CN117126741A - 一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用 - Google Patents

一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117126741A
CN117126741A CN202210548831.7A CN202210548831A CN117126741A CN 117126741 A CN117126741 A CN 117126741A CN 202210548831 A CN202210548831 A CN 202210548831A CN 117126741 A CN117126741 A CN 117126741A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutant strain
culture medium
algae
chlorophyll
mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210548831.7A
Other languages
English (en)
Inventor
魏东
陈霄
王百龙
史相儒
魏子轩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zaoeng Rare Biotechnology Research And Development Guangzhou Co ltd
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
Zaoeng Rare Biotechnology Research And Development Guangzhou Co ltd
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zaoeng Rare Biotechnology Research And Development Guangzhou Co ltd, South China University of Technology SCUT filed Critical Zaoeng Rare Biotechnology Research And Development Guangzhou Co ltd
Priority to CN202210548831.7A priority Critical patent/CN117126741A/zh
Publication of CN117126741A publication Critical patent/CN117126741A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用。该突变株包括凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)SCUT‑ACB 4和SCUT‑ACB 4‑65，保藏编号为CCTCC NO：M 2022518和CCTCC NO：M 2022519，已于2022年04月28日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。本发明中的突变株与野生型藻株相比，从根本上切断了非光依赖型的叶绿素合成，叶绿素a含量降低了98％以上，叶绿素b降低了100％，藻体呈金黄色，可以用于生产蛋白，为替代蛋白的精密发酵生产提供了产能高、品质好的优质发酵藻种。

Description

一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用
技术领域
本发明属于微生物工程领域，特别涉及一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用。
背景技术
随着社会发展和人们消费水平的提升，人们对动物蛋白的需求逐渐增大。传统的动物蛋白一般来自于畜牧业，然而畜牧业的发展会导致水土和粮食资源的短缺以及环境的日益恶化，特别是甲烷和CO2的排放量占食物生产系统温室气体排放的26％，引起的温室效应越来越严重。大量摄入动物肉易导致肥胖、心血管疾病等人体健康危险。因此非动物来源的替代蛋白市场近两年形成井喷式增长，开发营养优质、高性价比、生产可持续的替代蛋白新品类成为人们对于粮食安全、营养健康、环境友好的关注焦点。
单细胞绿藻(如小球藻、栅藻、绿球藻等)具有极高的营养价值，蛋白含量高达50％～ 65％，富含18种氨基酸、多不饱和脂肪酸、多糖、维生素、矿物质等复合营养成分，尤其可在工业发酵系统中易于实现高密度发酵，生产周期短，生产效能高，因此被视作替代蛋白精密发酵生产的优质微生物种质。
然而，野生型单细胞绿藻在实际应用中受到叶绿素含量高、藻腥味严重等因素的制约，严重影响其食品感官感受，抑制了市场消费欲望，极大限制了其在食品领域中的广泛应用。因此，食品级绿藻藻粉的叶绿素脱除加工这一步骤必不可少。传统的叶绿素脱除方法通常采用溶剂提取法，不仅工艺复杂、成本高，还会造成环境污染以及其他营养成分的损失。因此，单细胞绿藻中叶绿素和腥味的存在成为其作为替代蛋白和食品配料市场的最大限制，目前尚未找到高效脱色脱腥、低能耗、环境友好的解决方案。
单细胞绿藻叶绿素去除的研究主要有两个方向，一是对叶绿素溶剂提取方法进行优化和探索，如超临界CO2法、吸附树脂法和有机溶剂浸提法等。目前各类参数已逐步优化，但都很难100％脱除，达不到产品应用的要求；二是采用基因操作、诱变等手段对单细胞绿藻进行遗传改造，抑制或阻断细胞内叶绿素的生物合成途径，在遗传物质水平上突破藻株性状表达上的瓶颈，从根源上解决叶绿素合成和腥味物质的产生，使发酵生产的绿藻藻粉不再具有绿色，腥味也极大减轻，更有利于在食品工业的广泛应用。
由清华大学与北京思清源生物科技有限公司联合自主研发的新型常压室温等离子体(ARTP)生物诱变育种技术，有射流温度低、活性粒子分布均匀，操作简易，对人体和环境无危害等优势，为利用系统生物学和合成生物学手段构建目的菌株提供创新平台方法，是降低或消除单细胞绿藻中叶绿素合成与腥味物质形成的新途径。但目前未见有关于使用ARTP 诱变筛选叶绿素合成缺陷型微藻突变株的报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株。
本发明的另一目的在于提供所述单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株，为突变株P.ks SCUT-ACB 4(以下简称为P.ks 4)和突变株P.ks SCUT-ACB 4-65(以下简称为P.ks 4-65)中的至少一株；其中，
所述的突变株P.ks SCUT-ACB 4，名称为凯氏拟小球藻(Parachlorellakessleri)SCUT-ACB 4，保藏编号为CCTCC NO：M 2022518，已于2022年04月28日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
所述的突变株P.ks SCUT-ACB 4-65，名称为凯氏拟小球藻(Parachlorellakessleri) SCUT-ACB 4-65，保藏编号为CCTCC NO：M 2022519，已于2022年04月28日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
本发明提供的凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)，曾用名为凯氏小球藻(Chlorella kessleri)，具有典型的绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、小球藻科、小球藻属的特征性结构。在无菌Basal、BG-11、BBM等培养液中、适宜条件下培养时，其营养细胞大小约5～10μm，球形，绿色，以孢子繁殖的方式进行无性繁殖，每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子。可营自养、异养、兼养生长，其中自养生长最慢，异养次之，兼养最快。
