KR20080098246A

KR20080098246A - 재조합 대장균을 이용한 라이코펜 생산 방법

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Publication number: KR20080098246A
Application number: KR1020070043682A
Authority: KR
Inventors: 조남륜; 박민수; 이동현; 정호승; 김종근
Original assignee: 에스케이에너지 주식회사; 아미코젠주식회사
Priority date: 2007-05-04
Filing date: 2007-05-04
Publication date: 2008-11-07
Anticipated expiration: 2027-05-04
Also published as: US8828697B2; WO2008136632A1; US20100227370A1; CN101861384A; US20120295322A1; KR101441613B1; US8232083B2

Abstract

본 발명은 라이코펜의 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터를 이용하여 제조된 재조합 균주를 이용한 높은 생산성을 갖는 라이코펜의 생산방법에 관한 것으로, 라이코펜 생합성 관련 유전자인 crtE, crtB, crtI 을 포함하되, 상기 유전자 crtE, crtB 및 crtI 중 적어도 하나는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 crtE, 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 crtB, 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 crtI 로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 대장균에 형질도입하는 단계; 및 형질도입된 대장균 형질전환체를 배양하여 그 배양액으로부터 라이코펜을 회수하는 단계를 포함하는 라이코펜의 생산 방법이 제공된다.

본 발명의 재조합 대장균을 배양하면 최대 1.75 g/L의 수율과 36.5 mg/L/hr의 단위시간당 생산성이 획득되며, 새로운 crtE, crtB, crtI 유전자와의 조합 및 메발론산 경로의 도입으로 인해 공지 연구결과에 비해 높은 단위시간당 생산성을 가진 라이코펜 생산 균주가 제공된다. 또한 상기 균주를 이용한 발효 배양 방법을 개발함으로써, 라이코펜을 비롯한 카로티노이드의 대량 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

카로티노이드, 라이코펜, 대장균, 해수의 메타게놈, crtE, crtB, crtI, idi, 메발로네이트 경로

Description

재조합 대장균을 이용한 라이코펜 생산 방법{Method for producing Lycopene using recombinant Escherichia coli}

도 1은 라이코펜의 생합성 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 재조합 벡터 pSANF의 구조를 도시한 것이다.

도 3은 재조합 벡터 pT5-ErEBI 의 구조를 도시한 것이다.

도 4는 재조합 벡터 pT5-LYC-idi 의 구조를 도시한 것이다.

도 5는 재조합 벡터 pT5-ErBI의 구조를 도시한 것이다.

도 6은 재조합 벡터 pT-EF5의 구조를 도시한 것이다.

도 7은 재조합 벡터 pT-RF5의 구조를 도시한 것이다.

도 8은 재조합 벡터 pT-SF5의 구조를 도시한 것이다.

[서열목록의 간단한 설명]

서열번호 1은 해수의 메타게놈에서 유래한 crtE 유전자의 염기서열 (867 bp)이다.

서열번호 2는 crtE 유전자에 의해 코딩되는 제라닐제라닐 피로인산 합성효소 (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase)의 아미노산 서열(288개)이다.

서열번호 3은 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtB 유전자의 염기서열(909 bp)이다.

서열번호 4는 crtB 유전자에 의해 코딩되는 피토엔 합성효소(Phytoene synthase)의 아미노산 서열(302개)이다.

서열번호 5는 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtI 유전자의 염기서열(1,485 bp)이다.

서열번호 6은 crtI 유전자에 의해 코딩되는 피토엔 디세튜레이즈(Phytoene desaturase)의 아미노산 서열(494개)이다.

서열번호 7은 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides) crtE 유전자의 염기서열이다.

서열번호 8은 시네코시스티스(Synechocystis sp.) PCC 6803 crtE 유전자의 염기서열이다.

본 발명은 라이코펜의 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 형질전환된 균주를 통해 라이코펜을 고농도로 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라이코펜 생합성에 필요한 유전자로서 신규한 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 조합으로 라이코펜 생합성 유전자들을 도입하여 제조한 벡터로 형질전환된 대장균(Escherichia coli)을 특정한 배양조건 하에서 발효 배양하여 생산성이 향상된 라이코펜의 생산방법에 관한 것이다.

화학식 1의 구조를 갖는 라이코펜은 1kg의 토마토에서 0.02g 정도 얻어지며, 토마토, 수박, 포도 등에 붉은 색소의 본체를 이루고 있는 극성이 대단히 낮은 지용성 물질로 강력한 항산화, 항암 작용을 한다.

그 동안의 연구 결과를 살펴보면, 지난 2000년 미국 디트로이트 캘마노즈 암센터의 오머팀에서 라이코펜이 전립선 암 전이 억제를 한다는 연구 성과를 발표하였다 (Omer Kucuk et al., Cancer Epidemiology, 10, 861-869, 2001). 이스라엘 텔아비브의 하샤론 병원 알러지교실과 라이코펜 전문 메이커인 라이코레드사(LycoRed)는 운동 유발성 천식 환자(Exercises-induced asthma)를 대상으로 천식 증상 완화 효과를 확인하였다(I. Neuman et al., Allergy, 55, 1184-1189). 또한 핀란드 쿠오피오대학의 공중 보건학 교실에서는 심근 질환 및 죽상 동맥경화에 라이코펜이 탁월한 보호 효과를 갖는 것을 임상 실험 결과로 얻었다(Tiina Rissanen et al., Exp Biol Med (Maywood)., 227, 900-907, 2002).

상기와 같이 카로티노이드의 우수한 효과들이 확인됨에 따라, 라이코펜은 그 수요가 점차 증대되고 있으며, 천연물에서 직접 추출하는 방법, 유기 화학합성 방법에 의해 생산되고 있으며, 최근 미생물을 이용한 생산방법에 대한 연구가 활발하다. 특히, 미생물 배양을 통한 발효 방법의 경우 라이코펜을 생산하지 않는 균주에 라이코펜 생합성 관련 유전자를 도입하여 라이코펜을 생산하는 방법과 베타 카로틴이나 아스타잔틴과 같이 라이코펜을 중간체로 가지는 카로티노이드를 생산하는 균주의 라이코펜 시클라제(Lycopene cyclase)의 활성을 저해시켜 라이코펜을 생산하는 방법이 있다.

라이코펜의 생합성 과정은 도 1과 같다.

