７，９８３号、米国特許第８，０６７，２１４号、米国特許第７，８５８，３５０号、米国特許第８，１２９，１６９号、米国特許第８，３７７，６６６号、ＵＳ２０１３／００６６０３５、ＵＳ２０１３／００２９３８１、ＵＳ２０１４／００３０７７９、ＵＳ２０１５／０１４８５１３およびＵＳ２０１４／０３７１４１７も参照）。各標識の最初の３桁は、基質特異性に依存しない変換の一般型を示す酵素番号の最初の３桁に対応する。例示的な酵素としては：１．１．１．ａ、オキシドレダクターゼ（ケトンからヒドロキシル、またはアルデヒドからアルコール）；１．１．１．ｃ、オキシドレダクターゼ（２ステップ、アシルＣｏＡからアルコール）；１．２．１．ｂ、オキシドレダクターゼ（アシルＣｏＡからアルデヒド）；１．２．１．ｃ、オキシドレダクターゼ（２－オキソ酸からアシルＣｏＡ、脱カルボキシル化）；１．２．１．ｄ、オキシドレダクターゼ（リン酸化／脱リン酸化）；１．３．１．ａ、ＣＨ－ＣＨドナーに作用するオキシドレダクターゼ；１．４．１．ａ、アミノ酸に作用するオキシドレダクターゼ（脱アミノ化）；２．３．１．ａ、アシルトランスフェラーゼ（リン酸基の転移）；２．６．１．ａ、アミノトランスフェラーゼ；２．７．２．ａ、ホスホトランスフェラーゼ、カルボキシル基アクセプター；２．８．３．ａ、補酵素Ａトランスフェラーゼ；３．１．２．ａ、チオールエステルヒドロラーゼ（ＣｏＡ特異的）；４．１．１．ａ、カルボキシリアーゼ；４．２．１．ａ、ヒドロリアーゼ；４．３．１．ａ、アンモニアリアーゼ；５．３．３．ａ、イソメラーゼ；５．４．３．ａ、アミノムターゼ；および６．２．１．ａ、酸－チオールリガーゼが挙げられる。
本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに転換するために細胞においてまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで利用することができる。本明細書で開示されるように、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡのＳエナンチオマーに優るＲエナンチオマーについての特異性の増大、アセチルＣｏＡに優る３－ヒドロキシブチリルＣｏＡおよび／または４－ヒドロキシブチリルＣｏＡについての特異性の増大、活性の増大、副産物生成の低減、ｋｃａｔの増大などを含むが、これらに限定されない、有益かつ有用な特性を有する。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、１，３－ブタンジオールデヒドロゲナーゼを用いて本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼの生成物、３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチルアルデヒドを（Ｒ）－１，３－ブタンジオールに酵素的に転換することによって、１，３－ブタンジオールのＲ形態（（Ｒ）－１，３－ブタンジオールとも呼ばれる）を生成するために用いることができる。
１，３－ブタンジオールの生物由来Ｒ形態は、Ｒ形態が好ましい下流生成物の生成のために利用することができる。いくつかの実施形態では、Ｒ形態は、医薬および／または栄養補助食品として利用することができる（ＷＯ２０１４／１９０２５１を参照）。例えば、（Ｒ）－１，３－ブタンジオールは、血中のケトン体レベルの増大などの有益な効果を有し得る（３Ｒ）－ヒドロキシブチル（３Ｒ）－ヒドロキシブチレートを生成するために用いることができる。ケトン体レベルの増大は、身体および認知能力の増強、および心血管状態、糖尿病の治療およびミトコンドリア機能不全障害の治療、ならびに筋肉疲労および筋肉障害の治療を含む、様々な臨床利益をもたらし得る（ＷＯ２０１４／１９０２５１を参照）。１，３－ブタンジオールの生物由来Ｒ形態は、例えば、石油由来ラセミ体１，３－ブタンジオール、そのＳ形態またはそのＲ形態を、生物由来Ｒ形態で置換することによって、石油ベースでない生成物が所望される下流生成物の生成のために利用することができる。
一実施形態では、本発明は、化合物のＲ形態のエナンチオマーが富化されている３－ＨＢａｌもしくは１，３－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを提供する。いくつかの実施形態では、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯは、Ｒエナンチオマーを富化したラセミ体である、すなわち、Ｓ－エナンチオマーよりＲ－エナンチオマーを多く含む。例えば、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯラセミ体は、５５％またはそれよりも多いＲ－エナンチオマーおよび４５％またはそれよりも少ないＳ－エナンチオマーを含み得る。例えば、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯラセミ体は、６０％またはそれよりも多いＲ－エナンチオマーおよび４０％またはそれよりも少ないＳ－エナンチオマーを含み得る。例えば、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯラセミ体は、６５％またはそれよりも多いＲ－エナンチオマーおよび３５％またはそれよりも少ないＳ－エナンチオマーを含み得る。例えば、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯラセミ体は、７０％またはそれよりも多いＲ－エナンチオマーおよび３０％またはそれよりも少ないＳ－エナンチオマーを含み得る。例えば、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯラセミ体は、７５％またはそれよりも多いＲ－エナンチオマーおよび２５％またはそれよりも少ないＳ－エナンチオマーを含み得る。例えば、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯラセミ体は、８０％またはそれよりも多いＲ－エナンチオマーおよび２０％またはそれよりも少ないＳ－エナンチオマーを含み得る。例えば、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯラセミ体は、８５％またはそれよりも多いＲ－エナンチオマーおよび１５％またはそれよりも少ないＳ－エナンチオマーを含み得る。例えば、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯラセミ体は、９０％またはそれよりも多いＲ－エナンチオマーおよび１０％またはそれよりも少ないＳ－エナンチオマーを含み得る。例えば、３－ＨＢａｌまたは１，３－ＢＤＯラセミ体は、９５％またはそれよりも多いＲ－エナンチオマーおよび５％またはそれよりも少ないＳ－エナンチオマーを含み得る。いくつかの実施形態では、３－ＨＢａｌもしくは１，３－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドは、９０％を超えるＲ形態、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％を超えるＲ形態である。一実施形態では、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドは、５５％以上のＲ－エナンチオマー、６０％以上のＲ－エナンチオマー、６５％以上のＲ－エナンチオマー、７０％以上のＲ－エナンチオマー、７５％以上のＲ－エナンチオマー、８０％以上のＲ－エナンチオマー、８５％以上のＲ－エナンチオマー、９０％以上のＲ－エナンチオマーまたは９５％以上のＲ－エナンチオマーであり、高度に化学的純粋な、例えば、９９％以上、例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のＲ－エナンチオマーであり得る。
一実施形態では、３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯの前駆体の石油由来ラセミ混合物、特に３－ヒドロキシブチリルＣｏＡのラセミ混合物は、Ｓ形態に優るＲ形態についての特異性の増大を示す、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼの基質として用いられて、Ｒ形態のエナンチオマーが富化されている３－ＨＢａｌもしくは１，３－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する。そのような反応は、石油由来前駆体を、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞、特に前駆体を３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる細胞に供給することによって行うことができるか、または石油由来前駆体を３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換する１つもしくは複数の酵素を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、もしくはｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏ反応との組合せで行うことができる。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼで４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応は同様に、石油由来前駆体を、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞、特に前駆体を４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換することができる細胞に供給することによって行うことができるか、または石油由来前駆体を４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換する１つもしくは複数の酵素を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、もしくはｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏ反応との組合せで行うことができる。
本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌまたは１，４－ＢＤＯ経路を含有する細胞について本明細書で一般に記載されているが、本発明はまた、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む細胞を提供することが理解される。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、所望の生成物、例として、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の生成物またはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成するのに十分な量で発現され得る。例示的な３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌまたは１，４－ＢＤＯ経路は、図１および２に示され、本明細書に記載されている。
実施例で記載され、図に例示されるように、図１および２の経路を含む本明細書で開示される経路のいずれかは、所望により、任意の経路、特に本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを利用する経路の中間体または生成物を生成する細胞を生成するために利用することができることが理解される。本明細書で開示されるように、中間体を生成するそのような細胞は、所望の生成物を生成する１つまたは複数の上流または下流経路酵素を発現する別の細胞と組み合わせて用いることができる。しかしながら、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌまたは１，４－ＢＤＯ経路中間体を生成する細胞は、所望の生成物としての中間体を生成するために利用することができることが理解される。
一般に、代謝反応、その反応体または生成物について言及しつつ、あるいは特に、言及する代謝反応、反応体もしくは生成物と関連があるかもしくはそれを触媒する酵素、または言及する代謝反応、反応体もしくは生成物と関連があるタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸または遺伝子に言及しつつ、本明細書において本発明を記載する。本明細書で別段明示的に述べられていない限り、反応への言及はまた、反応の反応体および生成物への言及にもなることを当業者は理解する。同様に、本明細書で別段明示的に述べられていない限り、反応体または生成物への言及はまた、反応にも言及しており、これらの代謝構成要素のいずれかへの言及は、言及する反応、反応体もしくは生成物を触媒する酵素または言及する反応、反応体もしくは生成物に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子にも言及している。同様にして、代謝生化学、酵素学およびゲノミクスの周知の分野を考慮すると、本明細書における遺伝子またはコード核酸への言及はまた、対応するコードされる酵素およびそれが触媒する反応または反応と関連があるタンパク質、ならびにその反応の反応体および生成物への言及にもなる。
本明細書で開示されるように、カルボン酸である生成物または経路の中間体は、完全プロトン化形態、部分的プロトン化形態および完全脱プロトン化形態を含めた、種々のイオン化の形態をとって存在し得る。したがって、接尾語の「～エート（－ａｔｅ）」または酸の形を互換的に使用して、遊離酸の形態および任意の脱プロトン化形態の両方を記載することができ、これは、特に、イオン化形態は、その中で、化合物が見出されるｐＨに依存することが公知であるからである。カルボン酸生成物または中間体には、カルボン酸生成物または経路の中間体のエステル形態、例として、Ｏ－カルボキシレートエステルおよびＳ－カルボキシレートエステルが含まれることを理解されたい。Ｏ－およびＳ－カルボキシレートは、Ｃ１～Ｃ６である低級アルキルの、分枝鎖または直鎖のカルボキシレートを含むことができる。いくつかのそのようなＯ－またはＳ－カルボキシレートとして、非限定的に、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉ－プロピル、ｓｅｃ－ブチルおよびｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシルのＯ－またはＳ－カルボキシレートが挙げられ、これらはいずれも、不飽和をさらに保有することができ、それらには、例えば、プロペニル、ブテニル、ペンチルおよびヘキセニルのＯ－またはＳ－カルボキシレートがある。Ｏ－カルボキシレートは、生合成経路の生成物である場合がある。生合成により入手し得る他のＯ－カルボキシレートとして、脂肪アルコール、例として、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、セチルアルコール、パルミトリルアルコール、ヘプタデシルアルコール、ステアリルアルコール、ノナデシルアルコール、アラキジルアルコール、ヘンイコシルアルコールおよびベヘニルアルコールから誘導される、中鎖～長鎖の基、すなわちＣ７～Ｃ２２のＯ－カルボキシレートエステルを挙げることができ、それらのいずれも必要に応じて、分枝していてもよく、かつ／または不飽和を含有してもよい。Ｏ－カルボキシレートエステルはまた、生化学または化学的プロセス、例として、遊離カルボン酸の生成物のエステル化、またはＯ－もしくはＳ－カルボキシレートのエステル交換反応を介して入手することもできる。Ｓ－カルボキシレートは、例えば、ＣｏＡ Ｓ－エステル、システイニルＳ－エステル、アルキルチオエステル、ならびに種々のアリールチオエステルおよびヘテロアリールチオエステルである。
本発明の細胞を、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする発現可能な核酸、および必要に応じて、１つまたは複数の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ生合成経路生合成経路に関与する酵素またはタンパク質の１つまたは複数をコードする発現可能な核酸、およびさらに必要に応じて、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する酵素をコードする核酸を導入することによって生成することができる。選ばれる宿主細胞に応じて、特定の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ生合成経路または下流生成物の一部または全部についての核酸を発現させることができる。例えば、所望の生合成経路についての１つまたは複数の酵素またはタンパク質が、選ばれた宿主に欠損している場合、欠損している酵素（複数可）またはタンパク質（複数可）のための発現可能な核酸を宿主に導入し、続いて、外因性の発現を行う。あるいは、選ばれた宿主がいくつかの経路の遺伝子の内因性の発現を示すが、他の遺伝子は欠損している場合には、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成を達成するには、欠損している酵素（複数可）またはタンパク質（複数可）についてのコード核酸が含まれる、または外因性に発現される遺伝子の外因性発現が、所望の場合、経路の酵素の発現を増大させるために提供され得る。したがって、本発明の細胞を、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および必要に応じて、外因性の酵素もしくはタンパク質の活性を導入して、所望の生合成経路を得ることによって、または１つもしくは複数の内因性の酵素もしくはタンパク質と一緒になって、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含め、所望の生成物、例として、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ、もしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する、１つもしくは複数の外因性の酵素もしくはタンパク質の活性を導入することによって、生成することができる。
例えば、発酵プロセスに適用可能または好適な細菌、酵母、真菌または様々な微生物のいずれかから宿主細胞を選択することができ、これにおいて本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する天然に存在しない細胞を生成することができる。例示的な細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科；Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属を含むＡｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＭａｎｎｈｅｉｍｉａ属を含むＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ目Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属を含むＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ目Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科；Ｂａｃｉｌｌｕｓ属を含むＢａｃｉｌｌａｌｅｓ目Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属をそれぞれ含むＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科；Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属を含むＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ目Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科；Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属を含むＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属をそれぞれ含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ目Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ科Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属；ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科から選択される任意の種が挙げられる。宿主細菌の非限定的な種としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子工学に好適な十分に特徴付けられている微生物体であるので、特に有用な宿主生物体である。
同様に、酵母または真菌種の例示的な種としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属およびＰｉｃｈｉａ属を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科；Ｙａｒｒｏｗｉａ属を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目Ｄｉｐｏｄａｓｃａｃｅａｅ科；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属を含むＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属を含むＥｕｒｏｔｉａｌｅｓ目Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ科；ならびにＲｈｉｚｏｐｕｓ属を含むＭｕｃｏｒａｌｅｓ目Ｍｕｃｏｒａｃｅａｅ科から選択される任意の種が挙げられる。宿主酵母または真菌の非限定的な種としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどが挙げられる。酵母である特に有用な宿主生物体としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられる。
特に３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成するための宿主細胞として微生物体である細胞を利用することについて本明細書で一般に記載されているが、宿主細胞は、より高度な真核生物の細胞系、例として、哺乳動物細胞系または昆虫細胞系であり得ることが理解される。したがって、微生物体である宿主細胞についての本明細書での言及は、所望の生成物を生成するためにより高度な真核細胞系を代わりに利用してもよいことが理解される。例示的なより高度な真核細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト（Ｈｅｌａ、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３、Ｊｕｒｋａｔ）、マウス（３Ｔ３）、霊長類（Ｖｅｒｏ）、昆虫（Ｓｆ９）などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような細胞系は、商業的に入手可能である（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡを参照）。所望の生成物を生成するために本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ならびに必要に応じて代謝および／または遺伝子改変を導入するために、任意の好適な宿主細胞を用いることができることが理解される。
