CN111607546A - 一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用，属于微生物技术领域。为了解决大肠杆菌合成法尼烯过程中存在的异源MVA下游途径催化效率低、法尼烯产量低等问题，本发明构建了质粒pACYC‑mvaE‑mvaS‑ispA‑AaFS、pTrcLower‑ΔIDI、pTrcLower‑AaIDI和pET28a‑AaFS‑ispA‑SlIDI/AaIDI(IDI基因分别来自番茄、青蒿)，将以上质粒进行组合后转化大肠杆菌，并改良培养条件，制备的基因工程菌可显著提高法尼烯合成产量，有利于推动生物法合成法尼烯的工业化进程。

Description

一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
法尼烯(farnesene)，分子式C15H24，又称金合欢烯，是一种链状倍半萜烯。法尼烯因具有芳香气味和抗氧化等活性，可作为添加剂应用于日化、医药、食品等工业；还可作为信息素，应用于农业害虫的生物防治；此外，法尼烯还是合成维生素E侧链的重要中间体。近年来，萜烯类生物燃料越来越受到关注。法尼烯的加氢产物法尼烷(farnesane)因具有高十六烷值和较低的碳排放，被认为是极具潜力的航空航天领域新型生物燃料。
天然法尼烯存在于多种植物精油中，其合成的直接单体异戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)主要来自于上游的甲羟戊酸(mevalonate,MVA)途径和2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythrito-4-phosphate,MEP)途径。IPP和DMAPP经法尼基二磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase,FPPS/IspA)催化缩合，再经过法尼烯合成酶(farnesene synthase,FS)催化生成法尼烯。植物中法尼烯含量低，提取成本高，易受原料限制；而化学法合成法尼烯需要专门仪器设备，步骤复杂，能耗高，易产生污染。随着基因工程和合成生物学的发展，利用工程微生物来生产法尼烯已经实现。通过引入外源途径，利用大肠杆菌(Escherichia coli)合成法尼烯的产量在摇瓶水平达到5.40g/L(发酵96h)，在发酵罐水平达到8.74g/L(发酵120h)。通过改造内源途径和引入合成酶，利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)合成法尼烯的产量在20万升工业级发酵罐水平达到130g/L以上(发酵两周)。鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)仅利用二氧化碳、光照和微量元素合成法尼烯的产量达到69.1±1.8μg·L-1·O.D.-1·d-1。
大肠杆菌与酵母相比具有生长速度快、培养容易、遗传操作简单等优点，减少了发酵周期长带来的染菌风险。由于法尼烯本身对宿主细胞没有毒害作用，其在大肠杆菌中的产量有望通过关键酶优化、培养条件优化等手段得到进一步提高。
发明内容
为了解决大肠杆菌合成法尼烯过程中存在的异源MVA下游途径催化效率低、中间代谢产物如IPP/DMAPP对宿主有毒性以及法尼烯产量如何进一步提升的问题，本发明采用技术方案如下：
本发明提供了植物来源的异戊烯基二磷酸异构酶(isopentyl diphosphateisomerase,IDI)，相比于大肠杆菌来源的催化活性更高；并通过增加关键基因IDI、ispA和AaFS的拷贝数来提高MVA下游途径的催化效率和减少有毒中间产物的积累。利用酶切-连接的方法构建了pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS和pTrcLower-AaIDI质粒，利用吉布森组装(Gibson Assembly)的方法构建了质粒pTrcLower-ΔIDI和一系列pET28a-AaFS-ispA-SlIDI/AaIDI质粒(IDI基因分别来自番茄、青蒿)。将以上质粒进行组合后转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别进行了摇瓶发酵。通过IPTG诱导表达和TRPO原位萃取获得含有法尼烯的样品，通过气相色谱和法尼烯标准品曲线对样品进行定量分析。
基于上述技术方案，本发明提供了一种高产法尼烯的基因工程菌，所述基因工程菌为过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG-CoA还原酶mvaE基因、HMG-CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶ERG19基因、异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的重组菌，出发菌株为大肠杆菌，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因或来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因；所述来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；所述法尼基二磷酸合成酶ispA基因核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；所述来自青蒿的β-法尼烯合成酶AaFS基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
优选地，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因时，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的拷贝数均为1个或者均为2个；所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因时，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的拷贝数均为1个。
优选地，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
本发明还提供了上述高产法尼烯的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
1)质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS构建：将所述的β-法尼烯合成酶AaFS基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后，采用酶切-连接的方式构建到pACYC-mvaE-mvaS-ispA-Sab1载体上，获得质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS；
2)质粒pTrcLower-ΔIDI构建：敲除pTrcLower载体中来自酵母的异戊烯基二磷酸异构酶ScIDI基因，得到含有ERG12、ERG8和ERG19的质粒pTrcLower-ΔIDI；