所述的单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株中，突变株P.ks 4的18S rRNA基因如SEQ ID NO.1所示，突变株P.ks 4-65的18S rRNA基因如SEQ ID NO.2所示。
一种培养所述单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株的方法，具体步骤为：将所述的单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株接种到培养基中，于28～30℃条件下进行培养。
所述的培养基为Basal培养基、BG-11培养基和BBM培养基中的至少一种；优选为含有碳氮源的Basal培养基；进一步优选为含2.5～5g/L硝酸钠和10～30g/L葡萄糖的Basal培养基；再进一步优选为含5g/L硝酸钠和30g/L葡萄糖的Basal培养基。
所述的培养基的配方如下：NaNO3 2.5～5g/L，葡萄糖10～30g/L，H3BO3114.2 mg/L， MoO3 7.1mg/L，KH2PO4 1250mg/L，CaCl2·2H2O 111mg/L，MnCl2·4H2O 14.2mg/L，MgSO4·7H2O 1000mg/L，FeSO4·7H2O 49.8mg/L，CuSO4·5H2O 15.7mg/L，EDTA 500mg/L， ZnSO4·7H2O 88.2mg/L，CoNO3·6H2O 6.1mg/L。
所述的培养优选为在摇床中进行培养，其转速为125～150rpm。
所述的培养为在光照(兼养)或黑暗(异养)条件下进行培养；优选为在黑暗条件下进行培养。
所述的光照强度优选为10μmol/m2/s。
本发明提供的单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株P.ks 4和P.ks 4-65在异养条件下，突变株藻体呈金黄色，无绿色表型；仅含有一种类胡萝卜素—叶黄素，叶绿素a相较于野生型分别下降了99.54％及98.16％，均不含叶绿素b，异养发酵藻粉中蛋白含量分别达到39.25％及46.62％，其中P.ks 4-65蛋白产率相较于野生型提高了25.05％，大幅度提高了藻株的生产效能。
所述的单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株在生产蛋白方面的应用。
所述的单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株在生产蛋白方面的应用，为将活化后的单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株接种到含有碳氮源的培养基中，于28～30℃、黑暗条件下进行培养，离心收集藻液，洗涤、冷冻干燥，得到富含蛋白的藻粉。
所述的含有碳氮源的培养基为含有碳氮源的Basal培养基、BG-11培养基和BBM培养基中的至少一种；优选为含有碳氮源的Basal培养基；进一步优选为含2.5～5g/L硝酸钠和10～ 30g/L葡萄糖的Basal培养基；再进一步优选为含5g/L硝酸钠和30g/L葡萄糖的Basal培养基。
所述的含有碳氮源的培养基的配方如下：NaNO3 2.5～5g/L，葡萄糖10～30g/L，H3BO3114.2 mg/L，MoO3 7.1mg/L，KH2PO4 1250mg/L，CaCl2·2H2O 111mg/L，MnCl2·4H2O14.2 mg/L，MgSO4·7H2O 1000mg/L，FeSO4·7H2O 49.8mg/L，CuSO4·5H2O 15.7mg/L，EDTA500 mg/L，ZnSO4·7H2O 88.2mg/L，CoNO3·6H2O 6.1mg/L。
所述的培养优选为在三角瓶中进行培养，其摇床转速为125～150rpm。
所述的接种密度为1×106～1×107cells/mL；优选为2×106～1×107cells/mL。
所述的蛋白为替代蛋白，在黑暗条件下异养培养突变株P.ks 4和P.ks 4-65，藻体呈金黄色，叶绿素a含量比野生型分别降低了99.54％及98.16％，无叶绿素b，实际应用中可免除传统脱色工艺，且突变株P.ks 4和P.ks 4-65异养发酵藻粉中蛋白含量分别达到39.25％及 46.62％，包含8种人体必需氨基酸且氨基酸评分远高于野生型。其中，突变株P.ks 4-65的蛋白产率相较于野生型提高了25.05％，大幅度提高了藻株的生产效能。因此，以本发明中的突变株P.ks 4或P.ks 4-65为发酵藻株无需脱色、脱腥处理，进行替代蛋白的精密发酵生产有明显的质量和成本优势。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过ARTP诱变的方法选育获得凯氏拟小球藻突变株，先通过致死率曲线确定常压室温等离子体的最佳诱变条件，在此基础上进行多轮诱变，得到叶绿素合成缺陷型突变藻株并进行系统评价，即综合评价发酵生产性能和蛋白与类胡萝卜素品质特征，最终获得了优质的黄色突变株，即叶绿素合成缺陷的凯氏拟小球藻突变株P.ks 4和P.ks4-65。与野生型藻株相比，从根本上切断了非光依赖型的叶绿素合成，叶绿素a含量降低了98％以上，叶绿素b降低了100％，藻体呈金黄色，从源头上突破了技术瓶颈，减少了工业生产过程中低效、高成本、高污染的脱色去腥步骤，大大简化工艺流程，降低生产成本。
(2)本发明揭示不同营养方式及碳氮源浓度对野生型和突变株生长及蛋白积累的影响，确定了异养突变株P.ks 4能实现更优色素组成的营养方式，5g/L初始硝酸钠浓度、30g/L初始葡萄糖浓度为突变株P.ks 4高效积累蛋白的最优碳氮源浓度，大幅度提高蛋白含量和产量；相较于2.5g/L初始硝酸钠浓度、10g/L初始葡萄糖浓度，P.ks 4的蛋白含量和产量分别提高了96.34％及99.56％，实现高产蛋白的发酵调控，可以运用于大规模精密发酵生产替代蛋白的技术领域。
(3)本发明以突变株P.ks 4为出发藻株进行二次诱变得到单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株P.ks 4-65，在上述最优培养条件下，P.ks 4-65生物量净产率相较于野生型和突变株P.ks 4分别提高了3.63％及4.18％，蛋白含量和蛋白产率相较于野生型分别提高了20.46％和 25.05％，相较于突变株P.ks 4分别提高了18.77％及24.10％，大幅度提高生产效率。且相较于野生型，突变株P.ks 4-65的氨基酸组成更佳、含量更丰富，从根本上解决了野生型凯氏拟小球藻因合成大量叶绿素而影响色彩和气味感官以及存在限制性氨基酸而影响营养价值的应用瓶颈，为替代蛋白的精密发酵生产提供了产能高、品质好的优质发酵藻种，减少了实际生产中脱色去腥步骤，为推动替代蛋白在食品领域的应用以及市场的发展奠定了基础。
附图说明
图1是实施例1中不同营养模式下凯式拟小球藻野生型(P.ks)的ARTP诱变致死率曲线图；其中，(a)为兼养；(b)为异养。
图2是实施例1中叶绿素合成缺陷型突变株(P.ks 1～4)藻落及藻苔照片图；其中，a～ d分别为突变株在兼养筛选平板上；e～h分别为突变株在兼养纯化平板上；i～l分别为突变株在异养纯化平板上。
图3是实施例2中野生型和突变株的藻液照片图；其中，a～e为异养藻液；f～j为兼养藻液。
图4是实施例2中野生型和突变株兼养培养的生物量浓度曲线图。
图5是实施例2中野生型和突变株异养培养的生物量浓度曲线图。
图6是实施例2中野生型和突变株异养和兼养下蛋白质含量、产量和产率统计图。
