CN110981591A

CN110981591A - 一种油茶专用促生肥料及其制备和应用

Info

Publication number: CN110981591A
Application number: CN201911325119.5A
Authority: CN
Inventors: 倪源; 刘君昂; 徐睿; 宋雨露
Original assignee: Hainan Keda Forestry Co ltd; Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Hainan Keda Forestry Co ltd; Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-04-10

Abstract

本发明公开了一种油茶专用促生肥料及其制备和应用，所述油茶专用促生肥料包括以下原料：菌糠、玉米粉、混合菌剂、微量元素以及化学肥料，所述混合菌剂由韩国假单胞菌、恶臭假单胞菌、格氏假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、分散泛菌组成。与现有技术相比，本发明提供的油茶专用促生肥料的配方合理，具有突出的溶磷、释钾和固氮的功效，显著促进油茶对于氮磷钾的吸收转化改良土壤结构，增加土壤的透气性和保水性，促进植物生长发育。经试验，使用本发明公开的油茶专用促生肥料能够显著缩短油茶的生长周期，并且健康状况良好。

Description

一种油茶专用促生肥料及其制备和应用

技术领域：

本发明属于油茶促生长技术领域，具体涉及一种新型油茶专用促生肥料及其制备方法及其在提高油茶品质中的应用。

背景技术：

油茶属山茶科山茶属植物，与椰子、棕榈、橄榄并称为世界4大木本油料植物。目前，我国油茶主要栽培品种为普通油茶，其次有小果油茶、博白大果油茶、越南油茶、腾冲红花油茶、广宁红花油茶、攸县油茶、贵州匹它山茶、多齿红山茶、浙江红花油茶等10余种。茶油色清味香，营养丰富，不饱和脂肪酸一般在90％以上，易于消化吸收，具有软化血管、促进骨骼发育、美容养颜、乌发健体等功效，是烹制食品、加工罐头、制造人造奶油最理想的油脂之一。除此之外，茶枯还可炼汽油、制沼气，是良好的有机肥料。

由于油茶施肥及后期管理中存在各种各样的问题，大部分油茶林栽培管理水平比较落后，产出比不高。提高油茶产量和品质，除了按照常规的培育出油茶优良品种外，其中林木的合理施肥及配方施肥是提高油茶产量的一项及其重要的措施。因此，采用合理适宜的方式施肥及后期管理有利于提高油茶的产投比，提高油茶种植的生态效益以及经济价值。

目前，有一些油茶栽培技术方案中有采用微生物的菌肥，例如：专利201310302372.5，公开了一种油茶专用生物菌肥的制备方法，其中使用的EM菌为有效微生物群的英文缩写，也叫益生菌，是光和菌、乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、醋酸菌、双歧杆菌、放线菌七大类微生物中的10属80种有益微生物共存的微生物群，可市购。溶磷菌为广州农冠生物科技有限公司生产的农冠2号溶磷菌。专利201710180720.4公开了一种油茶专用肥料，其中采用的生物菌为植物根际促生菌，包括芽孢杆菌属、假单胞菌属、荧光假单胞菌、黄杆菌属和固氮菌属中的一种或几种。但这些专利当中均没有把微生物之间的协同，或者拮抗作用研究清楚，更没有研究如何让这些微生物联合起来发挥最好的作用。

菌糠是利用秸秆、木屑等原料进行食用菌代料栽培，收货后的培养基剩余物，俗称食用菌栽培废料、菌渣或余料；是食用菌菌丝残体及经食用菌酶解，结构发生质变的粗纤维等成分的复合物。菌糠中含有大量的菌糠蛋白、多糖和微量元素。菌糠中的菌丝蛋白及微量元素等物质含量很丰富。菌糠中还检测到多种代谢产物如多种有肌酸、黄酮类物质、及少量生物碱等化学物质。为了实现食用菌菌糠的高效利用，将菌糠制备成肥料是一种合理有效的途径。食用菌生长过程中，菌糠会被逐渐分解，其中对植物生长有利的N、P、K等营养元素远远高于种植食用菌前的培养基质，易被农作物、树木吸收利用。因此，菌糠是一种非常好的培养基质，由功能菌与一定的菌糠混合发酵，能够利用微生物自身的生命活动很好的产生促进作物生长的物质，或将土壤中难溶的矿物质转化为作物可以利用的物质，从而增加肥效，促进油茶生长。

鲜少有人针对油茶种植土壤环境，选择合适的菌群搭配，高效的溶磷、解钾、固氮，从而极大促进油茶的生长。

发明内容：

为了解决以上问题，本发明的首要目的是提供一种油茶专用促生肥料，可用于油茶种植中。该油茶专用促生抗病肥料具有显著的溶磷、释钾和固氮功能，促进油茶对土壤中氮、钾、磷的吸收利用。促进了土壤微生物的繁殖，提高土壤速效氮磷钾以及有机质含量，从而促进油茶生长。

本发明通过以下技术方案得以实现：

一种油茶专用促生肥料，所述油茶专用促生肥料由菌糠菌肥和化学肥料混合而成；所述的菌糠菌肥是由混合菌剂与载体混合发酵而成；所述混合菌剂是由韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、格氏假单胞菌(Pseudomonas grimontii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、分散泛菌(Pantoea dispersa)混合。

所述的油茶专用促生肥料，所述的韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、格氏假单胞菌(Pseudomonas grimontii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、分散泛菌(Pantoea dispersa)按照1:1:1:1:2混合接种至载体中发酵。