3)质粒pTrcLower-AaIDI构建：将来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后，采用酶切-连接的方式构建到pTrcLower载体上，获得质粒pTrc-ERG12-ERG8-ERG19-AaIDI即pTrcLower-AaIDI。
4)质粒pET28a-AaFS-ispA-IDI构建：
分别扩增pET28a载体序列、AaFS基因、ispA基因、来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因序列和来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因，通过Gibson Assembly方法分别构建获得质粒pET28a-AaFS-ispA-AaIDI和质粒pET28a-AaFS-ispA-SlIDI；
5)质粒转化：
将质粒pACYC-mvaE-mvaS、步骤2)制备得到的pTrcLower-ΔIDI和步骤4)制备得到的pET28a-AaFS-ispA-AaIDI共同转化到大肠杆菌感受态细胞，得到含青蒿来源AaIDI基因的单拷贝基因工程菌；
将质粒pACYC-mvaE-mvaS、步骤2)制备得到的pTrcLower-ΔIDI和步骤4)制备得到的pET28a-AaFS-ispA-SlIDI共同转化到大肠杆菌感受态细胞，得到含番茄来源SlIDI基因的单拷贝基因工程菌；
将步骤1)制备的质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS、步骤3)制备的质粒pTrcLower-AaIDI和步骤4)制备的质粒pET28a-AaFS-ispA-AaIDI共同转化到大肠杆菌感受态细胞，得到含青蒿来源AaIDI基因的双拷贝基因工程菌。
进一步地限定，步骤1)所述来自青蒿的β-法尼烯合成酶AaFS基因优化后，基因两端分别添加限制性内切酶BglII、XhoI酶切位点，经合成后克隆到pUC57-simple载体上，得到的质粒pUC57-AaFS经限制性内切酶BglII、XhoI双酶切，回收AaFS基因酶切产物；将pACYC-mvaE-mvaS-ispA-SabS1经限制性内切酶BglII、XhoI双酶切，回收8260bp片段；上述两酶切回收片段经T4 DNA连接酶连接，获得质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS。
进一步地限定，步骤3)所述来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因优化后，经合成克隆到pUC57-simple载体上，得到质粒pUC57-AaIDI，分别扩增AaIDI片段和载体pTrc-ERG12-ERG8-ERG19片段，扩增引物上下游分别添加SacI、PstI酶切位点，扩增产物分别进行限制性内切酶SacI、PstI双酶切，回收AaIDI片段和载体片段，两者经T4 DNA连接酶连接，获得质粒pTrc-ERG12-ERG8-ERG19-AaIDI即pTrcLower-AaIDI。
进一步地限定，步骤4)所述pET28a载体序列扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:5所示，下游引物序列如SEQ ID No:6所示；AaFS基因扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:7所示，下游引物序列如SEQ ID No:8所示；ispA基因扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:9所示，下游引物序列如SEQ ID No:10所示；来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:11所示，下游引物序列如SEQ ID No:12所示；来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:13所示，下游引物序列如SEQ ID No:14所示。
本发明还提供了上述基因工程菌在合成法尼烯中的应用。
进一步地限定，将所述的基因工程菌经一级种子培养基培养后，获得的种子液接种到摇瓶发酵培养基中进行发酵得到法尼烯。
进一步地限定，所述一级种子培养基为LB培养基，其成分为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，其余为水；所述摇瓶发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖、9.8g/LK2HPO4、5g/L牛肉提取物、0.3g/L柠檬酸铁氨、2.1g/L一水合柠檬酸、0.06g/L MgSO4、1mL/L微量元素溶液，其余为水；所述微量元素溶液含有(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.37g/L、ZnSO4·7H2O0.29g/L、H3BO3 2.47g/L、CuSO4·5H2O 0.25g/L和MnCl2·4H2O 1.58g/L。
本发明所述的一种高产法尼烯的基因工程菌在构建过程中使用的：
质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-Sab1，构建时采用的原始空载体为pACYCDuet-1。所述质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-Sab1记载在Zhang H,Liu Q,Cao Y,Feng X,Zheng Y,ZouH,Liu H,Yang J,Xian M.2014.Microbial production of sabinene-a new terpene-based precursor of advanced biofuel.Microbial Cell Factories 13:20。
质粒pACYC-mvaE-mvaS，构建时采用的原始空载体为pACYCDuet-1。所述质粒pACYC-mvaE-mvaS记载在Yang J,Xian M,Su S,Zhao G,Nie Q,Jiang X,Zheng Y,LiuW.2012.Enhancing production of bio-isoprene using hybrid MVA pathway andisoprene synthase in E.coli.PLOS ONE 7:e33509，该质粒中含有本发明所述的乙酰CoA酰基转移酶/HMG-CoA还原酶mvaE基因、HMG-CoA合成酶mvaS基因。
质粒pTrcLower，构建时采用的原始空载体为pTrcHIS2b。所述质粒pTrcLower(即pTrc-ERG12-ERG8-ERG19-ScIDI)记载在Jiang X,Yang J,Zhang H,Zou H,Wang C,XianM.2012.In vitro assembly of multiple DNA fragments using successivehybridization.PLOS ONE7:e30267，该质粒中含有本发明所述的甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶ERG19基因和来自酿酒酵母的异戊烯基二磷酸异构酶ScIDI基因。
有益效果