图7是实施例2中野生型和突变株异养和兼养下叶黄素含量、叶绿素a和b相对含量图。
图8是实施例3中不同补糖模式和不同氮源浓度下的野生型和突变株异养培养的生物量净产率统计图。
图9是实施例3中不同补糖模式下的野生型和突变株异养培养的叶黄素含量、叶绿素a 和b相对含量图(图中，初始氮源浓度为2.5g/L NaNO3)。
图10是实施例3中不同补糖模式下的野生型和突变株异养培养的叶黄素含量、叶绿素a 和b相对含量图(图中，初始氮源浓度为3.75g/L NaNO3)。
图11是实施例3中不同补糖模式下的野生型和突变株异养培养的叶黄素含量、叶绿素a 和b相对含量图(图中，初始氮源浓度为5g/L NaNO3)。
图12是实施例3中不同补糖模式和不同氮源浓度下的野生型和突变株异养培养的蛋白质产率统计图。
图13是实施例4中不同异养细胞时期的P.ks 4突变株ARTP二次诱变的致死率曲线图。
图14是二次诱变获得的P.ks 4-65突变株在异养纯化平板上的藻落及藻苔照片图。
图15是实施例4中野生型P.ks、突变株P.ks 4和P.ks 4-65的比生长速率和生物量净产率统计图。
图16是实施例4中野生型P.ks、突变株P.ks 4和P.ks 4-65的叶黄素含量、叶绿素a和b相对含量，以及蛋白质含量、产量和产率统计图；其中，(A)为叶黄素含量、以及叶绿素a和b相对含量；(B)为蛋白质含量、产量和产率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明的过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂、仪器及设备未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
本发明实施例中采取的检测方法可参照如下说明：
(一)细胞密度测定
采用流式细胞仪进行细胞密度测定。吸取2mL细胞培养液，离心去除上清液，用超纯水洗涤、重悬至上机浓度(约1～5×106cells/mL)，经300目尼龙筛绢过滤后上机进行细胞密度绝对计数(3次重复)。
(二)生物量浓度测定
采用烘干差重法测定生物量浓度。测量已烘至恒重的离心管重量，记为空管重量W1。吸取2mL藻液于该离心管中，8000r/min下离心3min，弃上清，蒸馏水洗涤、离心两次后将藻泥置于烘箱中80℃烘干至恒重，测定并记录总重量W2。每个样品设置3个平行，取平均值并计算标准差，按如下公式计算生物量浓度及生物量净产率：
式中：W1为空管重，单位为g；
W2为烘干后离心管和微藻生物质的总重量，单位为g；
V为样品体积，单位为L；
t为培养时间，单位为d；
生物量净产量为培养结束第t天的生物量浓度减去第0天的生物量浓度。
(三)蛋白含量测定——凯氏定氮法
(1)将新鲜藻液在4℃、8000r/min离心5min收集藻细胞，蒸馏水洗涤、离心两次后冷冻干燥获得冻干藻粉。称冻干藻粉100mg于凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂(0.4g无水硫酸铜、6g硫酸钠，研磨混匀)以及12mL 18.4mol/L浓硫酸，置于电炉两段式加热消解样品：150℃，40min和420℃，150min；直至样品呈透明蓝绿色，冷却至室温，同时准备空白样。
(2)将上述样品置于凯氏定氮仪，设置加碱量75mL(40％(w/v)NaOH溶液)，硼酸吸收液20mL(10％(w/v)硼酸溶液)，稀释水量10mL，蒸馏时间5min。
(3)反应结束后，于接收瓶中加入三滴混合指示剂(将甲基红乙醇溶液和溴甲酚绿乙醇溶液等体积混合。其中，甲基红乙醇溶液配制方法为：称取0.1g甲基红，用乙醇溶解并稀释至100mL；溴甲酚绿乙醇溶液配制方法为：称取0.5g溴甲酚绿，用乙醇溶解并稀释至100mL)，用0.1mol/L盐酸标准液进行滴定，当溶液由蓝绿色变为灰红到达滴定终点，记下滴定体积。
试样中粗蛋白含量以质量分数计，数值以质量分数(％)表示，按以下公式计算：
式中：
V2——滴定试样所消耗盐酸标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)；
V1——滴定空白所消耗盐酸标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)；
c——盐酸标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
m——试样质量，单位为克(g)；
14——氮的摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol)；
6.25——氮换算成粗蛋白的平均系数。
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为测定结果。
(四)氨基酸分析——氨基酸自动分析仪法
氨基酸分析采用氨基酸分析仪进行测定。具体步骤如下：
(1)常规酸解法提取17种氨基酸(Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Val、Met、 Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg、Pro)
准确称取50～100mg冻干藻粉于水解管中，准备三组平行，准确加入10mL 6mol/L的盐酸水解溶液，旋紧管盖。将水解管放在110℃±2℃恒温干燥箱中，水解22～24h。冷却，混匀，开管，过滤。用移液管精确吸取适量滤液，置于培养皿中烘干。加入3～5mL柠檬酸钠缓冲溶液(pH＝2.2)复溶，使试样中氨基酸浓度达到50～250nmol/mL，摇匀过滤或离心后，上清液于L-8900高速氨基酸分析仪测定，进样量为20μL，570nm和440nm双波长同时进行吸光值的测定并积分。
(2)碱解法提取色氨酸(Trp)
准确称取50～100mg冻干藻粉于聚四氟乙烯水解管中，准备三组平行，加入1.5mL4 mol/L氢氧化锂溶液，充氮1min，旋紧密封盖后放入110℃±2℃恒温干燥箱中，水解20h。取出水解管冷却至室温，用乙酸钠缓冲液(pH＝4.5)将水解液定量转移至25mL容量瓶中，并用上述缓冲液定容，离心或过滤后，上清液于L-8900高速氨基酸分析仪测定，570nm和440nm双波长同时进行吸光值的测定并积分。
试样中氨基酸含量以质量分数ω(％)计，按如下公式计算：
式中：
n——试样水解溶液的稀释倍数；
Ai——试样中对应氨基酸的峰面积；
V——试样中水解溶液体积，单位mL；
c——标准工作液中对应氨基酸的浓度，单位nmol/mL；
M——氨基酸摩尔质量，单位g/mol；
Vi——试样进样体积，单位μL；
Ast——氨基酸标准溶液的峰面积；
m——试样质量，单位mg；
Vst——氨基酸标准溶液进样体积，单位μL。
(五)天然色素——高效液相色谱法
天然色素测定采用高效液相色谱法。具体步骤如下：
(1)标准曲线的绘制：准确称取10mg叶黄素标准品溶于10mL定容剂中(甲醇：叔丁基甲醚(MTBE)＝1:1，v/v；含0.1％(w/v)2,6-二叔丁基对甲酚(BHT))，配制为标准溶液。再用定容剂将其稀释为不同浓度梯度，用0.22μm有机过滤膜过滤至液相小瓶中上机测试。HPLC系统采用Waters双1525泵，Waters 2996二极管阵列(PDA)检测器，YMC carotenoidcolumn C30柱(4.6×150mm，3μm)。流动相由甲醇A和叔丁基甲醚B组成。洗脱条件为0～2min，90％→80％A，10％→20％B；2～6min，80％→60％A，20％→40％B；6～15 min，60％→50％A，40％→50％B；15～16min，50％→90％A，50％→10％B。流速为0.8mL/min，进样量为20μL，检测波长为445nm，柱温为25℃。绘制叶黄素浓度(mg/L，y)对峰面积 (x)的标准曲线。