所述的油茶专用促生肥料，有效菌总数至少5.3×10⁸个/g。

所述的油茶专用促生肥料，所述载体为菌糠：玉米粉：水重量比＝(20-30):(5-10):(60-75)；所述载体优选为菌糠：玉米粉：水重量比＝25:5:70。

所述的油茶专用促生肥料，所述载体还加入HN₄NO₃0.2％-0.4％、KH₂PO₄0.2％-0.4％；优选加入HN₄NO₃0.2％、KH₂PO₄0.2％。

所述的油茶专用促生肥料，所述载体选自自然风干凤尾菇后的20-80目新鲜菌糠；优选菌糠60目。

所述的油茶专用促生肥料，菌糠菌肥和化学肥料按照40-80％与20-60％的质量比例混合，优选将60％菌糠菌肥和40％化学肥料混合。

本发明的第二个目的是提供所述油茶专用促生肥料的制备方法。

将菌糠、玉米粉、HN₄NO₃、KH₂PO₄，水混合灭菌冷却后，接入活化后的韩国假单胞菌、恶臭假单胞菌、格氏假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、分散泛菌培养得到菌糠菌肥；然后将菌糠菌肥和化学肥料混合。

进一步的，包括以下步骤：

将新鲜菌糠自然风干，粉碎过筛，加入玉米粉，再加入HN₄NO₃、KH₂PO₄，培养基初始pH 7.0，三角瓶装载量300g/L，培养基初始含水量70％，121℃灭菌20min；待培养基冷却后，将活化后的韩国假单胞菌、恶臭假单胞菌、格氏假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌各1mL、分散泛菌取2mL，加入冷却的培养基中，33℃,160r/min恒温培养6d；

然后将60％菌糠菌肥和40％化学肥料混合，化学肥料由用量配比为2:1:2的尿素、钙镁磷肥及氯化钾构成。

本发明的第三个目的是提供上述油茶专用促生肥料的应用，所述油茶专用促生肥料能促进油茶的生长。

本发明的第四个目的是提供一种适合于固氮解钾菌的液体培养方法，碳源为葡萄糖，氮源为硝酸铵；温度为33℃，pH为7.2，装载量为30％，转速为160r/min；接种量为8％。

固氮解钾菌包括：韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、格氏假单胞菌(Pseudomonas grimontii)、分散泛菌(Pantoeadispersa)中的一种或多种。

本发明的第五个目的是提供一种适合于解磷菌的液体培养方法，碳源为葡萄糖，氮源为硝酸铵；温度为30℃；pH为7.2，装载量为30％，转速为160r/min；接种量为10％。

解磷菌包括：洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、分散泛菌(Pantoeadispersa)中的一种或几种。

本发明的增益效果：

本发明将韩国假单胞菌、恶臭假单胞菌、格氏假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、分散泛菌混合培养后加入载体，能够促进了土壤微生物的繁殖。本发明通过试验证实，能够提高土壤速效氮磷钾以及有机质含量，从而对于油茶的生长有明显促生作用。而且其中，韩国假单胞菌该菌株抑菌谱较广，能够抑制黑胫病菌、青枯病菌、赤星病菌的生长；酸性条件下拮抗活性强，能够产生嗜铁素。恶臭假单胞菌为高产铁载体的优势菌株，能合成分泌儿茶酚型铁载体。洋葱伯克霍尔德菌对土传病原菌—尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌均具有强拮抗作用。此外，本发明还提供了这些菌的最优培养条件。

虽然本发明的研发过程中筛选出几个菌株有较好的效果，但本发明依旧不仅仅限于这几个菌株，相同名称的其他常规菌株也能达到较好的效果。例如：韩国假单胞菌、恶臭假单胞菌、格氏假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、分散泛菌均可以在各大微生物保藏中心或者生物公司购买。说明本发明效果也体现在这几种名称的细菌的协同作用。

本发明技术方案的研发过程如下：

1、油茶根际土壤细菌nifH、ALP基因群落结构分析。

本发明采用高通量测序技术，以海南省澄迈县油茶幼林的根际特色土壤为样本，对氮、磷循环中两个重要的基因:固氮基因(nifH)和碱性磷酸酶基因(ALP gene)进行了Miseq文库的构建，并进行了油茶根际土壤细菌nifH、ALP基因群落结构分析。

试验结果：

(1)油茶根际土壤细菌nifH、ALP基因群落结构的多样性分析

在相似性水平为97％的条件下，对各样地的土壤细菌nifH、ALP基因多样性系数进行计算得出，ace指数表明细菌群落的OTU数目的种类依次为：20_1>20_2>20_3；chao指数表明各样地细菌的物种总数依次为：20_1>20_2>20_3。根据shannon指数和simpson指数，可以看出各样地细菌群落的多样性依次为：20_1>20_2>20_3。

(2)土壤细菌多样性指数与土壤性质的关系

油茶根际土壤理化性质与酶活相关性分析结果显示，土壤有机碳含量与土壤速效N、P、K含量及土壤ALP活性呈显著正相关(r分别为0.998、0.998、1.000、0.999)。而土壤pH与土壤有机碳、碱性磷酸酶活性、速效N、P、K含量呈负相关，(r分别为-0.998、-0.996、-0.992、-0.992、-0.999)。这可能是因为土壤有机质的增加促进了土壤微生物和土壤动物的繁殖，同时也促进了土壤功能菌的繁殖；而土壤碱性增强则会使土壤有效态养分含量降低，不利于植物的生长发育。