1.本发明将来源于番茄和青蒿的IDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化后均能够在大肠杆菌中实现表达，在构建的基因重组体系中实现法尼烯的合成，发酵培养24h或48h后，相比于来自大肠杆菌的idi基因，β-法尼烯合成的产量均获得了不同程度的提高，其中催化效果最好的是来自青蒿的AaIDI，且该AaIDI是首次被用于微生物代谢工程研究；并将法尼烯合成途径上的关键基因IDI、ispA和AaFS的异源拷贝数都增加至2个，产量又进一步提高；此外，将培养容器由盐水瓶改为三角瓶，使法尼烯在摇瓶发酵48h产量达到4.31g/L，在效率上已超过目前文献报道的最高产量(Lv J,Wang Y,Zhang C,You S,Qi W,Su R,HeZ.2019.Highly efficient production of FAMEs andβ-farnesene from a two-stagebiotransformation of waste cooking oils，发酵96h，产量5.40g/L)。
2.本发明方法不仅具有生长发酵周期短、培养成本低、遗传操作简单等特点，与酵母做宿主相比减少了发酵周期长带来的染菌风险，而且进一步提高大肠杆菌合成法尼烯的产量，生产出的法尼烯具有产量和纯度较高、无毒无害的优点，与植物提取和化学合成相比，是更为经济、环保、可持续的生产方式，更有利于推动生物法合成法尼烯的工业化进程。
附图说明
图1为法尼烯的合成途径；
图2质粒图谱，a为pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS质粒图谱；b为pTrcLower-ΔIDI质粒图谱；c为pTrcLower-AaIDI质粒图谱；d为pET28a-AaFS-ispA-AaIDI质粒图谱；
图3为摇瓶水平发酵法尼烯产量，a为含有不同IDI的单拷贝菌株摇瓶发酵结果，横坐标为发酵时间(h)，纵坐标为法尼烯产量(mg/L)；b为含AaIDI的单拷贝和双拷贝菌株在三角瓶和盐水瓶中发酵48h结果，横坐标为发酵时间(h)，纵坐标为法尼烯产量(g/L)。
具体实施方式
实施例中所用质粒pACYCDuet-1、pTrcHIS2b、pET28a、大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞、引物和试剂等均可通过商业途径购买获得或通过本领域技术人员所熟知的常规手段获得。
其中：限制性内切酶BglII(货号：FD0083)、XhoI(货号：FD0694)、SacI(货号：FD1133)、PstI(货号：FD0614)均购买自Thermo Scientific。
T4 DNA连接酶购买自NEB，货号：M0202S。
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix试剂盒购自NEB，货号：E2621S
DNA聚合酶预混液PrimeSATR Max Premix购自TaKaRa，货号：R045A。
引物合成自：青岛擎科梓熙生物技术有限公司。
大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)，购自北京全式金生物技术有限公司。
Cm代表氯霉素；Kan代表卡那霉素；Amp代表氨苄青霉素。本发明所提供的菌株是大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，pACYC-mvaE-mvaS或pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS、pTrcLower-ΔIDI或pTrcLower-AaIDI和pET28a-AaFS-ispA-Ecidi/SlIDI/AaIDI，以上质粒通过酶切-连接或吉布森组装(Gibson Assembly)的方法构建。
Ecidi：来自于大肠杆菌的异戊烯基二磷酸异构酶idi基因；
SlIDI：来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因；
AaIDI：来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因。
本发明构建的法尼烯合成途径示意图如附图1所示，以来自青蒿的AaIDI基因为例，该途径由质粒pACYC-mvaE-mvaS、pTrcLower-ΔIDI、pET28a-AaFS-ispA-AaIDI(单拷贝)或者pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS、pTrcLower-AaIDI、pET28a-AaFS-ispA-AaIDI(下游三个基因异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因为双拷贝)以及大肠杆菌本身的MEP途径组成。其中，乙酰CoA酰基转移酶/HMG-CoA还原酶mvaE基因为一个拷贝，它能催化两步反应。
实施例1.合成法尼烯的基因工程菌的构建方法。
1)质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS构建：来自青蒿的β-法尼烯合成酶AaFS基因序列经大肠杆菌密码子偏好性优化后，两端分别加限制性内切酶BglII、XhoI酶切位点，由华大基因进行序列合成，合成后的序列如SEQ ID No:4所示，并克隆到pUC57-simple载体上得到质粒pUC57-AaFS。质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS(附图2中a所示)的构建采取酶切-连接的方法。首先用限制性内切酶BglII、XhoI分别对质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-Sab1和pUC57-AaFS进行双酶切，酶切体系如下：
Figure BDA0002477209410000061
酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的条带割胶回收，其中pACYC-mvaE-mvaS-ispA-Sab1经BglII、XhoI双酶切后回收8260bp片段，作为载体；pUC57-AaFS经BglII、XhoI双酶切后回收1725bp片段，作为插入片段，回收产物进行连接反应：
Figure BDA0002477209410000062
Figure BDA0002477209410000071
连接产物10μL热激转化DH5α感受态细胞并涂布LB Cm平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，获得质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS。
2)质粒pTrcLower-ΔIDI构建：为考察所有基因拷贝数都为1的情况下异源IDI的催化效果，制备单拷贝基因重组菌，将质粒pTrcLower原来含有的酵母ScIDI去掉。质粒pTrcLower-ΔIDI(附图2中b所示)的构建采取Gibson Assembly方法，以pTrcLower质粒为模板扩增不含ScIDI的载体部分即pTrc-ERG12-ERG8-ERG19，上游引物GA-Low-F序列如SEQID No:15所示，下游引物GA-Low-R序列如SEQ ID No:16所示。PCR扩增体系如下：
Figure BDA0002477209410000072