(2)测定叶黄素含量
准确称取冻干藻粉样品10mg，置于冻存管中，加入适量研磨珠，加入1mL提取剂(甲醇：丙酮＝1:1，v/v；含0.1％(w/v)BHT)。放入液氮中速冻，再在研磨器中快速震荡(70kHz，60s)，重复四次。离心收集上清至15mL离心管，多次反复至藻粉完全变白。氮气吹干15mL 离心管内有机溶剂，加入定容剂(甲醇：叔丁基甲醚MTBE＝1:1，v/v；含0.1％(w/v)BHT)，准确定容至1mL，用0.22μm有机过滤膜过滤至液相小瓶中上机测试(方法同步骤(1))。利用标准曲线计算液体中叶黄素浓度。再换算为藻粉中叶黄素含量。
(3)计算突变株叶绿素a和叶绿素b的相对含量
叶绿素a和叶绿素b的提取及洗脱梯度同叶黄素。设置HPLC上PDA检测波长为663nm及645nm，计算663nm下突变株藻粉中叶绿素a对应的峰面积与野生型藻粉中叶绿素a对应的峰面积的比值，并将野生型藻粉中叶绿素a对应的峰面积记为100％，得到突变株中叶绿素a的相对含量。同理，计算645nm下突变株藻粉中叶绿素b对应的峰面积与野生型藻粉中叶绿素b对应的峰面积的比值，将野生型藻粉中叶绿素b对应的峰面积记为100％，得到突变株叶绿素b的相对含量。
实施例1ARTP诱变选育叶绿素合成缺陷型突变株
本实施例以凯氏拟小球藻为例，详细说明此方法。凯氏拟小球藻(Parachlorellakessleri) 购于Carolina Biological Supply Company(USA)，采用Basal培养基进行斜面转接保藏，保藏温度为4℃。其中，Basal培养基配方如表1所示。所采用的ARTP(常压室温等离子体) 诱变育种仪来自无锡源清天木生物科技有限公司。
表1.Basal培养基配方
组分 含量(mg/L) 组分 含量(mg/L) 组分 含量(mg/L)
NaNO3 1250 H3BO3 114.2 MoO3 7.1
KH2PO4 1250 CaCl2·2H2O 111 MnCl2·4H2O 14.2
MgSO4·7H2O 1000 FeSO4·7H2O 49.8 CuSO4·5H2O 15.7
EDTA 500 ZnSO4·7H2O 88.2 CoNO3·6H2O 6.1
注：若配制固体Basal培养基，需再加入2％(w/v)琼脂；EDTA为乙二胺四乙酸。
1.1小球藻培养
50mL三角瓶中装有10mL Basal培养基(含10g/L葡萄糖和1.25g/L硝酸钠，pH调为6.14±0.05)，经121℃高压灭菌15min后冷却至室温，用接种环从固体斜面或平板培养基上挑取凯式拟小球藻的单藻落接种，置于培养温度为30℃，转速为150r/min的恒温振荡摇床中培养，设置两组，兼养组(置于光照为10μmol/m2/s)以及异养(黑暗)组培养。
1.2诱变前处理
分别取对数早、中、末期的兼养和异养培养凯式拟小球藻种子液，用无菌水稀释至106～ 107cells/mL，在超净工作台上取500μL稀释液与500μL 10％(v/v)的甘油溶液混合，使甘油的最终浓度为5％(v/v)，以作为诱变保护剂。取10μL上述混合藻液均匀涂在已灭菌的专用金属载片上。
1.3诱变操作具体步骤：
设置ARTP诱变育种仪的工作条件为：射频功率120W，纯度为99.99％的氦气流量为10 L/min，处理距离(等离子体发射源与金属载片之间的距离)2mm，操作温度为室温。处理时间设置为0、15、20、25、30、40、50s。处理结束后，连同金属载片立即置于装有1mL Basal培养基的离心管中，震荡洗脱1min。黑暗培养3h以防止光修复。将洗脱液梯度稀释到适当浓度，分别取100μL进行涂布Basal培养基平板，置于30℃光照培养箱培养10d(其他培养条件同1.1)，每组三个平行样。以未诱变处理的藻液做空白对照，计算各组菌落数并与对照组比较，计算致死率(致死率(％)＝(1-处理组菌落数/对照组菌落数)×100％)。选取致死率在95％以上的时间作为最优诱变时间。并根据结果进一步细化处理时间，设置为0、15、 17、19、21、23s，重复以上步骤。
ARTP对兼养和异养凯式拟小球藻的致死率曲线如图1所示：异养凯式拟小球藻对ARTP 的敏感度更高，且对数早期和末期的敏感度高于对数中期。最终确定：兼养凯式拟小球藻的最佳诱变时间为对数早期：15s；对数中期：19s；对数末期：15s，致死率分别为98.91％、 97.17％、96.36％。异养凯式拟小球藻的最佳诱变时间为对数早期：15s；对数中期：19s；对数末期：17s，致死率分别为99.57％、98.73％、99.77％。在以上确定的最佳诱变时间下对相应的藻液进行诱变，有利于提高正向突变率。
1.4突变株筛选
对经诱变后长出的单藻落以可视化藻落颜色为指标进行初筛，与野生型藻落相比，选择肉眼可见的绿色变浅的藻落，如浅绿、淡绿或黄色藻落，经系统评价其生长速率、蛋白含量和生物量产率等指标，确定生长优势明显、蛋白含量高的突变藻株，最终构建叶绿素合成缺陷型凯式拟小球藻突变库。经过初筛，以墨绿色野生型凯式拟小球藻P.ks为出发藻株，在最佳条件下诱变得到了四株颜色突变株P.ks 1～4，在兼养条件下均呈现浅绿色藻落，而在异养条件下P.ks 1为浅绿色，P.ks 2～4均为黄色。筛选平板、兼养纯化平板、异养纯化平板藻落及藻苔照片见图2。
1.5传代培养
将上述突变株P.ks 1～4采用平板划线进行八次传代培养，以可视化藻落颜色验证其遗传稳定性，得到该类突变株具有很好的遗传稳定性。
实施例2不同营养模式下叶绿素合成缺陷型突变株生产性能和品质特征评价
2.1藻种的活化
将凯式拟小球藻野生型(P.ks)及突变株P.ks 1～4的单藻落从固体培养基中挑出并接种于121℃灭菌15min的含10g/L葡萄糖的Basal培养基(pH值为6.14±0.05)中，分别进行异养(黑暗)和兼养(光照强度为10μmol/m2/s)培养，在温度为30℃、转速为150rpm的恒温摇床中培养种子液至对数生长期。
2.2不同营养模式下培养
配制初始硝酸钠浓度为3.75g/L、初始葡萄糖浓度为30g/L的Basal培养基，pH值为6.14，于121℃灭菌15min。然后取一定体积的上述2.1中获得的对数生长期种子液于无菌离心管中， 4000r/min下离心3min，弃上清，使用灭菌Basal培养基重悬细胞沉淀并接种至配制的新培养基中，接种密度为2×106cells/mL，分别进行异养和兼养培养，培养周期为4天直至碳源或氮源耗尽。
2.3分析检测
每24h取样2mL测细胞密度及生物量浓度。培养结束后收集藻液，离心、洗涤、冻干获得藻粉并置于-20℃冰箱中储存，用于分析色素组成和蛋白含量，计算蛋白产量和产率。
采用Origin 9.0和SPSS软件对数据进行处理，统计学分析采用单因素方差分析法和成对数据t-检验进行显著性检验，不同字母表示组间显著性差异(P<0.05)。
2.4生产性能及品质特征分析结果
采用同一碳氮源浓度，异养和兼养下野生型及突变株的生物量浓度见图4和图5。如图所示，在兼养条件下，野生型和突变株比生长速率相近且无显著性差异，但都显著高于异养下比生长速率(P<0.05)。其中，兼养下突变株P.ks 3生物量浓度和净产率最大，分别为17.0 g/L和3.75g/L/d，相较于野生型分别提高了13.33％和16.80％；异养下突变株P.ks 3获得最大生物量浓度和净产率为14.42g/L和3.24g/L/d，相较于野生型分别提高了41.03％和41.36％。
采用同一碳氮源浓度，异养和兼养下野生型及突变株的蛋白含量、产量和产率见图6。如图所示，异养下所有藻株的蛋白含量均略高于兼养，但由于兼养生物量净产率较高，故兼养下除P.ks 3外所有藻株的蛋白产量和产率均高于异养，其中P.ks 1的蛋白产量和产率最高，分别达到4.26g/L和1.07g/L/d，相较于野生型提高了8.85％。