土壤细菌nifH与ALP基因多样性指数和土壤性质进行相关性分析结果表明，simpson指数与shannon指数、ace指数、chao指数负相关；simpson指数与土壤有机碳、速效氮、速效磷、速效钾含量、碱性磷酸酶活性含量显著正相关。

(3)油茶根际土壤细菌nifH、ALP基因群落结构分析

从门、纲、目三个水平对油茶根际土壤中具有ALP基因的细菌进行分析，发现它们主要分属于2个门(变形菌门和放线菌门)、4个纲(α-变形杆菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲和放线菌纲)、8个目(红螺菌目、伯克氏菌目、弗兰克氏菌目、根瘤菌目、假诺卡式菌目、粘球菌目、棒杆菌目及假单胞菌目)中。而土壤中的固氮细菌(具有nifH基因)主要分布于4个门(变形菌门、蓝细菌门、广古菌门、壁厚菌门)、4个纲(α-变形杆菌纲、β-变形菌纲、甲烷微菌纲、梭菌纲、及蓝细菌门未分类菌群、变形菌门未分类菌群)及6个目(伯克氏菌目、颤藻目、宽球藻目、甲烷八叠球菌目、根瘤菌目及梭菌目)中。除此之外，还有相当一部分的门类待定菌群。

通过高通量测序的方法对具有nifH、ALP基因的细菌群落结构进行分析，不仅揭示了该地区油茶根际土壤中固氮、解有机磷细菌的群落结构和数量特征，对优势种、属的鉴定对油茶根际高效固氮、解磷菌的筛选及油茶菌肥的选用有指导性意义。

2、油茶根际土壤高效功能菌株的分离筛选

综合多方因素考虑，筛选出菌株YC-NK07、YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-P05及YC-P06，进行鉴定。

菌株形态观察

在相应的培养基上，YC-NK05、YC-NK07菌落为乳白色，粘稠，生长速度较YC-NK03、YC-NK04快，YC-NK03菌落为乳白色，粘稠，边缘整齐；YC-NK04菌落为乳白色，表面光滑、边缘整齐，生长较慢；YC-P05菌落透明，表面光滑(后期呈淡黄色)，生长速度中等；YC-P06菌落呈淡黄色，不透明，生长较慢(图1)。

菌株的菌体形态见图2，菌株YC-NK05、YC-NK07、YC-NK03、YC-NK04、YC-P05及YC-P06革兰氏染色均呈阴性。其中YC-NK03为短杆菌，两端钝圆，散生排列，无芽孢，有荚膜，菌体大小为(0.5～0.8)×(1.3～2.2)μm。YC-NK04呈杆状，单个排列，大小为(0.5-1)μm×(1.4～4)μm。YC-NK05呈杆状，单个或成对排列，大小为(1.4～3)μm×(0.6～0.8)μm。YC-NK07、YC-P05呈杆状，单个排列，大小为0.4μm×(0.9～1.5)μm，革兰氏阴性。YC-P06呈杆状，单个或成对排列，大小为(1.4～2.1)μm×(0.6～0.8)μm；

根际土壤功能菌生理生化试验

表1土壤功能菌株主要生理生化特征

注：“—”表示阴性；“+”表示阳性。功能菌株16S rDNA序列测定及分析

测序所得的功能菌株16S rDNA序列长度均在1500bp左右，将各菌株序列在NCBI中进行BLAST同源性比较，同时与GenBank中的核酸数据进行对比分析。筛选出有较高同源性的代表菌株，以各根际土壤功能菌的16S rRNA序列为基础，构建各自的系统进化树。YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05菌聚于假单孢菌属的族群上，其中YC-NK04与韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)的遗传进化亲缘关系最近，YC-NK05与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的遗传进化亲缘关系最近，YC-NK03与格式假单胞菌(Pseudomonasgrimontii)的遗传进化亲缘关系最近(图4)。YC-NK07、YC-P05聚于泛菌属的族群上，与分散散菌(Pantoea dispersa)的遗传进化亲缘关系最近(图3、5)。YC-P06聚于伯克霍尔德菌属的族群上，与洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)的遗传进化距离最近(图6)。

试验结果：

(1)本发明从油茶不同林龄根际土壤中筛选高效固氮菌，共分离出可培养物368个。菌株YC-NK07、YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-N23的固氮酶活在1000nmol.h^-1.mL^-1以上。近年来，研究发现根际固氮微生物不仅具有固氮能力，还可溶解难溶性磷甚至分泌植物促生物质如有机酸、激素等。在本发明中20株固氮菌株具有固氮及分泌IAA的能力，YC-NK07、YC-NK03、YC-NK04和YC-NK05的固氮量在100mg/L以上，其分泌IAA的量分别为29.21ug/mL、15.42ug/mL、20.22ug/mL和18.23ug/mL。

(2)本发明从不同林龄的油茶根际中筛选高效解磷菌，共分离出87个可培养物，其中YC-P05和YC-P06无机磷溶量达到180mg/L以上，故选择这两个菌株作为菌肥发酵的目标菌株。溶磷圈法只能作为初筛解磷微生物的方法，D/d值不能完全反应菌株的解磷能力。本发明中，YC-P10的D/d值(1.45)小于YC-P11(2.75)，但YC-P10的无机磷溶量(36.77mg/L)却高于YC-P11(30.64mg/L)。Kucey等^[100]研究也证实了溶磷圈法只能用于初筛解磷菌。另外，不同根际解磷菌株的解磷能力存在较大差异，YC-P05溶解磷酸钙、卵磷脂的量分别是YC-P09的16.47倍和20.96倍。2株解磷菌的IAA分泌量在25ug/mL以上，菌株YC-P06的IAA分泌量为25.37ug/mL，YC-P11的IAA分泌量为25.22ug/mL。

