CN114561319B - 一种解钾菌及解钾菌肥 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种解钾菌及解钾菌肥,所述解钾菌为寡养单胞菌属菌株,保藏编号为CCTCC M 2021355。所述解钾菌肥包括前述解钾菌和用于负载所述解钾菌的生物炭载体。本发明从酸性紫色土中筛选得到的寡氧单胞菌具稳定的解钾性能,适用于酸性紫色土中。高浓度菌液在提高土壤速效钾含量及促进黑麦草生长方面效果显著,具有开发利用潜力,为紫色土地区开发环境友好的生物菌肥提供了良好的菌种资源。发明解钾菌在生物炭及生物炭协同钾矿材料负载下对于黑麦草的促生效果显著,这有利于减少钾肥施用,缓解钾肥缺乏的矛盾。

Description

一种解钾菌及解钾菌肥
技术领域
本发明属于微生物肥料领域,涉及解钾菌,以及包含该解钾菌的解钾菌肥。
背景技术
钾素是植物生长过程中不可或缺的营养元素,其在参与植物的光合作用、提高植物抗倒伏、抗寒、抗旱能力过程中发挥着重要作用,因能促进作物合成生长所需的蛋白质,提升作物的品质,又被称为“品质元素”。我国农业生产中传统习惯于偏施氮磷肥、轻钾肥,而我国钾矿资源匮乏,农用钾肥大部分依靠进口,价格昂贵的进口钾肥加剧了实际生产中钾肥的供应不足,同时随着高产品种的作物和喜钾作物大量吸钾,土壤中的钾素随作物收获被大量带出而得不到有效补充而导致其有效钾储量减少,土壤钾素亏缺问题日益突出。然而实际上土壤中并不缺乏钾源,地壳中钾元素含量达2.59%,而土壤中90%~98%的钾存在于硅酸盐矿物中,但只有经过漫长的风化作用后这部分钾源才能转变为可被植物直接吸收利用的有效钾。因此,充分挖掘与利用土壤的固有钾源、提高土壤钾素有效性是集约化农业生产中亟待解决的关键问题,对于生态环境的保护和资源可持续利用也发挥着重要作用。
解钾菌能将矿物中难溶态的钾、硅、铝等元素转化为可溶态养分,同时提高作物对土壤钾素的吸收。解钾菌的施入作为一种提高土壤矿物钾利用率的科学手段愈来愈受到研究者的重视。已有研究发现在水稻土、紫色土、红壤等不同土壤类型中分离出的解钾菌在解钾能力上差异显著,如李新新等筛选的类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)解钾效率达27.62%,陈易等测定出一株具紫色土亲和性解钾菌对钾长石解钾量达12.8mg/L。
已有研究更多倾向于针对作物种类来分离筛选不同的解钾菌,但针对不同地区分离筛选土著解钾菌以适应该地区土壤性质和作物生产的研究较为有限,对酸性紫色土亲和性的解钾菌研究也较少。紫色土广泛分布于我国四川、广东、福建等地区,面积约有2000万hm2,具有肥力高、生产潜力大等特点,是我国所特有的具有重要农业潜力的土壤资源,然而频繁耕作和不合理偏施肥料使得酸性紫色土中可溶性钾含量存在较大差异。
发明内容
鉴于此,本发明目的在于提供一种酸性紫色土亲和性解钾细菌。
本发明的另一目的是提供一种解钾菌肥,该解钾菌肥能够提高土壤速效钾含量及促进植物生长方面效果显著。
发明人通过长期的探索和尝试,以及多次的实验和努力,不断的改革创新,为解决以上技术问题,本发明提供的技术方案是,提供一种解钾菌,所述解钾菌为寡养单胞菌属菌株,保藏编号为CCTCC M 2021355。寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.sp.)Ab27,生物保藏编号为:CCTCC M 2021355。保藏日期:2021年4月12日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:武汉大学。进一步地,所述解钾菌为酸性紫色土亲和性解钾细菌。
本发明还提供了一种解钾菌肥,包括前述解钾菌,还包括用于负载所述解钾菌的生物炭载体。