采用同一碳氮源浓度，异养和兼养下野生型及突变株的叶黄素含量、叶绿素a和b相对含量见图7。如图所示，光照对于叶黄素及叶绿素的合成有非常大的影响，其中叶黄素含量在兼养条件下显著高于异养条件，叶绿素a和b的相对含量则呈现的更明显，在异养条件下突变株的叶绿素合成很大程度上被抑制，其中突变株P.ks 4叶绿素含量最低，叶绿素a仅为野生型的0.46％，无叶绿素b。而在兼养条件下，突变株叶绿素合成与野生型相近，其中突变株P.ks 2～3的叶绿素a含量高于野生型，为野生型的118.9％和103.6％。因此，在异养条件下突变株P.ks 1藻液呈现浅绿色，突变株P.ks 2～4藻液呈现黄色，但在兼养条件下都为较深的墨绿色，如图3所示。因此，在兼养条件下虽然细胞生长较快，蛋白产率较高，但色素组成不符合选育目标，故后续培养都选择异养模式。
实施例3不同碳氮源浓度下叶绿素合成缺陷型突变株生产性能和品质特征评价
3.1藻种的活化
将凯式拟小球藻野生型及突变株P.ks 1～4的单藻落从固体培养基中挑出并接种于121℃灭菌15min的含10g/L葡萄糖的Basal培养基(pH值为6.14±0.05)中，在温度为30℃、转速为150rpm的恒温摇床中、在黑暗条件下异养培养至对数生长期。
3.2不同碳氮源浓度下异养培养
配制初始硝酸钠浓度分别为2.5、3.75、5g/L，初始葡萄糖浓度分别为30g/L(一次性加入葡萄糖)和10g/L(分批补糖：每天监测葡萄糖浓度，当耗尽时将培养基中葡萄糖浓度补加至10g/L，共补加两次)的Basal培养基，pH值为6.14，于121℃灭菌15min。取一定体积的上述3.1中获得的对数生长期种子液于无菌离心管中，4000r/min离心3min，弃上清，使用灭菌的不同碳氮源浓度的Basal培养基重悬细胞并接种至配制的培养基中，接种密度为 2×106cells/mL。野生型及突变株P.ks 1～4各设置初始硝酸钠浓度为2.5、3.75、5g/L，初始葡萄糖浓度为30g/L及10g/L，每个藻株设置六组实验(共30组)，每组两个生物学平行。在温度为30℃、转速为150rpm的恒温摇床中进行异养，培养4天直至碳源或氮源耗尽。
3.3分析检测
每24h取样2mL测细胞密度，藻液离心、洗涤后测生物量浓度。培养结束后藻液离心、洗涤冻干获得藻粉并置于-20℃冰箱中储存，以分析检测色素组成、蛋白含量及氨基酸组成，计算蛋白产量和产率及氨基酸评分AAS(AAS＝被测食物蛋白质每克氮或蛋白质氨基酸含量 (mg)/参考蛋白质的每克氮或蛋白质氨基酸含量(mg)×100。参考蛋白质可采用WHO人体必需氨基酸模式。
3.2.3生产性能及品质特征分析结果
不同培养基初始碳氮源浓度下野生型P.ks及突变株P.ks 1～4的生物量净产率见图8。如图所示，当初始氮源浓度保持一致时，采用一次性加入葡萄糖，野生型和突变株的生物量净产率均显著高于采用分批补糖模式(P<0.05)。采用补糖模式时，生物量净产率的总体规律是随着初始氮源浓度的上升呈下降趋势，说明较高的氮源浓度会抑制细胞生长。
不同初始氮源浓度下叶黄素含量及叶绿素a和b相对含量见图9～11。如图所示，同一初始硝酸钠浓度下，一次性加入葡萄糖相较于分批补糖更有利于叶黄素、叶绿素a和叶绿素 b的合成。同一初始葡萄糖浓度下，较高的初始氮源浓度会促进叶绿素的合成，对叶黄素的影响呈现先上升后下降的趋势。在不同碳氮源浓度下，突变株P.ks 4叶绿素a和叶绿素b相较于野生型分别降低了98.78％～99.54％和100％，为P.ks 1～4中叶绿素含量最低的突变株，同时其叶黄素在初始葡萄糖浓度为30g/L、初始硝酸钠浓度为5g/L时达到0.62mg/g，相较于2.5g/L硝酸钠的培养条件提高了115.9％，且优于其它突变株。故突变株P.ks 4的色素组成最符合预期。
不同培养基初始碳氮源浓度下的蛋白质含量、产量和产率见图12。如图所示，当初始氮源浓度一致时，采用一次性加入葡萄糖时，野生型和突变型的蛋白质产率要显著高于采用分批补糖模式(p<0.05)。随着氮源浓度的上升，蛋白含量和产率显著增高。其中突变株P.ks 4 表现最优，当初始硝酸钠浓度为5g/L时，蛋白含量高达39.25％，相较于初始硝酸钠浓度为 2.5g/L提高了96.34％；蛋白质产率高达1.15g/L/d，相较于2.5g/L硝酸钠时提高了86.75％，并为所有藻株在所有培养条件下的最高水平。
对初始葡萄糖浓度30g/L、初始硝酸钠浓度5g/L下培养的藻粉进行氨基酸组成分析，结果见表2。如表2所示，全部藻株都含有十八种氨基酸，包括人体必需的八种氨基酸，且谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和脯氨酸含量较高，组氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸含量较低。其中P.ks 4氨基酸总量最高，达到340.55mg/g，相较于野生型提高了6.33％。其中8种必需氨基酸(Lys、His、Trp、Phe、Met、Ile、Leu、Val、Thr)含量为135.69mg/g，相较于野生型提高了14.86％。支链氨基酸(Val、Ile、Leu)总量为63.96mg/g，相较于野生型提高了17.76％。
表2. 5g/L NaNO3和一次性加入葡萄糖下藻粉的氨基酸组成
对以上所含的人体必需氨基酸与FAO/WHO建议模式进行对比，得到氨基酸评分表如表 3所示。其中P.ks、突变株P.ks 1的氨基酸组成较不均衡，有蛋氨酸+胱氨酸、异亮氨酸两类限制性氨基酸，氨基酸评分仅有49.05和51.94，不利于人体的消化吸收。突变株P.ks2、P.ks 3的氨基酸组成与FAO/WHO建议模式相近，第一限制性氨基酸为含硫氨基酸，评分达到94.51 和78.74。突变株P.ks 4氨基酸组成最优，各项都优于FAO/WHO建议模式，没有限制性氨基酸，评分高达101.34，相较于野生型藻株有了极大幅度的改善，达到优质蛋白质的标准。
表3. 5g/L NaNO3和一次性加入葡萄糖下藻粉的氨基酸评分表
综上，突变株P.ks 4的色素组成及蛋白产率及氨基酸组成皆为最优，故为最符合预期的叶绿素合成缺陷型突变藻株。同时初始葡萄糖浓度为30g/L、初始硝酸钠浓度为5g/L为实现蛋白高效积累最优条件。
将突变株P.ks 4的18S rRNA基因进行测序分析(广东省微生物分析检测中心)，序列如SEQ ID NO.1所示。根据序列比对，突变株P.ks 4与已公布的凯式拟小球藻藻株的18SrRNA 同源性达99.88％。
根据突变株P.ks 4的菌落形态特征和分子鉴定结果，将突变株P.ks 4命名为凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)SCUT-ACB 4，已于2022年04月28日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2022518。
实施例4：突变株P.ks 4二次诱变及各项性能的系统评价
本实施例以上述最优突变株P.ks 4为出发藻株进行二次诱变。
4.1种子液培养
方法同1.1。
4.2诱变前处理
方法同1.2。
4.3诱变操作具体步骤：
方法同1.3。
致死率曲线见图13：如图所示，P.ks 4处于对数早期和后期对ARTP的敏感度高于对数中期。最终确定P.ks 4最佳诱变时间：对数早期：15s；对数中期：17s；对数末期：15s，致死率分别为98.01％、99.84％、97.96％。在以上确定的最佳诱变时间下对相应藻液进行诱变。
4.4突变株筛选
经诱变后，以固体筛选平板上单藻落出现的时间为生长速度指标进行初筛排序，选择最早于诱变后第6～7d生长出来的单藻落为目标藻株，再一一转接至纯化平板，最终将得到的22株突变株置于48孔板中进行高通量异养培养(在黑暗条件下)，以生物量产率为指标进行复筛，得到生长最快的突变株P.ks 4-65。将其划线异养培养在固体平板上，其藻落及藻苔颜色表征见图14。
4.5传代培养
将上述突变株P.ks 4-65采用划线平板法进行八次传代培养，以可视化藻落颜色验证其遗传稳定性，得到该突变株具有很好的遗传稳定性。
4.6突变株P.ks 4-65生产性能和品质特征评价