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收约8352bp的pTrc-ERG12-ERG8-ERG19载体片段，用NEBuilder试剂盒进行自连接反应，根据说明书计算片段的比例和各成分的量，连接反应50℃，60min，产物加等体积无菌水稀释，取5μL热激转化DH5α感受态细胞并涂布LBAmp平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，获得质粒pTrcLower-ΔIDI。
3)质粒pTrcLower-AaIDI构建：来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因序列经大肠杆菌密码子偏好性优化后，由华大基因进行序列合成，合成后的序列如SEQ ID No:1所示，并克隆到pUC57-simple载体上得到质粒pUC57-AaIDI，质粒pTrcLower-AaIDI(附图2中c所示)的构建采取酶切-连接的方法。首先以质粒pUC57-AaIDI和pTrcLower为模板，用带有SacI和PstI的引物分别扩增AaIDI基因片段和pTrc-ERG12-ERG8-ERG19载体片段：
Figure BDA0002477209410000073
Figure BDA0002477209410000081
所述pTrc-ERG12-ERG8-ERG19载体序列扩增用的上游引物low-Pst-F序列如SEQID No:17所示，下游引物low-Sac-R序列如SEQ ID No:18所示；AaIDI基因扩增用的上游引物AaIDI-Sac-F序列如SEQ ID No:19所示，下游引物AaIDI-Pst-R序列如SEQ ID No:20所示。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别割胶回收约708bp的AaIDI基因片段和8412bp的pTrc-ERG12-ERG8-ERG19载体片段，用SacI和PstI进行双酶切：
Figure BDA0002477209410000082
酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别割胶回收约708bp的AaIDI基因片段和8412bp的pTrc-ERG12-ERG8-ERG19载体片段，回收产物进行连接反应：
Figure BDA0002477209410000083
连接产物10μL热激转化DH5α感受态细胞并涂布LB Amp平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，获得质粒pTrc-ERG12-ERG8-ERG19-AaIDI即pTrcLower-AaIDI。
4)质粒pET28a-AaFS-ispA-IDI构建：
来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，由华大基因进行序列合成，合成后的序列如SEQ ID No:1所示，并克隆到pUC57-simple载体上得到质粒pUC57-AaIDI；来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，由华大基因进行序列合成，合成后的序列如SEQ ID No:2所示，并克隆到pUC57-simple载体上得到质粒pUC57-SlIDI。
质粒pET28a-AaFS-ispA-IDI(附图2中d所示)的构建采取Gibson Assembly方法，首先扩增出pET28a载体和AaFS、ispA、IDI(分别来自于青蒿和番茄)三个基因片段，分别以pET28a质粒、pUC57-AaFS质粒、大肠杆菌BL21(DE3)菌液、pUC57-AaIDI质粒、pUC57-SlIDI质粒为模板：
Figure BDA0002477209410000091
所述pET28a载体扩增用的上游引物GA-28a-F序列如SEQ ID No:5所示，下游引物GA-28a-R序列如SEQ ID No:6所示；AaFS基因扩增用的上游引物GA-AaFS-F序列如SEQ IDNo:7所示，下游引物GA-AaFS-R序列如SEQ ID No:8所示；ispA基因扩增用的上游引物GA-IspA-F序列如SEQ ID No:9所示，下游引物GA-IspA-R序列如SEQ ID No:10所示；来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因扩增用的上游引物GA-AaIDI-F序列如SEQ ID No:11所示，下游引物GA-AaIDI-R序列如SEQ ID No:12所示；来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因扩增用的上游引物GA-SlIDI-F序列如SEQ ID No:13所示，下游引物GA-SlIDI-R序列如SEQ ID No:14所示。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的条带割胶回收，测定胶回收产物浓度，使用NEBuilder试剂盒进行Gibson Assembly，根据说明书计算片段的比例和各成分的量，连接反应50℃，60min，产物加等体积无菌水稀释，取5μL热激转化DH5α感受态细胞并涂布LB Kan平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，分别获得质粒pET28a-AaFS-ispA-AaIDI和质粒pET28a-AaFS-ispA-SlIDI。
5)质粒转化：将测序正确的质粒pACYC-mvaE-mvaS、步骤2)制备得到的pTrcLower-ΔIDI和步骤4)制备得到pET28a-AaFS-ispA-SlIDI/AaIDI(单拷贝)或步骤1)制备的pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS、步骤3)制备pTrcLower-AaIDI和步骤4)制备的pET28a-AaFS-ispA-AaIDI(双拷贝)组合转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布相应的三抗(Cm、Amp和Kan)LB培养基平板，其中Cm在LB培养基中的终浓度为34mg/L，Amp在LB培养基中的终浓度为100mg/L，Kan在LB培养基中的终浓度为50mg/L，37℃培养至有单菌落长出，获得合成法尼烯的基因工程菌。
本实施例共获得3种基因工程菌，分别为：
含青蒿来源AaIDI基因的基因工程菌(单拷贝)：过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG-CoA还原酶mvaE基因、HMG-CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶ERG19基因、来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的重组菌，所述IDI基因、ispA基因和AaFS基因在质粒上的拷贝数均为1个。
含番茄来源SlIDI基因的基因工程菌(单拷贝)：过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG-CoA还原酶mvaE基因、HMG-CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶ERG19基因、来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的重组菌，所述IDI基因、ispA基因和AaFS基因在质粒上的拷贝数均为1个。