포도당(Glucose)이나 글리세롤(Glycorol)은 2-C-메틸-D-에리트리톨-4-인산 경로 (2-C-Methyl-D-eythritol-4-phosphate pathway, 이하 MEP 경로) 또는 메발론산 경로 (Mevalonate pathway, 이하 MVA 경로)와 같은 대사경로를 거쳐 이소펜테닐 피로인산(Isopentenyl pyrophosphate, 이하 IPP)나 다이메틸아릴 피로인산(Dimethylallyl pyrophosphate, 이하 DMAPP)로 바뀐다. 본 발명에서는 MVA 경로를 도입하여 IPP(Isopentenyl pyrophosphate)를 생합성하였다. MVA 경로에서는 포도당이나 글리세롤에서 유래한 글리세린알데히드-3-인산(Glyceraldehyde-3- phosphate)이 아세틸-코에이 (Acetyl-CoA)로 전환되고, 아세틸-코에이는 아세토아세틸-코에이 (Acetoacetyl-CoA), 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임에이 (3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A, 이하 HMG-CoA), 메발론산(Mevalonate), 메발론산-5-인산(Mevalonate-5-phosphate), 메발론산-5-이인산 (Mevalonate-5-diphosphate)를 거쳐 IPP로 합성된다. 이 과정에서 필요한 효소들을 암호화하는 유전자들이 atoB , mvaS, mvaA , mvaK1 , mvaK2 및 mvaD이다. 이렇게 합성된 IPP 는 몇 단계를 거쳐 일반적인 이소프레노이드 경로의 중요한 중간 생성물인 파네실 피로인산(Farnesyl pyrophosphate, 이하 FPP)가 된다. FPP는 제라닐제라닐 피로인산(Geranylgeranyl pyrophosphate, 이하 GGPP)로 되고, 다시 GGPP는 피토엔(Phytoene)이 되며, 피토엔은 라이코펜으로 된다. 이 과정의 효소는 crtE, crtB 및 crtI에 의해 암호화되어 있다.

상기와 같이 카로티노이드의 공통 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)의 생합성 경로로서 메발론산 경로(Mevalonate pathway) 및 비메발론산 경로(Non-mevalonate pathway)가 알려져 있으며, 메발론산 경로는 대부분의 진핵 생물(예컨데, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)), 식물 세포의 세포질, 일부 박테리아(예컨데, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 및 파라코커스 제악산티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens)) 및 말라리아 세포에 존재하는 것으로 알려져 있다. 비메발론산 경로는 대부분의 박테리아(예 대장균), 식물 세포의 색소체(plastid)에 존재한다. 즉 그람 음성 박테리아인 대장 균(E. coli)의 경우 비메발론산 경로만을 이용하여 IPP를 생합성한다. 그러나, 야생형의 대장균은 라이코펜을 포함한 카로티노이드 생합성에 관련되는 유전자를 가지고 있지 않기 때문에, 라이코펜을 생산할 수 없다.

먼저 라이코펜 비생산 균주에서의 라이코펜의 생산에 관한 연구들에서는 주로 라이코펜 생합성 유전자를 새로 발견하거나 기존의 유전자를 이용한 조합에 관련된 연구들이 많으며, 이 유전자들을 이용해 대장균이나 효모등에서 라이코펜의 생합성의 확인에 초점이 맞추어져 있다. 로슈 비타민사(Roche Vitamins, Inc)에서는 플라보박테리움 R1534(Flavobacterium sp. R1534) 종에서 유래한 crtB, crtI , crtE를 도입하여 라이코펜 함량이 0.5 mg/gDCW인 대장균을 만들었으며(Luis Pasamontes and Yuri Tsygankov, US20040058410, 2004), 아모코사(Amoco Corporation)에서는 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola)에서 유래한 crtI를 이용하여 효모에서 0.1 mg/gDCW의 함량을 갖도록 하였다(Ausich, Rodney L. et al., US5,530,189, 1996). 기린 맥주사(Kirin Beer Kabushiki Kaisha)에서는 에르위니아 우레도브라(Erwinia uredovora)에서 유래한 crtE , crtI , crtB 유전자를 이용하여 미생물에서 라이코펜을 생산하여 함량이 2.0 mg/gDCW인 대장균을 확보하였다(Norihiko Misawa et al., US 5,429,939, 1995). 또한 에르위니아 우레도브라 유래의 crtE , crtB , crtI 유전자와 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 유래의 HMG-CoA 환원효소를 생산하는 유전자를 이용하여 캔디다 유틸리스 IFO 0988을 형질전환하고 이를 배양한 결과, 2.9 mg/gDCW의 라이코펜 함량을 갖는 균주를 제조하였 다(Norihiko Misawa et al., J. of Biotechnology, 59, 169-181, 1998). 최근 세균인 아그로박테리움 오란티아컴(Agrobacterium aurantiacum), 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola) 또는 에르위니아 우레도보라(Erwinia uredovora)로부터 클로닝된 카로티노이드 유전자 crtE(GGPP 신타아제 코딩), crtB(피토엔 신타제 코딩) 및 crtI(피토엔 디새츄라제 코딩)을 대장균에 도입하여 얻어지는 재조합 대장균이 라이코펜의 생합성능을 가진다는 것이 개시된 바 있다.(미국 특허 제6,706,516호: Misawa and Shimada, J.Biotechnol., 59:169-181, 1998)

그러나 상기의 연구들에 언급된 수율은 매우 낮기 때문에 경제적인 생산 공정의 개발이 쉽지 않다. 이를 해결하기 위해 본 발명에서는 신규 유전자 및 높은 생산성을 갖는 유전자 조합을 이용하며, 대장균에 메발론산 경로에서 필요한 효소들을 암호화하는 유전자들인 atoB , mvaS , mvaA , mvaK1 , mvaK2 및 mvaD를 도입함으로써, 형질전환된 미생물을 이용한 생산성이 향상된 라이코펜 생산 방법을 제공한다.

즉, 본 발명은 라이코펜의 생산성 향상을 위한 연구를 수행한 결과, 해수의 메타게놈에서 라이코펜 생합성에 관련된 유전자 중 crtE , crtB 및 crtI 유전자를 분리하고, 상기 crtE , crtB 및 crtI 유전자를 클로닝하여 그의 염기서열을 규명하고, 이 유전자를 벡터에 도입하여 라이코펜을 생산하지 않는 미생물에서 라이코펜을 생산할 수 있도록 하였으며, 신규 유전자와 공지 유전자의 조합으로서 라이코펜 의 생산성이 향상되도록 하였다. 그리고, 대장균에서 메발론산 경로의 이용이 가능하도록 메발론산 경로와 관련된 유전자를 대장균에 도입함으로써, 라이코펜의 생산성이 더욱 향상되게 하였다. 또한, 발효방법을 개발하여 특정한 조건에서 상기 재조합 미생물을 이용하여 라이코펜을 고농도로 생산할 수 있는 방법을 제시하여, 기존의 연구에 비해 높은 단위시간당 생산성을 확인하였으며, 본 발명은 이를 기초로 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 라이코펜 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 신규 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 재조합된 균주에서 라이코펜을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

라이코펜 생합성 관련 유전자인 crtE, crtB, crtI 을 포함하되, 상기 유전자 crtE, crtB 및 crtI 중 적어도 하나는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 crtE, 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 crtB, 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 crtI 로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 대장균에 형질도입하는 단계; 및 형질도입된 대장균 형질전환체를 배양하여 그 배양액으로부터 라이코펜을 회수하는 단계를 포함하는 라이코펜의 생산 방법이 제공된다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 해수의 메타게놈으로부터 라이코펜 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 3개 신규 유전자 crtE, crtB 및 crtI를 클로닝하였으며, 이들 유전자가 포함된 재조합 벡터를 확보하였으며, 이를 이용하여 라이코펜을 생산하지 않는 대장균을 형질전환하였다.