4.6.1异养培养
将P.ks 4-65接种于121℃灭菌15min的Basal培养基中，设置初始硝酸钠浓度为5g/L、初始葡萄糖浓度为30g/L，pH值为6.14，在温度为30℃、转速为150rpm的恒温摇床中进行周期4天的异养(在黑暗条件下)培养，直至碳源或氮源耗尽。
4.6.2分析检测
每24h取样2mL测细胞细胞密度及生物量浓度。培养结束后制备冻干藻粉并置于-20℃冰箱中储存，以分析检测色素组成、蛋白含量及氨基酸组成，计算蛋白产量和产率及氨基酸评分。
4.6.3P.ks 4-65生产性能及品质特征分析结果
同一条件下突变株P.ks 4-65的比生长速率、生物量净产率见图15。如图所示，在初始葡萄糖浓度为30g/L、初始硝酸钠浓度为5g/L条件下，突变株P.ks 4-65的比生长速率和生物量净产率分别达到0.97和2.92g/L/d，均显著高于野生型P.ks及出发突变株P.ks 4。说明经过第二轮诱变，其生长性能得到较好的改善。
同一条件下P.ks、突变株P.ks 4和P.ks 4-65的叶黄素含量及叶绿素a和b相对含量见图 16(A)。如图所示，在初始葡萄糖浓度为30g/L、初始硝酸钠浓度为5g/L条件下，突变株P.ks 4-65叶绿素a含量相较于野生型降低了98.16％，无叶绿素b。同时突变株P.ks 4-65叶黄素含量可达0.83mg/g，相较于P.ks及突变株P.ks 4分别提高了27.01％和33.85％。
同一条件下P.ks、突变株P.ks 4和P.ks 4-65的蛋白含量、产率及产率见图16(B)。如图所示，在初始葡萄糖浓度为30g/L、初始硝酸钠浓度为5g/L条件下，突变株P.ks 4-65的蛋白含量、产量、产率均显著高于P.ks和突变株P.ks 4。其中，突变株P.ks 4-65蛋白含量高达 46.62％，相较于P.ks和突变株P.ks 4分别提高了20.46％和18.77％；蛋白产量和产率高达5.44 g/L和1.36g/L/d，相较于P.ks和突变株P.ks 4分别提高了25.05％和18.77％。说明经过第二轮诱变后突变株P.ks 4-65蛋白积累加强。
同一条件下对野生型P.ks、突变株P.ks 4和P.ks 4-65进行氨基酸组成分析，结果见表4。如表4所示，P.ks 4-65氨基酸总量达到414.16mg/g，相较于野生型和P.ks 4分别提高了29.33％及21.65％，氨基酸含量更为丰富。其中8种必需氨基酸(Lys、His、Trp、Phe、Met、Ile、 Leu、Val、Thr)含量为162.24mg/g，相较于野生型和P.ks 4分别提高了37.34％及19.56％。支链氨基酸(Val、Ile、Leu)总量为80.1mg/g，相较于野生型和P.ks 4分别提高了47.48％及25.23％。
表4. 5g/L NaNO3和一次性加入葡萄糖下藻粉的氨基酸组成
对以上所含的人体必需氨基酸与FAO/WHO建议模式进行对比，得到氨基酸评分表如表 5所示。突变株P.ks 4-65的氨基酸评分为70.03，其第一限制性氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸，其余氨基酸含量均优于FAO/WHO建议模式。由表5可知，P.ks 4-65胱氨酸的绝对含量显著低于P.ks 4，故其氨基酸评分低于P.ks 4，但仍显著高于野生型P.ks，相较于野生型，P.ks 4-65 的氨基酸组成有一定程度的改善。
表5. 5g/L NaNO3和一次性加入葡萄糖下藻粉的氨基酸评分表
本实施例以叶绿素合成缺陷型突变株P.ks 4为出发藻株，经过第二轮诱变得到突变株P. ks 4-65，其生长性能及品质特征都得到了进一步的改善，为替代蛋白领域提供了不可多得的优良发酵藻株。
将突变株P.ks 4-65的18S rRNA基因进行测序分析(广东省微生物分析检测中心)，基因序列如SEQ ID NO.2所示，突变株P.ks 4-65与已公布的凯式拟小球藻藻株的18SrRNA同源性达99.94％。
根据突变株P.ks 4-65的菌落形态特征和分子鉴定结果，将突变株P.ks 4-65命名为凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)SCUT-ACB 4-65，已于2022年04月28日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2022519。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
广州藻能生物科技有限公司
<120> 一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1615
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P.sk SCUT-ACB 4 18s rRNA基因序列
<400> 1
cccgggttgc caatccgaac acttcaccag cacacccaat cggtaggagc gacgggcggt 60
gtgtacaaag ggcagggacg taatcaacgc aagctgatga cttgcgctta ctaggcattc 120
ctcgttgaag attaataatt gcaataatct atccccatca cgatgcagtt tcaaagatta 180
cccgggcctc tcggccaagg ctaggctcgt tgattgcatc agtgtagcgc gcgtgcggcc 240
cagaacatct aagggcatca cagacctgtt attgcctcat gcttccattg gctagtcgcc 300
aatagtccct ctaagaagtc tgccggcccc cgaggaggcc gtgactattt agcaggctga 360
ggtctcgttc gttaccggaa tcaacctgac aaggcaaccc accaactaag aacggccatg 420
caccaccacc catagaatca agaaagagct ctcaatctgt caatcctcac tatgtctgga 480
cctggtaagt tttcccgtgt tgagtcaaat taagccgcag gctccacgcc tggtggtgcc 540
cttccgtcaa tttcctttaa gtttcagcct tgcgaccata ctccccccgg aacccaaaaa 600
ctttgatttc tcataaggtg ccggcggagt catcgaagaa acatccgccg atccctagtc 660
ggcatcgttt atggttgaga ctaggacggt atctaatcgt cttcgagccc ccaactttcg 720
ttcttgatta atgaaaacat ccttggcaaa tgctttcgca gtagttcgtc tttcgaaaat 780
ccaagaattt cacctctgac atcgaaatac gaatgccccc gactgtccct cttaatcatt 840
actccggtcc tacagaccaa caggataggc cagagtccta tcgtgttatt ccatgctaat 900
gtattcagag cgtaggcctg ctttgaacac tctaatttac tcaaagtaac agcgccgact 960
ccgagtcccg gacagtgaag cccaggagcc cgtccccggc aacaaggcgg gccctgccag 1020
tgcacaccga aacggcggac cggcaggccc cgcccgaaat ccaactacga gctttttaac 1080