選択される宿主細胞の、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成経路の構成要素に応じて、本発明の天然に存在しない細胞は、少なくとも１つの、外因性に発現される３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路のコード核酸、そして最大では、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含め、１つまたは複数の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成経路もしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドのためのコード核酸を全て含む。例えば、メ３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成を、経路の酵素またはタンパク質が欠損している宿主において、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含め、対応するコード核酸の外因性の発現を通して確立することができる。３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路もしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの全ての酵素またはタンパク質が欠損している宿主では、前記経路中の全ての酵素またはタンパク質の外因性の発現を含めることができるが、宿主が経路の酵素またはタンパク質の少なくとも１つを含有する場合でも、該経路の全ての酵素またはタンパク質を発現させることができることが理解される。例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路もしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成するための経路中の全ての酵素またはタンパク質の外因性の発現が、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含め、含まれ得る。
本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、発現可能な形態で導入するコード核酸の数は、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路が細胞に含まれるべき場合は、少なくとも、選択される宿主細胞の、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の欠損と平行することが当業者により理解される。したがって、本発明の天然に存在しない細胞は、本明細書に開示される３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成経路を構成する酵素またはタンパク質をコードする核酸を、特定の経路に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８つなど、最大で全て、有し得る。いくつかの実施形態では、前記天然に存在しない細胞また、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成を促進もしくは最適化するまたは他の有用な機能を宿主の微生物体に付与する他の遺伝子改変を含んでもよい。１つのそのような他の機能性として、例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の前駆体、例として、アセチルＣｏＡまたはアセトアセチルＣｏＡの１つまたは複数の合成の増大を挙げることができる。
一般に、宿主細胞が、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現することができ、必要に応じて３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の前駆体を、そのような経路を含む細胞において、自然に生成した分子または工学的に操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）生成物のいずれかとして生成し、所望の前駆体の新規の生成または宿主細胞により自然に生成される前駆体の生成の増加のいずれかをもたらすように、宿主細胞は選択される。本明細書で開示されるように、宿主の生物体を、前駆体の生成を増大させるように工学的に操作することができる。さらに、所望の前駆体を生成するように工学的に操作されている細胞を、宿主の生物体として使用し、さらに工学的に操作して、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路もしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド（所望の場合）の酵素またはタンパク質を発現させることもできる。
いくつかの実施形態では、本発明の天然に存在しない細胞は、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを合成する酵素能力を含有する宿主から生成される。この特定の実施形態では、例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の反応を、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生成もしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドに向けて推進するために、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の生成物の合成または蓄積を増大させることが有用となる場合がある。合成または蓄積の増大は、例えば、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含め、上記の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の酵素またはタンパク質の１つまたは複数をコードする核酸の過剰発現によって達成することができる。３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の１つもしくは複数の酵素および／または１つもしくは複数のタンパク質の過剰発現を、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼの外因性発現を含め、例えば、内因性の１つもしくは複数の遺伝子の外因性の発現を通して、または異種の１つもしくは複数の遺伝子の外因性の発現を通して起こすことができる。したがって、例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８つまたはそれより多く、すなわち、最大で全ての、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成経路の酵素またはタンパク質、またはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する酵素をコードする核酸の過剰発現を通して、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する本発明の天然に存在しない細胞に、天然に存在する生物体を容易に変換することができる。さらに、天然に存在しない生物体は、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成経路もしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの酵素の活性の増大をもたらす内因性の遺伝子の変異誘発により生成することもできる。
特に有用な実施形態では、コード核酸の外因性発現が使用される。外因性発現は、発現および／または調節エレメントを宿主および用途向けに調整する能力を付与し、使用者によって制御される所望の発現レベルを達成する。しかし、誘導可能なプロモーターまたは他の調節エレメントに連結する場合、負の調節エフェクターの除去または遺伝子のプロモーターの誘導などによって、内因性発現を他の実施形態で利用することもできる。したがって、天然に存在する誘導可能なプロモーターを有する内因性遺伝子は、適当な誘導剤を提供することによって上方制御することができるか、または、内因性遺伝子の調節領域を誘導可能な調節エレメントを組み込むように工学的に処理し、それによって所望の時間における内因性遺伝子の発現の増加の調節を可能にすることができる。同様に、天然に存在しない細胞に導入される外因性遺伝子のための調節エレメントとして、誘導可能なプロモーターを含めることができる。
１つまたは複数の外因性核酸のいずれかを細胞に導入して、本発明の天然に存在しない細胞を生成することができることが理解される。核酸を導入し、その結果、例えば、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸を導入することを含め、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成経路を細胞に付与することができる。あるいは、コード核酸を導入して、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成能力を得て中間体を生成するのに必要な反応のいくつかを触媒する生合成能力を有する細胞を生成することもできる。例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成経路を有する天然に存在しない細胞は、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含め、所望の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも２つの外因性核酸を含むことができる。したがって、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含め、生合成経路の２つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せを、本発明の天然に存在しない細胞に含めることができることが理解される。同様に、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せにより、対応する所望の生成物の生成が生じる限り、所望により、生合成経路の３つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せを、本発明の天然に存在しない細胞に含めることができることも理解される。同様に、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せにより、対応する所望の生成物の生成が生じる限り、４つの任意の組合せ、または本明細書で開示される生合成経路のより多くの酵素またはタンパク質を、所望により、本発明の天然に存在しない細胞に含めることもできる。
本明細書に記載する３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成に加えて、本発明の天然に存在しない細胞および方法はまた、種々の組合せ、すなわち、お互いに組合せて、ならびに／あるいは当技術分野で周知の他の細胞および方法と組合せて利用して、他のルートによる生成物の生合成を達成することもできる。例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生産体の使用に代わる、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯを生成するための１つの代替が、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の中間体を、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯに転換することが可能な別の細胞の添加によるものである。１つのそのような手順は、例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の中間体を生成する細胞の発酵を含む。次いで、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の中間体を、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯに転換する第２の細胞のための基質として、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の中間体を使用することができる。３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の中間体を、第２の生物体の別の培養物に直接添加して、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の中間体の生産体の元々の培養物から、これらの細胞を、例えば、細胞分離により枯渇させることができ、次いで、その後に、第２の生物体を発酵ブロスに添加し、これを利用して、中間体の精製ステップなしで最終生成物を生成することができる。３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する細胞が、必要に応じて、そのような下流生成物を生成するために含められ得る。
あるいは、そのような酵素変換は、酵素の組み合わせ、または基質の所望の生成物への変換をもたらす連続的な基質の酵素への曝露により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。別の代替として、所望の場合、細胞ベースの変換およびｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素変換の組み合わせを使用することができる。
他の実施形態では、本発明の天然に存在しない細胞および方法を、多種多様なサブ経路として組み立てて、例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成を達成することができる。これらの実施形態では、所望の本発明の生成物の生合成経路を、異なる細胞へと分離することができ、これらの異なる細胞を共培養して、最終生成物を生成することができる。そのような生合成スキームでは、最終生成物が合成されるまで、１つの細胞の生成物が、第２の細胞のための基質となる。例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成を、１つの経路の中間体を、別の経路の中間体、または生成物に転換するための生合成経路を含有する細胞を構築することによって達成することができる。それに代わって、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯはまた、同じ槽中で２つの異なる細胞を使用する共培養または共発酵を通して、細胞から生合成的に生成することもでき、この場合、第１の細胞が、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの中間体を生成し、第２の細胞が、その中間体を、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドに転換する。
本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成するために、他の細胞、サブ経路を有する他の天然に存在しない細胞の共培養、ならびに当技術分野で周知の他の化学的および／または生化学的な手順の組合せを併用する、本発明の天然に存在しない細胞および方法について、多種多様な組合せおよび置換形態が存在することが当業者により理解される。
３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の酵素またはタンパク質もしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドのためのコード核酸の供給源は、例えば、コードされる遺伝子産物が参照反応を触媒することが可能である任意の種を含み得る。そのような種は、原核生物および真核生物の両方を含み、それらとして、これらに限定されないが、古細菌および真正細菌を含めた、細菌、ならびに酵母、植物、昆虫、動物、およびヒトを含む哺乳動物を含めた、真核生物が挙げられる。そのような供給源の例示的な種には、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓおよびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｌｅａｔｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、海洋ガンマプロテオバクテリア、ブチレート生成細菌、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｎｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ＭＣ２ １５５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｋ－１０、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ Ｍ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ ＤＳＭ ２０１６２、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ ＰＣＣ７００１、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ ＡＸ４、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ、Ｃｉｔｒｕｓ ｊｕｎｏｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ ＰＣＣ７００１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ ａｎｄ Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ種（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｓｐａｒａｇｉｆｏｒｍｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌａｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｆｏｒｍｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ｃａｌｄａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍが挙げられるが、これらに限定されない）、Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ種、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍが挙げられるが、これらに限定されない）、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏ

ｓｉｄａｎｓが挙げられるが、これに限定されない）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ ｐｏｔｅｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓが挙げられるが、これらに限定されない）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｂｅｕｍ）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｌｅｘｉｃａｕｄａｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｙｕｒｉｉが挙げられるが、これらに限定されない）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｏｃｅａｎｉ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ ｓａｔｅｌｌｅｓ、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、および本明細書に開示されるかまたは表４に記載のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードの供給源生物体を含め対応する遺伝子のための供給源生物体として利用可能である他の例示的な種が含まれる。しかし、完全ゲノム配列が現在、３９５種の微生物のゲノム、ならびに多様な酵母、真菌、植物および哺乳動物のゲノムを含めて、５５０超の種について利用可能である（これらの半分超が公共のデータベース、例として、ＮＣＢＩ上で利用可能である）ので、例えば、公知の遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子の置換物を含めた、関係のあるまたは離れた種における１つまたは複数の遺伝子について、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成活性をコードする遺伝子を同定すること、ならびに生物体間で遺伝子変化物（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を交換することは、当技術分野で日常的であり、周知である。したがって、特定の生物体、例として、Ｅ．ｃｏｌｉに言及して本明細書に記載する、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を含め、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成を可能にする代謝変化は、原核生物および真核生物を一様に含めた、他の微生物に容易に適用することができる。本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、１つの生物体において例示される代謝変化を、他の細胞、例として、生物体に等しく適用することができることを当業者は知る。
代替の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成経路が無関係な種に存在する場合などの一部の例では、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの生合成を、例えば、参照反応に代わる類似するが同一ではない代謝反応を触媒する、無関係な種からの１つまたは複数のパラログの外因性の発現により、宿主種に付与することができる。異なる生物体間には、代謝のネットワークの間に特定の差が存在することから、異なる生物体間においては、実際の遺伝子の使用が異なる場合があることが当業者により理解される。しかし、本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、本発明の教示および方法を、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを導入することを含め、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを合成する細胞を対象種において構築するために本明細書に例示される代謝変化とコグネイトな代謝変化を使用すれば、全ての細胞に適用することができることもまた当業者は理解する。