나아가, 새로운 상기 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 조합으로 형질전환된 대장균을 발효하면 라이코펜을 고농도 생산할 수 있음을 규명하였으며, 바람직하게는 신규의 crtB(서열번호 3) 및 crtI(서열번호 5) 유전자와 공지의 crtE 유전자의 조합의 경우, 기존 연구에 비해 높은 단위시간당 생산성을 갖는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 라이코펜 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 신규 유전자는 해수의 메타게놈으로부터 확보된 유전자이다. 상기 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 염기서열은 각각 서열번호 2(제라닐제라닐 피로인산 합성효소), 서열번호 4(피토엔 합성효소) 및 서열번호 6(피토엔 디세튜레이즈)으로 기재되는 아미노산을 암호화하는 서열이다.

본 발명에 따라 제공되는 유전자들은 다양한 숙주세포에 도입되어 라이코펜을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 상기 신규 유전자들은 단독으로 사용될 수도 있으며, 2개 이상이 함께 사용될 수도 있다. 예를 들면, crtE 및 crtB 만을 가지고 있는 미생물에 본 발명의 crtI를 도입하여 라이코펜을 생산하는 데 사용될 수 있으며, 아스타잔틴과 같은 카로티노이드를 생합성 하는 미생물에 본 발명의 crtE, crtB 및 crtI를 도입하여 향상된 수율을 얻는 데 사용될 수도 있다.

본 발명은 상기 라이코펜 생합성 유전자와 함께 메발론산 경로에 필요한 유전자를 이용하여 대장균에서 메발론산 경로를 통해 라이코펜을 생산하는 방법을 제공한다.

라이코펜 생합성 유전자를 이용하여 미생물에서 라이코펜을 생산하는 본 발명의 방법은, 라이코펜 생합성 관련 유전자인 crtE, crtB, crtI와 함께 mvaK1, mvaD, mvaK2, mvaE, mvaS 및 idi를 더 포함하되, 상기 유전자 crtE, crtB 및 crtI 중 적어도 하나는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 crtE, 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 crtB, 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 crtI 로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 대장균에 형질도입하는 단계; 및 형질도입된 대장균 형질전환체를 배양하여 그 배양액으로부터 라이코펜을 회수하는 단계를 포함한다.

라이코펜의 생합성 과정에 필요한 상기 mvaK , mvaD , mvaK2 , mvaE , mvaS , crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자는 이들로부터 선택된 최소 하나의 유전자를 포함하는 적어도 한 개 이상의 별도의 벡터로 제조될 수 있으며, 예를 들어 mvaK , mvaD , mvaK2 , mvaE , mvaS , crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자가 각각 9개의 벡터로 제조되거나, 상기 유전자 중 하나 이상을 포함하는 여러 개의 벡터로 제조되어 형질도입될 수 있다. 다만, 상기 별도로 제조된 각각의 벡터들에 포함된 유전자를 조합하면, 상기 mvaK , mvaD, mvaK2 , mvaE , mvaS , crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자가 모두 형질도입된 대장균에 포함되게 한다. 본 명세서에서 mvaE 는 도 2의 라이코펜 생합성 과정에서 atoB와 mvaA의 기능을 동시에 하는 유전자이다.

바람직하게는 상기 벡터는 mvaK , mvaD , mvaK2 , mvaE 및 mvaS 유전자와 crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자를 포함하는 각각의 재조합 벡터로 제조된 후 대장균에 형질도입하여 대장균을 형질 전환시킬 수 있다. 여기서 상기 mvaK , mvaD , mvaK2 , mvaE 및 mvaS 유전자는 공지 유전자가 사용될 수 있으며, 한편, 상기 crtE, crtB 및 crtI 유전자 중 적어도 하나는 해수의 메타게놈으로부터 유래된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현으로 crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자를 포함하는 상기 재조합 벡터는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 crtE 유전자, 서열번 호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 crtB 유전자, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 crtI 유전자 및 대장균의 idi 유전자를 포함하여 구성되며, 본 발명의 다른 바람직한 구현으로 crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자를 포함하는 상기 재조합 벡터는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 갖는 crtE 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 crtB 유전자, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 crtI 유전자 및 대장균의 idi 유전자를 포함하여 구성되며, 본 발명의 또 다른 바람직한 구현으로는 crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자를 포함하는 상기 재조합 벡터는 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola)에서 유래된 crtE 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 crtB 유전자, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 crtI 유전자 및 대장균의 idi 유전자를 포함하여 구성된다.

본 발명은 어떠한 재조합 벡터의 제조에 의한 유전자의 조합에 제한되지 않으며, mvaK , mvaD, mvaK2 , mvaE , mvaS , crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자를 포함하되 , crtE, crtB 및 crtI 중 적어도 하나는 해수의 메타게놈으로부터 유래한 본 발명의 유전자인 것을 특징으로 하는 대장균을 생산하는 어떠한 방법을 포함한다.

보다 상세하게, 상기 재조합 균주를 배양하여 고농도 라이코펜의 생산을 위해, 상기 형질전환 균주의 배양 온도는 25-35℃, 멸균 전 배양액의 pH는 7.0-7.5, 교반 속도는 200rpm 내지 1,000rpm에서 용존산소의 농도는 20 ~ 30%로 유지되도록 조절하여 기본 배양 조건인 배양 온도, 배양 pH, 교반 조건, 통기 조건 등을 최적 화하였다.

한편, 균체량과 라이코펜의 생산량을 증가시키기 위해서는 유가식 배양법이 바람직하다. 탄소원이 고갈되면 1회에 0.4%의 배양 용액이 들어가도록 조절하는 방법으로 진행하며, 이때의 배양 용액은 글리세롤 70%, MgSO₄ _ㆍH₂O 2%로 구성된다.