tgcagcaact taaatatacg ctattggagc tggaattacc gcggctgctg gcaccagact 1140
tgccctccaa ttgatcctcg ttaaggggtt tagattgtac tcattccaat taccagacct 1200
gaaaaggccc ggtattgtta tttattgtca ctacctccct gtgtcaggat tgggtaattt 1260
gcgcgcctgc tgccttcctt ggatgtggta gccgtttctc aggctccctc tccggaatcg 1320
aaccctaatc ctccgtcacc cgttaccacc atggtaggcc tctatcctac catcgaaagt 1380
tgatagggca gaaatttgaa tgaaacatcg ccggcgcaag gccatgcgat tcgtgaagtt 1440
atcatgattc accgcgagac cggcagagcc gggtcggcct taaatctaat aaatacgtcc 1500
cttccagaag tcgggattta cgcacgtatt agctctagaa ttactacggt tatccggtag 1560
taaggtacca tcaaataaac tataactgat ttaatgagcc attcgcagtt tcaca 1615
<210> 2
<211> 1615
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P.sk SCUT-ACB 4-65 18s rRNA基因序列
<400> 2
ggaaaccgcc ccgggttgcc aatccgaaca cttcaccagc acacccaatc ggtaggagcg 60
acgggcggtg tgtacaaagg gcagggacgt aatcaacgca agctgatgac ttgcgcttac 120
taggcattcc tcgttgaaga ttaataattg caataatcta tccccatcac gatgcagttt 180
caaagattac ccgggcctct cggccaaggc taggctcgtt gattgcatca gtgtagcgcg 240
cgtgcggccc agaacatcta agggcatcac agacctgtta ttgcctcatg cttccattgg 300
ctagtcgcca atagtccctc taagaagtct gccggccccc gaggaggccg tgactattta 360
gcaggctgag gtctcgttcg ttaccggaat caacctgaca aggcaaccca ccaactaaga 420
acggccatgc accaccaccc atagaatcaa gaaagagctc tcaatctgtc aatcctcact 480
atgtctggac ctggtaagtt ttcccgtgtt gagtcaaatt aagccgcagg ctccacgcct 540
ggtggtgccc ttccgtcaat tcctttaagt ttcagccttg cgaccatact ccccccggaa 600
cccaaaaact ttgatttctc ataaggtgcc ggcggagtca tcgaagaaac atccgccgat 660
ccctagtcgg catcgtttat ggttgagact aggacggtat ctaatcgtct tcgagccccc 720
aactttcgtt cttgattaat gaaaacatcc ttggcaaatg ctttcgcagt agttcgtctt 780
tcgaaaatcc aagaatttca cctctgacat cgaaatacga atgcccccga ctgtccctct 840
taatcattac tccggtccta cagaccaaca ggataggcca gagtcctatc gtgttattcc 900
atgctaatgt attcagagcg taggcctgct ttgaacactc taatttactc aaagtaacag 960
cgccgactcc gagtcccgga cagtgaagcc caggagcccg tccccggcaa caaggcgggc 1020
cctgccagtg cacaccgaaa cggcggaccg gcaggccccg cccgaaatcc aactacgagc 1080
tttttaactg cagcaactta aatatacgct attggagctg gaattaccgc ggctgctggc 1140
accagacttg ccctccaatt gatcctcgtt aaggggttta gattgtactc attccaatta 1200
ccagacctga aaaggcccgg tattgttatt tattgtcact acctccctgt gtcaggattg 1260
ggtaatttgc gcgcctgctg ccttccttgg atgtggtagc cgtttctcag gctccctctc 1320
cggaatcgaa ccctaatcct ccgtcacccg ttaccaccat ggtaggcctc tatcctacca 1380
tcgaaagttg atagggcaga aatttgaatg aaacatcgcc ggcgcaaggc catgcgattc 1440
gtgaagttat catgattcac cgcgagaccg gcagagccgg gtcggcctta aatctaataa 1500
atacgtccct tccagaagtc gggatttacg cacgtattag ctctagaatt actacggtta 1560
tccggtagta aggtaccatc aaataaacta taactgattt aatgagccat tcgca 1615

Claims (10)

1.一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株，其特征在于：所述的突变株为突变株P.ks SCUT-ACB 4和突变株P.ks SCUT-ACB 4-65中的至少一株；其中，
所述的突变株P.ks SCUT-ACB 4，名称为凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)SCUT-ACB 4，保藏编号为CCTCC NO：M 2022518，已于2022年04月28日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心；
所述的突变株P.ks SCUT-ACB 4-65，名称为凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)SCUT-ACB 4-65，保藏编号为CCTCC NO：M 2022519，已于2022年04月28日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
2.一种培养权利要求1所述单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株的方法，其特征在于，具体步骤为：将单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株接种到培养基中，于28～30℃条件下进行培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述的培养基为Basal培养基、BG-11培养基和BBM培养基中的至少一种；