(3)利用钾细菌富集培养基、钾细菌筛选培养基从油茶根际土壤中，共分离纯化纯培养物46个。利用火焰光度法，筛选出可溶性钾含量大于10的菌株共计16株，各菌株间解钾量差异不大，故选择固氮解钾菌YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-NK07作为菌肥发酵的目标菌株。

(4)观察高效功能菌株的形态学特征、测定其生理生化指标，并分析其16SrRNA序列。初步鉴定菌株YC-NK03为格式假单胞菌(Pseudomonas grimontii)，YC-NK04为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)，YC-NK05为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，YC-NK07、YC-P05为分散散菌(Pantoea dispersa)，YC-P06为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)。

将采用传统分离方法分离到的固氮解磷菌与采用高通量鉴定的结果进行对比，发现YC-P06(Burkholderia cepacia)属于伯克氏菌目(Burkholderiales)，是油茶根际土壤细菌(具有ALP基因)中的优势类群。而假单胞菌属(Pseudomonas sp.)虽为传统分离方法筛选出的高效固氮菌的优势菌种，在油茶根际土壤固氮菌群落中含量较少。

3、根际土壤高效功能菌株液体发酵优化

以本发明中分离纯化及筛选出的固氮解钾菌YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-NK07，解磷菌YC-P05、YC-P06为供试菌株，进行发酵优化，以提高菌群活性及菌体浓度。

试验结果：功能菌株生长曲线测定

将菌株YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-NK07、YC-P05及YC-P06，分别按5％的接种量接入相应的发酵培养基中，30℃，160r/min，培养48h，每隔4h取样一次，测定各菌株的OD值。经光谱扫描，菌株YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-NK07在610nm处吸光值最大，结果如图7所示。

从菌株培养开始计时，第8h后，4株固氮菌进入对数生长期。培养时间在24-36h时，菌株处于稳定期。4株固氮菌的生长曲线大体相同，培养时间在0至16h时，菌株YC-NK05增长较快，培养时间为16h至24h时，菌株YC-NK04增长速率较快，各菌株的生长曲线相互重叠，且在稳定期时菌体浓度相差不大，培养36h后4株菌株均进入衰退期，其中YC-NK04衰退速度最快。

菌株YC-P05、YC-P06在650nm处吸光值最大，结果如图8所示。从菌株培养开始计时，第8h后，菌株YC-P05进入对数期，20h进入稳定期。12h后，菌株YC-P06进入对数期，24h后处于稳定期。培养32h后，两菌株均转入衰退期，菌体浓度有交叉重叠。

功能菌株间的拮抗试验

在LB固体培养基上，各菌株在划线交叉处，均形成菌落且生长良好，无拮抗现象出现。见下表2。

表2不同菌株间拮抗关系

注：×表示同一菌株；-表示无明显的拮抗作用

功能菌组合的活性研究

将YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-NK07不同组合之间进行混菌培养。结果显示：YC-NK(03+04+05+07)的固氮、解钾量最高，分别达到206.77mg/L和24.62mg/L，说明YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-NK07混菌培养对于提高固氮、解钾活力具有协同增效作用。

解磷菌的组合实验结果表明，菌株YC-P(05+06)组合培养比YC-P05和YC-P06单株培养无机溶磷量更高，达到了220.51mg/L。说明YC-P05、YC-P06混菌培养能协同提高菌株的解磷能力。见下表3。

表3不同菌株组合的固氮、解磷、解钾活力

不同碳氮源对功能菌群活性及菌体浓度的影响

碳源、氮源是微生物生长、繁殖必须的营养物质，碳素为细胞提供碳架，提供细胞生命活动所需的能量。氮素则是核酸、蛋白质等含氮化合物的重要原料之一。不同微生物根据自身所产生的酶系不同，对不同的碳源的利用程度不同。同时，不同微生物的生长发育中代谢特征不同，对不同氮源的需求量也不尽相同。因此，在对微生物进行液体发酵条件优化时，研究不同碳、氮源对微生物生长的影响至关重要。根际生产实际，常用的碳源包括单糖(葡萄糖、果糖、甘露糖)、二糖(乳糖、蔗糖、麦芽糖)和多糖(淀粉)等；常用的氮源分为有机氮源(牛肉膏、蛋白胨等)和有机氮源，而无机氮源又包括铵盐和硝酸盐等。

选用葡萄糖、淀粉、果糖、蔗糖、甘露糖五种常用碳源，分别等量替换固氮菌群、解磷菌群、解钾菌的液体发酵基础培养基中的碳源，同时测定各试验组培养液中菌群活性及菌体浓度，结果如图9。

固氮解钾菌群菌群在不同碳源下的固氮、解钾活力依次为葡萄糖>蔗糖>果糖>甘露糖>淀粉。葡萄糖作碳源时，组合菌群的固氮活力高达203.45mg/L；而用淀粉替代后，菌群的固氮活力下降至31.39mg/L。以葡萄糖为碳源时，解磷菌群的菌体浓度、培养液的无机磷溶量最高；而以淀粉为碳源时，培养液中菌体浓度、无机磷溶量最低。组合菌群在不同碳源下的解钾活力依次为葡萄糖>果糖>蔗糖>甘露糖>淀粉，当以葡萄糖为碳源时，培养液中可溶性钾含量达到26.60mg/L，而解钾菌群对淀粉的吸收效果最差，培养液中可溶性钾含量仅为2.58mg/L。实验结果表明，结构简单的单糖和二糖更易被组合菌群吸收，进行细胞代谢活动。