본 발명에서는 상기 단계를 통하여 형질전환된 균주로부터 생산된 라이코펜의 양을 측정하였으며, 본 발명에서 제공하는 신규 crtE , crtB , crtI 유전자의 조합으로 형질전환된 대장균의 라이코펜 생산성은 0.65 mg/L/hr이었으나, 본 발명의 신규한 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 다른 공지 유전자와의 조합의 경우에는 최대 3.30 mg/L/hr의 생산성을 획득하였으며, 이를 유가식 배양하는 경우 9.7 mg/L/hr , 또한 IPTG induction을 더 수행하는 경우 36.5 mg/L/hr의 라이코펜을 생산성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 메발론산 경로(Mevalonate pathway)를 도입하고, 최적의 유전자 조합을 결정한 뒤, 발효조건을 최적화하였으며, 상기와 같은 방법에 의해 재조합된 대장균의 발효결과 이는 기존의 발명들과 비교하여 높은 단위시간당 생산성을 확보함으로써 수율은 높으나 장시간이 소요되는 종래 발명들에 비해 단시간 동안 향상된 수율을 보이므로, 경제적인 공정의 개발을 가능하게 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시 예 1> 라이코펜 생합성 관련 유전자의 클로닝 및 재조합 벡터 pSANF 제조

야생종의 대장균은 라이코펜을 생산하지 않기 때문에 메발론산, 이소펜테닐 피로인산 및 라이코펜의 생산에 관련된 mvaK1 , mvaD , mvaK2 , mvaE , mvaS , crtE , crtB , crtI 및 idi 유전자를 도입하여 라이코펜을 생산하도록 하였다. 먼저, 이들 유전자를 2개의 벡터에 나누어 도입하였다. mvaK1 , mvaD, mvaK2 , mvaE 및 mvaS유전자는 pSTV28에 도입하였고, crtE , crtB , crtI 및 idi 유전자는 pTrc99A에 도입하였다. pSTV28은 클로람페니콜에 저항성을 가지며, pTrc99A는 암피실린에 저항성을 가지므로 두 항생제를 이용하여 두 가지의 재조합 벡터를 모두 가지고 있는 재조합 균주를 선별할 수 있다.

이들 유전자 중 mvaK1 , mvaD , mvaK2 , mvaE , mvaS 및 idi 유전자는 기존에 그 서열이 알려진 것들에서 선택하였으며, crtB 및 crtI 유전자는 해수의 메타 게놈에 서 선별된 유전자를 사용하였다. crtE는 해수의 메타 게놈에서 선별한 것과 기존에 알려진 것들을 각각 사용하여 라이코펜 생산성을 확인하였다.

mvaK1 유전자는 포도상구균(Staphylococcus aureus) ATCC35556에서 클로닝하였다. 포도상구균의 게놈 DNA로부터 증폭된 DNA절편은 EcoRI과 SacI으로 절단하여 동일한 제한부위를 절단한 pSTV28 벡터에 도입하고 이를 pSTV28-SA1으로 명명하였다.

mvaD와 mvaK2 유전자는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) ATCC6314의 게놈 DNA로부터 클로닝하였다. mvaD유전자는 제한효소 SacI과 KpnI으로 절단하여 동일한 제한부위를 절단한 pSTV28-SA1 벡터에 도입하고 이를 pSTV28-SA1D로 명명하였다. mvaK2유전자는 KpnI과 BamHI으로 절단하여 동일한 제한부위를 절단한 pSTV28-SA1D 벡터에 도입하고 이를 pSTV28-SA12D로 명명하였다.

mvaE , mvaS를 도입하기 전에 벡터 pTrc99A에서 프로모터와 전사중지서열을 각각 확보한 후 Over lap extension PCR을 실시하여 프로모터가 들어있는 DNA절편과 전사중지서열이 들어있는 DNA 절편을 하나로 연결하였다. 이렇게 확보된 DNA 절편을 BglII와 NsiI로 절단하고 BamHI과 PstI로 제한부위를 절단한 pSTV28-SA12D 벡터에 도입을 하였다. 이를 pSTV28-SA12D-Trc로 명명하였다.

mvaE와 mvaS 유전자는 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis) ATCC700802의 게놈 DNA로부터 클로닝하였으며, 이를 Over lap extension PCR을 실시하였다. mvaE 는 도 2의 라이코펜 생합성 과정에서 atoB와 mvaA의 기능을 동시에 하는 유전자이다. 상기에서 확보된 mvaE와 mvaS가 포함된 DNA절편을 BamHI과 PstI로 절단하여 동일한 제한부위를 절단한 pSTV28-SA12D-Trc 벡터에 도입하였고, 이를 pSANF <도면 2>로 명명하였다.

상기 5종의 유전자는 모두 Qiagen PCR purification kit (Qiagen사)로 정제한 후 사용하였다.

<실시 예 2> 라이코펜 생합성 관련 유전자의 클로닝 및 재조합 벡터 pT5-LYC-idi제조

2.1 해수 메타게놈으로부터 신규 라이코펜 생합성 관련 유전자(crtE , crtB, crtI)의 클로닝

라이코펜 생합성에 필요한 유전자, crtE, crtB 및 crtI를 얻기 위하여 해수로부터 직접 게놈 DNA(메타게놈)를 확보하고 라이브러리를 구축한 다음 라이코펜이 붉은 색을 띠는 점을 이용하여 붉은 색을 띠는 클론을 선별하고 클론의 DNA를 분석하는 방법을 이용하였다.

먼저 해수로부터 메타게놈 DNA를 확보하기 위하여 막여과(Membrane filtration)를 통해 대량의 해수로부터 미생물을 농축하였다. 대부분의 미생물의 크기가 0.2μm에서 10μm 사이이므로 1차적으로, 대량의 해수를 연동 펌프를 통해 10μm의 포어 사이즈 필터로 통과시켜 10μm이상의 크기를 갖는 여러 부유물질을 제거하였고 2차적으로, 0.2μm의 포어 사이즈 필터를 통해 0.2μm 이상의 크기를 가지는 미생물만 선택적으로 회수하였다. 회수된 미생물의 염색체 DNA의 추출은 CTAB(Hexadecyltrimethyl ammonium bromide)를 이용한 방법(Zhou et al., Appl.Environm.Microbiol. 62:316-322,1996)을 사용하였다.

상기에서 얻은 미생물 균체로부터 준비한 메타게놈 DNA를 사용하여 카피 콘트롤 포스미드 라이브러리 생산 키트(Copy Control fosmid library production kit(Epicenter 사))로 메타게놈 라이브러리를 제조하였으며 제조과정은 제조사의 매뉴얼을 따랐다. 라이브러리 제조는 포스미드(Fosmid) 벡터 카피 콘트롤(Copy Control) pCC1FOS(Epicenter 사)를 사용하였다. 삽입 DNA와 카피 콘트롤 pCC1FOS 벡터의 라이게이션 반응을 수행한 후 라이게이션 된 포스미드 클론을 맥스플랙스 람다 패키징 추출물(MaxPlax lambda packaging extracts(Epicenter 사))로 패키징시켰다. 이와 같은 과정을 통하여 10,000개 이상의 클론을 얻을 수 있었다.