本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含め、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する天然に存在しない宿主を構築し、それらの発現レベルを試験するための方法を、例えば、当技術分野で周知の組換えおよび検出の方法により実施することができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ（１９９９年）に記載されているのを見出すことができる。
本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする外因性核酸、および必要に応じて、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する経路に関与する外因性核酸配列は、それらに限定されないが、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学的変換、形質導入、トランスフェクションおよび超音波形質転換を含む当技術分野で周知の技術を用いて、宿主細胞に安定してまたは一時的に導入することができる。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の原核細胞での外因性発現では、遺伝子のいくつかの核酸配列または真核生物の核酸のｃＤＮＡは、Ｎ末端ミトコンドリアなどのターゲティングシグナルまたは他のターゲティングシグナルをコードすることができ、それは、所望により、原核生物の宿主細胞への形質転換の前に除去することができる。例えば、ミトコンドリアのリーダー配列を除去すると、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現が増加した（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０巻、４３２９～４３３８頁（２００５年））。酵母または他の真核細胞での外因性発現では、宿主細胞に適したミトコンドリアのターゲティングまたは分泌シグナルなどの適切なターゲティング配列を加えることによって、遺伝子は、リーダー配列を加えることなしにサイトゾルで発現させることができるか、またはミトコンドリアもしくは他のオルガネラを標的にすることができるか、または分泌を標的にすることができる。したがって、核酸配列にターゲティング配列を除去するか含めるための適当な改変を外因性核酸配列に組み込んで、望ましい特性を付与できることが理解される。さらに、当技術分野で周知の技術を用いて遺伝子にコドン最適化を行って、タンパク質の最適化された発現を達成することができる。
宿主生物体で機能的である発現調節配列に作動可能に連結されている、本明細書で例示される、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、および／または必要に応じて１つまたは複数の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ生合成経路をコードする核酸、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する酵素をコードする核酸を含むように、１つまたは複数の発現ベクターを構築することができる。本発明の宿主細胞での使用に適用可能な発現ベクターには、例えば、宿主染色体への安定した組込みで作動可能なベクターおよび選択配列またはマーカーを含めて、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が含まれる。さらに、発現ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および適当な発現調節配列を含むことができる。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性を提供するか、栄養要求性の欠乏を補充するか、または培地中にない重大な栄養素を供給する、選択可能なマーカー遺伝子を含めることもできる。発現調節配列は、当技術分野で周知である、構成的および誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含めることができる。２つ以上の外因性コード核酸を共発現させる場合、両方の核酸を、例えば、単一の発現ベクターまたは別々の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクターの発現では、コード核酸を作動的に１つの共通の発現調節配列に連結することもでき、または異なる発現調節配列に、例えば１つの誘導可能なプロモーターおよび１つの構成的プロモーターに連結することもできる。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするまたは代謝もしくは合成経路に関与するポリペプチドをコードする外因性核酸配列の形質転換は、当技術分野で周知である方法を用いて確認することができる。そのような方法には、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸分析、または遺伝子産物の発現についてのイムノブロッティング、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験する他の適切な分析法が含まれる。外因性核酸は所望の産物の産生に十分な量で発現されることが当業者によって理解され、また、当技術分野で周知であり本明細書で開示される方法を用いて発現レベルを最適化して十分な発現を得ることができることがさらに理解される。
ベクターまたは発現ベクターはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳によってコードされた核酸を発現して、コードされたポリペプチドを生成するために用いることができる。そのようなベクターまたは発現ベクターは、少なくとも１つのプロモーターを含み、本明細書中上で記載するベクターを含む。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳のためのベクターは一般に、二本鎖ＤＮＡである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳の方法は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９年）を参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳のためのキットも、商業的に入手可能である（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡを参照）。
一実施形態では、本発明は、３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、本発明の細胞を培養して、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたはそのエステルもしくはアミドを生成する工程を含む方法を提供する。そのような細胞は、本発明のポリペプチドを発現する。一実施形態では、本発明は、４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、本発明の細胞を培養して、４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯまたはそのエステルもしくはアミドを生成する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、細胞は、実質的に嫌気性の培地中にある。一実施形態では、方法は、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯ、またはそのエステルもしくはアミドを単離または精製する工程をさらに含み得る。特定の実施形態では、単離または精製する工程は、蒸留を含む。
一実施形態では、本発明は、本発明の製品を生成するためのプロセスであって、製品を生成する反応において、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを、それ自体または別の化合物と化学反応させる工程を含むプロセスを提供する。
一実施形態では、本発明は、３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、基質を本発明のポリペプチドに提供する工程と、基質を３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯに転換する工程とを含み、基質が、１，３－ヒドロキシブチリルＣｏＡのラセミ混合物である、方法を提供する。一実施形態では、３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯは、Ｒ形態のエナンチオマーが富化されている。一実施形態では、本発明は、４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）またはそのエステルもしくはアミドを生成するための方法であって、基質を本発明のポリペプチドに提供する工程と、基質を４－ＨＢａｌおよび／または１，４－ＢＤＯに転換する工程とを含み、基質が、１，４－ヒドロキシブチリルＣｏＡである、方法を提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、細胞中、細胞溶解物中に存在するか、または細胞もしくは細胞溶解物から単離される。
一実施形態では、本発明は、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを生成するための方法であって、本発明の細胞の溶解物をインキュベートして、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを生成する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、細胞溶解物は、第２の細胞溶解物と混合され、第２の細胞溶解物は、本発明のポリペプチドの基質、または３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯの下流生成物を生成する酵素活性を含む。
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成するための方法であって、細胞においてポリペプチドを発現する工程を含む方法も提供する。本発明は、本発明のポリペプチドを生成するための方法であって、本発明の核酸または本発明のベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳して、ポリペプチドを生成する工程を含む方法をさらに提供する。
本明細書に記載するように、細胞は、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現するために用いることができ、必要に応じて、細胞は、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを利用して所望の生成物、例として、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを生成する代謝経路を含み得る。所望の生成物を発現するためのそのような方法は、本明細書に記載されている。あるいは、本明細書に記載するように、細胞溶解物、例えば、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞の細胞溶解物、または本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび代謝経路を発現して所望の生成物を生成する細胞において、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは発現され、かつ／または所望の生成物は生成され得る。別の実施形態では、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳によって発現することができ、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、細胞を含まない系において生成される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳によって発現されるアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで反応を行うために用いることができる。必要に応じて、他の酵素またはそのような酵素を含有する細胞溶解物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素反応の生成物を所望の下流生成物に転換するために用いることができる。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性について試験ためのアッセイを含め、アルデヒドデヒドロゲナーゼの発現、あるいは３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生成について試験するのに適した精製および／またはアッセイを、周知の方法を使用して実施することができる（実施例も参照）。試験する各工学的に操作された株について、３連の培養物などの適切な複製物を増殖させることができる。例えば、工学的に操作された産生宿主における生成物および副産物の形成をモニタリングすることができる。最終生成物および中間体、ならびに他の有機化合物を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＣ－ＭＳ（ガスクロマトグラフィー－質量分析）およびＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）などの方法、または当技術分野で周知である日常的な手順を用いる他の適切な分析法によって分析することができる。発酵ブロス中の生成物の放出を、培養上清で試験することもできる。副産物および残留グルコースは、例えば、グルコースおよびアルコールには屈折率検出器を、有機酸には紫外線検出器を用いるＨＰＬＣによって（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９０巻、７７５～７７９頁（２００５年））、または当技術分野で周知である他の適切なアッセイおよび検出方法によって定量化することができる。また、外因性ＤＮＡ配列から得られた個々の酵素またはタンパク質の活性も、当技術分野で周知の方法を使用してアッセイすることができる。
３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくは他の所望の生成物、例として、それに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドは、当技術分野で周知である様々な方法を用いて培養物中の他の成分から分離することができる。そのような分離法には、例えば、抽出法、ならびに連続液液抽出、浸透気化法、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーおよび限外濾過を含む方法が含まれる。上記の方法は全て、当技術分野において周知である。
本明細書で記載される天然に存在しない本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞のいずれかを培養して、本発明の生合成生成物を生成および／または分泌することができる。例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生産する細胞を、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成のために培養することができる。したがって、一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、あるいは３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を含む培養培地を提供する。一部の局面では、培養培地を、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、あるいは３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を生成する、本発明の天然に存在しない細胞から分離することもできる。培地から細胞を分離するための方法は、当技術分野で周知である。例示的な方法としては、濾過、凝集、沈殿、遠心分離、沈降などが挙げられる。
本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞において、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼ、あるいは３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成するために、組換え体の株を、炭素供給源および他の必須栄養素を有する培地で培養する。全体的なプロセスのコストを低減するために、発酵槽中の嫌気的条件を維持することが、時には望ましく、そうすることが、極めて望ましい場合がある。そのような条件は、例えば、最初に、窒素で培地をスパージし、次いで、フラスコを、セプタムおよびクリンプキャップを用いて密封することによって得ることができる。嫌気的条件で増殖が観察されない株については、微好気的または実質的に嫌気的な条件を、限定的通気のための小さな穴をセプタムに開けることによって適用することができる。例示的な嫌気的条件は、先に記載されており、当技術分野で周知である。例示的な好気的条件および嫌気的条件が、例えば、２００７年８月１０日出願の米国公開第２００９／００４７７１９号に記載されている。本明細書で開示されるように、発酵は、回分、流加または連続的な様式で実施することができる。発酵は、所望の場合、２相で行うこともできる。第１の相は、高増殖およびそれゆえ高生産性を可能にする好気性であり得、これに高収率の所望の生成物、例として、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの嫌気相が続いてもよい。
培地を望ましいｐＨに維持することが必要なとき、所望により、塩基、例えばＮａＯＨもしくは他の塩基、または酸の添加によって培地のｐＨを所望のｐＨ、特に中性ｐＨ、例えば約７のｐＨに維持することができる。増殖速度は、分光光度計（６００ｎｍ）を用いて光学密度を測定することによって決定することができ、グルコース取り込み速度は、炭素源枯渇を経時的にモニターすることによって決定できる。
増殖培地は、例えば、天然に存在しない細胞に炭素源を供給することができる任意の炭水化物源を含み得る。そのような供給源としては、例えば：糖、例として、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロースおよびデンプン；またはグリセロールが挙げられ、炭素供給源は、唯一の炭素供給源として単独で、または本明細書に記載するか、もしくは当技術分野で公知の他の炭素供給源と組合せて用いることができることが理解される。炭水化物の他の供給源には、例えば再生可能なフィードストックおよびバイオマスが含まれる。本発明の方法でフィードストックとして用いることができる例示的なバイオマスの型には、セルロースのバイオマス、ヘミセルロースのバイオマスおよびリグニンフィードストックまたはフィードストックの部分が含まれる。そのようなバイオマスフィードストックは、例えば炭素源として有用な炭水化物基質、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンを含有する。本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、上記に例示されるもの以外の再生可能なフィードストックおよびバイオマスを、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現、および必要に応じて３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生成のための本発明の細胞を培養するのに用いることもできることを理解するであろう。
再生可能なフィードストック、例として、上記に例示されるものに加えてまた、炭素の供給源としてのシンガスで増殖するために、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する本発明の細胞を改変することもできる。この特定の実施形態では、シンガスまたは他の気体の炭素供給源を利用するための代謝経路をもたらすために、１つまたは複数のタンパク質または酵素を、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯを生成する生物体で発現させる。
合成ガス（ｓｙｎｇａｓ）またはプロデューサーガスとしても公知の合成ガス（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ）は、石炭、ならびに炭素材、例えば農作物および残渣を含むバイオマス材のガス化の主要な生成物である。合成ガスは主としてＨ２およびＣＯの混合物であり、それらに限定されないが、石炭、石油、天然ガス、バイオマスおよび廃棄有機物を含む任意の有機フィードストックのガス化から得ることができる。ガス化は、高い燃料対酸素比の下で一般に実施される。ほとんどＨ２およびＣＯであるが、合成ガスはより少ない量のＣＯ２および他のガスをも含み得る。したがって、合成ガスはＣＯ、さらにＣＯ２などのガス状炭素の費用効果の高い供給源を提供する。
Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、ＣＯおよびＨ２からアセチルＣｏＡおよびアセテートなどの他の生成物への転換を触媒する。ＣＯおよび合成ガスを利用することができる生物体は一般に、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に包含される酵素および変換の同じ基本セットを通して、ＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物を利用する能力も有する。同じ生物体がＣＯを用いることもでき、同じ経路が含まれることが明らかにされるずっと前に、微生物によるＣＯ２からアセテートへのＨ２依存性転換が認識された。必要な還元当量を供給する水素が存在する限り、多くの酢酸生成菌がＣＯ２の存在下で増殖し、アセテートなどの化合物を生成することが示された（例えば、Ｄｒａｋｅ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ、３～６０頁、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９９４年）参照）。これは、以下の式に要約することができる：
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ
したがって、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有する天然に存在しない微生物は、アセチルＣｏＡおよび他の所望の生成物の生成にＣＯ２およびＨ２混合物も利用することができる。
Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は当技術分野で周知であり、１２個の反応からなり、それらは２つの分岐：（１）メチル分岐および（２）カルボニル分岐に分けることができる。メチル分岐はシンガスをメチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）に転換し、カルボニル分岐はメチルＴＨＦをアセチルＣｏＡに転換する。メチル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質によって順番に触媒される：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ。カルボニル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質によって順番に触媒される：メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄－硫黄タンパク質、ニッケル－タンパク質集合タンパク質（例えば、ＡｃｓＦ）、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、およびニッケル－タンパク質集合タンパク質（例えば、ＣｏｏＣ）（ＷＯ２００９／０９４４８５を参照）。本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路またはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成するために十分な数のコード核酸を導入するための本明細書で提供される教示および手引きに従って、当業者は、宿主生物体に存在しないＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ酵素またはタンパク質をコードする核酸を少なくとも導入することに関して、同じ工学的設計を実施することもできることを理解する。したがって、改変された生物体が完全なＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含むように、本発明の細胞へ１つまたは複数のコード核酸を導入すると、シンガス利用能が付与される。
さらに、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよび／またはヒドロゲナーゼ活性と協働した還元的（逆行性）トリカルボン酸回路が、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を、アセチルＣｏＡ、および他の生成物、例として、アセテートに転換するために使用することができる。炭素を、還元的ＴＣＡ経路を介して固定することが可能な生物体は、以下の酵素の１つまたは複数を利用することができる：ＡＴＰクエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ－ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、およびヒドロゲナーゼ。具体的には、ＣＯ２を、還元的ＴＣＡ回路を介してアセチルＣｏＡまたはアセテートに固定するために、ＣＯおよび／またはＨ２から一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼにより抽出された還元当量が利用される。アセテートを、酵素、例として、アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ／ホスホトランスアセチラーゼ、およびアセチルＣｏＡシンテターゼによりアセチルＣｏＡに転換することができる。アセチルＣｏＡを、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、および糖新生の酵素により、グリセルアルデヒド－３－リン酸、ホスホエノールピルベート、およびピルベートに転換することができる。アセチルＣｏＡはまた、本明細書で開示されるように（図１を参照）、例えば、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼによって、アセトアセチルＣｏＡに転換して、１，３－ＢＤＯ経路に送り込んでもよい。３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路もしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する経路を生成するのに十分な数のコード核酸を導入するための、本明細書において提供される教示および手引きに従って、同じ工学的設計をまた、少なくとも、宿主の生物体中に存在しない還元的ＴＣＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする核酸を導入することに関しても実施することができることが当業者により理解される。したがって、改変された生物体が還元的ＴＣＡ経路を含有するように、１つまたは複数のコード核酸の本発明の細胞への導入が実施できる。
したがって、本明細書において提供される教示および手引きを考慮すると、天然に存在しない細胞であって、炭素供給源、例として、炭水化物で増殖する場合、生合成された本発明の化合物を生成および／または分泌する細胞を生成することができることが当業者により理解される。そのような化合物には、例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、ならびに３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路における中間体の代謝産物のいずれかが含まれる。必要とされることは、例えば、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含め、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成経路の一部または全部を含める操作を含めて、所望の化合物または中間体の生合成を達成するため、必要とされる酵素またはタンパク質の活性の１つまたは複数に関して工学的な操作を行うだけである。したがって、本発明は、天然に存在しない細胞であって、炭水化物または他の炭素供給源で増殖する場合、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成および／または分泌する細胞、ならびに炭水化物または他の炭素供給源で増殖する場合、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路において示される中間体の代謝産物のいずれかを生成および／または分泌する細胞を提供する。本発明の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する細胞は、中間体、例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の中間体から合成を開始することができる。
本発明の天然に存在しない細胞は、本明細書で例示されるように、当技術分野で周知の方法を用いて、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および必要に応じて、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の酵素もしくはタンパク質またはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドをコードする少なくとも１つの核酸を外因的に発現して、構築される。酵素またはタンパク質は、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成するのに十分な量で発現され得る。本発明の細胞は、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現するか、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成するのに十分な条件下で培養されることが理解される。本明細書で提供される教示およびガイダンスに従って、本発明の天然に存在しない細胞は、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成を達成し、約０．１～３００ｍＭの間またはそれよりも高い、例えば、０．１～１．３Ｍまたはそれよりも高い細胞内濃度をもたらし得る。一般に、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの細胞内濃度は、約３～１５０ｍＭの間、特に約５～１２５ｍＭの間、より特に約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭまたはそれよりも高い濃度を含む約８～１００ｍＭの間である。これらの例示的な範囲のそれぞれの間のおよびそれらを上回る細胞内濃度もまた、本発明の天然に存在しない細胞から達成され得る。例えば、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの細胞内濃度は、約１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、８００ｍＭ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍまたはそれよりも高い濃度を含む約１００ｍＭ～１．３Ｍの間であり得る。
本発明の細胞は、周知の方法を用いて培養される。培養条件には、例えば、液体培養法ならびに発酵および他の大規模培養法が含まれ得る。本明細書に記載するように、本発明の生合成生成物の特に有用な収率は、嫌気的または実質的に嫌気的な培養条件下で得ることができる。
いくつかの実施形態では、培養条件には、嫌気的または実質的に嫌気的な増殖または維持条件が含まれる。例示的な嫌気的条件は、以前に記載されており、当技術分野で周知である。発酵プロセスのための例示的な嫌気的条件は、本明細書に記載されており、例えば、２００７年８月１０日に出願の米国公開第２００９／００４７７１９号に記載されている。これらの条件のいずれかは、天然に存在しない細胞および当技術分野で周知の他の嫌気的条件で利用され得る。そのような嫌気的または実質的に嫌気的な条件下で、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌまたは１，４－ＢＤＯ手順は、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを５～１０ｍＭまたはそれよりも高い細胞内濃度および本明細書で例示される全ての他の濃度で合成することができる。上の記載は、細胞内濃度について言及するが、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌまたは１，４－ＢＤＯ生成細胞は、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを細胞内で生成し、かつ／または生成物を培地に分泌し得ることが理解される。
本明細書に記載するように、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成を達成するための１つの例示的な増殖条件は、嫌気的培養または発酵条件を含む。特定の実施形態では、本発明の天然に存在しない細胞は、嫌気的または実質的に嫌気的な条件の下で保持し、培養し、または発酵させることができる。簡潔には、嫌気的条件とは、酸素不足の環境を指す。実質的に嫌気的な条件には、例えば培地中の溶存酸素濃度が飽和の０～１０％の間にとどまるような、培養、回分発酵または連続発酵が含まれる。実質的に嫌気的な条件には、１％未満の酸素の雰囲気で維持された密封チャンバー内の液体培地または固体寒天で細胞を増殖または休止させることも含まれる。酸素の割合は、例えば、培養物をＮ２／ＣＯ２混合物または他の好適な１つまたは複数の非酸素ガスでスパージすることによって維持することができる。
本明細書に記載する培養条件の規模を拡大し、連続的に増殖させて、本発明の細胞によって、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを製造することができる。例示的な増殖法には、例えば、流加回分発酵および回分分離；流加回分発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離が含まれる。これらのプロセスは全て、当技術分野において周知である。発酵法は、商業的な量の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成による生成に特に有用である。一般に、また非連続的な培養法と同様に、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの連続的および／またはほとんど連続的な生成には、指数増殖期の増殖を維持および／またはほとんど維持するのに十分な栄養素および培地で、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する本発明の天然に存在しない細胞を培養することが含まれる。そのような条件下における連続培養は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日間またはそれよりも長い増殖または培養を含むことができる。さらに、連続培養は、１、２、３、４もしくは５週間またはそれよりも長い週、および最長数ヶ月間のより長い期間を含むこともできる。あるいは、本発明の生物体は、特定の用途に適する場合は数時間培養することができる。連続的および／またはほとんど連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の間の全ての期間を含むこともできることを理解すべきである。本発明の細胞を培養する時間は、所望の目的に十分な量の生成物を生成するのに十分な期間であることがさらに理解される。
例示的な発酵プロセスとしては、流加回分発酵および回分分離；流加回分発酵および連続分離；ならびに連続発酵および連続分離が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な回分発酵プロトコールでは、生成生物体を、適切なガスでスパージした好適な大きさのバイオリアクターで増殖させる。嫌気的条件下で、培養物を不活性ガスまたはガス、例えば窒素、Ｎ２／ＣＯ２混合物、アルゴン、ヘリウムなどの組合せでスパージする。細胞が増殖し、炭素供給源を利用するにつれて、追加の炭素供給源および／または他の栄養素を、炭素供給源および／または栄養素の消費とおよそ平衡を保つ速度でバイオリアクターに供給する。バイオリアクターの温度は、所望の温度、一般に２２～３７℃の範囲内で維持されるが、温度は、生成生物体の増殖特徴および／または発酵プロセスについて所望の条件によってより高温またはより低温で維持してもよい。発酵槽内の培養物の所望の特徴、例えば、細胞密度、生成物濃度などを達成するために所望の期間の間、増殖を続ける。回分発酵プロセスでは、発酵のための期間は一般に、所望の培養条件によって数時間～数日間の範囲内、例えば、８～２４時間または１、２、３、４もしくは５日間または最長で１週間である。ｐＨは、所望により、制御しても、しなくてもよく、ｐＨが制御されない場合、培養物は典型的に、ランの終わりまでにｐＨ３～６まで低減する。培養期間の完了の際に、発酵槽内容物は、細胞分離ユニット、例えば、遠心分離、濾過ユニットなどを通過させて、細胞および細胞片を除去してもよい。所望の生成物が細胞内で発現した場合、追加の生成物を放出するために、所望により、発酵ブロスからの細胞の分離前または後に、細胞を溶解、または酵素的もしくは化学的に破壊してもよい。発酵ブロスを、生成物分離ユニットに移してもよい。生成物の単離は、希釈水溶液から所望の生成物を分離するための当技術分野で利用される標準の分離手順によって行われる。そのような方法としては、発酵プロセスの生成物の化学的特徴によって、生成物の有機溶液を提供するための水不混和性有機溶媒（例えば、トルエン、またはジエチルエーテル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、メチル第三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを含むが、これらに限定されない他の好適な溶媒）を用いた液液抽出、適切な場合、標準蒸留法などが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な完全連続発酵プロトコールでは、生成生物体は一般に、所望の細胞密度を達成するために最初に回分様式で増殖させる。炭素供給源および／または他の栄養素が消耗したら、同じ組成の供給培地を所望の速度で連続的に供給し、発酵液を同じ速度で取り除く。そのような条件下では、バイオリアクター内の生成物濃度、および細胞密度は概して、一定に保たれる。発酵槽の温度は、上記のように、所望の温度で維持される。連続発酵相中、生成を最適化するために、好適なｐＨ範囲を維持することは、概して望ましい。ｐＨをモニタリングして、所望のｐＨ範囲を維持するための好適な酸または塩基の添加を含む、日常的な方法を用いて維持してもよい。バイオリアクターは、適宜および所望により、長期間、一般に少なくとも１週間～数週間および最長で１ヶ月またはそれよりも長く連続作動する。発酵液および／または培養物は、所望により、最多で毎日試料採取することを含む、定期的にモニタリングして、生成物濃度および／または細胞密度の一貫性を保証する。連続様式では、新しい供給培地を供給するにつれて、発酵槽内容物は絶えず除去される。細胞、培地および生成物を含有する退出流は一般に、所望により、細胞および細胞片の除去を伴うか、または伴わない、連続生成物分離手順に供される。水不混和性有機溶媒（例えば、トルエン、またはジエチルエーテル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、メチル第三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを含むが、これらに限定されない他の好適な溶媒）を用いた連続液液抽出、標準連続蒸留法など、または当技術分野で周知の他の方法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で利用される連続分離法は、希釈水溶液から生成物を分離するために用いることができる。
発酵手順は、当技術分野で周知である。簡潔には、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成生成のための発酵は、例えば、流加回分発酵および回分分離；流加回分発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離で利用することができる。回分および連続発酵手順の例は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。
実質的な量の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの連続生成のための本発明の、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生成体を用いる、本明細書に記載する発酵手順に加えて、また、所望により、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド生成体を、例えば、化学合成および／もしくは酵素手順に同時にかけて、生成物を他の化合物に転換してもよく、または発酵培養物から生成物を分離し、順次、化学的および／もしくは酵素的な転換にかけて、生成物を他の化合物に転換してもよい。
本明細書に開示される培養および発酵の条件に加えて、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生合成を達成するための増殖条件に、浸透圧保護剤を培養条件に添加することを含めることもできる。特定の実施形態では、本発明の天然に存在しない細胞を、浸透圧保護剤の存在下において、本明細書に記載されるように維持し、培養し、または発酵させることができる。手短に述べると、浸透圧保護剤は、オスモライトとして作用し、本明細書に記載する細胞が浸透圧のストレスを生き延びるのを支援する化合物を指す。浸透圧保護剤には、これらに限定されないが、ベタイン、アミノ酸、および糖のトレハロースが含まれる。そのような浸透圧保護剤の非限定的な例が、グリシンベタイン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）ベタイン、ジメチルテチン、ジメチルスルホニオプロプリオネート、３－ジメチルスルホニオ－２－メチルプロプリオネート、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオアセテート、コリン、Ｌ－カルニチンおよびエクトインである。一態様では、浸透圧保護剤は、グリシンベタインである。本明細書に記載する細胞を浸透圧のストレスから保護するのに適している浸透圧保護剤の量およびタイプは、使用される細胞に依存することは当業者に理解される。培養条件における浸透圧保護剤の量は、例えば、約０．１ｍＭ以下、約０．５ｍＭ以下、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下、約２．５ｍＭ以下、約３．０ｍＭ以下、約５．０ｍＭ以下、約７．０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、または約５００ｍＭ以下であり得る。
いくつかの実施形態では、炭素フィードストック、ならびにホスフェート、アンモニア、サルフェート、クロリドおよび他のハロゲンなどの細胞による他の取り込み供給源を選んで、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または任意の３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体に存在する原子の同位体の分布を変化させることができる。上記に列挙した種々の炭素フィードストックおよび他の取り込み供給源は、本明細書ではまとめて「取り込み供給源」を指す。取り込み供給源は、生成物としての３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体に存在する任意の原子について、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路から逸脱した反応において生成される副産物について、同位体の富化をもたらし得る。同位体の富化は、例えば、炭素、水素、酸素、窒素、硫黄、リン、クロリドまたは他のハロゲンを含めた、任意の標的原子について達成することができる。
いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、酸素－１６、酸素－１７および酸素－１８の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、水素、重水素および三重水素の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、窒素－１４および窒素－１５の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、硫黄－３２、硫黄－３３、硫黄－３４および硫黄－３５の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、リン－３１、リン－３２およびリン－３３の比を変化させることができる。いくつかの実施形態では、取り込み供給源を選択して、塩素－３５、塩素－３６および塩素－３７の比を変化させることができる。