优选地,所述生物炭载体为玉米秸秆炭、小麦秸秆炭或稻壳炭。
进一步地,所述玉米秸秆炭是利用玉米秸秆采用限氧裂解法在300℃~800℃下制得;所述小麦秸秆炭是利用小麦秸秆采用限氧裂解法在300℃~800℃下制得;所述稻壳炭是利用稻壳采用限氧裂解法在300℃~800℃下制得。
优选地,所述解钾菌接入LB液体培养基的活化,然后按照5%接种量接入添加1%生物炭的牛肉膏蛋白胨培养基上,培养6~48h后,用固体用磷酸盐缓冲液反复洗涤、离心,再冷冻干燥,得到生物炭固定化解钾菌的复合材料。
进一步地,所述冷冻干燥具体条件为:冷阱温度为-55℃,真空度为0.05~0.3pa,冷冻干燥时间为8~12h。
进一步地,还包括钾矿粉,所述钾矿粉与负载有所述解钾菌的生物炭载体混合。
优选地,所述钾矿粉为钾长石粉。
优选地,所述钾矿粉与所述负载有所述解钾菌的生物炭按照重量比为1:1的比例混合。
与现有技术相比,上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点:
a)本发明从酸性紫色土中筛选得到的寡氧单胞菌(Stenotrophomonas sp.sp.)具稳定的解钾性能,适用于酸性紫色土中。解钾菌菌液在提高土壤速效钾含量及促进黑麦草生长方面效果显著,具有开发利用潜力,为紫色土地区开发环境友好的生物菌肥提供了良好的菌种资源。
b)本发明生物炭负载解钾菌及生物炭协同钾矿材料负载解钾菌均能够显著提高植物的吸钾量,对于提高植物吸钾量具有长期效应,且该作用能持续发挥,对土壤长期供钾潜力有着较好的正效应。
c)本发明解钾菌在生物炭及生物炭协同钾矿材料负载下对于植物的促生效果显著,这有利于减少钾肥施用,缓解钾肥缺乏的矛盾。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案,下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是基因系统发育树。
图2是采用限氧裂解法在300℃、500℃、700℃下制备稻壳炭电镜扫描图。
图3是图2稻壳炭负载菌体后电镜扫描图。
图4是采用限氧裂解法在300℃、500℃、700℃下制备玉米秸秆炭电镜扫描图。
图5是图4玉米秸秆炭负载菌体后电镜扫描图。
图6是采用限氧裂解法在300℃、500℃、700℃下制备小麦秸秆炭电镜扫描图。
图7是图5小麦秸秆炭负载菌体后电镜扫描图。
图8是本发明实施例中3种生物炭材料负载菌株前后衰减全反射光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施方式,对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式是本发明一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。因此,以下对在本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例1
本实施例所描述的解钾菌为寡养单胞菌属菌株,菌株分离、筛选及鉴定过程如下。
采用稀释平板法筛选紫色土解钾菌,紫色土壤采自雅安市雨城区老板山的酸性紫色土农田区域,采集0~30cm深的土壤,将根系表面附着的土壤轻轻抖落在无菌袋中,带回实验室置于4℃冰箱中保存。称取10g该土样于有玻璃珠的三角瓶,加入90ml无菌蒸馏水,以180r/min,25℃振荡30min至充分摇匀。吸取1mL的土壤混悬液于无菌水试管中,用无菌水稀释10倍,移液枪吹打均匀,再进行10倍梯度稀释,分别制备10-4、10-5、10-6三个浓度梯度的土壤稀释液,吸取150μL不同浓度稀释液涂布到解钾细菌初筛培养基,实验设置3个重复,将平板倒置在生化培养箱中,于30℃培养3-5d,挑取圆形、透明、表面湿润粘稠的大型菌落,反复进行平板划线,同时用显微镜观察菌落纯度,直至获得纯培养。将纯化后的菌株与25%的甘油混合放置于-20℃冷藏保存。