위에서 얻은 Fosmid 클론들을 실온에서 48시간 정치 배양하여 콜로니의 색깔을 관찰하였으며 그 중 적색을 띄는 콜로니들을 선별하였다. 이들 콜로니들로부터 crt 유전자의 유무를 PCR로 확인하기 위하여 에르위니아 우레도브라(Erwinia uredovora), 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola), 플라보박테리움 STCC21588(Flavobacterium sp. Strain ATCC21588) 종, 로토박터 스파이로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 그리고 아그로박테리움 아우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)으로부터 유래된 crtI C-말단 부분(crtIf)과 crtB중간 부분(crtBr)의 보존된 부위의 아미노산 서열로부터 프라이머를 합성하였다. 이들 프라이머들의 염기서열은 다음과 같다.

crtIf :

5'-GTNGGNGCRGGCACNCAYCC-3'

crtBr :

5'-TCGCGRGCRATRTTSGTSARRTG-3'

각각의 붉은색을 띄는 콜로니로부터 추출한 포스미드 DNA를 주형으로 하여 상기에서 합성한 프라이머들을 통해 crt 유전자를 증폭하였다. 즉, 포스미드 DNA 100ng를 주형으로 하여 94 ℃에서 5분 동안 변성(Denaturation) 후 94 ℃에서 30초, 50 ℃ ~ 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분의 사이클(Cycle)을 20회 수행 후, 94 ℃에서 30초, 50 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분의 사이클을 15회 수행하였다. 그 결과 한 개의 클론으로부터 예상되는 620 bp 크기의 띠(Band)를 얻을 수 있었으며, 이를 pST-Blue1벡터(Novagen 사) 에 삽입하여 염기서열을 분석한 결과, 보고된 crtB 유전자 염기서열과 상동성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 얻어진 crtB 유전자의 조각을 탐침(Probe)으로 하여 서던 블러팅을 통해 crtB유전자를 포함하는 전체 라이코펜 생합성 유전자 클러스터를 획득하고자 하였다. 탐침으로 사용한 crtB유전자의 조각은 PCR을 통해 DIG 화합물을 부착하였으며, 주형 DNA를 각각 제한효소 BamHI, SalI, EcoRI으로 절단한 후 서던 블러팅하였다. 먼저 여러 가지 제한효소로 각각 처리한 DNA를 0.9% 아가로스 젤에서 전기 영동하여 크기별로 분획한 후 나일로 멤브레인(Schleicher & Schuell, 독일)으로 모세관 이동(Capillary transfer)방법으로 옮겼다. 하이브리드화는 42℃에서 50% 포름아미드를 포함하는 표준용액 (5XSSC, 0.1% N-Lauroylsarcosine, 0.02% SDS, 5% Blocking regent, 50% Formamide)을 사용하여 탐침을 첨가한 후 6시간 이상 지속하였다. 제조사 (Boehringer-Mannheim, 독일)의 메뉴얼에 따라서 멤브레인을 알칼라인 포스파타제와 연결된 DIG에 대한 항체와 반응시킨 후 기질인 NBT와 X-포스페이트를 첨가하여 발색반응을 수행하였다.

서던 블러팅 결과, 시그널을 나타내는 EcoRI 절단 DNA 중 약 4kb 밴드를 pBluescript II KS(+) 벡터 (Stratagene 사)에 전환하여 DNA의 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석결과 총 3.2 kb의 crtE, crtB, crtI 유전자 부위를 확인 할 수 있었다.

상기와 같이crtE , crtB 및 crtI 유전자는 해수의 메타게놈으로부터 클로닝하였으며, 이는 기존에 알려진 유전자들과는 그 서열이 다르다. IPP 이성화효소(IPP isomerase)를 코딩하는 idi 유전자는 대장균 MG1655의 게놈 DNA로부터 증폭하였다

2.2 재조합 벡터 pT5-LYC-idi제조

우선 확보된 crtE 유전자가 들어있는 DNA 절편을 EcoRI과 BamHI으로 절단하여 동일한 제한부위를 절단한 pTrc99A 벡터에 도입하고 이를 pT-f5crtE로 명명하였다. crtB와 crtI유전자는 Over lap extension PCR반응을 통해 최종 crtB와 crtI유전자를 모두 함유하는 약 2.4 kb의 DNA 절편을 얻었다. 이를 Qiagen PCR purification kit으로 정제한 다음 XhoI과 SalI으로 절단하여 동일한 제한부위를 절단한 pT-f5crtE에 도입하고 이를 pT-f5EBI로 명명하였다. 여기에 대장균 MG1655에서 유래한 idi 유전자를 SacI과 NotI으로 절단한 후 동일한 제한부위를 절단한 pT-f5EBI에 도입하고 이를 pT5-LYC-idi <도면 4>로 명명하였다.

상기의 유전자들은 모두 Qiagen PCR purification kit (Qiagen사)로 정제한 후 사용하였다.

<실시예3> 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtE, crtB 및 crtI유전자와 메발론산 합성 유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생 산성 평가

상기 실시예 1 및 실시예2에서 얻은 벡터 pSANF와 pT5-LYC-idi로 형질전환된 대장균에서 라이코펜 생합성 유무을 판별하였다.

먼저 벡터 pSANF와 pT5-LYC-idi를 MG1655에 도입시켜 형질전환하였다. 형질전환된 대장균의 단일 콜로니를 확보한 후 암피실린(Ampicillin) 50ppm과 클로람페니콜(Chloramphenicol) 20ppm이 함유된 LB배지(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모추출물 및 10 g/L NaCl) 5 mL에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕배양 하였으며, 얻어진 배양액 600μL를 1% 글리세롤, 암피실린 50ppm과 클로람페니콜 20ppm이 함유된 2YT배지 30 mL에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 본 배양하였다.

배양이 완료되면, 적당량의 배양액을 취하여 건조세포 중량(Dry cell weight, gDCW/L), 수율(mgLycopene/L, 이하 mg/L로 표시), 함량(Content, mgLycopene/gDCW, 이하 mg/gDCW로 표시), 단위시간당 생산성(Productivity, mgLycopene/L/hr, 이하 mg/L/hr)을 구하여 라이코펜의 생산성을 확인하였다.

먼저 건조 세포 중량을 얻기 위해서는 균주 배양액 5 mL를 채취하여 50 mL 원심분리관에 첨가하고 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 제거하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 20 mL의 멸균된 증류수 용액을 첨가하여 현탁한 뒤 원심분리하여 배양액 성분을 완전히 제거하고 균체를 회수한 후, 회수된 균체에 5 mL의 멸균 증류수를 첨가하여 완전히 현탁하여 미리 무게를 측정해둔 알루미늄 칭량접시(Weighing dish)에 옮겼다. 이때 멸균 증류수를 이용하여 원심분리관을 세척하고 세척액도 칭량접시에 첨가하였다. 칭량 접시를 105℃의 건조 오븐(Dry oven)에서 12시간 이상 건조한 뒤 냉각하여 칭량 접시의 무게를 mg 단위로 측정하였다. 건조세포중량(gDCW/L)은 [식1]를 이용하여 계산하였다.