いくつかの実施形態では、標的原子の同位体の比を、１つまたは複数の取り込み供給源を選択することによって、所望の比に変化させることができる。取り込み供給源は、自然界に見出されるような天然の供給源、または人造の供給源から得ることができ、当業者は、天然の供給源、人造の供給源、またはそれらの組合せを選択して、標的原子の同位体の所望の比を達成することができる。人造の取り込み供給源の例には、例えば、少なくとも部分的に化学的合成反応から得られる取り込み供給源が含まれる。そのような同位体が富化された取り込み供給源を、商業的に購入することもしくは実験室で調製することができ、かつ／または必要に応じて、取り込み供給源の天然の供給源と混合して、同位体の所望の比を達成することもできる。いくつかの実施形態では、所望の起源の、自然界に見出されるような取り込み供給源を選択することによって、取り込み供給源の標的原子の同位体比を達成することができる。例えば、本明細書で論じるように、天然の供給源は、バイオベースの供給源であり、生物学的有機体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来してもよくもしくは生物学的有機体により合成されてもよく、または石油に基づく生成物もしくは大気などの供給源であってもよい。いくつかのそのような実施形態では、炭素の供給源を、例えば、炭素－１４が比較的に枯渇している場合がある、化石燃料に由来する炭素供給源、または石油に由来する対応物よりも多くの量の炭素－１４を保有する場合がある、環境もしくは大気中の炭素供給源、例として、ＣＯ２から選択することができる。
不安定な炭素の同位体である炭素－１４または放射性炭素は、地球の大気中の１０１２個の炭素原子うちのおおよそ１個を構成し、約５７００年の半減期を有する。炭素のストックは、上層大気中で、宇宙線および通常の窒素（１４Ｎ）が関与する核反応により補充される。炭素－１４が、遠い昔に崩壊したので、化石燃料は、炭素－１４を含有しない。化石燃料の燃焼により、大気中の炭素－１４の割合が下がり、これは、いわゆる「スース効果」である。
化合物中の原子の同位体の比を決定する方法は、当業者に周知である。同位体の富化は、質量分析により、当技術分野で公知の技法、例として、加速器質量分析（ＡＭＳ）、安定同位体比質量分析（ＳＩＲＭＳ）、および核磁気共鳴による部位特異的天然同位体分配（ＳＮＩＦ－ＮＭＲ）を使用して容易に評価される。そのような質量分析の技法を、分離の技法、例として、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／またはガスクロマトグラフィーなどと一体化することができる。
炭素の場合、ＡＳＴＭ Ｄ６８６６が、固体、液体および気体の試料のバイオベースの含有量を、放射性炭素年代測定を使用して決定するための標準化された分析方法として、米国材料試験協会（ＡＳＴＭ）インターナショナルにより米国で開発された。この標準法は、放射性炭素年代測定の使用に基づいて、生成物のバイオベースの含有量の決定を行う。ＡＳＴＭ Ｄ６８６６は、最初に２００４年に公開され、この標準法の現在有効なバージョンは、ＡＳＴＭ Ｄ６８６６－１１である（２０１１年４月１日以来有効）。本明細書に記載する技法を含めて、放射性炭素年代測定の技法は、当業者に周知である。
化合物のバイオベースの含有量は、炭素－１４（１４Ｃ）対炭素－１２（１２Ｃ）の比により推定される。具体的には、現在の割合（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｒｎ）（Ｆｍ）は、式：Ｆｍ＝（Ｓ－Ｂ）／（Ｍ－Ｂ）から算出され、式中、Ｂ、ＳおよびＭはそれぞれ、ブランク、試料および現在の参照の１４Ｃ／１２Ｃ比を示す。現在の割合は、「現在」からの、試料の１４Ｃ／１２Ｃ比の偏差の測定値である。現在は、δ１３ＣＶＰＤＢ＝－１９／ｍｉｌに対して正規化された、国家標準局（ＮＢＳ）シュウ酸Ｉ（すなわち、標準参照（ｒｅｓｆｅｒｅｎｃｅ）物質（ＳＲＭ）４９９０ｂ）の（ＡＤ１９５０年の）放射性炭素濃度の９５％と定義される（Ｏｌｓｓｏｎ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ａ Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｂｅｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ， １２ｔｈ Ｐｒｏｃ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７０年））。例えば、ＡＳＭにより測定された質量分析の結果は、国際的に同意されている定義、すなわち、δ１３ＣＶＰＤＢ＝－１９／ｍｉｌに対して正規化された、ＮＢＳシュウ酸Ｉ（ＳＲＭ ４９９０ｂ）の比活性の０．９５倍を使用して計算される。これは、１．１７６±０．０１０×１０－１２の、（ＡＤ１９５０年の）１４Ｃ／１２Ｃの絶対比と同等である（Ｋａｒｌｅｎら、Ａｒｋｉｖ Ｇｅｏｆｙｓｉｋ、４巻：４６５～４７１頁（１９６８年））。標準法の計算には、１つの同位体の、別の同位体に関する識別的な取り込み、例えば、Ｃ１２＞Ｃ１３＞Ｃ１４の生物学的な系における優先的な取り込みが考慮に入れられており、これらの補正は、δ１３について補正されたＦｍとして反映されている。
シュウ酸標準物質（ＳＲＭ ４９９０ｂまたはＨＯｘ１）は、１９５５年のサトウダイコンの作物から作製された。１０００ポンドが作製されたが、このシュウ酸標準物質は最早、商業的に入手可能でない。シュウ酸ＩＩ標準物質（ＨＯｘ２；Ｎ．Ｉ．Ｓ．Ｔ 表記 ＳＲＭ ４９９０Ｃ）が、１９７７年のＦｒｅｎｃｈ ｂｅｅｔの作物の糖蜜から作製された。１９８０年代初期に、１２の研究室からなるグループが、２つの標準物質の比を測定した。シュウ酸ＩＩ対１の活性の比は、１．２９３３±０．００１（加重平均）である。ＨＯｘＩＩの同位体の比は、－１７．８／ミル（ｍｉｌ）である。ＡＳＴＭ Ｄ６８６６－１１は、現在の標準物質のために、入手可能なシュウ酸ＩＩ標準物質ＳＲＭ ４９９０Ｃ（Ｈｏｘ２）の使用を提案している（Ｍａｎｎ、Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ、２５巻（２号）：５１９～５２７頁（１９８３年）における元々のシュウ酸標準物質対現時点で入手可能なシュウ酸標準物質についての考察を参照）。Ｆｍ＝０％は、材料中に炭素－１４原子を完全に欠くことを示し、したがって、化石（例えば、石油に基づく）炭素供給源を示す。核爆弾の試験からの大気中への炭素－１４の１９５０年以降の射出について補正した後のＦｍ＝１００％は、完全に現在の炭素供給源を示す。本明細書に記載する場合、そのような「現在の」供給源には、バイオベースの供給源が含まれる。
ＡＳＴＭ Ｄ６８６６に記載されているように、現在の炭素のパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｍｏｄｅｒｎ ｃａｒｂｏｎ）（ｐＭＣ）が、１００％よりも大きくなる場合がある。これは、減少しつつあるが継続的している１９５０年代の核試験プログラムの作用により、ＡＳＴＭ Ｄ６８６６－１１に記載されているように、大気中の炭素－１４の相当な富化が生じたことによる。全ての試料の炭素－１４活性が、「爆弾前（ｐｒｅ－ｂｏｍｂ）」の標準物質へ参照されること、およびほとんど全ての新しいバイオベースの生成物が、爆弾後の環境において生成されることから、試料の本当のバイオベースの含有量をより良好に反映するために、（同位体の割合についての補正の後の）全てのｐＭＣ値に、（２０１０年の時点では）０．９５を乗じなければならない。１０３％よりも大きいバイオベースの含有量は、分析の誤りが生じてしまった、またはバイオベースの炭素の供給源が、数年超古いものであるかのいずれかであることを示唆している。
ＡＳＴＭ Ｄ６８６６により、材料の総有機含有量と比べたバイオベースの含有量が定量化され、存在する無機炭素および炭素を含有しない他の物質は考慮されない。例えば、ＡＳＴＭ Ｄ６８６６に基づくと、５０％がデンプンに基づく材料であり、５０％が水である生成物は、バイオベースの含有量＝１００％を有するとみなされる（１００％バイオベースである、５０％の有機含有量）。別の例では、５０％がデンプンに基づく材料であり、２５％が石油に基づき、２５％が水である生成物は、バイオベースの含有量＝６６．７％を有する（有機含有量は７５％であるが、生成物の５０％のみがバイオベースである）。別の例では、５０％が有機炭素であり、石油に基づく生成物である生成物は、バイオベースの含有量＝０％を有するとみなされる（有機炭素は５０％であるが、化石供給源に由来する）。したがって、化合物または材料のバイオベースの含有量を決定するための周知の方法および公知の標準物質に基づいて、当業者は、バイオベースの化合物または材料の含有量を容易に決定すること、および／またはバイオベースの所望の含有量を有する本発明の化合物または材料を利用する下流の生成物を調製することができる。
材料のバイオベースの含有量を定量化するための、炭素－１４年代測定の技法の適用は、当技術分野で公知である（Ｃｕｒｒｉｅら、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂ、１７２巻：２８１～２８７頁（２０００年））。例えば、炭素－１４年代測定を使用して、テレフタレート含有材料中のバイオベースの含有量が定量化されている（Ｃｏｌｏｎｎａら、Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻：２５４３～２５４８頁（２０１１年））。とりわけ、再生可能な１，３－プロパンジオールおよび石油に由来するテレフタル酸から得られたポリプロピレンテレフタレート（ＰＰＴ）ポリマーでは、、ほぼ３０％のＦｍ値が得られた（すなわち、ポリマー炭素の３／１１が、再生可能な１，３－プロパンジオールに由来し、８／１１が、化石の終点メンバーのテレフタル酸に由来するからである）（Ｃｕｒｒｉｅら、上記、２０００年）。対照的に、再生可能な１，４－ブタンジオールおよび再生可能なテレフタル酸の両方から得られたポリブチレンテレフタレートポリマーからは、９０％を上回るバイオベースの含有量が得られた（Ｃｏｌｏｎｎａら、上記、２０１１年）。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、環境の炭素ともまた呼ばれる、大気中の炭素の取り込み供給源を反映する炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の比を有する、本発明の細胞によって生産される３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を提供する。例えば、いくつかの態様では、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％程度のＦｍ値を有し得る。いくつかのそのような実施形態では、取り込み供給源はＣＯ２である。いくつかの実施形態では、本発明は、石油に基づく炭素の取り込み供給源を反映する炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の比を有する、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を提供する。この態様では、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体は、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満のＦｍ値を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明は、大気の炭素の取り込み供給源と石油に基づく取り込み供給源との組合せにより得られる炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の比を有する、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を提供する。取り込み供給源のそのような組合せの使用は、炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の比を変化させることができる１つの方法となり、それぞれの比が、取り込み供給源の比率を反映する。
さらに、本発明は、生物学的に生成された３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または本明細書で開示される３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体に、およびそれに由来する生成物に関し、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体は、環境に存在するＣＯ２とおよそ同じ値の炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の同位体比を有する。例えば、いくつかの態様では、本発明は、環境に存在するＣＯ２とおよそ同じ値の炭素－１２対炭素－１３対炭素－１４の同位体比、または本明細書で開示される他の比のいずれかを有する生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ中間体を提供する。本明細書で開示されるように、生成物は、環境に存在するＣＯ２とおよそ同じ値の炭素－１２対炭素－１３対炭素－１４の同位体比、または本明細書で開示される比のいずれかを有してもよく、生成物は、本明細書で開示されるように、生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体から生成され、生物由来生成物は化学的に改変されて、最終生成物を生成することが理解される。３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生物由来生成物、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯの中間体を化学的に改変して所望の生成物を生成する方法は、本明細書に記載するように、当業者に周知である。本発明は、環境に存在するＣＯ２とおよそ同じ値の炭素－１２対炭素－１３対炭素－１４の同位体比を有する、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドに基づき得るプラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品、ならびに４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドに基づき得るプラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロンなどをさらに提供し、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品は、本明細書で開示されるように、生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体から直接的に、またはこれとの組合せで生成される。ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品を生成するための方法は、以前に記載されている（例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１０／１２７３１９、ＷＯ２０１３／０３６７６４、米国特許第９，０１７，９８３号、ＵＳ２０１３／００６６０３５、ＷＯ／２０１２／０１８６２４、ＵＳ２０１２／００２１４７８を参照）。１，３－ＢＤＯは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、例えば、リパーゼを用いて酸と反応させて、エステルに転換することができる。そのようなエステルは、栄養補助食品、医薬品および食品用途を有する場合があり、１，３－ＢＤＯのＲ－形態が用いられる場合、それは（Ｓ－形態またはラセミ混合物と比較すると）エネルギー供給源として動物およびヒトの両方によって最もよく利用される形態であるので、有利である（例えば、ケトンエステル、例として、（米国でＧｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）承認を有する）（Ｒ）－３－ヒドロキシブチル－Ｒ－１，３－ブタンジオールモノエステルおよび（Ｒ）－３－ヒドロキシ酪酸グリセロールモノエステルまたはジエステル）。ケトンエステルは、経口で送達することができ、エステルは、身体によって用いられるＲ－１，３－ブタンジオールを放出する（例えば、ＷＯ２０１３１５０１５３を参照）。アミドを生成する方法は、当技術分野で周知である（例えば、ＧｏｓｗａｍｉおよびＶａｎ Ｌａｎｅｎ、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｓｙｓｔ． １１巻（２号）：３３８～３５３頁（２０１５年）を参照）。
したがって、本発明は、酵素経路の改善、および１，３－ＢＤＯの組成の改善、つまり高度に富化されているか、または本質的にエナンチオマー的に純粋な、副産物について純度の質の改善をさらに有するＲ－１，３－ブタンジオールを提供する微生物を提供するために特に有用である。１，３－ＢＤＯは、直接的に食品供給源、食品成分、香味料、香味料のための溶媒または可溶化剤、安定剤、乳化剤ならびに抗菌剤および保存剤としての用途を含む、さらなる食品関連用途を有する。１，３－ＢＤＯは、非経口薬物溶媒として医薬産業で用いられる。１，３－ＢＤＯは、皮膚軟化薬、保水剤である成分、不溶性成分の結晶化を予防する成分、芳香剤などのより水溶性でない成分のための可溶化剤として、ならびに抗菌剤および保存剤として化粧品における用途を見出す。例えば、それは、とりわけヘアスプレーおよびセッティングローション中で保水剤として用いることができる；それは、精油からの芳香の喪失を低下させ、微生物による変質に対して保存し、ベンゾエートのための溶媒として用いられる。１，３－ＢＤＯは、０．１％～５０％、ならびにさらに０．１％未満およびさらに５０％を超える濃度で用いることができる。それは、毛髪および入浴製品、眼および顔面化粧品、芳香剤、身体の清潔のための製品ならびに剃毛およびスキンケア調製物で用いられる（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄの報告書：「Ｆｉｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｕｔｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ， Ｈｅｘｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ， Ｅｔｈｏｘｙｄｉｇｌｙｃｏｌ， ａｎｄ Ｄｉｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、４巻、５号、１９８５年を参照）。この報告は、化粧品における１，３－ＢＤＯの特定の用途および濃度を提供するものであり、例えば、「Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄａｔａ」という表題のその中の報告の表２を参照されたい。
一実施形態では、本発明は、生物由来３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを含む培地であって、生物由来３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯが、大気中の二酸化炭素取り込みの供給源を反映する炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の同位体比を有し、生物由来３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯが、本発明または本発明の方法の、細胞によってまたは細胞溶解物中で生成される、培地を提供する。一実施形態では、培地は、細胞から分離される。
一実施形態では、本発明は、大気中の二酸化炭素取り込みの供給源を反映する炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の同位体比を有する、３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）または４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）であって、本発明または本発明の方法の、細胞によってまたは細胞溶解物中で生成される３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを提供する。一実施形態では、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のＦｍ値を有する。
一実施形態では、本発明は、本発明または本発明の方法の、細胞によってまたは細胞溶解物中で生成された３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／もしくは１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）または４－ヒドロキシブチルアルデヒド（４－ＨＢａｌ）および／もしくは１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）を提供する。一実施形態では、本発明は、大気中の二酸化炭素取り込みの供給源を反映する炭素－１２、炭素－１３および炭素－１４の同位体比を有する３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／または１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）であって、本発明または本発明の方法の、細胞によってまたは細胞溶解物中で生成され、Ｒ形態のエナンチオマーが富化されている３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯを提供する。一実施形態では、３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のＦｍ値を有する。
一実施形態では、本発明は、本発明または本発明の方法の、細胞によってまたは細胞溶解物中で生成された３－ヒドロキシブチルアルデヒド（３－ＨＢａｌ）および／または１，３－ブタンジオール（１，３－ＢＤＯ）であって、Ｒ形態のエナンチオマーが富化されている３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯを提供する。一実施形態では、Ｒ形態は、３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯの９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％を超える。一実施形態では、３－ＨＢａｌおよび／または１，３－ＢＤＯは、５５％以上のＲ－エナンチオマー、６０％以上のＲ－エナンチオマー、６５％以上のＲ－エナンチオマー、７０％以上のＲ－エナンチオマー、７５％以上のＲ－エナンチオマー、８０％以上のＲ－エナンチオマー、８５％以上のＲ－エナンチオマー、９０％以上のＲ－エナンチオマーまたは９５％以上のＲ－エナンチオマーであり、高度に化学的純粋な、例えば、９９％以上、例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のＲ－エナンチオマーであり得る。
一実施形態では、本発明は、本発明または本発明の方法の、細胞によってまたは細胞溶解物中で生成された３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯ、ならびにそれぞれ、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ以外の化合物を含む組成物を提供する。一実施形態では、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯ以外の化合物は、それぞれ、３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを生成するか、または本発明のポリペプチドを発現する細胞の部分である。