初步筛选土壤中解钾微生物选用亚历山大罗夫选择性培养基,根据菌体形态大小、生长速度等特点将所得菌株依次命名为Ab27、Ca10、S1、Bb18以及Z4,对5株菌株进行解钾能力的测定。结果表明,5种菌株解钾能力差异显著,Ab27解钾量在不同培养时长下均为最高,表现出较为稳定和高效的解钾能力,当培养至60h时,Ab27解钾率高出空白对照91.7%。因此选定Ab27作为研究对象,继续后续试验。
采用革兰氏染色法,参照《常见细菌系统鉴定手册》,对照《伯杰细菌鉴定手册》以解钾细菌培养基为基础,对供试菌株进行吲哚试验、脲酶试验和接触酶试验等生理生化特性测定。经革兰氏染色,观察菌株形态特征,Ab27在解钾固体培养基上的菌落呈圆形,边缘整齐,表面湿润圆滑,泛白凸起且粘稠,挑起时具有弹性可拉丝,革兰氏染色结果显示为阴性,菌体形态为杆状,其生理生化特征见表1。其能发酵葡萄糖,柠檬酸盐利用试验阳性,色氨酸试验、V-P试验和甲基红试验呈阴性、接触酶试验、脲酶试验、纤维素试验、明胶试验和吲哚试验的结果均为阳性。
表1生理生化试验结果
Figure BDA0003469320710000041
注:+:阳性;-:阴性。
将活化后的菌株利用细菌总DNA试剂盒提取DNA,吸取1ml活化菌液并加入1.5ml的EP管中,以12000r/min离心一分钟,尽量去除上清液,利用碱裂解法提取DNA,反复漂洗并离心,得到高质量的细菌基因组DNA,即为鉴定所用DNA模板,以通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和1492R(5’-TACGGCTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增,将扩增产物经电泳检测后由北京擎科生物科技有限公司成都分公司完成测序。将所得序列利用Seqman软件进行多序列比对及裁剪,上传到NCBI数据库并与其相关同源序列比对,用MEGA7.0软件采用邻接法(Neighbor Joining Method)构建菌株系统发育树。对Ab27菌株测序得到的16S rDNA序列提到NCBI数据库中进行同源性比对,进行BLASTn比对分析及利用MEGA 5.0软件的邻近法构建系统进化树(见图1)。
结果表明,Ab27鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株。寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.sp.)Ab27,生物保藏编号为:CCTCC M 2021355。保藏日期:2021年4月12日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:武汉大学。。
实施例2
本实施例所描述的解钾菌肥,包括实施例1所述解钾菌,还包括用于负载所述解钾菌的生物炭载体。在进一步的实施方式中,还包括钾矿粉。
生物炭载体的制备
采用限氧裂解法分别在300℃、500℃和700℃下制备玉米秸秆炭、小麦秸秆炭和稻壳炭。
稻壳炭电镜扫描图如图2,图2中RHC表示稻壳炭,RHC300表示采用限氧裂解法在300℃条件下制备得到的稻壳炭,RHC500表示采用限氧裂解法在500℃条件下制备得到的稻壳炭,RHC700表示采用限氧裂解法在700℃条件下制备得到的稻壳炭。
玉米秸秆炭电镜扫描图如图4,图4中MSC表示玉米秸秆炭,MSC300表示采用限氧裂解法在300℃条件下制备得到的玉米秸秆炭,MSC500表示采用限氧裂解法在500℃条件下制备得到的玉米秸秆炭,MSC700表示采用限氧裂解法在700℃条件下制备得到的玉米秸秆炭。