[식1]

건조세포중량(gDCW/L) = {건조 후 접시무게(mg) - 접시무게(mg)}/5

라이코펜의 수율 (mg/L)은 다음과 같은 방법으로 얻었다. 배양액을 100μL 원심분리하여 균체를 얻은 후 이를 아세톤 400μL으로 현탁시켜 55℃에서 15분간 방치하고, 여기에 다시 아세톤 600μL를 가하여 55℃에서 15분간 방치하여 라이코펜을 추출하였다. 얻어진 추출액을 14,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 분리하고 분광광도계를 이용하여 474.5 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정값을 검량선을 통해 얻은 방정식에 대입하였고, 희석배수를 계산하여 라이코펜의 양을 계산하였다. 이때, 검량선 작성을 위해서 표준 라이코펜 (Sigma 사)을 구입하여 아세톤에 용해시킨 후 각각 다른 농도로 아세톤에 희석하여 분광광도계에서 474.5 nm 파장을 이용해 흡광도를 측정하고 이를 이용하여 표준 검량선을 작성하였다.

라이코펜의 함량 (mg/gDCW)은 상기의 건조세포 중량 (gDCW/L)과 라이코펜의 수율(mg/L)를 이용하여 [식2]을 이용하여 계산하였다.

[식2]

라이코펜 함량(mg/gDCW) = 라이코펜 수율(mg/L) / 건조세포중량(gDCW/L)

라이코펜의 단위시간 생산성 (mg/L/hr)은 상기에서 얻어진 라이코펜의 수율을 배양 시간으로 나누는 [식3]을 이용하여 계산하였다.

[식3]

라이코펜의 단위시간 생산성(mg/L/hr) = 라이코펜 수율(mg/L) / 배양 시간(hr)

상기 방법으로부터 확인된 pSANF와 pT5-LYC-idi로 형질전환된 대장균의 라이코펜 생산성은 [표 1]과 같다.

[표1]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)	단위시간당 생산성(mg/L/hr)
5.11	31.2	6.1	0.65

<실시예 4> 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola) 유래의 crtE , crtB 및 crtI 유전자, 및 상기 유전자와 메발론산 합성 유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

4.1 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola) 유래의 crtE , crtB 및 crtI 유전자로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

에르위니아 하이르비콜라 유래의 crtE , crtB 및 crtI 유전자를 확보하여 pT5-ErEBI(도 3)를 제조하고 이를 도입하여 형질전환 된 대장균를 확보하여 실시예3에서와 동일한 방법으로 라이코펜의 생산성 평가를 하였다. 48시간 배양 후 확인 된 형질전환 대장균의 라이코펜 생산성은 [표 2]와 같다.

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)	단위시간당 생산성(mg/L/hr)
3.7	12.7	3.5	0.3

4.2 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola) 유래의 crtE , crtB 및 crtI 유전자와 메발론산 합성 유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

에르위니아 하이르비콜라 유래의 crtE , crtB 및 crtI 유전자로 구성된 pT5- ErEBI 와 실시예 1의 pSANF를 도입하여 형질전환 된 대장균를 확보하여 실시예3에서와 동일한 방법으로 라이코펜의 생산성 평가를 하였다. 48시간 배양 후 확인된 형질전환 대장균의 라이코펜 생산성은 [표 3]과 같다.

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)	단위시간당 생산성(mg/L/hr)
4.0	66.3	16.6	1.4

<실시예5> 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtE유전자와 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola) 유래의 crtB , crtI 유전자와 메발론산 합성 유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

상기 실시예 2에서 얻어진 벡터 pT5-LYC-idi에서 crtB유전자와 crtI유전자를 기존에 알려진 에르위니아 하이르비콜라유래의 유전자로 대체하여 재조합 벡터 pT5-ErBI(도 5)를 제조하였다.

이를 도입하여 형질전환 된 대장균를 확보하여 실시예3에서와 동일한 방법으로 라이코펜의 생산성 평가를 하였다. 48시간 배양 후 확인된 pSANF와 pT5-ErBI로 형질전환된 대장균의 라이코펜 생산성은 [표4]와 같다.

[표4]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)	단위시간당 생산성(mg/L/hr)
5.89	50.1	8.5	1.04

<실시예6> 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola) 유래의 crtE유전자(AMOCO CORPORATION의 미국 특허 US5530189 'Lycopene biosynthesis in genetically engineered hosts')와 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtB 및 crtI 유전자와 메발론산 합성 유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

상기 실시예2에서 얻어진 벡터 pT5-LYC-idi에서 crtE유전자를 에르위니아 하이르비콜라 유래의 유전자로 대체하여 재조합 벡터 pT-EF5(도 6)를 제조하였다.

이를 도입하여 형질전환 된 대장균를 확보하여 실시예3에서와 동일한 방법으로 라이코펜의 생산성 평가를 하였다. 48시간 배양 후 확인된 pSANF와 pT-EF5로 형질전환된 대장균의 라이코펜 생산성은 [표5]과 같다.

[표5]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)	단위시간당 생산성(mg/L/hr)
5.19	134.1	25.8	2.79

<실시예7> 로토박터 스파이로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 crtE 유전자(서열번호 7)와 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtB유전자와 crtI 유전자와 메발론산 합성 유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

상기 실시예2에서 얻어진 재조합 벡터 pT5-LYC-idi에서 crtE유전자를 로토박터 스파이로이데스 유래의 유전자로 대체하여 재조합 벡터 pT-RF5(도 7)를 제조하였다. 이로 형질전환된 대장균의 라이코펜 생산성 평가를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였으며, 이를 통하여 확인된 pSANF와 pT-RF5로 형질전환된 대장균의 라이코펜 생산성은 [표6]와 같다.

[표6]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량 (mg/gDCW)	단위시간당 생산성(mg/L/hr)
5.63	106.4	18.9	2.22

<실시예8> 시네코시스티스 PCC6803 (Synechocystis sp. PCC6803) 종 유래의 crtE유전자(서열번호 8)와 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtB유전자와 crtI 유전자와 메발론산 합성 유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

상기 실시예2에서 얻어진 재조합 벡터 pT5-LYC-idi에서 crtE 유전자를 시네 코시스티스 PCC6803 종 유래의 유전자로 대체하여 재조합 벡터 pT-SF5(도 8)를 제조하였다. 이로 형질전환된 대장균의 라이코펜 생산성 평가를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였으며, 이를 통하여 확인된 pSANF와 pT-SF5로 형질전환된 대장균의 라이코펜 생산성은 [표7]와 같다.