不同氮源试验结果见图10。如图所示，在硝酸铵为氮源的液体培养基中，功能菌群固氮、解磷、解钾活力最高，且培养液中菌体浓度最高。实验结果表明，以铵盐(氯化铵)为氮源时，更有利于菌群的营养吸收。其次，硝酸盐(硝酸钠)的吸收效果好于有机氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉)。

高效功能菌株液体发酵条件优化

培养温度对功能菌活性及菌体浓度的影响

温度是影响微生物生长的最重要因素之一。温度对微生物的影响具体表现在温度通过影响酶的活性，影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。过低的培养温度会抑制细胞酶活性，而培养温度过高则会造成发酵周期缩短、菌体细胞过早衰老，细胞酶系失活、新陈代谢紊乱等不良后果。设定24℃、27℃、30℃、33℃、36℃、39℃6个梯度温度，并测定各试验组培养液的菌体浓度及菌群活性。如图11所示，在33℃时，固氮解钾菌群的菌体浓度，固氮、解钾活力最高。30℃时，溶磷菌群的菌体浓度和溶液中的无机磷溶量最高。

初始pH对功能菌群活性及菌体浓度的影响

不同种类的微生物具有不同的酶系，不同的酶系最适pH不同。因此，环境中pH过高或过低都会对微生物的生长代谢造成不良影响。在试验中，设置了6.6、6.9、7.2、7.5、7.8、8.1六个pH梯度实验，结果见图12。在pH值7.2左右时，功能菌群的固氮、溶磷、解钾活力及菌体浓度最大。

装液量对功能菌群活性及菌体浓度的影响

装液量通过影响发酵液中溶解氧的含量影响微生物的生长速率。装液量过大，发酵液中的溶解氧含量不足，微生物的生长速率下降；装液量不足，会导致发酵罐空间的浪费，增加生产成本。如图13所示，在装液量为30％时，功能菌群的固氮量，发酵液中可溶性钾含量，无机磷溶量及菌体浓度达到最大。

不同接种量对功能菌群活性及菌体浓度的影响

接种量通过影响发酵液中的菌体数量影响微生物的生长速率和菌群活性。接种量过大，菌体数量过多，微生物种内和种间竞争较大，营养物质和生存空间不足，不利于菌体的生长和繁殖；而菌体数量过少则会造成空间的浪费，生产成本的增加。见图14。

当设定8％的接种量时，固氮解钾菌群的菌体浓度、固氮活力、解钾活力最大。当设定10％的接种量时，解磷菌群的菌体浓度、发酵液中无机磷溶量最大。

不同转速对功能菌群活性及菌体浓度的影响

发酵时，不同的摇床转速通过影响摇床震荡频率和振幅大小影响发酵液中菌体分布的性和溶解氧的传递速率。如图15所示，设定160r/min的转速时，各菌群的菌体浓度达到最大，解磷菌群发酵液的无机磷溶量及固氮解钾菌群的固氮、解钾活力最高。

总结：

(1)测定并绘制各功能菌株的生长曲线，固氮解钾菌YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-NK07的生长曲线大体相同。在培养24h后，4株固氮菌株进入稳定期，且各菌株的菌体浓度差别不大，36h后三株菌株均转入衰退期。解磷菌株YC-P05、YC-P06分别在培养20h和24h后进入稳定期，培32h后转入衰退期。根据各菌株的生长曲线，当菌株进入稳定期时，各菌株的菌体浓度均维持在较高水平，适宜取样接种。

(2)菌株间拮抗关系实验结果表明，6株功能菌株相互之间均无拮抗性。研究固氮解钾菌组合、解磷菌组合的活性。结果显示，组合YC-NK(03+04+05+07)的固氮活力，菌液中的可溶性钾含量达到最高，分别为206.77mg/L和24.62mg/L。组合YC-P(05+06)培养液中无机磷溶量较菌株JT-P15、JT-P25单株培养更高，高达220.51mg/L。上述试验说明，4株固氮解钾菌、2株解磷菌混合培养对于提高菌群活性具有协同增效作用。

(2)单因素试验结果表明，固氮解钾、解磷、解钾菌群最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为硝酸铵；固氮解钾菌群最适温度为33℃，溶磷菌群最适温度为30℃；固氮解钾、解磷、解钾菌群最适pH为7.2，最适装载量为30％，最适转速为160r/min；固氮解钾菌群最适接种量为8％，溶磷菌群最适接种量为10％。

附图说明

图1为本发明的几个功能菌株的菌落形态；

图2为本发明的几个功能菌株的菌体形态；

图3为依据16SrRNA基因序列构建的YC-NK07的系统发育树；

图4为依据16SrRNA基因序列构建的YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05的系统发育树；