小麦秸秆炭电镜扫描图如图6。图6中WSC表示小麦秸秆炭,WSC300表示采用限氧裂解法在300℃条件下制备得到的小麦秸秆炭,WSC500表示采用限氧裂解法在500℃条件下制备得到的小麦秸秆炭,WSC700表示采用限氧裂解法在700℃条件下制备得到的小麦秸秆炭。
将寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株接入LB液体培养基的活化,将接入LB液体培养基的活化菌株按照5%接种量接入添加1%生物炭的牛肉膏蛋白胨培养基上,培养后固体用磷酸盐缓冲液反复洗涤、离心,冷冻干燥后得到生物炭固定化解钾菌复合材料C-KSB,利用MTT法检测生物炭上细胞存活情况以筛选出合适的载体。该复合材料C-KSB可以作为解钾菌肥C-KSB施用。
洗涤、离心为常规操作。冷冻干燥使用的冻干机型号为YB-FD-1,使用前先将冷冻干燥机预冷6h,温度达到-20℃到-35℃即可,设置条件为:打开真空泵抽真空,冷阱温度为-55℃,真空度为0.1pa,冷冻干燥时间为8-12h,冻干后的生物炭负载解钾菌菌粉放置于4℃低温保存。
负载有寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株的稻壳炭电镜扫描图如图3,图3中RHC300-KSB、RHC300-KSB、RHC300-KSB中,RHC表示稻壳炭,KSB表示寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株,300、500、700分别表示热解温度。
负载有寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株的玉米秸秆炭电镜扫描图如图5,图5中MSC300-KSB、MSC500-KSB、MSC700-KSB中,MSC表示玉米秸秆炭,KSB表示寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株,300、500、700分别表示热解温度。
负载有寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株的小麦秸秆炭电镜扫描图如图7。图7中WSC300-KSB、WSC500-KSB、WSC700-KSB中,WSC表示小麦秸秆炭,KSB表示寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株,300、500、700分别表示热解温度。
MTT比色法结果表明,玉米秸秆炭、小麦秸秆炭和稻壳炭3种生物炭材料均显著提高了寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株的细胞数量,各热解温度的玉米秸秆生物炭负载菌株的甲臜生成率随着培养时间的增加而提升。截至24h,以玉米秸秆500℃热解生物炭对甲臜的提升效果更显著,相较玉米秸秆300℃热解和700℃热解分别增加了40.9%和20%。
通过测量OD510nm吸光值,反应出生物炭对菌株细胞生长的影响,见下表2所示:
表2生物炭对菌株细胞生长的影响
Figure BDA0003469320710000061
注:*不同小写字母表示同一材料在同一热解温度下,吸光值在p<0.05水平上的差异显著;不同大写字母表示同一材料在不同热解温度下,吸光值在p<0.05水平上的差异显著。
通过扫描电子显微镜(SEM)(见图2至图7)与衰减全反射光谱(ATR-FTIR)(见图8)对生物炭材料的表面形貌结构和官能团特征观察发现,以玉米秸秆500℃热解对细胞的吸附程度最为显著,其良好的孔隙结构能为菌株细胞提供足够的生存空间,生物炭负载菌株后表面官能团的增加会促使生物炭表面负电荷的增加,从而增加生物炭对菌株的吸附力。图8中虚线表示生物炭原始材料,实线表示生物炭负载菌株的复合材料。