[표7]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)	단위시간당 생산성(mg/L/hr)
4.52	158.2	35.0	3.30

<실시예9> 시네코시스티스 PCC6803 종 유래의 crtE유전자와 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtB유전자와 crtI 유전자와 메발론산 합성 유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균의 유가식 배양을 통한 라이코펜의 생산성 평가

실시예8의 SANF와 pT-SF5로 형질전환된 대장균을 이용하여 유가식 배양을 실시하였다.

유가식 배양을 위해서 Biostat B 발효기(B. Brown Biotech International)를 사용하였다. 배양용기의 전체부피는 5L 이며 Working volume은 2L 이다.

발효기에는 수소이온농도를 측정하는 pH 장치와, 용존 산소의 농도를 측정하는 DO 장치가 부착되었으며, 발효과정에서 발생하는 기포를 제거하기 위해 거품을 감지할 수 있는 포옴 센서를 부착하였다.

발효 동안의 pH 조절은 암모니아수(Ammonia solution)와 30% 인산(Phosporic acid) 용액으로 하였으며, 배양기 내에 유입되는 압축공기는 2L/min의 속도로 유입되도록 조절하였다. 배양기 온도는 30℃로 유지하였고 교반 속도는 200rpm에서부터 1,000rpm까지 용존 산소의 농도가 20 ~ 30%가 유지되도록 적절히 조절하였다. 배양기 내에는 2L의 멸균된 라이코펜 생산 배양 배지를 주입하였는데 라이코펜 생산 배양 배지는 코르츠(Kortz)의 배양 배지를 변형하여 사용하였으며(D.J.Korz et al., J. of Biotechnology, 39, 59-65, 1995), 이때 각각의 성분은 글리세롤 2%, KH₂PO₄ 1.33%, (NH₄)₂HPO₄ 0.4%, MgSO₄.7H₂O 0.12%, 구연산 0.17%, EDTA 8.4mg/L, CoCl₂.6H₂O 2.5mg/L, MnCl₂.4H₂O 15.0mg/L, CuCl₂.2H₂O 1.5mg/L, H₂BO₃ 3.0mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 2.5mg/L, Zn(CH₃COO)₂.2H₂O 13.0mg/L, Fe(III) 시트레이트 100mg/L로 배지의 pH는 멸균 전에 7.0으로 맞추었다. 배양액이 포함된 배양기는 멸균기를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균하여 배양기 내의 미생물을 멸균한 뒤, 균주를 접종하기 전에 암피실린 50ppm, 클로람페니콜 20ppm의 농도로 항생제의 농도를 맞추었다.

실시예 8에서 확보된 균주의 콜로니를 3mL의 LB 배지가 들어있는 시험관에 백금이를 이용하여 1차 전배양하여 접종하고 진탕 배양기를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 배양 중에 분광광도계를 이용하여 600nm에서의 광학밀도(Optical density, 이하 O.D.로 표시)가 1.0 정도 되었을 때 배양액 2mL를 100mL 배양액이 들어있는 500mL 삼각플라스크에 접종한다. 접종이 완료되면 다시 30℃에서 2차 전 배양을 실시하고 다시 O.D.가 1.0이 되었을 때 상기의 멸균된 배양기에 전체를 접종하여 유가식 배양을 실시한다. 배양 중에 영양원의 공급은 탄소원이 고갈되면 1회에 0.4%의 배양 용액이 들어가도록 조절하였다. 배양 용액은 글리세롤 70%, MgSO4ㆍ7H2O 2%로 구성하였다.

배양이 진행되면 일정시간마다 배양액을 취하여 O.D. 및 수율 (mg/L)을 결정하였다. 48시간 배양 후 측정된 라이코펜의 생산성은 [표8]과 같다.

[표8]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)	단위시간당 생산성(mg/L/hr)
39.8	466	11.7	9.7

<실시예10> IPTG 유도를 통한 라이코펜의 생산성 증대

실시예 8 에서 확보된 균주의 콜로니를 3mL의 LB 배지가 들어있는 시험관에 백금이를 이용하여 1차 전배양하여 접종하고 진탕 배양기를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 배양 중에 분광광도계를 이용하여 600nm에서의 광학밀도가 1.0 정도 되었을 때 배양액 2mL를 100mL 배양액이 들어있는 500mL 삼각플라스크에 접종한다. 접종이 완료되면 다시 30℃에서 2차 전배양을 실시하고 다시 O.D.가 1.0이 되었을 때 상기의 멸균된 배양기에 전체를 접종하여 실시예 9과 같은 방법으로 유가식 배 양을 실시한다.

배양이 진행되면 일정시간마다 배양액을 취하여 O.D. 및 수율(mg/L)을 결정하였다. 분광광도계를 이용하여 600nm에서의 O.D.가 70.0이 되었을 때 0.025mM의 농도로 IPTG 유도를 실시하였다. 48시간 배양 후 측정된 라이코펜의 생산성은 [표9]과 같다.

[표9]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)	단위시간당 생산성(mg/L/hr)
46.1	1754	38.1	36.5