一実施形態では、本発明は、本発明もしくは本発明の方法の、細胞によってもしくは細胞溶解物中で生成された３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを含む組成物、または３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯもしくは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを生成する細胞の細胞溶解物もしくは培養上清を提供する。
一実施形態では、本発明は、本発明または本発明の方法の、細胞によってまたは細胞溶解物中で生成された３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを含む製品であって、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリエステル、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマー、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンまたはブタジエンベースの製品である製品を提供する。一実施形態では、製品は、化粧品または食品添加物である。一実施形態では、製品は、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％の生物由来３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは生物由来４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯを含む。一実施形態では、製品は、繰返し単位として、生成された３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは生成された４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯの部分を含む。一実施形態では、本発明は、本発明または本発明の方法の、細胞によってまたは細胞溶解物中で生成された３－ＨＢａｌおよび／もしくは１，３－ＢＤＯまたは４－ＨＢａｌおよび／もしくは１，４－ＢＤＯで製造されたまたはこれに由来する製品を成型することによって得られた成型製品を提供する。
本発明は、生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、および生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド以外の化合物を含む組成物をさらに提供する。生物由来生成物以外の化合物は、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する経路を有する本発明の天然に存在しない細胞の細胞部分、例えば、微量の細胞部分であってもよく、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成する経路を有する本発明の天然に存在しない細胞の存在下で生成された発酵ブロスもしくは培地もしくはその精製もしくは部分精製画分であってもよい。組成物は、本明細書で開示されるように、副産物形成が低下した生物体によって生成された場合、例えば、低レベルの副産物を含み得る。組成物は、例えば、生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または本発明の細胞の細胞溶解物もしくは培養上清を含み得る。
３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドは、商業的および産業的な適用で用いられる化学物質である。そのような適用の非限定的な例としては、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品の生成が挙げられる。さらに、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌまたは１，４－ＢＤＯは、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品を含む、広い範囲の製品の生成における原材料としても用いられる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現するか、または本明細書で開示される方法を用いて生成された本発明の天然に存在しない細胞によって生成された１つもしくは複数の生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を含む、バイオベースのプラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品を提供する。
本明細書で用いる場合、用語「生物由来」は、生物学的有機体から得られるまたは生物学的有機体により合成されることを意味し、生物学的有機体により生成され得ることから、再生可能な資源とみなすことができる。そのような生物学的有機体、特に、本明細書に開示される本発明の細胞は、農業、植物、細菌または動物からの供給源から得られるフィードストックまたはバイオマス、例として、糖または炭水化物を利用することができる。あるいは、生物学的有機体は、大気中の炭素を利用することもできる。本明細書で用いる場合、用語「バイオベース（ｂｉｏｂａｓｅｄ）」は、本発明の生物由来化合物の全体または部分で構成される、上記した生成物を意味する。バイオベースの生成物または生物由来生成物は、石油に由来する生成物とは対照的であり、そのような生成物は、石油もしくは石油化学フィードストックから得られるかまたは石油もしくは石油化学フィードストックから合成される。
いくつかの実施形態では、本発明は、生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を含む、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品を提供し、生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体は、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品の生成で用いられる３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体の全てまたは部分を含む。例えば、最終的なプラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品は、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品の製造の結果である生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、もしくは３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体、またはその部分を含有し得る。そのような製造は、生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を化学反応させて（例えば、化学的転換、化学的官能化、化学的カップリング、酸化、還元、重合、共重合など）、最終的なプラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品にすることを含み得る。したがって、いくつかの態様では、本発明は、本明細書で開示されるように、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％の生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を含む、バイオベースのプラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品を提供する。
加えて、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で開示される生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体、および生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体以外の化合物を有する組成物を提供する。例えば、いくつかの態様では、本発明は、バイオベースのプラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品を提供し、その生成で用いられる３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体は、生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体と、石油に由来する３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体との組合せである。例えば、バイオベースのプラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品は、製品の少なくとも一部が、本明細書で開示される細胞によって生成された生物由来生成物を含む限り、５０％の生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドと、５０％の石油に由来する３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドとを、または他の所望の比、例として、６０％／４０％、７０％／３０％、８０％／２０％、９０％／１０％、９５％／５％、１００％／０％、４０％／６０％、３０％／７０％、２０％／８０％、１０％／９０％の生物由来前駆体／石油に由来する前駆体を用いて生成することができる。本発明の生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミド、または生物由来３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路中間体を用いて、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）またはそのコポリマーなどのポリヒドロキシアルカノエートを含むポリエステル、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール（ＰＴＭＥＧ）（ＰＴＭＯ、ポリテトラメチレンオキシドとも呼ばれる）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）およびスパンデックス、エラスタンまたはＬｙｃｒａ（商標）と呼ばれるポリウレタン－ポリ尿素コポリマー、ナイロン、有機溶媒、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、血糖低下剤、ブタジエンおよび／またはブタジエンベースの製品を生成するための方法は、当技術分野で周知であることが理解される。
より良好な生産体を得るために、代謝モデリングを利用して、増殖条件を最適化することができる。モデリングを用いて、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計することができる（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析は、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯもしくはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドのより効率の高い生成の方向に代謝を移動させる細胞増殖に対する影響の信頼性のある予測を可能にする。
所望の生成物の生合成を有利にする代謝改変を特定し、設計するための１つのコンピュータ方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークである（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８４巻、６４７～６５７頁（２００３年））。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、標的生成物を過剰に生産する遺伝的に安定した微生物をもたらす遺伝子欠失または破壊戦略を示唆する、代謝モデリングおよびシミュレーションプログラムである。具体的には、フレームワークは、所望の生化学物質を細胞増殖の必須の副産物になるように強制する遺伝子操作を示唆するために、微生物の完全な代謝ネットワークおよび／または生化学ネットワークを調べる。戦略的に置かれた遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊を通して生化学的生成を細胞増殖と連結することによって、バイオリアクター内での長期間の後に設計製作された株に加えられる増殖淘汰圧は、強制的な増殖連結型の生化学的生成の結果として、性能の改善をもたらす。最後に、遺伝子欠失が構築されると、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択された遺伝子はゲノムから完全に除去されるので、設計された株がそれらの野生型状態に戻る可能性はごくわずかである。したがって、このコンピュータ方法は、所望の生成物の生合成をもたらす代替経路を特定するために用いること、または所望の生成物の生合成のさらなる最適化のために、天然に存在しない細胞と共に用いることができる。
簡単に述べると、ＯｐｔＫｎｏｃｋは細胞代謝のモデリングのためのコンピュータによる方法およびシステムを指すために本明細書で用いられる用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、特定の制約をフラックスバランス分析（ＦＢＡ）モデルに組み込む、モデルおよび方法のフレームワークに関する。これらの制約には、例えば、定性的動態学情報、定性的調節情報および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データが含まれる。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、例えばフラックスバランスモデルを通して誘導されるフラックス境界を締め、その後、遺伝子付加または欠失の存在下で代謝ネットワークの性能限界を調査することによって、様々な代謝問題の解法も計算する。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の効果的なクエリーを可能にするモデル式の構築を可能にし、生じる混合整数線形計画法の問題を解決する方法を提供する。ＯｐｔＫｎｏｃｋとして本明細書で言及される代謝モデリングおよびシミュレーション法は、例えば、２００２年１月１０日に出願の米国特許公開第２００２／０１６８６５４号、２００２年１月１０日に出願の国際特許ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０、および２００７年８月１０日に出願の米国公開第２００９／００４７７１９号に記載されている。
生成物の生合成による生成を有利にする代謝変化を特定および設計するための別のコンピュータ方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と呼ばれる代謝モデリングおよびシミュレーションシステムである。このコンピュータ方法およびシステムは、例えば、２００２年６月１４日に出願の米国特許公開２００３／０２３３２１８および２００３年６月１３日に出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８に記載されている。ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、コンピュータでネットワークモデルを生成し、生物系の化学反応を通して質量、エネルギーまたは電荷のフラックスをシミュレートして、その系の化学反応のありとあらゆる可能な機能を含む解空間を定義し、それによってその生物系に許容される一連の活性を判定するのに用いることができるコンピュータシステムである。この手法は、含まれる反応の公知の化学量などの制約、ならびに反応を通して最大フラックスに関連する反応の熱力学のおよび容量制約によって解空間が定義されるので、制約に基づくモデリングと称される。これらの制約によって定義される空間を調べて、生物系またはその生化学成分の表現型能力および挙動を判定することができる。
生物系は柔軟であり、多くの異なる方法で同じ結果に到達することができるので、これらのコンピュータ手法は生物的な現実と一貫している。生物系は、全ての生物系が直面しなければならない基本的な制約によって制限されている進化機構を通して設計される。したがって、制約に基づくモデリング戦略は、これらの一般的な現実を包含する。さらに、制約の締め付けを通してさらなる制限をネットワークモデルに連続的に加える能力は、解空間のサイズの縮小をもたらし、それによって、生理的性能または表現型を予測できる精度を高める。
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、代謝モデリングおよびシミュレーションのための様々なコンピュータフレームワークを適用して、宿主細胞における所望の化合物の生合成を設計および実施することができる。そのような代謝モデリングおよびシミュレーション方法には、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋのような上で例示したコンピュータシステムが含まれる。本発明の説明のために、モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームワークに関して、いくつかの方法を本明細書に記載する。当業者は、ＯｐｔＫｎｏｃｋを用いる代謝変化の特定、設計および実行を、当技術分野で周知であるそのような他の代謝モデリングおよびシミュレーションコンピュータフレームワークおよび方法のいずれかに適用する方法を知るであろう。
上記の方法は、破壊する１セットの代謝反応を提供する。セット内の各反応の除去または代謝改変は、生物体の増殖期の間の必須の生成物として、所望の生成物をもたらすことができる。反応が知られているので、２層の（ｂｉｌｅｖｅｌ）ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解決は、反応セット内の各反応を触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の関連遺伝子も提供する。反応セットおよび各反応に関与する酵素をコードするそれらの対応遺伝子の同定は、一般に自動化されたプロセスであり、その反応と、酵素およびコード遺伝子の間の関係を有する反応データベースとの相関関係を通して達成される。
同定されると、標的細胞または生物体において、所望の生成物の生成を達成するために破壊される反応セットが、セット内の各代謝反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能的破壊によって実施される。反応セットの機能的破壊を達成する１つの特に有用な手段は、各コード遺伝子の欠失によるものである。しかし、一部の例では、例えば、変異、プロモーターもしくは調節因子のためのシス結合部位などの調節領域の欠失を含む他の遺伝子異常、またはいくつかの場所のいずれかにおけるコード配列の切断によって反応を破壊することが有益となることがある。例えば、生成物の連結の速やかな評価が所望され、または遺伝子復帰変異が起こる可能性がより低い場合、遺伝子セットの全体未満の欠失をもたらすこれらの後者の異常が有用なことがある。
所望の生成物の増殖連結型の生合成を含む生合成をもたらすことができる破壊すべきさらなる反応セットまたは代謝改変をもたらす上記の２層のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題のさらなる生産的解法を特定するために、整数カットと呼ばれる最適化法を実施することができる。この方法は、各反復での整数カットと呼ばれる追加の制約の組込みで、上に例示されるＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することによって進行する。整数カット制約は、解決手法が、生成物生合成を増殖に不可避的に連結する任意の前の反復で特定されるものと正確に同じ反応セットを選択することを、効果的に防止する。例えば、前に特定された増殖連結型の代謝改変が破壊のための反応１、２および３を特定する場合、以下の制約は、その後の解法で同じ反応が同時に考慮されることを防止する。整数カット法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １７巻、７９１～７９７頁（２００１年）に記載されているのを見ることができる。代謝モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークと組み合わせたそれらの使用に関して本明細書で記載される全ての方法と同様に、反復性コンピュータ分析でのリダンダンシーを減らす整数カット法は、例えばＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）を含む当技術分野で周知である他のコンピュータフレームワークとともに適用することもできる。
本明細書で例示される方法は、所望の生成物を生合成的に生成する細胞および生物体の構築を可能にし、それには、特定された遺伝子改変を抱えるように設計製作された細胞または生物体の増殖への、標的生化学生成物の生成の必須の連結が含まれる。したがって、本明細書で記載されるコンピュータ方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）から選択されるコンピュータ方法によって特定される代謝改変の同定および実行を可能にする。代謝改変のセットには、例えば、１つまたは複数の生合成経路の酵素の付加および／または、例えば遺伝子欠失による破壊を含む１つまたは複数の代謝反応の機能的破壊を含めることができる。
上記のように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ方法は、長期の増殖選択に曝した場合、変異体微生物ネットワークをコンピュータによって予測されるそれらの最大増殖表現型の方へ進化させることができるという前提で開発された。言い換えると、本手法は、選択圧の下で自己最適化する生物体の能力を導入する。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づいて生化学的生成と細胞増殖との間の連結を強制する遺伝子欠失組合せの網羅的な列挙を可能にする。最適遺伝子／反応ノックアウトの同定は、生じたネットワークについての最適増殖の解法が対象とする生化学物質を過剰に生産するように活性反応セットを選択する、２層の最適化問題の解決を必要とする（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８４巻、６４７～６５７頁（２００３年））。
前に例示され、例えば米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号に記載されるように、代謝経路に必要不可欠な遺伝子を同定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ代謝のコンピュータ化学量論モデルを使用することができる。本明細書で開示されるように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学フレームワークを、所望の生成物の増殖連結型生成をもたらす正確な遺伝子欠失に適用することができる。さらに、２層のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解決は、１セットの欠失だけを提供する。全ての意味がある解決、すなわち増殖連結型生成の形成をもたらすノックアウトの全セットを列挙するために、整数カットと呼ばれる最適化技術を実施することができる。これは、上記のように、各反復での整数カットと呼ばれる追加の制約の組込みでＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することを必要とする。
本明細書で開示されるように、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントに関する（実施例を参照）。そのようなバリアントの生成は、実施例で記載される。様々な方法のいずれかを、アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアント、例として、本明細書で開示されるアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントを生成するために用いることができる。そのような方法としては、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリーおよび以下に記載される他の変異誘発法が挙げられるが、これらに限定されない（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９年）；Ｇｉｌｌｍａｎら、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｒｅａｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、第２版（２０１４年）を参照）。
本明細書で開示されるように、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ、またはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドのための経路の所望の活性をコードする核酸を、宿主の生物体に導入することができる。場合によっては、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ、またはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの経路の酵素またはタンパク質の活性を改変して、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯまたはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドの生成を増大させるのが望ましいことがある。例えば、タンパク質または酵素の活性を増大させる公知の変異を、コード核酸分子に導入することができる。さらに、最適化の方法を適用して、酵素もしくはタンパク質の活性を増大させること、および／または阻害活性を低下させる、例えば、負のレギュレーターの活性を低下させることもできる。
１つのそのような最適化の方法が、定向進化である。定向進化は、酵素の特性を改善するためおよび／または変化させるための特定の遺伝子を標的とする変異の導入が関与する、強力なアプローチである。多く（例えば、＞１０４個）の酵素バリアントの自動化スクリーニングを可能にする、感度の高い高スループットスクリーニングアッセイの開発および実行を通して、改善されたおよび／または変化した酵素を同定することができる。典型的には、変異誘発およびスクリーニングを反復して実施して、最適化された特性を有する酵素を得る。また、変異誘発のための遺伝子の領域を同定するのを支援することができる計算アルゴリズムも開発されており、これにより、生成し、スクリーニングする必要がある酵素バリアントの数を顕著に低下させることができる。多種多様なバリアントライブラリーを有効に生み出すために、多数の定向進化の技術が開発されており（総説については、Ｈｉｂｂｅｒｔら、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ、２２巻：１１～１９頁（２００５年）；ＨｕｉｓｍａｎおよびＬａｌｏｎｄｅ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、７１７～７４２頁（２００７年）、Ｐａｔｅｌ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；ＯｔｔｅｎおよびＱｕａｘ、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ、２２巻：１～９頁（２００５年）．；ならびにＳｅｎら、Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４３巻：２１２～２２３頁（２００７年）を参照）、これらの方法は、多くの酵素のクラスにわたる広い範囲の特性の改善に首尾よく適用されている。定向進化の技術により改善および／または変化が生じている酵素の特徴として、例えば、非天然の基質の転換についての選択性／特異性；ロバストな高温処理のための温度安定性；より低いまたはより高いｐＨ条件下におけるバイオ処理のためのｐＨ安定性；高い生成物タイターを達成することができるような、基質または生成物の耐性；非天然の基質を含めるための、基質結合性を広げることを含んだ、結合性（Ｋｍ）；生成物、基質または主要な中間体による阻害を除去するための阻害（Ｋｉ）；酵素反応速度を増加させて、所望のフラックスを達成するための活性（ｋｃａｔ）；タンパク質収率および全体的な経路のフラックスを増大させるための発現レベル；好気的条件において、空気に感受性の酵素を操作するための酸素安定性；ならびに酸素の非存在下において、好気的酵素を操作するための嫌気性下での活性が挙げられる。
特定の酵素の所望の特性を標的にする、遺伝子の変異誘発および多様化のために、いくつかの例示的な方法が開発されている。そのような方法は、当業者に周知である。これらのいずれかを使用して、３－ＨＢａｌ、１，３－ＢＤＯ、４－ＨＢａｌもしくは１，４－ＢＤＯ経路の酵素もしくはタンパク質またはそれに関連する下流生成物、例として、そのエステルもしくはアミドを生成するための、または本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を変化させることおよび／または最適化することができる。そのような方法としては、ＰＣＲ反応におけるＤＮＡポリメラーゼの忠実度を低下させることによって、ランダム点変異を導入する、ＥｐＰＣＲ（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｊ Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ． ２３４巻：４９７～５０９頁（２００５年））；ｅｐＰＣＲと同様であり、ただし、環状プラスミド全体が、鋳型として使用され、最後の２つのヌクレオチド上にエキソヌクレアーゼ抵抗性のチオホスフェート連結を有する、ランダムな６塩基長を使用して、プラスミドを増幅し、続いて、細胞への形質転換を行い、細胞中で、該プラスミドは、タンデムリピートにおいて再環状化する、誤りがちのローリングサークル増幅（Ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ｅｐＲＣＡ）（Ｆｕｊｉｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２巻：ｅ１４５頁（２００４年）；およびＦｕｊｉｉら、Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． １巻：２４９３～２４９７頁（２００６年））；典型的には、２つまたはそれよりも多いバリアント遺伝子を、ヌクレアーゼ、例として、Ｄｎａｓｅ ＩまたはＥｎｄｏＶを用いて消化して、ランダムな断片のプールを生成し、これらの断片を、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのアニーリングおよび伸長のサイクルにより再度組み立てて、キメラ遺伝子のライブラリーを生み出すことに関与する、ＤＮＡシャフリング（ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）またはファミリーシャフリング（Ｆａｍｉｌｙ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１巻：１０７４７～１０７５１頁（１９９４年）；およびＳｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３７０巻：３８９～３９１頁（１９９４年））；鋳型のプライミングを引き起こし、続いて、変性および非常に短い期間（５秒程度の短さ）のアニーリング／伸長が伴う２段階ＰＣＲのサイクルが繰り返される、互い違いの伸長（Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＳｔＥＰ）（Ｚｈａｏら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６巻：２５８～２６１頁（１９９８年））；ランダムな配列のプライマーを使用して、鋳型の異なるセグメントに相補的な、多くの短いＤＮＡ断片を生成する、ランダムプライミング組換え（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＲＰＲ）（Ｓｈａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６巻：６８１～６８３頁（１９９８年））が挙げられるが、これらに限定されない。
追加の方法としては、線形化プラスミドＤＮＡを使用して、ミスマッチ修復により修復されるヘテロ二重鎖を形成する、ヘテロ二重鎖組換え（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（Ｖｏｌｋｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７巻：ｅ１８頁（１９９９年）；およびＶｏｌｋｏｖら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２８巻：４５６～４６３頁（２０００年））；Ｄｎａｓｅ Ｉによる断片化および一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のサイズ分画を用いる、一過性鋳型上におけるランダムキメラ形成（Ｒａｎｄｏｍ Ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｎ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＲＡＣＨＩＴＴ）（Ｃｏｃｏら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９巻：３５４～３５９頁（２００１年））；鋳型のプールとして使用される一方向性のｓｓＤＮＡ断片の存在下において、プライマーから一方向性に成長しつつある鎖の鋳型スイッチを引き起こす、切断型鋳型上における組換え伸長（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｎ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＲＥＴＴ）（Ｌｅｅら、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ２６巻：１１９～１２９頁（２００３年））；縮重プライマーを使用して、分子間の組換えを制御する、縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャフリング（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（ＤＯＧＳ）（ＢｅｒｇｑｕｉｓｔおよびＧｉｂｂｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３５２巻：１９１～２０４頁（２００７年）；Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ ２２巻：６３～７２頁（２００５年）；Ｇｉｂｂｓら、Ｇｅｎｅ ２７１巻：１３～２０頁（２００１年））；対象の遺伝子または遺伝子断片の１塩基対の欠失を有するコンビナトリアルライブラリーを生み出す、ハイブリッド酵素の創出のための漸進的切断（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＴＣＨＹ）（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６巻：３５６２～３５６７頁（１９９９年）；およびＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７巻：１２０５～１２０９頁（１９９９年））；ホスホチオエートｄＮＴＰを使用して切断部を生成することを除いては、ＩＴＣＨＹに類似する、ハイブリッド酵素の創出のためのチオ－漸進的切断（Ｔｈｉｏ－Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＴＨＩＯ－ＩＴＣＨＹ）（Ｌｕｔｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９巻：Ｅ１６頁（２００１年））；遺伝子を組み換えるための２つの方法、ＩＴＣＨＹとＤＮＡシャフリングとを組み合わせる、ＳＣＲＡＴＣＨＹ（Ｌｕｔｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８巻：１１２４８～１１２５３頁（２００１年））；変異を、ｅｐＰＣＲを介して作り、続いて、使用可能な活性を維持する変異についてスクリーニング／選択を行う、ランダムドリフト変異誘発（Ｒａｎｄｏｍ Ｄｒｉｆｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＮＤＭ）（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら、Ｂｉｏｍｏｌ． Ｅｎｇ． ２２巻：６３～７２頁（２００５年））；ランダム変異誘発の方法であり、ランダムな長さの断片のプールを、ホスホチオエートヌクレオチドのランダムな組込みおよび切断を使用して生成し、このプールを鋳型として使用して、「ユニバーサル」塩基、例として、イノシンの存在下において伸長し、イノシンを含有する相補体の複製により、ランダムな塩基の組込みをもたらし、その結果、変異誘発をもたらす、配列飽和変異誘発（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＳｅＳａＭ）（Ｗｏｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊ． ３巻：７４～８２頁（２００８年）；Ｗｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２巻：ｅ２６頁（２００４年）；およびＷｏｎｇら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３４１巻：１８７～１８９頁（２００５年））；「標的における全ての遺伝子多様性」をコードし、シャフルされた子孫について非常に高い多様性を可能にするように設計されたオーバーラップするオリゴヌクレオチドを使用する、合成シャフリング（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｎｅｓｓら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０巻：１２５１～１２５５頁（２００２年））；ｄＵＴＰの組込みの組合せを利用し、続いて、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、次いで、ピペリジンを用いて処理して、エンドポイントＤＮＡ断片化を実施する、ヌクレオチド交換および切除技術（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ＮｅｘＴ（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３巻：ｅ１１７頁（２００５年））が挙げられる。
さらなる方法としては、リンカーを使用して、関係の薄いまたは無関係の２つの遺伝子間の融合を促進し、２つの遺伝子間の様々なキメラを生成し、単一クロスオーバーハイブリッドのライブラリーが得られる、配列相同性に依存しないタンパク質の組換え（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＳＨＩＰＲＥＣ）（Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９巻：４５６～４６０頁（２００１年））；開始材料が、挿入部を含有するスーパーコイル二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プラスミド、および変異の所望の部位において縮重している２つのプライマーを含む、Ｇｅｎｅ Ｓｉｔｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（商標）（ＧＳＳＭ（商標））（Ｋｒｅｔｚら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３８８巻：３～１１頁（２００４年））；短いオリゴヌクレオチドカセットを使用して、限定的な領域を、多数の可能なアミノ酸配列の変化で置き換える、コンビナトリアルカセット変異誘発（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＣＣＭ）（Ｒｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０８巻：５６４～５８６頁（１９９１年）；およびＲｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１巻：５３～５７頁（１９８８年））；本質的には、ＣＣＭに類似し、ｅｐＰＣＲを、高い変異率で使用して、ホットスポットおよびホット領域を同定し、次いで、ＣＭＣＭにより伸長して、タンパク質配列空間の定義された領域を網羅する、コンビナトリアル複数カセット変異誘発（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＣＭＣＭ）（Ｒｅｅｔｚら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ Ｅｎｇｌ． ４０巻：３５８９～３５９１頁（２００１年））；ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの変異体サブユニットをコードするｍｕｔＤ５遺伝子を利用して、条件付ｔｓミューテータープラスミドにより、選択の間に、ランダムなおよび天然の変異の頻度を２０～４０００倍増大させることが可能になり、選択が必要でない場合、有害な変異が蓄積するのがブロックされる、ミューテーター株技法（Ｍｕｔａｔｏｒ Ｓｔｒａｉｎｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖａら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６７巻：３６４５～３６４９頁（２００１年）；Ｌｏｗら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６０巻：３５９～３６８０頁（１９９６年））が挙げられる。
追加の例示的な方法としては、選択されたアミノ酸のコンビナトリアル変異を評価し、最適化する、多次元の変異誘発の方法である、ルックスルー変異誘発（Ｌｏｏｋ－Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２巻：８４６６～８４７１頁（２００５年））；複数の遺伝子に一度に適用すること、または単一の遺伝子のキメラの大きなライブラリー（複数の変異）を生み出すために適用することができる、ＤＮＡシャフリング方法である、遺伝子の再組立て（Ｇｅｎｅ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより供給されるＴｕｎａｂｌｅ ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）（ＴＧＲ（商標））技術）；特定の折畳みを有する、構造的に定義されたタンパク質骨格をアンカーし、折畳みおよび全体的なタンパク質のエネルギー特性を安定化させることができるアミノ酸置換について、配列空間を検索する最適化アルゴリズムであり、概して、三次元構造が公知のタンパク質については最も有効である、インシリコのタンパク質設計の自動化（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）（ＰＤＡ）（Ｈａｙｅｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９巻：１５９２６～１５９３１頁（２００２年））；ならびに構造／機能の知識を使用して、酵素の改善に有望な部位を選ぶこと、飽和変異誘発を、選ばれた部位において、変異誘発の方法、例として、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を使用して実施すること、所望の特性についてスクリーニング／選択すること、および改善されたクローン（複数可）を使用して、別の部位において再度始め、所望の活性が達成されるまで繰り返し続けることを含む、反復飽和変異誘発（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＩＳＭ）（Ｒｅｅｔｚら、Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ２巻：８９１～９０３頁（２００７年）；およびＲｅｅｔｚら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ Ｅｎｇｌ． ４５巻：７７４５～７７５１頁（２００６年））が挙げられる。
変異誘発のための上記の方法はいずれも、単独で、または任意に組み合わせて使用することができる。さらに、本明細書に記載するように、定向進化の方法は、いずれか１つを、またはそれらを組み合わせて、適応進化の技法と併せて使用してもよい。
本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない改変はまた、本明細書で提供される本発明の定義内に提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定するとは意図されない。
アルデヒドデヒドロゲナーゼバリアント
この実施例では、望ましい特性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントの生成を記載する。
変異誘発技法を用いて、鋳型ＡＬＤ－１に基づいてバリアントアルデヒドデヒドロゲナーゼを生成した。誤りがちのＰＣＲ、部位特異的変異誘発を用いて、および遺伝子選択中の自然発生の変異により、バリアントを生成した。鋳型ＡＬＤ－１は、以下に提供するアルデヒドデヒドロゲナーゼに対応する：
Figure 2022159411000002
ＡＬＤ－２およびＡＬＤ－３についての追加のＡＬＤ配列を、以下に提供する：
Figure 2022159411000003
Figure 2022159411000004
ＡＬＤ－１は、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡのＲエナンチオマーについて、Ｓエナンチオマーと比較してわずかにより特異的である。ＡＬＤ－１の、ＡＬＤ－２およびＡＬＤ－３に対する配列アラインメントを、図３に示す。配列は、それぞれ、配列番号１、２および３に対応する。ＡＬＤ－３については結晶構造も存在し（ＰＤＢＩＤ ４Ｃ３Ｓ）、ＡＬＤ－２は、ＡＬＤ－１よりＡＬＤ－３により緊密に関連している。それゆえ、ＡＬＤ－３を鋳型として使用した。図３の下線部は、２つのループ領域であり、第１番目はＡ、第２番目はＢと名付けられ、両方とも、本明細書で決定されるように基質特異性およびエナンチオマー特異性に関与する。ＡＬＤ－１のループＡは、配列ＬＱＫＮＮＥＴＱＥＹＳＩＮＫＫＷＶＧＫＤ（配列番号１２４）であり、ＡＬＤ－２のループＡは、配列ＩＧＰＫＧＡＰＤＲＫＦＶＧＫＤ（配列番号１２５）であり、ＡＬＤ－３のループＡは、配列ＩＴＰＫＧＬＮＲＮＣＶＧＫＤ（配列番号１２６）である。ＡＬＤ－１のループＢは、配列ＳＦＡＧＶＧＹＥＡＥＧＦＴＴＦＴＩＡ（配列番号１２７）であり、ＡＬＤ－２のループＢは、配列ＴＹＣＧＴＧＶＡＴＮＧＡＨＳＧＡＳＡＬＴＩＡ（配列番号１２８）であり、ＡＬＤ－３のループＢは、配列ＳＹＡＡＩＧＦＧＧＥＧＦＣＴＦＴＩＡ（配列番号１２９）である。ＡＬＤ－２由来の基質特異性ループＡおよびＢの配列および長さは、ＡＬＤ－１およびＡＬＤ－３の基質特異性ループＡおよびＢの配列および長さとは異なる；それにもかかわらず、アラインメントは、本明細書に記載するように置換についての対応する位置の特定を容易にするのに十分な保存を示し、とりわけ図６に示されるように３Ｄモデリングと組み合わせた場合、十分な保存を示し、これは、とりわけ本明細書に記載するように例示的な置換で改変した場合、２つのループ領域が相互作用して、基質特異性およびエナンチオマー特異性に影響を及ぼすことを示す。ＡＬＤ－１およびＡＬＤ－３は、５１．９％同一である。ＡＬＤ－１およびＡＬＤ－２は、３５．９％同一である。ＡＬＤ－３およびＡＬＤ－２は、４０％同一である。図３のアラインメントに基づいてコンセンサスＡＬＤ配列を生成した。ＡＬＤ－１、ＡＬＤ－２およびＡＬＤ－３のアラインメントに基づくループＡについてのコンセンサスは、ＩＸＰＫＧ－－－－－ＸＸＮＲＫＸＶＧＫＤ（配列番号５）である。ＡＬＤ－１、ＡＬＤ－２およびＡＬＤ－３のアラインメントに基づくループＢについてのコンセンサスは、ＳＹＡＧＸＧＸＸＸＥ－－－－ＧＦＸＴＦＴＩＡ（配列番号６）である。
追加のアラインメントを行った（図４）。図４Ａは、ＡＬＤ－１と比較した４０～５５％カットオフでのアラインメントを示す。図４Ｂは、ＡＬＤ－１と比較した７５～９０％カットオフでのアラインメントを示す。図４Ｃは、ＡＬＤ－１と比較した９０％カットオフでのアラインメントを示す。図４Ａ～４Ｃで示される例示的なアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ）のアラインメントは、本発明の置換が行われ得る代表的な鋳型ＡＬＤ配列における位置に対応するＡＬＤにおける位置の特定を示す。下線部は、２つの重要なループ領域であり、第１番目はＡ、第２番目はＢと名付けられ、両方とも、本明細書で決定されるように基質特異性およびエナンチオマー特異性に関与する。図４Ａ～４Ｃは、本明細書で教示される置換についての対応する位置が、ＡＬＤ－１と少なくとも４０％同一であるＡＬＤ、とりわけループＡおよびＢ領域、およびとりわけ非常に保存されているループＢ領域において特定され得ることを示す。
アセチルＣｏＡに対して３ＨＢ－ＣｏＡについてバリアント４５の特異性を増大させるための変異は、１，３ ＢＤＯ生成の増大およびエタノールの低減を有するいくつかのバリアントをもたらした。アセチルＣｏＡから生成したアセトアルデヒドは、宿主細胞でネイティブに酵素によって、または３－ヒドロキシブチルアルデヒドを１，３－ブタンジオールに転換する経路酵素によってエタノールに転換され得るので、アセチルＣｏＡに優る３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの特異性を増大させる変異誘発は、エタノールの低減をもたらす。アルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性を増大させるか、またはその、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡについての特異性を増大させるバリアントは、酵素経路を通して１，３－ブタンジオールへの流れを増大させることによって４－ヒドロキシ－２－ブタノンを低減し、これはアセトアセチルＣｏＡを１，３－ブタンジオール形成に引き込み、それが、ネイティブ酵素または特異性のより低い経路酵素による４－ヒドロキシ－２－ブタノンへの２ステップ転換への可用性を低減する。バリアント４５の配列を、以下に提供する：
Figure 2022159411000005
行ったアッセイは、ＮＡＤＨがＮＡＤに転換されるときの吸光度の低減をモニタリングすることによって３ＨＢ－ＣｏＡに対する活性を調べるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイである。アセチルＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）を基質とするアッセイも行い、３ＨＢ－ＣｏＡの、ＡｃＣｏＡに対する活性の比における改善について、改善された酵素を特定した。アセチルＣｏＡから生成したアセトアルデヒドは、宿主細胞でネイティブに酵素によって、または３－ヒドロキシブチルアルデヒドを１，３－ブタンジオールに転換する経路酵素によってエタノールに転換され得るので、アセチルＣｏＡに優る３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの特異性を増大させる変異は、エタノールの低減をもたらす。
これらのバリアントのサブセットの、（Ｒ）および（Ｓ）３－ヒドロキシブチルアルデヒドによるさらなる調査は、試験したバリアント（９５２、９５５、９５７、９５９、９６１）のうちの５つは、親酵素（バリアント４５）および野生型ＡＬＤ－１と比較してＲエナンチオマーについての選択性の改善を有することを示した（図５）。図５Ａは、３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチルアルデヒド（バーの組の左のバー）および３ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチルアルデヒド（バーの組の右のバー）に対するＡＬＤ－２、ＡＬＤ－１およびＡＬＤ－１バリアントの比活性を示す。精製ストレプトアビジンタグ付きタンパク質を、３５℃でＩＶＩ緩衝液ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＮＡＤ＋、２ｍＭ ＣｏＡ中にて１０ｍＭ ＲまたはＳいずれかの３－ヒドロキシブチルアルデヒドの存在下でアッセイし、３４０ｎｍでのＮＡＤＨ吸光度の変化によって活性をモニタリングした。ＩＶＩ緩衝液は、５ｍＭ第一リン酸カリウム、２０ｍＭ第二リン酸カリウム、１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム一水和物および１５０ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ７．５を含有する。したがって、アッセイにおける酵素反応は、図１に示される方向とは逆の方向で行われた、すなわち、反応は、３－ヒドロキシブチルアルデヒドの３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへの転換を測定した。図５Ｂに示されるように、ある特定のアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントは、Ｓ－３－ヒドロキシブチルアルデヒド（Ｓ－３ＨＢ－アルデヒド）に優るＲ－３－ヒドロキシブチルアルデヒド（Ｒ－３ＨＢ－アルデヒド）についての選択性を示した。
ＡＬＤ－１結晶構造を用いた変異体９５９のコンピュータモデリングにより、アミノ酸置換Ｆ４４２Ｎのために、Ｒ異性体の炭素３上のヒドロキシルで水素結合ネットワークが形成されることが可能になるが、（Ｓ）異性体では可能でないことが示唆される（図６）。図６Ａ～６Ｃは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ９５９の構造のリボン図を示す。図は、９５９の構造への３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチルアルデヒド（図６Ａ）または３－ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチルアルデヒド（図６Ｂ）のドッキングを示す。図６Ｃは、３－ヒドロキシ－（Ｓ）－ブチルアルデヒドが、図６Ａで示される３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチルアルデヒドのドッキングについてエネルギー的に最も好ましい向きと同じ向きでドッキングされた場合、活性部位に位置するイソロイシンで、好ましくない相互作用（丸で囲んだ）が生み出されることを示す。モデルは、変異Ｆ４４２Ｎが、タンパク質と３－ヒドロキシ－（Ｒ）－ブチルアルデヒドのヒドロキシルとの間で水素結合を生み出し、これはＳエナンチオマーでは可能でないことを示す。
例示的なアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントを、表１Ａ～１Ｄに示す。
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ＡＬＤバリアントの様々な活性を決定し、表２に示す。
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例示的なＡＬＤバリアントの追加の活性を、表３に示す。ＡＬＤバリアントで、５０ｇ／リットルを超える、６０ｇ／リットルを超える、７０ｇ／リットルを超える、８０ｇ／リットルを超える、および９０ｇ／リットルを超えるほど高い、４８時間での１，３－ＢＤＯ生成のレベルが得られた。
Figure 2022159411000032
Figure 2022159411000033
上記のそのようなアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントを用いて、Ｒ－３－ヒドロキシブチルアルデヒドの立体異性体、またはより高い割合のＲ形態を有するＲおよびＳ形態の混合物を生成することができる。そのような立体異性体を利用して、下流生成物の立体異性体、例として、Ｒ－１，３－ブタンジオールを製造することができる。そのような立体異性体は、医薬または栄養補助食品としての有用性を有する。
これらの結果は、３－ヒドロキシブチルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、４－ヒドロキシブチルアルデヒドもしくは１，４－ブタンジオールまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む代謝経路によって生成される他の所望の生成物の商業的生成に有用である、望ましい特性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼバリアントの生成を示す。
上記のバリアントは、ＡＬＤ－１親配列に基づく。表１、２または３に示されるバリアントアミノ酸位置は、相同アルデヒドデヒドロゲナーゼ配列に適用することができることが理解される。表４は、相同性に基づいて例示的なＡＬＤ配列を示す。当業者は、そのような配列は、配列をアラインするための日常的であり周知の方法（例えば、ＢＬＡＳＴ、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．」２１５巻：４０３～４１０頁（１９９０年））で分析することができることを容易に理解する。さらに、公に利用可能な配列データベース、例として、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＧｅｎＢａｎｋデータベース、欧州分子生物学研究所（）、ＥｘＰａｓｙ ＰｒｏｓｉｔｅまたはＢＬＡＳＴを用いる他の公に利用可能な配列データベースで見出される配列データベースを検索することによって、追加の相同ＡＬＤ配列を特定することができる。そのようなアラインメントは、酵素活性を保存するためのコンセンサス配列およびさらなる酵素バリアントを生成するための位置を特定するために利用され得る、保存されている残基についての情報を提供し得る。
Figure 2022159411000034
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上記のバリアントなどの個々のＡＬＤバリアントは、望ましい活性を有する追加のバリアントを生成するために、単独で用いてもよく、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６個を含む任意の他のバリアントアミノ酸位置、すなわち、最大で本明細書で開示される全てのバリアントアミノ酸位置（表１～３を参照）と組み合わせてもよいことが理解される。例示的なＡＬＤバリアントとしては、表１～３のいずれかで開示されるアミノ酸位置における、例えば、ＡＬＤ－１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応するアミノ酸位置１２、１９、３３、４４、６５、７２、７３、１０７、１２２、１２９、１３９、１４３、１４５、１５５、１６３、１６７、１７４、１８９、２０４、２２０、２２７、２２９、２３０、２４３、２４４、２５４、２６７、３１５、３５３、３５６、３９６、４２９、４３２、４３７、４４０、４４１、４４２、４４４、４４７、４５０、４６０、４６４または４６７における、単一の置換または置換のうちの１つもしくは複数の組合せが挙げられるが、これらに限定されない（表１～３を参照）。例えば、ＡＬＤバリアントとしては、ＡＬＤ－１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応するアミノ酸位置Ｄ１２、Ｖ１９、Ｃ３３、Ｉ４４、Ｋ６５、Ｋ７２、Ａ７３、Ｙ１０７、Ｄ１２２、Ｅ１２９、Ｉ１３９、Ｔ１４３、Ｐ１４５、Ｇ１５５、Ｖ１６３、Ｇ１６７、Ｃ１７４、Ｃ１８９、Ｍ２０４、Ｃ２２０、Ｍ２２７、Ｋ２２９、Ｔ２３０、Ａ２４３、Ｇ２４４、Ａ２５４、Ｃ２６７、Ｖ３１５、Ｃ３５３、Ｃ３５６、Ｒ３９６、Ｆ４２９、Ｖ４３２、Ｅ４３７、Ｔ４４０、Ｔ４４１、Ｆ４４２、Ｉ４４４、Ｓ４４７、Ｅ４５０、Ｒ４６０、Ｃ４６４またはＡ４６７における、アミノ酸置換、単一の置換または置換のうちの１つもしくは複数の組合せが挙げられるが、これらに限定されない（表１～３を参照）。他の１９個のアミノ酸の任意の置換を、１つまたは複数の所望のアミノ酸位置において行ってもよいことが理解される。
一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｄ１２Ａである１２位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｖ１９Ｉである１９位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｃ３３Ｒである３３位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｉ４４Ｌである４４位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｋ６５Ａである６５位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｋ７２Ｎである７２位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ａ７３Ｓ、Ａ７３Ｄ、Ａ７３Ｇ、Ａ７３Ｌ、Ａ７３Ｑ、Ａ７３Ｆ、Ａ７３Ｅ、Ａ７３Ｗ、Ａ７３Ｒ、Ａ７３ＣおよびＡ７３Ｍから選択される７３位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｙ１０７Ｋである１０７位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｄ１２２Ｎである１２２位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｅ１２９Ｉである１２９位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｉ１３９Ｓ、Ｉ１３９ＶおよびＩ１３９Ｌから選択される１３９位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｔ１４３ＮまたはＴ１４３Ｓである１４３位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｖ１６３Ｃ、Ｖ１６３ＧおよびＶ１６３Ｔから選択される１６３位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｇ１６７Ｓである１６７位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｃ１７４Ｓである１７４位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｃ１８９Ａである１８９位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｍ２０４Ｒである２０４位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｃ２２０Ｖである２２０位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｍ２２７Ｋ、Ｍ２２７Ｑ、Ｍ２２７Ｉ、Ｍ２２７Ｖ、Ｍ２２７Ｃ、Ｍ２２７ＬおよびＭ２２７Ａから選択される２２７位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｋ２２９Ｓである２２９位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｔ２３０Ｒ、Ｔ２３０Ｋ、Ｔ２３０Ｈ、Ｔ２３０Ａ、Ｔ２３０Ｍ、Ｔ２３０Ｃ、Ｔ２３０Ｌ、Ｔ２３０Ｓ、Ｔ２３０Ｙ、Ｔ２３０Ｇ、Ｔ２３０Ｔ、Ｔ２３０Ｉ、Ｔ２３０Ｗ、Ｔ２３０Ｎ、Ｔ２３０ＶおよびＴ２３０Ｑから選択される２３０位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ａ２４３Ｐ、Ａ２４３Ｑ、Ａ２４３Ｅ、Ａ２４３Ｓ、Ａ２４３Ｎ、Ａ２４３Ｋ、Ａ２４３Ｌ、Ａ２４３Ｃ、Ａ２４３ＭおよびＡ２４３Ｉから選択される２４３位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ａ２５４Ｔである２５４位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｃ２６７Ａである２６７位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｖ３１５Ａである３１５位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｃ３５３Ａである３５３位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｃ３５６ＴまたはＣ３５６Ｌである３５６位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｒ３９６Ｈである３９６位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｆ４２９Ｙ、Ｆ４２９Ｑ、Ｆ４２９Ｈ、Ｆ４２９Ｍ、Ｆ４２９ＤおよびＦ４２９Ｌから選択される４２９位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｖ４３２ＶまたはＶ４３２Ｎである４３２位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｅ４３７Ｐである４３７位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｔ４４０Ｈである４４０位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｔ４４１Ｇである４４１位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｆ４４２Ｔ、Ｆ４４２Ｙ、Ｆ４４２Ｈ、Ｆ４４２Ｎ、Ｆ４４２Ｑ、Ｆ４４２ＭおよびＦ４４２Ｆから選択される４４２位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｉ４４４Ｖである４４４位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｓ４４７Ｍ、Ｓ４４７Ｐ、Ｓ４４７Ｈ、Ｓ４４７Ｋ、Ｓ４４７Ｒ、Ｓ４４７Ｔ、Ｓ４４７ＥおよびＳ４４７Ｓから選択される４４７位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｒ４６０Ｋである４６０位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ｃ４６４ＶまたはＣ４６４Ｉである４６４位におけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＬＤは、Ａ４６７Ｖである４６７位におけるアミノ酸置換を含む。上記のアミノ酸位置のいずれかを、単一のアミノ酸置換または置換のうちの１つもしくは複数の組合せのために用いて、本発明のＡＬＤバリアントを生成することができる。
本明細書での教示に基づいて、当業者は、相同ＡＬＤ配列における、ＡＬＤ－１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応するアミノ酸位置１２、１９、３３、４４、６５、７２、７３、１０７、１２２、１２９、１３９、１４３、１４５、１５５、１６３、１６７、１７４、１８９、２０４、２２０、２２７、２２９、２３０、２４３、２４４、２５４、２６７、３１５、３５３、３５６、３９６、４２９、４３２、４３７、４４０、４４１、４４２、４４４、４４７、４５０、４６０、４６４または４６７のいずれかに対応するアミノ酸位置を容易に特定することができる。例えば、図４Ａでのアラインメントにおいて示されるように、ＡＬＤ－１のアミノ酸Ｉ１３９は、配列番号１３および２０のアミノ酸Ｉ１３３に対応する。配列番号２４については、対応する位置は、Ｖ１９９である。アミノ酸配列をアラインするための周知の方法を用いて、一般に本明細書で開示されるようにデフォルトパラメータを用いて、当業者は、ＡＬＤ－１のアミノ酸配列（配列番号１）に対応するアミノ酸位置１２、１９、３３、４４、６５、７２、７３、１０７、１２２、１２９、１３９、１４３、１４５、１５５、１６３、１６７、１７４、１８９、２０４、２２０、２２７、２２９、２３０、２４３、２４４、２５４、２６７、３１５、３５３、３５６、３９６、４２９、４３２、４３７、４４０、４４１、４４２、４４４、４４７、４５０、４６０、４６４または４６７のいずれかに対応する別のＡＬＤ配列におけるアミノ酸位置を容易に決定することができる。
ＡＬＤバリアントは、例えば、表１～３中の、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個、すなわち、最大で本明細書で開示される全てのバリアントアミノ酸位置を含有し得ることがさらに理解される。当業者は、本明細書で開示されるように、任意の単一または組合せのアミノ酸置換、例として、上記および表１～３のアミノ酸バリアント位置に基づいてＡＬＤバリアントを容易に生成することができる。特定の実施形態では、ＡＬＤバリアントは、表１～３に開示されるバリアントである。
本出願を通して、種々の刊行物が参照されている。ＧｅｎＢａｎｋ受託更新番号および／またはＧＩ番号公開を含めて、これらの刊行物の開示は、その全体が、本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために、本出願において本明細書に参照として組み込まれる。本発明は、上に提供された実施例を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の変更を行うことができることが理解されるべきである。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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