经过研究发现,采用限氧裂解法在500℃条件下制备得到的玉米秸秆炭,对本实施例中寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株的吸附效果最好。以下生物炭载体特指玉米秸秆炭。
将上述负载解钾细菌的生物炭装入无菌塑料袋,于4℃以下保存备用;或者将上述负载解钾细菌的生物炭与钾矿粉(钾长石粉)按1:1混合,装入无菌塑料袋,4℃以下保存备用。施用前调整其含水量为20%,活化菌株,后从而得到复合材料C-P-KSB。该复合材料C-P-KSB作为解钾菌肥C-P-KSB施用。
实施例3
本实施例为实施例2所述解钾菌肥C-KSB、解钾菌肥C-P-KSB的应用实施例。本实施例中,以黑麦草为试验对象,对本发明的技术效果进行说明。
1.1菌悬液(KSB)的制备
将甘油保藏的寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)菌株接入解钾固体培养基中,于30℃倒置培养5天,活化后的菌株接种至LB液体扩大培养基,于30℃、180r/min培养过夜,菌悬液于10000r/min离心10分钟,倾倒多余的培养液,利用无菌蒸馏水多次润洗并调整OD600值为1,按照5%的质量比施入土壤中。
1.2黑麦草种子的处理
选取籽粒大小均一的一年生黑麦草(Lolium perenne L.perenne L.)种子,称取所需种子量的1.5倍,加入去离子水搅拌浸泡2h,去除上层干瘪种子,加入3%双氧水浸泡30min,用去离子水冲洗干净并放入25℃培养箱24h,接入培养皿中培养1~2d,种子一端白芽生长约0.5cm时播种于盆栽中。
1.3盆栽试验设计
供试土壤采自雅安市雨城区老板山的酸性紫色土农田内,采集0~30cm深的土壤自然风干后,去除石砾等杂质过2mm筛保存备用。其基本理化性质:pH 4.01,全氮0.97g/kg,全磷0.19g/kg,速效磷1.88mg/kg,全钾8.08g/kg,缓效钾139.51mg/kg,速效钾42.74mg/kg。
试验在四川农业大学设施大棚内进行,试验设置7个处理(如表3所示),CK为空白对照,每盆装紫色土2kg,供试肥料为氯化钾(KCl,60%),基施尿素(N,46.2%)和过磷酸钙(P2O5,12%),每个处理重复3次。期间定期浇水,保持盆中无杂草生长,30d后进行收割,测定每茬作物生物量及土壤速效钾含量,每茬收获后,将盆土重新压碎过筛,并与剪碎为0.5~1cm的植株地下部混匀后装盆,重新施入尿素和过磷酸钙后播种下一茬黑麦草,连续种植5茬。
表3各组处理方法
Figure BDA0003469320710000071
注:+表示添加。
2数据处理
采用EXCEL 2016和SPSS 22.0进行试验数据处理,不同处理差异显著性分析采用单因素方差分析(最小显著差法LSD)。
2.1黑麦草生物量
接种解钾菌各处理均不同程度地促进了黑麦草的生长(见表4)。与CK相比,KSB处理的黑麦草生物量增加了32.95%,说明接种解钾菌对黑麦草有促生效果,C-KSB处理的黑麦草生物量增加121.90%,说明生物炭负载解钾菌促生效果较好,C-P-KSB处理的黑麦草生物量增加159.37%,表明生物炭协同钾矿材料对黑麦草的促生效果更好。与KCl相比,C-KSB、C-P-KSB处理的黑麦草生物量分别提高了58.44%、85.19%,说明解钾菌在生物炭及生物炭协同钾矿材料负载下对于黑麦草的促生效果显著,这有利于减少钾肥施用,缓解钾肥缺乏的矛盾。
表4各处理黑麦草生物量
Figure BDA0003469320710000081
注:*不同小写字母表示同一处理在不同种植茬数下,黑麦草生物量在p<0.05水平上的差异显著;不同大写字母表示不同处理在同一茬数下,黑麦草生物量在p<0.05水平上的差异显著。
2.2黑麦草吸钾量
不同施钾方式下各处理黑麦草吸钾量均得到显著提升(见表5)。在持续耗钾过程中,种植第1茬、第3茬、第5茬时,C-KSB、C-P-KSB处理黑麦草吸钾量均明显高于其余处理,说明生物炭负载解钾菌及生物炭协同钾矿材料负载解钾菌均能够显著提高黑麦草吸钾量,对于提高黑麦草吸钾量具有长期效应,且该作用能持续发挥,对土壤长期供钾潜力有着较好的正效应。
表5各处理黑麦草吸钾量
Figure BDA0003469320710000082
注:*不同小写字母表示同一处理在不同种植茬数下,黑麦草吸钾量在p<0.05水平上的差异显著;不同大写字母表示不同处理在同一茬数下,黑麦草吸钾量在p<0.05水平上的差异显著。
2.3添加解钾细菌对土壤速效钾的影响
连续盆栽耗钾试验后,不同施钾方式下各处理土壤速效钾含量均存在显著下降的趋势(见表6),添加解钾菌使土壤速效钾含量得到了提升。结果表明,C-KSB、C-P-KSB处理土壤速效钾含量均明显高于其他各组,且长期供应效果较好;C-P-KSB处理对土壤速效钾的提升效果最好,且表现出持续的速效钾供应潜力。与CK相比,KSB处理前3茬土壤速效钾含量没有显著差异,当种植至第四茬时,土壤速效钾含量有所上升,显著高于CK和KCl处理,原因可能是土壤中仍存活的KSB菌株持续释放了土壤中被固定的钾,进而增加了土壤中可溶性的钾含量。KCl处理的土壤速效钾含量仅在前三茬高于KSB处理,钾肥的持续效用并不长,施入土壤后能快速被作物吸收,作物的大量带走可能是导致土壤速效钾含量持续降低的原因。
表6各处理土壤速效钾含量
Figure BDA0003469320710000091
注:*不同小写字母表示同一处理在不同种植茬数下,黑麦草生物量在p<0.05水平上的差异显著;不同大写字母表示不同处理在同一茬数下,黑麦草生物量在p<0.05水平上的差异显著。
本发明从酸性紫色土中筛选得到的寡氧单胞菌具稳定的解钾性能,特备适用于酸性紫色土中。寡氧单胞菌菌液在提高土壤速效钾含量及促进黑麦草生长方面效果显著,具有开发利用潜力,为紫色土地区开发环境友好的生物菌肥提供了良好的菌种资源。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种解钾菌,其特征在于,所述解钾菌为寡养单胞菌属Stenotrophomonas sp. 菌株,保藏编号为CCTCC M 2021355。
2.一种解钾菌肥,其特征在于,包括权利要求1所述解钾菌,还包括用于负载所述解钾菌的生物炭载体。
3.根据权利要求2所述的解钾菌肥,其特征在于,所述生物炭载体为玉米秸秆炭、小麦秸秆炭或稻壳炭。
4.根据权利要求3所述的解钾菌肥,其特征在于,所述玉米秸秆炭是利用玉米秸秆采用限氧裂解法在300℃~800℃下制得;所述小麦秸秆炭是利用小麦秸秆采用限氧裂解法在300℃~800℃下制得;所述稻壳炭是利用稻壳采用限氧裂解法在300℃~800℃下制得。
5.根据权利要求4所述的解钾菌肥,其特征在于,所述解钾菌接入LB液体培养基的活化,然后按照5%接种量接入添加1%生物炭的牛肉膏蛋白胨培养基上,培养6~48h后,用固体用磷酸盐缓冲液反复洗涤、离心,再冷冻干燥,得到生物炭固定化解钾菌的复合材料。
6.根据权利要求5所述的解钾菌肥,其特征在于,所述冷冻干燥具体条件为:冷冻温度为-50℃~-60℃,真空度为0.05~0.3pa,冷冻干燥时间为8~12h。
7.根据权利要求2~6任一项所述的解钾菌肥,其特征在于,还包括钾矿粉,所述钾矿粉与负载有所述解钾菌的生物炭载体混合。
8.根据权利要求7所述的解钾菌肥,其特征在于,所述钾矿粉为钾长石粉。
9.根据权利要求7所述的解钾菌肥,其特征在于,所述钾矿粉与所述负载有所述解钾菌的生物炭按照重量比为1:1的比例混合。
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