图5为依据16SrRNA基因序列构建的YC-P05的系统发育树；

图6为依据16SrRNA基因序列构建的YC-P06的系统发育树；

图7为本发明液体培养时的固氮解钾菌的生长曲线；

图8为本发明液体培养时的解磷菌的生长曲线；

图9为本发明液体培养时不同碳源对菌群活性的影响；

图10为本发明液体培养时不同氮源对组合菌群的影响；

图11为本发明液体培养时不同温度对土壤功能菌的影响；

图12为本发明液体培养时不同pH值对土壤功能菌的影响；

图13为本发明液体培养时不同装液量对土壤功能菌的影响；

图14为本发明液体培养时不同接种量对土壤功能菌的影响；

图15为本发明液体培养时不同摇床转速对土壤功能菌的影响；

图16为本发明半固体发酵培养时含水量对菌体数量的影响；

图17为本发明半固体发酵培养时颗粒大小对菌体数量的影响；

图18为施用本发明生物复合肥对油茶苗高、地径的影响；

图19为施用本发明生物复合肥对油茶根际土壤微生物总量的影响；

图20为施用本发明生物复合肥对油茶根际土壤有机质的影响；

图21为施用本发明生物复合肥对油茶根际土壤速效氮的影响；

图22为施用本发明生物复合肥对油茶根际土壤速效磷的影响；

图23为施用本发明生物复合肥对油茶根际土壤速效钾的影响；

图24为施用本发明生物复合肥对油茶幼林树高、地径的影响；

图25为施用本发明生物复合肥对油茶根际土壤微生态效应指标的影响。

具体实施方式：

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

药品及试剂

菌糠(由上林县明山菌业有限责任公司提供)、玉米粉

功能菌和培养基

供试菌：菌株YC-NK03、YC-NK04、YC-NK05、YC-NK07、YC-P05、YC-P06

供试培养基：

(1)Ashby液体培养基：

(2)PKO无机磷液体培养基：

(3)半固态发酵基础培养基：以一定比例的菌糠、玉米粉进行混合作为发酵培养基的固体部分，以一定添加量水作为发酵培养基的液态部分，菌糠：玉米粉：水＝25:5:70。

主要实验仪器

电热鼓风干燥箱(DGG-9240A)北京恒泰丰科试验设备有限公司

新华高压蒸汽灭菌器(LMQ.C-50E)济南来宝医疗器械有限公司

HNY-211恒温振荡培养箱江苏中和实验仪器制造有限公司

菌群的培养

将4株固氮解钾菌，2株解磷菌活化后，以10％的接种量分别接种在pH为7的Ashby液体培养基、PKO无机磷液体培养基中，30℃，160r/min培养至菌体25亿/mL备用。

含水量对半固态混菌发酵的影响

分别配制含水量为50％、60％、70％和80％的半固态发酵基础培养基，将混合后的固氮解钾菌和解磷菌各取1mL接种到不同含水量的培养基中，33℃160rpm恒温振荡培养6d。准确称取10g发酵样品，放入250mL锥形瓶中，加入10颗玻璃微球和100mL无菌蒸馏水，静态浸泡20min后在恒温摇床中160rpm振荡30min，即可得到菌悬母液。稀释母液到10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度，吸取三个稀释度的样品溶液各100μL，分别注入到对应的筛选培养基表面，用无菌玻璃三角刮均匀涂布。涂布完毕后将平板倒置于生化培养箱中，33℃培养，计算有效活菌数。

颗粒大小对半固态混菌发酵的影响

菌糠粉碎后过20、40、60、80目筛，配制颗粒大小不同的半固态发酵培养基。

将混合后的固氮解钾菌和解磷菌各取1mL接种到半固态发酵基础培养基中，33℃160rpm恒温振荡培养6d。准确称取10g发酵样品，放入250mL锥形瓶中，加入10颗玻璃微球和100mL无菌蒸馏水，静态浸泡20min后在恒温摇床中160rpm振荡30min，即可得到菌悬母液。稀释母液到10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度，吸取三个稀释度的样品溶液各100μL，分别注入到对应的筛选培养基表面，用无菌玻璃三角刮均匀涂布。涂布完毕后将平板倒置于生化培养箱中，33℃培养，计算有效活菌数。

菌糠菌肥的制作

将采收凤尾菇后的新鲜菌糠自然风干，粉碎过筛(颗粒大小60目)备用，玉米粉备用，混合得到半固态发酵基础培养基，然后加入0.2％的HN₄NO₃、0.2％的KH₂PO₄，培养基初始pH 7.0，装载量300g/L，养基初始含水量70％，121℃灭菌20min。待培养基冷却后，将活化后的固氮解钾菌、解磷菌各取1mL，加入半固态发酵培养基中，33℃,160r/min恒温培养6d。将菌肥储存于阴凉无污染的条件下，用平板稀释计数法检测其中有效菌数。

生物复合肥的盆栽实验

(1)供试土壤

供式土壤来自合肥丽科农业有限公司的育苗基质。

(2)供试苗木

江西长林系列高产0.5a生，由江西新余亚林中心长埠林场提供。

(3)菌糠菌肥对油茶生长的影响

为了研究菌糠菌肥对油茶的肥效及替代化学肥料的程度，本实验按照替代化学肥料不同梯度，设置七个处理(每株10g)：T1：完全菌糠菌肥；T2：菌糠菌肥(80％)+化学肥料(20％)；T3：菌糠菌肥(60％)+化学肥料(40％)；T4：菌糠菌肥(40％)+化学肥料(60％)；T5：完全菌糠基质(不添加功能菌)；T6：完全化学肥料；Tck：不施肥。

每个实验组油茶苗木9株，共计63株。从施肥日算起，3月后测定植株根际微生态效益。检测的主要指标包括：油茶的地径、苗高及根际土壤微生物总量、土壤有机质及速效N、P、K含量。