所述的培养为在光照或黑暗条件下进行培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述的培养基为含2.5～5g/L硝酸钠和10～30g/L葡萄糖的Basal培养基；
所述的培养为在黑暗条件下进行培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述的培养基的配方如下：NaNO3 2.5～5g/L，葡萄糖10～30g/L，H3BO3114.2 mg/L，MoO37.1mg/L，KH2PO4 1250mg/L，CaCl2·2H2O 111mg/L，MnCl2·4H2O 14.2mg/L，MgSO4·7H2O1000mg/L，FeSO4·7H2O 49.8mg/L，CuSO4·5H2O 15.7mg/L，EDTA 500mg/L，ZnSO4·7H2O88.2mg/L，CoNO3·6H2O 6.1mg/L。
6.权利要求1所述的单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株在生产蛋白方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将活化后的单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株接种到含有碳氮源的培养基中，于28～30℃、黑暗条件下进行培养，离心收集藻液，洗涤、冷冻干燥，得到富含蛋白的藻粉。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的含有碳氮源的培养基为含有碳氮源的Basal培养基、BG-11培养基和BBM培养基中的至少一种；
所述的接种密度为1×106～1×107cells/mL。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述的含有碳氮源的培养基为含2.5～5g/L硝酸钠和10～30g/L葡萄糖的Basal培养基。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述的含有碳氮源的培养基的配方如下：NaNO3 2.5～5g/L，葡萄糖10～30g/L，H3BO3114.2 mg/L，MoO3 7.1mg/L，KH2PO4 1250mg/L，CaCl2·2H2O 111mg/L，MnCl2·4H2O14.2mg/L，MgSO4·7H2O 1000mg/L，FeSO4·7H2O 49.8mg/L，CuSO4·5H2O 15.7mg/L，EDTA500mg/L，ZnSO4·7H2O 88.2mg/L，CoNO3·6H2O 6.1mg/L。
CN202210548831.7A 2022-05-20 2022-05-20 一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用 Pending CN117126741A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210548831.7A CN117126741A (zh) 2022-05-20 2022-05-20 一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210548831.7A CN117126741A (zh) 2022-05-20 2022-05-20 一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117126741A true CN117126741A (zh) 2023-11-28

Family

ID=88851355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210548831.7A Pending CN117126741A (zh) 2022-05-20 2022-05-20 一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117126741A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106754390B (zh) 一株高产蛋白的小球藻及其培养方法和应用
CN109825444B (zh) 一种提高红曲黄酒食品安全的菌株及其酿造方法
CN101861384A (zh) 使用重组大肠杆菌生产番茄红素的方法
Chen et al. Effective two-stage heterotrophic cultivation of the unicellular green microalga Chromochloris zofingiensis enabled ultrahigh biomass and astaxanthin production
CN110042096A (zh) 一种用紫光提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法
CN112481348A (zh) 一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的筛选方法
CN104450571B (zh) 一种高效降解蝇蛆蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株
CN116855387A (zh) 一种高产菌体蛋白文氏镰刀真菌突变株及其应用
CN114907982B (zh) 小球藻突变株及其高密度异养培养方法和应用
CN112358975A (zh) 红法夫酵母菌及其用途
CN115044474B (zh) 一株高生育酚含量的微藻突变株、其筛选方法及应用
CN114891637B (zh) 一株高产虾青素的小球藻Chlorella zofingiensis突变体及其应用
WO2023016387A1 (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用
CN117126741A (zh) 一种单细胞绿藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用
Guan et al. Biomass and terpenoids produced by mutant strains of Arthrospira under low temperature and light conditions
CN116574613B (zh) 一种蛋白核小球藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用
KR20120127153A (ko) 글루타치온을 고발현하는 효모 균주 및 이의 용도
Nguyen et al. Cultural characteristics and cordycepin production of some Cordyceps militaris strains under artificial cultivation conditions
CN110305797B (zh) 一株花青素产生菌株cj6及其应用
CN108728363A (zh) 一种裸藻培养基
CN111876350A (zh) 一种高产碳水化合物的纤细鞘丝藻及其应用
CN106467894B (zh) 一株高产淀粉和油脂的单针藻及其培养应用
CN115820423B (zh) 一种波斯枝藻及其培养方法和应用
CN116376730B (zh) 一种红法夫酵母菌及其用途
CN117417853B (zh) 一种海水罗塞略莫拉氏菌、菌剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination