CN111876350A - 一种高产碳水化合物的纤细鞘丝藻及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产碳水化合物的纤细鞘丝藻，该藻株从中国云南省热泉周边的生物垫中分离获得，已于2019年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 19154，分类命名为纤细鞘丝藻NK1‑12；还涉及该纤细鞘丝藻在产碳水化合物中的应用；还涉及一种培养上述纤细鞘丝藻的方法，以及用该方法获得的培养物。本发明所述纤细鞘丝藻具有72％的总糖含量，并且可分泌较高浓度的可溶性糖至培养环境中。此外，该藻株的最优培养温度为40℃，有一定程度的耐盐性，在外加100mM氯化钠的BG11培养基中，该藻株具有更高的海藻糖等可溶性糖含量和分泌能力。

Description

一种高产碳水化合物的纤细鞘丝藻及其应用

技术领域

本发明涉及应用微藻领域，更特别地，涉及一种高产碳水化合物的纤细鞘丝藻及其应用。

背景技术

碳水化合物、脂肪和蛋白质是生物界三大基础物质。其中碳水化合物是绿色化工的根基，是生物体维持生命活动所需能量的主要来源。碳水化合物可分为可溶性碳水化合物(例如可溶性糖类)和不溶性碳水化合物(例如纤维素、淀粉等)。传统碳水化合物的生产主要依赖于粮食作物(如玉米)、纤维素类生物质(如作物秸秆)及糖类作物(如甘蔗)。伴随全球范围内自然资源开发的加速和人类生存环境的日趋恶化，新型碳水化合物制备路线的开发也迫在眉睫。

蓝细菌是地球上最古老的光合原核微生物，可进行植物型产氧光合作用，广泛分布于各种水体、土壤甚至岩石表面。具有极强的生命力，在一些极端环境中(如热泉、冰原、沙漠、盐湖)也可找到他们的踪迹，素有“先锋生物”之称。蓝细菌兼具细菌和藻类的代谢特征，但与真核微藻合成淀粉或者β-葡聚糖不同，蓝细菌碳水化合物的主要存储形式为糖原。蓝细菌外膜与革兰氏阴性菌类似，但其细胞壁上包含较厚的肽聚糖层。许多蓝细菌胞外黏液层或荚膜中还富含多糖类物质，普通微藻的碳水化合物含量在20-40％之间。

陆地热泉是一类天然的高温环境，为人类认识极端生命与环境协同演化做出了重要贡献。当前，结合组学和同位素标记等研究技术，已对热泉环境的微生物资源多样性和代谢特征有了一定程度的认识。但是，热泉微生物的分离纯化的研究相对滞后，而嗜热蓝细菌作为一类光合自养微生物，自身可能蕴含着更为丰富的包含碳水化合物在内的生物界基础物质，是一类优良的“绿色细胞工厂”。因此，热泉蓝细菌资源的发掘及碳水化合物组分的分离鉴定，可发展成为特定碳水化合物的新型生产路线，未来有望应用于新型能源、食品、药品、化妆品等领域相关化合物的光合生物合成。

发明内容

发明人从野外采集藻样，经培养分离，得到一株能够高产碳水化合物的藻株。液体培养呈黄褐色，可形成毛状体。光镜下其形态为多个细胞串成单列丝状体，呈黄绿色，没有细胞核，丝状体上下等宽，外有明显的胶质鞘，顶端细胞为钝圆形，呈现典型的纤细鞘丝藻形态，经测序得到其16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，将该序列在NCBI数据库中进行比对，与纤细鞘丝藻属的类群相似度较高，命名为纤细鞘丝藻NK1-12，拉丁学名为Leptolyngbya sp.NK1-12。

基于以上发现，本发明提供了一种高产碳水化合物的纤细鞘丝藻，所述纤细鞘丝藻于2019年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 19154。

本发明还提供了上述纤细鞘丝藻在产碳水化合物中的应用。

在一个具体实施方案中，所述碳水化合物为可溶性糖。

在一个具体实施方案中，所述碳水化合物为海藻糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖中的一种或多种组合。

本发明还提供了一种上述纤细鞘丝藻的方法，包括将所述纤细鞘丝藻接种于液体培养基中并进行光合培养的步骤。

在一个优选实施方案中，所述液体培养基为外加0-100mM氯化钠的BG11培养基。

在一个优选实施方案中，培养温度为35-40℃。

在一个优选实施方案中，培养方式为通入含有3％CO₂的空气培养。

在一个优选实施方案中，培养时的光照强度为100-250μmol photons m^-2s^-1。

本发明还提供了通过上述方法培养得到的纤细鞘丝藻培养物。

本发明的纤细鞘丝藻具有72％的可溶性糖含量，并且可分泌较高浓度的可溶性糖至培养环境中。此外，该藻株的最优培养温度为40℃，有一定程度的耐盐性，并且在外加100mM氯化钠的BG11培养基中，该藻株具有更高的可溶性糖含量和分泌能力。

微生物保藏

本发明所述的藻株从中国云南省热泉泉口的生物垫中分离获得，经16S rRNA基因测序和形态学鉴定，该藻株属于蓝藻门颤藻科纤细鞘丝藻属，并且16S rRNA基因序列与纤细鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)近似度比较高。2019年12月27日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 19154，命名为纤细鞘丝藻NK1-12，拉丁学名为Leptolyngbya sp.NK1-12。

附图说明

图1为纤细鞘丝藻NK1-12的光学显微镜照片；

图2为纤细鞘丝藻NK1-12的扫描电镜照片；

图3为纤细鞘丝藻NK1-12的16S rRNA基因与其他蓝藻进行比对构建的系统进化树；

图4为纤细鞘丝藻NK1-12藻细胞中的碳水化合物、蛋白质和脂类的含量统计图；

图5为纤细鞘丝藻NK1-12的碳水化合物不同组分的分布统计图；

图6为纤细鞘丝藻NK1-12在锥形瓶中不同温度下震荡培养的生长曲线(固定光强30μmol photons m^-2s^-1)；

图7为纤细鞘丝藻NK1-12在柱式光生物反应器中不同温度下通气培养的生长曲线(固定光强100μmol photons m^-2s^-1)；

图8为纤细鞘丝藻NK1-12在柱式光生物反应器中于40℃不同光强下通气培养的生长曲线；

图9为纤细鞘丝藻NK1-12盐胁迫下(添加梯度浓度NaCl)在柱式光生物反应器中于40℃、100μmol photons m^-2s^-1通气培养的生长曲线；

图10为纤细鞘丝藻NK1-12盐胁迫下(添加梯度浓度NaCl)在柱式光生物反应器中于40℃、100μmol photons m^-2s^-1通气培养5天后胞内和胞外海藻糖含量统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、纤细鞘丝藻NK1-12的获得

本发明的藻株(Leptolyngbya sp.NK1-12)从云南热泉泉口的生物垫样品中分离获得。光学显微镜和扫描电镜观察其细胞形态如图1和2所示，为多细胞串成单列的丝状体，呈黄绿色，没有细胞核，丝状体上下等宽，外有明显的胶质鞘(Sh)，顶端细胞(ap)为钝圆形，为典型的纤细鞘丝藻形态。提取基因组DNA扩增16S rRNA基因测序如SEQ ID NO:1所示，与数据库中的微藻16S rRNA基因进行比对并构建进化树，显示其16S rRNA基因序列与纤细鞘丝藻属的类群相似度较高(图3)。结合形态和分子证据，将该藻株划入纤细鞘丝藻属，命名为纤细鞘丝藻NK1-12。该微藻已于2019年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 19154，命名为纤细鞘丝藻NK1-12，拉丁学名为Leptolyngbya sp.NK1-12。

2、纤细鞘丝藻NK1-12的碳水化合物组成

将纤细鞘丝藻NK1-12培养8天后，离心收集藻细胞，冷冻干燥后，分别采用入氯仿-甲醇法结合GC-MS测定、凯氏定氮法、苯酚-硫酸法测定其中的总脂、总蛋白和总碳水化合物(糖类)含量。结果如图4所示，其中的碳水化合物含量占细胞干重的72％，远高于已报道常规蓝细菌中的碳水化合物含量(约20-40％)。进一步分析碳水化合物的组分，结果如图5所示，纤细鞘丝藻NK1-12中的碳水化合物基本为可溶性糖，以麦芽糖、海藻糖、半乳糖和甘露糖为主。

3、纤细鞘丝藻NK1-12的培养优化

3.1、温度优化

将纤细鞘丝藻NK1-12以初始接种浓度OD₇₃₀≈0.1接种于装有BG11的三角瓶中，于不同温度下进行振荡培养，振荡速度为150rpm，光强30μmol photons m^-2s^-1，每天取样测OD₇₃₀，绘制生长曲线如图6所示，纤细鞘丝藻NK1-12在30-40℃左右(30±2℃至40±2℃)下均可生长，并于培养3天后进入对数期，培养8天后OD₇₃₀可达2左右。50℃左右，纤细鞘丝藻NK1-12生长受到抑制，培养5天后进入平台期，OD₇₃₀约为0.75。55℃左右纤细鞘丝藻NK1-12不生长。因此，就培养温度而言，该菌株呈现中度嗜热蓝细菌的典型特征。

为进一步优化纤细鞘丝藻NK1-12的培养条件，采用100mL柱式光生物反应器于不同温度下培养该藻株(其余培养条件参照该反应器常规参数，3％CO₂通气培养，光强100-120μmol photons m^-2s^-1)，每天取样测OD₇₃₀，绘制生长曲线如图7所示，纤细鞘丝藻NK1-12在40℃左右(40±2℃)下生长最好，在培养的两天后进入对数期，培养6天后OD₇₃₀超过6，远高于振荡培养；35℃左右(35±2℃)生长良好，但初期生长状态次于40℃，于培养4天左右进入对数期，培养6天后OD₇₃₀约为5，远高于振荡培养。30℃左右生长受到严重抑制，45和50℃左右纤细鞘丝藻NK1-12不生长。

以上结果显示，纤细鞘丝藻NK1-12的较低光强最适温度为30-40℃左右(30±2℃、40±2℃)，50℃左右可保持较低速的生长；在较高光强通气培养条件下，最适温度为35-40℃左右(35±2℃，40±2℃)，30℃及以下纤细鞘丝藻NK1-12基本不生长，45℃及以上完全不生长，并死亡。

3.2、光照强度优化

根据上面的实验结果，选择40℃作为培养温度，来优化培养过程中的光照强度。将纤细鞘丝藻NK1-12接种于装有BG11的柱式光生物反应器中，于不同光强下进行通气培养，通入气体中含有3％的CO₂，培养温度为40±2℃，每天取样测OD₇₃₀。结果如图8所示，藻株在250μmol photons m^-2s^-1光强下于培养1天后即进入对数期，至培养3-4天后进入平台期，进入平台期的时间最短，并且OD₇₃₀接近8，为所有培养中最高的OD值。100μmol photons m^-2s^-1光强下的生长状态与前述实验中类似，虽进入指数生长的时间相对较长，但培养5天后OD₇₃₀仍然可达6以上。

3.3、可溶性糖(海藻糖)生产条件优化

为进一步探究纤细鞘丝藻NK1-12可溶性糖的合成和分泌潜力，以海藻糖为例，设置梯度NaCl浓度胁迫，分析海藻糖的胞内外累积特征。将纤细鞘丝藻NK1-12接种于装有BG11(添加了不同浓度的NaCl)的柱式光生物反应器中，于40℃下通气培养，通入气体中含有3％的CO₂，光强100-120μmol photons m^-2s^-1，每天取样测定OD₇₃₀，绘制生长曲线如图9所示，100mM氯化钠对纤细鞘丝藻NK1-12的生长无显著影响，300mM和600mM严重抑制藻细胞生长，甚至导致藻细胞死亡。与不添加NaCl相比，100mM NaCl胁迫5天后大幅提高了海藻糖合成能力，总产量提高近2倍。更有意义的是，100mM NaCl胁迫主要导致外泌型海藻糖产量的提高(提高近4倍，可达80mg/L)。主要产品位于胞外的特性，极利于产品分离纯化，在实际生产中颇具应用价值。因此，培养基中添加100mM NaCl是热泉蓝细菌纤细鞘丝藻NK1-12生产海藻糖的最佳条件。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种高产碳水化合物的鞘丝藻及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 鞘丝藻NK1-12(Leptolyngbya sp. NK1-12)

<400> 1

ggtcgctaat acccgatgtg ccgagaggtg aaaggattaa ttgcctgagg atgagctcgc 60

gtctgattag ctagttggag gggtaacggc ccaccaaggc gacgatcagt agctggtctg 120

agaggatgat cagccacact gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag 180

tggggaattt tccgcaatgg gcgcaagcct gacggagcaa gaccgcgtga gggaagacgg 240

cctactggtt gtaaacctct tttgataggg aagaacacaa tgacggtacc tatcgaatca 300

gcctcggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga ggaggcaagc gttatccgga 360

attattgggc gtaaagcgtc cgtaggtgga tattcaagtc agttgttaaa gcgtggagct 420

taactccata agggcaattg aaactgaatg tctagagtgc gataggggca aggggaattc 480

ccagtgtagc ggtgaaatgc gtagatattg ggaagaacat cggtggcgaa agcgccttgc 540

tgggtctgca ctgacactga gggacgaaag ctaggggagc gaaagggatt agataccccc 600

Claims (10)

1.一种高产碳水化合物的纤细鞘丝藻，所述纤细鞘丝藻于2019年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 19154。

2.权利要求1所述的纤细鞘丝藻在产碳水化合物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述碳水化合物为可溶性糖。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述碳水化合物为海藻糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖中的一种或多种组合。

5.一种培养权利要求1所述纤细鞘丝藻的方法，其特征在于，包括将所述纤细鞘丝藻接种于液体培养基中并进行光合培养的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为外加0-100mM氯化钠的BG11培养基。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养温度为35-40℃。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养方式为通入含有3％CO₂的空气培养。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养时的光照强度为100-250μmolphotons m^-2s^-1。

10.一种纤细鞘丝藻培养物，其特征在于，通过权利要求5-9中任一项所述的方法得到。

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