含青蒿来源AaIDI基因的基因工程菌(双拷贝)：过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG-CoA还原酶mvaE基因、HMG-CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶ERG19基因、来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的重组菌，所述IDI基因、ispA基因和AaFS基因在质粒上的拷贝数均为2个。
对比例1.重复实施例1，与实施例1的不同在于，本对比例中异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自大肠杆菌的异戊烯基二磷酸异构酶Ecidi基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo：21所示，扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:22所示，下游引物序列如SEQ ID No:23所示，构建方法参照实施例1所述，所述基因工程菌Ecidi基因、ispA基因和AaFS基因在质粒上的拷贝数均为1个。
实施例2.实施例1构建的各基因工程菌在合成法尼烯中的应用。
本实施例中所述的利用气相色谱进行法尼烯定量检测，色谱柱为Agilent DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱，柱升温程序为：初始60℃保持0.75min，以40℃/min速率升温至300℃保持2min，再降至初始温度。利用β-法尼烯标准品做标准曲线(y＝0.4582x+0.3383，x为β-法尼烯标准品浓度，单位为g/L；y为β-法尼烯峰面积)进行定量。
本实施例中所述一级种子培养基为LB培养基，其成分为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，其余为水。
所述摇瓶发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖、9.8g/L K2HPO4、5g/L牛肉提取物、0.3g/L柠檬酸铁氨、2.1g/L一水合柠檬酸、0.06g/L MgSO4、1mL/L微量元素溶液，所述微量元素溶液含有(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.37g/L、ZnSO4·7H2O 0.29g/L、H3BO3 2.47g/L、CuSO4·5H2O 0.25g/L和MnCl2·4H2O 1.58g/L，所述浓度为各成分在微量元素溶液中的终浓度。
以摇瓶发酵法为例，描述实施例1中构建的基因工程菌在合成法尼烯中的应用。
挑取实施例1和对比例1中获得的含有不同来源IDI的基因工程菌(均为单拷贝)单菌落到5mL含有相应抗生素(Cm/Amp/Kan)的LB培养基中，37℃200rpm摇床培养8～12h，获得一级种子液。用体积600mL的盐水瓶进行摇瓶发酵，转接500μL一级种子液到50mL含有相应抗生素(Cm、Amp和Kan)的摇瓶发酵培养基中，37℃200rpm培养至OD600约0.6～0.9，加入终浓度为0.1mM的IPTG和10mL萃取剂TRPO，30℃200rpm摇床培养，分别在24h、48h取样，用分光光度计测OD600，经气相色谱-质谱鉴定，发酵产物为β-法尼烯，用气相色谱测定法尼烯产量，设置三个重复。如附图3中a所示，来源于番茄和青蒿的IDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化后均能够实现表达，在构建的基因重组菌中实现法尼烯的合成，且相比于来自大肠杆菌的Ecidi基因，β-法尼烯合成的产量均获得了不同程度的提高，其中含有AaIDI的工程菌株合成法尼烯的产量最高，在发酵48h时产量达到1.72g/L。
挑取实施例1中获得的含有青蒿AaIDI的单拷贝或双拷贝基因工程菌单菌落到5mL含有相应抗生素(Cm/Amp/Kan)的LB培养基中，37℃200rpm摇床培养8～12h，获得一级种子液。用体积600mL的盐水瓶或体积500mL的三角瓶进行摇瓶发酵，转接500μL一级种子液到50mL含有相应抗生素(Cm、Amp和Kan)的摇瓶发酵培养基中，37℃200rpm培养至OD600约0.6～0.9，加入终浓度为0.1mM的IPTG和10mL萃取剂TRPO，30℃200rpm摇床培养48h取样，用气相色谱测定法尼烯产量，设置三个重复。如附图3中b所示，由于利用三角瓶发酵增加了反应体系的溶氧量，双拷贝菌株和单拷贝菌株的法尼烯产量分别为4.31g/L和4.23g/L，而双拷贝菌株在盐水瓶中发酵产量为2.49g/L，可见溶氧是提高法尼烯产量的重要因素。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用
<130>
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 708
<212> DNA
<213> 经优化后的青蒿异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因序列
<400> 1
atgaccattc tgaccgatgc agatagcaat atggatgccg tgcagcgtcg tctgatgttt 60
gaagatgaat gcattctggt ggatgcaaat gatgccgtgg ttggccatga taccaaatat 120
aattgtcatc tgatggaaaa gatccagagc gaaaatctgc tgcatcgtgc ctttagtgtg 180
tttctgttta atagtaaata cgagctgctg ctgcaacagc gtagtgccac caaagttacc 240
tttccgctgg tgtggaccaa tacctgttgt agccatccgc tgtatcgtga aagtgaactg 300
attgaagaaa attatctggg cgtgcgcaat gcagcccagc gtaaactgct ggatgaactg 360
ggtattccga gtgatgaact gccggttaat gaattcattc cgctgggtcg cattctgtat 420
aaagcaccga gtgatggtaa atggggcgaa catgaactgg attatctgct gtttattgtt 480
cgcgatgtga gcatggcacc gaatccggat gaagttgccg aagttaaata tgtgaatcgt 540
gaacagctga aagaactggt tatgaaagcc gatctgggtg aagaaggtct gaaactgagc 600
ccgtggtttc gcattgttgt tgataatttt ctgttcaaat ggtgggatca tgtggaaaat 660
ggtagcctgc tggaagcctg tgatatgaaa accattcata atctgtaa 708
<210> 2
<211> 708
<212> DNA
<213> 经优化后的番茄异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因序列
<400> 2
atggttgatg ttatcgcaga tgcaaatatg gatgccgttc agcgtcgtct gatgtttgat 60
gatgaatgca ttctggttga tgtgaatgat aaagttgttg gtcatgaaag taagtataac 120
tgccatctga tggaaaaaat tgaaagcgaa aatctgctgc atcgcgcatt ttctgttttt 180
ctgtttaata gcaagtacga actgctgctg cagcagcgca gcgccaccaa agtgaccttt 240
ccgctggttt ggaccaatac ctgttgtagc catccgctgt atcgtgaaag tgaactgatt 300
gaagaaaatg ccctgggcgt tcgtaatgcc gcccagcgta aactgctgga tgaactgggt 360
attccggcag aagatgtgcc ggttgatcag tttaccccgc tgggtcgtat gctgtataaa 420
gccccgagtg atggtaaatg gggtgaacat gaactggatt atctgctgtt tattgtgcgc 480
gatgtgaatg tgcatccgaa tccggatgaa gttgccgata ttaagtatgt gaatcaggaa 540
cagctgaaag aactgctgcg caaagccgat gcaggtgaag aaggtctgaa actgagcccg 600
tggtttcgcc tggttgttga taattttctg tttaaatggt gggatcatgt tgaaaaaggt 660
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<210> 3
<211> 900
<212> DNA
<213> 大肠杆菌法尼基二磷酸合成酶ispA基因核苷酸序列
<400> 3
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tttatcgccc cactgccctt tcagaacact cccgtggtcg aaaccatgca gtatggcgca 120
ttattaggtg gtaagcgcct gcgacctttc ctggtttatg ccaccggtca tatgttcggc 180
gttagcacaa acacgctgga cgcacccgct gccgccgttg agtgtatcca cgcttactca 240
ttaattcatg atgatttacc ggcaatggat gatgacgatc tgcgtcgcgg tttgccaacc 300
tgccatgtga agtttggcga agcaaacgcg attctcgctg gcgacgcttt acaaacgctg 360
gcgttctcga ttttaagcga tgccgatatg ccggaagtgt cggaccgcga cagaatttcg 420
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gttcaggatg acatcctgga tgtggtggga gatactgcaa cgttgggaaa acgccagggt 720
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<211> 1725
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tttaaagaaa gcctgtgcaa tgatgcccag ggtattctgg cactgtatga agccgccttt 540
atgcgtgtgg aagatgaaac cattctggat aatgccctgg agtttactaa agtgcatctg 600
gatattattg caaaagatcc gagttgtgat agcagtctgc gcacccagat tcatcaggcc 660
ctgaaacagc cgctgcgtcg ccgcctggcc cgtattgaag ccctgcatta tatgccgatc 720
tatcagcagg aaaccagcca tgatgaagtt ctgctgaaac tggccaaact ggattttagt 780
gtgctgcaga gtatgcataa aaaagaatta agtcacatct gcaagtggtg gaaagatttg 840
gatctgcaga ataagctgcc gtatgttcgt gatcgcgttg tggaaggtta tttttggatt 900
ctgagtatct attacgagcc gcagcacgct cgtacccgca tgtttctgat gaaaacctgt 960
atgtggctgg ttgttctgga tgataccttt gataattatg gtacatacga agaactggaa 1020
atttttaccc aggccgttga acgttggagt attagctgtc tggatatgct gccggaatat 1080
atgaaactga tctatcagga actggttaat ctgcatgtgg aaatggaaga aagcctggaa 1140
aaagaaggca aaacctatca gattcattat gttaaagaga tggccaaaga actggtgcgc 1200
aattatctgg ttgaagcccg ctggctgaaa gaaggctata tgccgaccct ggaagaatat 1260
atgagcgtta gcatggtgac cggcacctat ggtctgatga ttgcacgcag ttatgtgggt 1320
cgcggcgata ttgttaccga agataccttt aaatgggtta gcagctatcc gccgattatt 1380
aaggccagct gtgttattgt gcgcctgatg gatgatattg tgagtcataa agaagaacag 1440
gaacgtggtc atgttgccag tagcattgaa tgttatagta aagaaagcgg cgcaagtgaa 1500
gaagaagcat gtgaatatat tagccgcaaa gttgaagatg cctggaaagt gattaatcgt 1560
gaaagtctgc gtccgaccgc cgttccgttt ccgctgctga tgccggccat taatctggcc 1620
cgtatgtgtg aagttctgta tagtgtgaat gatggtttta cccatgcaga aggtgacatg 1680
aaaagctata tgaaaagttt ctttgtgcac ccgatggttg tttaa 1725
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> GA-28a-F
<400> 5
ggatccgaat tcgagctc 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> GA-28a-R
<400> 6
gcccatggta tatctccttc 20
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> GA-AaFS-F
<400> 7
gaaggagata taccatgggc atgagcaccc tgccgatt 38
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> GA-AaFS-R
<400> 8
ttaaacaacc atcgggtgca c 21
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> GA-IspA-F
<400> 9
tgcacccgat ggttgtttaa aggaggttaa ttggatggac tttccgcagc aac 53
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> GA-IspA-R
<400> 10
ttatttatta cgctggatga tgtagtc 27
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> GA-AaIDI-F
<400> 11
tcatccagcg taataaataa aggaggttaa ttggatgacc attctgaccg atgc 54
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> GA-AaIDI-R
<400> 12
cggagctcga attcggatcc ttacagatta tgaatggttt tcatatcac 49
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> GA-SlIDI-F
<400> 13
tcatccagcg taataaataa aggaggttaa ttggatggtt gatgttatcg caga 54
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> GA-SlIDI-R
<400> 14
cggagctcga attcggatcc ttaggtcagt ttatgaatgg ttttcatatc 50
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> GA-Low-F
<400> 15
aaaggaataa ctgcagctgg taccatatgg 30
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> GA-Low-R
<400> 16
ccagctgcag ttattccttt ggtagaccag tctttg 36
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> low-Pst-F
<400> 17
aaaggaataa ctgcagctgg taccatatgg 30
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> low-Sac-R
<400> 18
taggagctct tattcctttg gtagaccagt ctttg 35
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> AaIDI-Sac-F
<400> 19
taggagctcg taaggaggta tcaatatgac cattctgacc gatgc 45
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> AaIDI-Pst-R
<400> 20
aactgcagtt acagattatg aatggttttc atatcac 37
<210> 21
<211> 549
<212> DNA
<213> 大肠杆菌Ecidi
<400> 21
atgcaaacgg aacacgtcat tttattgaat gcacagggag ttcccacggg tacgctggaa 60
aagtatgccg cacacacggc agacaccctc ttacatctcg cgttctccag ttggctgttt 120
aatgccaagg ggcaattatt agttacccgc cgcgcactga gcaaaaaagc atggcctggc 180
gtgtggacta actcggtttg tgggcaccca caactgggag aaagcaacga agacgcagtg 240
atccgccgtt gccgttatga gcttggcgtg gaaattacgc ctcctgaatc tatctatcct 300
gactttcgct atcgcgccac cgatccgaat ggcattgtgg aaaatgaagt gtgtccggta 360
tttgccgcac gcaccaacag tgcgttacag atcaacgatg atgaagtgat ggattatcaa 420
tggtgtgatt tagcagatgt attacacggt attgatgcca cgccgtgggc gttcagtccg 480
tggatggtaa tgcaggcagc caatagtgaa gcaagaaaat tgttgtctgc tttcgcgcag 540
cacaattaa 549
<210> 22
<211> 53
<212> DNA
<213> 扩增大肠杆菌Ecidi的上游引物
<400> 22
tcatccagcg taataaataa aggaggttaa ttggatgcaa acggaacacg tca 53
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增大肠杆菌Ecidi的下游引物
<400> 23
ttaattgtgc tgcgcgaaag 20

Claims (10)

1.一种高产法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG-CoA还原酶mvaE基因、HMG-CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶ERG19基因、异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的重组菌，出发菌株为大肠杆菌；
所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因或来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因；所述来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；所述法尼基二磷酸合成酶ispA基因核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；所述来自青蒿的β-法尼烯合成酶AaFS基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
2.根据权利要求1所述的高产法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因时，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的拷贝数均为1个或者均为2个；所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因为来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因时，所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的拷贝数均为1个。
3.根据权利要求1所述的高产法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
4.权利要求1-3任意一项所述的高产法尼烯的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS构建：将所述β-法尼烯合成酶AaFS基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后，采用酶切-连接的方式构建到pACYC-mvaE-mvaS-ispA-Sab1载体上，获得质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS；
2)质粒pTrcLower-ΔIDI构建：敲除pTrcLower载体中来自酵母的异戊烯基二磷酸异构酶ScIDI基因，得到含有ERG12、ERG8和ERG19基因的质粒pTrcLower-ΔIDI；
3)质粒pTrcLower-AaIDI构建：将来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后，采用酶切-连接的方式构建到pTrcLower载体上，获得质粒pTrc-ERG12-ERG8-ERG19-AaIDI即pTrcLower-AaIDI；
4)质粒pET28a-AaFS-ispA-IDI构建：
分别扩增pET28a载体序列、AaFS基因、ispA基因、来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因序列和来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因，通过Gibson Assembly方法分别构建获得质粒pET28a-AaFS-ispA-AaIDI和质粒pET28a-AaFS-ispA-SlIDI；
5)质粒转化：
将质粒pACYC-mvaE-mvaS、步骤2)制备得到的pTrcLower-ΔIDI和步骤4)制备得到的pET28a-AaFS-ispA-AaIDI共同转化到大肠杆菌感受态细胞，得到含青蒿来源AaIDI基因的单拷贝基因工程菌；
将质粒pACYC-mvaE-mvaS、步骤2)制备得到的pTrcLower-ΔIDI和步骤4)制备得到的pET28a-AaFS-ispA-SlIDI共同转化到大肠杆菌感受态细胞，得到含番茄来源SlIDI基因的单拷贝基因工程菌；
将步骤1)制备的质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS、步骤3)制备的质粒pTrcLower-AaIDI和步骤4)制备的质粒pET28a-AaFS-ispA-AaIDI共同转化到大肠杆菌感受态细胞，得到含青蒿来源AaIDI基因的双拷贝基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的高产法尼烯的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤1)所述来自青蒿的β-法尼烯合成酶AaFS基因优化后，基因两端分别添加限制性内切酶BglII、XhoI酶切位点，经合成后克隆到pUC57-simple载体上，得到的质粒pUC57-AaFS经限制性内切酶BglII、XhoI双酶切，回收AaFS基因酶切产物；将pACYC-mvaE-mvaS-ispA-SabS1经限制性内切酶BglII、XhoI双酶切，回收8260bp片段；上述两酶切回收片段经T4 DNA连接酶连接，获得质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS。
6.根据权利要求4所述的高产法尼烯的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤3)所述来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因优化后，经合成克隆到pUC57-simple载体上，得到质粒pUC57-AaIDI，分别扩增AaIDI片段和载体pTrc-ERG12-ERG8-ERG19片段，扩增引物上下游分别添加SacI、PstI酶切位点，扩增产物分别进行限制性内切酶SacI、PstI双酶切，回收AaIDI片段和载体片段，两者经T4 DNA连接酶连接，获得质粒pTrc-ERG12-ERG8-ERG19-AaIDI即pTrcLower-AaIDI。
7.根据权利要求4所述的高产法尼烯的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤4)所述pET28a载体序列扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:5所示，下游引物序列如SEQ IDNo:6所示；AaFS基因扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:7所示，下游引物序列如SEQ IDNo:8所示；ispA基因扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:9所示，下游引物序列如SEQIDNo:10所示；来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因扩增用的上游引物序列如SEQID No:11所示，下游引物序列如SEQ ID No:12所示；来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因扩增用的上游引物序列如SEQ ID No:13所示，下游引物序列如SEQ ID No:14所示。
8.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌在合成法尼烯中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述的基因工程菌经一级种子培养基培养后，获得的种子液接种到摇瓶发酵培养基中进行发酵得到法尼烯。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述一级种子培养基为LB培养基，其成分为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，其余为水；所述摇瓶发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖、9.8g/L K2HPO4、5g/L牛肉提取物、0.3g/L柠檬酸铁氨、2.1g/L一水合柠檬酸、0.06g/L MgSO4、1mL/L微量元素溶液，其余为水；所述微量元素溶液含有(NH4)6Mo7O24·4H2O0.37g/L、ZnSO4·7H2O 0.29g/L、H3BO3 2.47g/L、CuSO4·5H2O 0.25g/L和MnCl2·4H2O1.58g/L。
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