田间试验

(1)肥料种类

①菌糠菌肥

②化肥：N肥:以湖南株洲湘江氮肥厂生产的尿素，含N量≥460g.kg^-1；P肥:以湖南浏阳古港磷肥厂生产的钙镁磷肥，含P₂O₅量≥126g kg-1；K肥：以加拿大进口的氯化钾，K₂O含量≥600g.kg^-1；

(2)试验地概况

试验地设在海南省澄迈县国营林场，施肥对象为3a生油茶幼林，施肥时间为2017年4月30日。

(3)处理配方设计

本试验共设置三个处理见表4:(1)对照(CK)，不施任何肥料；(2)化肥处理(HC)；(3)化肥(40％)+菌肥(60％)(HJC)

表4不同处理的施肥用量

每个处理设置油茶5株，共计15株。从施肥日算起，3月后测定植株根际微生态效益。检测的主要指标包括：油茶的地径、树高及根际土壤pH及速效N、P、K含量。

含水量对半固态混菌发酵的影响

水是生物体的重要组成部分，参与新陈代谢，是良好的溶剂，溶解各种营养物质和代谢废物。水在细胞中含量越高，细胞的新陈代谢就越旺盛。因此，在一定范围内，菌体数量随着培养基含水量的增加而增加，但含水量过高可能会导致培养基内营养物质的浓度降低，不利于菌体的繁殖。综合各项因素，结果如图16所示，确定半固态混菌发酵培养的最佳含水量为70％。

颗粒大小对半固态混菌发酵的影响

在半固态发酵中，颗粒直径大小是影响培养基内空气流通的一个重要因素。合适的颗粒大小可以增加培养基的溶氧量，增加菌体的繁殖速率。如图17所示，当菌糠颗粒直径为60目时，菌体数量达到最大。因此确定60目为最佳颗粒直径。

菌糠菌肥质量检测

表5表菌糠菌肥质量指标检测

注：“+”表示已污染，“-”表示未污染

生物复合肥对油茶苗木生长的影响

与施用生物复合肥前相比，T1组、T2组、T3组、T4组、T5组、T6组的苗高分别增加了40.92％、74.32％、108.64％、90.33％、28.56％、30.77％。各试验组的地径与施肥前相比，均有不同程度的增加。T1组、T2组、T3组、T4组、T5组、T6组的地径增幅分别为22.24％、28.77％、45.62％、32.50％、15.40％、16.85％。而Tck组苗高和地径的增加量仅4.56％和10.70％。见图18。

盆栽实验微生态效应指标检测

生物复合肥对油茶根际土壤微生物总量的影响

施用生物复合肥后，与Tck组的土壤微生物总量相比，T3组增加了70.41％，T4组增加了62.32％，T2组增加了43.88％，T1组增加了32.85％，T5组增加了27.35％，而T6组(化肥组)仅增加了7.57％。这说明施用微生物复合肥能够很好的促进了土壤微生物的繁殖。见图19。

生物复合肥对油茶根际土壤有机质的影响

施用生物复合肥后，与Tck组土壤有机质含量相比，T1组增加了97.65％，T5组增加了89.92％，T2组增加了85.78％，T3组增加了83.26％，T4组增加了66.77％，而T6组(化肥组)仅增加了23.75％。分析各组测定数据发现，菌糠菌肥与化学复合肥的质量配比越大，施用后土壤有机质的含量越高。见图20。

生物复合肥对油茶根际土壤速效氮的影响

施用生物复合肥后，与Tck组的速效氮含量相比，T3组增加了101.55％，T4组增加了83.77％，T2组增加了65.24％，T1组增加了40.62％，T5组增加了28.88％，T6组增加了27.41％。见图21。

生物复合肥对油茶根际土壤速效磷的影响

施用生物复合肥后，与Tck组的速效磷含量相比，T3组增加了118.44％，T4组增加了101.65％，T2组增加了82.34％，T1组增加了55.30％，T5组增加了40.77％，T6组增加了33.86％。见图22。

生物复合肥对油茶根际土壤速效钾的影响

施用生物复合肥后，与Tck组的速效钾含量相比，T3组增加了25.93％，T4组增加了22.83％，T2组增加了21.65％，T1组增加了20.07％，T6组增加了18.76％，T5组增加了18.63％。见图23。

生物复合肥对油茶幼林生长量的影响

与施肥前相比，各实验组的树高和地径均有不同程度的增加。其中HC、HJC组的树高平均增长量为4.6cm、6.9cm，地径平均增长量为3.16mm、5.28mm。而Ck组的树高、地径增长量仅为2.6cm、1.34mm。见图24。

田间试验微生态效应指标检测

如图25所示，油茶根际土壤呈酸性，pH为4.28-4.47，肥料种类与用量对土壤pH无显著影响。与施肥前相比，HJC组与HC组的土壤速效N、P、K含量均有显著增加。与CK组相比，HC组的土壤速效N、P、K分别增加了21.71％、25.81％、29.77％，达到42.60mg.kg^-1、12.16mg.kg^-1、26.50mg.kg^-1；HJC组的土壤速效N、P、K分别增加了71.71％、81.84％、45.79％，达到了60.10mg.kg^-1、17.58mg.kg^-1、29.77mg.kg^-1。与盆栽实验相比，HJC组的土壤速效N、P、K含量增加幅度较小，这可能是因为海南多变的气候条件影响了功能菌的繁殖。

小结

(1)将筛选出的高效功能菌株应用于菌糠菌肥的研制。采用半固体培养基混菌发酵。在半固态发酵基础培养基的基础上(菌糠：玉米粉：水＝25:5:70)加入0.2％的HN₄NO₃、0.2％的KH₂PO₄，调节初始pH为7.0，装载量为300g/L。单因素实验可知：半固态混菌发酵的最佳含水量为70％，菌糠最佳颗粒大小为60目。最终制成菌糠菌肥有效活菌数为5.3×10⁸个/g，pH值为6.85。

(2)盆栽实验结果显示，T3组(60％菌糠菌肥+40％化学肥料)对油茶的促生效果最明显。其中T3组的苗高、地径比施用前增加了108.64％、45.62％，同时各试验组的微生态效应指标变化显著。油茶各试验组与对照组Tck组相比，T3组的各项指标总体变化最大。T3组的土壤微生物总量增加了70.41％，达到12.42×10⁵个/g；速效氮增加了101.55％，达到107.04mg.kg^-1；速效磷增加了118.44％，达到19.05mg.kg^-1，速效钾增加了18.63％，达到45.18mg.kg^-1。但土壤有机质含量T1组增幅最大，较Tck组增加了97.65％，达到40.02mg.kg^-1，说明菌糠菌肥与化学复合肥的质量配比越大，施用后土壤有机质的含量越高。

(3)通过上述试验，初步确定了菌糠菌肥与化学复合肥的最佳配比为6:4。为了进一步验证生物复合肥的肥效，采用此最优配比进行田间试验，田间试验选用化学复合肥(尿素、钙镁磷肥及氯化钾，用量配比为2:1:2)，与100％化肥处理(HC组)和不施肥(CK)组做对比，实验结果表明,与施肥前相比，各实验组的树高和地径均有不同程度的增加。其中HJC组的树高地径平均增长量分别为6.9cm、5.28mm，HC组的树高地径平均增长量分别为4.6cm、3.16mm，而Ck组的树高、地径增长量仅为2.6cm、1.34mm。微生态效应指标测定结果显示：油茶根际土壤呈酸性，肥料种类与用量对土壤pH无显著影响；与CK组相比，HC组的土壤速效N、P、K分别增加了21.71％、25.81％、29.77％，达到42.60mg.kg^-1、12.16mg.kg^-1、26.50mg.kg^-1；HJC组的土壤速效N、P、K分别增加了71.71％、81.84％、45.79％，达到了60.10mg.kg^-1、17.58mg.kg^-1、29.77mg.kg^-1。与盆栽实验相比，生物复合肥的施用对土壤速效N、P、K含量增加幅度较小，这可能是因为海南多变的气候条件影响了功能菌的繁殖。

Claims

1.一种油茶专用促生肥料，其特征在于，所述油茶专用促生肥料由菌糠菌肥和化学肥料混合而成；所述的菌糠菌肥是由混合菌剂与载体混合发酵而成；所述混合菌剂是由韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、格氏假单胞菌(Pseudomonas grimontii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、分散泛菌(Pantoea dispersa)混合；

优选：所述的韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、格氏假单胞菌(Pseudomonas grimontii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)、分散泛菌(Pantoea dispersa)按照1:1:1:1:2混合接种至载体中发酵。

2.根据权利要求1所述的油茶专用促生肥料，其特征在于，有效菌总数至少5.3×10⁸个/g。

3.根据权利要求1所述的油茶专用促生肥料，其特征在于，所述载体为菌糠：玉米粉：水重量比＝(20-30):(5-10):(60-75)；所述载体优选为菌糠：玉米粉：水重量比＝25:5:70。

4.根据权利要求3所述的油茶专用促生肥料，其特征在于，所述载体还加入HN₄NO₃0.2％-0.4％、KH₂PO₄0.2％-0.4％；优选加入HN₄NO₃0.2％、KH₂PO₄0.2％。

5.根据权利要求1所述的油茶专用促生肥料，其特征在于，所述载体选自自然风干凤尾菇后的20-80目新鲜菌糠；优选菌糠60目。

6.根据权利要求1所述的油茶专用促生肥料，其特征在于，菌糠菌肥和化学肥料按照40-80％与20-60％的质量比例混合，优选将60％菌糠菌肥和40％化学肥料混合。

7.一种权利要求1-6任一项所述油茶专用促生肥料的制备方法，其特征在于，将菌糠、玉米粉、HN₄NO₃、KH₂PO₄，水混合灭菌冷却后，接入活化后的韩国假单胞菌、恶臭假单胞菌、格氏假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、分散泛菌培养得到菌糠菌肥；然后将菌糠菌肥和化学肥料混合；

优选：包括以下步骤：

将新鲜菌糠自然风干，粉碎过筛，加入玉米粉，再加入HN₄NO₃、KH₂PO₄，培养基初始pH7.0，三角瓶装载量300g/L，培养基初始含水量70％，121℃灭菌20min；待培养基冷却后，将活化后的韩国假单胞菌、恶臭假单胞菌、格氏假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌各1mL、分散泛菌取2mL，加入冷却的培养基中，33℃,160r/min恒温培养6d；

8.一种权利要求1～6任一项所述油茶专用促生肥料的应用，其特征在于，所述油茶专用促生肥料能促进油茶的生长。

9.一种适合于固氮解钾菌的液体培养方法，其特征在于，碳源为葡萄糖，氮源为硝酸铵；温度为33℃，pH为7.2，装载量为30％，转速为160r/min；接种量为8％。

10.一种适合于解磷菌的液体培养方法，其特征在于，碳源为葡萄糖，氮源为硝酸铵；温度为30℃；pH为7.2，装载量为30％，转速为160r/min；接种量为10％。