본 발명의 crtE, crtB 및 crtI 유전자는 단독으로, 또는 이들 중 적어도 하나의 유전자와 공지 유전자의 조합으로 라이코펜의 생산에 이용될 수 있으며, 본 발명에 따른 유전자 조합으로 형질절환된 재조합 균주의 경우 공지 연구에 비해 향상된 생산성을 획득할 수 있다. 또한, 대장균에 메발론산 경로에서 필요한 유전자를 도입하여 메발론산 경로를 통해 라이코펜을 생산하게 함으로써 라이코펜의 생산성을 더욱 향상시킬 수 있다. 따라서, 최근 항산화 활성과 항암 효과로 그 수요가 증대되고 있는 라이코펜의 대량 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<110> SKcorporation <120> Process for Production of Lycopene by Recombinant Escherichia coli <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 867 <212> DNA <213> crtE of meta genome from sea water <400> 1 atgataagcc ctatatccac tgctgatgtg gcctttgagc gcctcgttga cagctgtgaa 60 cgatcgttga aagagtgtat agccgcgagc tgtccagccc ttcatcaagc ttggcagcat 120 cagttcgcag cgcgaggcaa gcgtttacgt atgcacctag ccttagaaag tagtctggcg 180 ctagggttga ccgaccatca atgccacacc attgcggtgg catgcgaatt agtccaccag 240 gcctcattga ttcacgatga tgtgcttgat gcggataccc accgaaatgg caaagcaacg 300 gtttggcacc agtatggagc tgccacagca atttgtctgg gtgacagttt attagttgag 360 gcaatgctgc aaatagcgtt gttggaaaat ttaccgagcg ccgttcggca gcagcttgtg 420 caattattta aagatgccat acaagccgcc gctgagggcc aaattgacga ttgtaatagc 480 gacaaaatag ccaactatag ccatgccgat tattgcactg cagtgcgcaa aaaatcaggc 540 gcgctgttcg gcttaccggt gttggcggct atgttaatga gtcaacagca tgcaattact 600 atcggggtag ccaaccgagc ctatgctgaa tttggtattg cctatcagtt actcgatgac 660 ctgcatgacc gtgacgttga tcagcagggt cggatgaacg gttattgggt attaagtcgg 720 gattatccga ccggggtaga agcagcactc tttgctgcgg ttgagcagca tctcggcgag 780 gccgagcgac tgatcgcatc attgccatcg agcttgcacc ccagctttta tgtggtgcat 840 gactcgctcc gagcgaagct cccatga 867 <210> 2 <211> 288 <212> PRT <213> Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase <400> 2 Met Ile Ser Pro Ile Ser Thr Ala Asp Val Ala Phe Glu Arg Leu Val 1 5 10 15 Asp Ser Cys Glu Arg Ser Leu Lys Glu Cys Ile Ala Ala Ser Cys Pro 20 25 30 Ala Leu His Gln Ala Trp Gln His Gln Phe Ala Ala Arg Gly Lys Arg 35 40 45 Leu Arg Met His Leu Ala Leu Glu Ser Ser Leu Ala Leu Gly Leu Thr 50 55 60 Asp His Gln Cys His Thr Ile Ala Val Ala Cys Glu Leu Val His Gln 65 70 75 80 Ala Ser Leu Ile His Asp Asp Val Leu Asp Ala Asp Thr His Arg Asn 85 90 95 Gly Lys Ala Thr Val Trp His Gln Tyr Gly Ala Ala Thr Ala Ile Cys 100 105 110 Leu Gly Asp Ser Leu Leu Val Glu Ala Met Leu Gln Ile Ala Leu Leu 115 120 125 Glu Asn Leu Pro Ser Ala Val Arg Gln Gln Leu Val Gln Leu Phe Lys 130 135 140 Asp Ala Ile Gln Ala Ala Ala Glu Gly Gln Ile Asp Asp Cys Asn Ser 145 150 155 160 Asp Lys Ile Ala Asn Tyr Ser Tyr Ala Asp Tyr Cys Thr Ala Val Arg 165 170 175 Lys Lys Ser Gly Ala Leu Phe Gly Leu Pro Val Leu Ala Ala Met Leu 180 185 190 Met Ser Gln Gln His Ala Ile Thr Ile Gly Val Ala Asn Arg Ala Tyr 195 200 205 Ala Glu Phe Gly Ile Ala Tyr Gln Leu Leu Asp Asp Leu His Asp Arg 210 215 220 Asp Val Asp Gln Gln Gly Arg Met Asn Gly Tyr Trp Val Leu Ser Arg 225 230 235 240 Asp Tyr Pro Thr Gly Val Glu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Val Glu Gln 245 250 255 His Leu Gly Glu Ala Glu Arg Leu Ile Ala Ser Leu Pro Ser Ser Leu 260 265 270 His Pro Ser Phe Tyr Val Val His Asp Ser Leu Arg Ala Lys Leu Pro 275 280 285 <210> 3 <211> 909 <212> DNA <213> crtB of meta genome from sea water <400> 3 atgaagatag cgctggaccg gcctgagcat gctgccatta tgcagcagca tggcaagtca 60 ttttatttgg ctggtagctt tctcggtcgt gatgcctggc agcgtgcgtc agcgctttat 120 gcttttttac gccatatcga cgaccaaatt gatgaagctg aaacatctgc cgtagcagcg 180 caacgactgg cacagattcg tcagcagctg ttctcaagcg caatcatgac cgacgcagat 240 gagcagagct taagcattga gcaaagcacc ctggagcaat ttttgcgtgg catggcttat 300 gacattggtc acgttgctat tgctgatcag gctgagttag aagactactg ctattgtgtc 360 gccggcaccg tcggtgaaat gatgtgtcag gccttgcgct gtgatgaccc gcgcgcaatt 420 ggtcatgcta ttgatttggg tgtcgctatg caaatgacca atattgcccg cgatgttcat 480 gccgatagcg ccttagggcg ccgttattta cccgccacct gggttggtga tctcagtgct 540 gagagcatta ccacggcaac accagctatc tcggcacaga tagccgcggc aattatgcgg 600 ctgattgcgt tatctgagca gcgttatcaa tcagcgtatg cgggtatcgc actgttgccg 660 ttgcgctcgc gcttggcaat tttggcggca agtcaccttt atgccggtat tggtcgcgcc 720 attgcggcgg agcatgcgca atcatggcag caacggaagg tgttgtcagg gtcgcgtaag 780 gcggcaatta ctgccgccgc agtggcggaa tttgcgactc gaccgcgact atggcgttat 840 tacgcgcagc ctagcttcgg taagccggcc gagcggatcg ctgcgtctgt tggcagtgag 900 ggtttatga 909 <210> 4 <211> 302 <212> PRT <213> Phytoene Synthase <400> 4 Met Lys Ile Ala Leu Asp Arg Pro Glu His Ala Ala Ile Met Gln Gln 1 5 10 15 His Gly Lys Ser Phe Tyr Leu Ala Gly Ser Phe Leu Gly Arg Asp Ala 20 25 30 Trp Gln Arg Ala Ser Ala Leu Tyr Ala Phe Leu Arg His Ile Asp Asp 35 40 45 Gln Ile Asp Glu Ala Glu Thr Ser Ala Val Ala Ala Gln Arg Leu Ala 50 55 60 Gln Ile Arg Gln Gln Leu Phe Ser Ser Ala Ile Met Thr Asp Ala Asp 65 70 75 80 Glu Gln Ser Leu Ser Ile Glu Gln Ser Thr Leu Glu Gln Phe Leu Arg 85 90 95 Gly Met Ala Tyr Asp Ile Gly His Val Ala Ile Ala Asp Gln Ala Glu 100 105 110 Leu Glu Asp Tyr Cys Tyr Cys Val Ala Gly Thr Val Gly Glu Met Met 115 120 125 Cys Gln Ala Leu Arg Cys Asp Asp Pro Arg Ala Ile Gly His Ala Ile 130 135 140 Asp Leu Gly Val Ala Met Gln Met Thr Asn Ile Ala Arg Asp Val His 145 150 155 160 Ala Asp Ser Ala Leu Gly Arg Arg Tyr Leu Pro Ala Thr Trp Val Gly 165 170 175 Asp Leu Ser Ala Glu Ser Ile Thr Thr Ala Thr Pro Ala Ile Ser Ala 180 185 190 Gln Ile Ala Ala Ala Ile Met Arg Leu Ile Ala Leu Ser Glu Gln Arg 195 200 205 Tyr Gln Ser Ala Tyr Ala Gly Ile Ala Leu Leu Pro Leu Arg Ser Arg 210 215 220 Leu Ala Ile Leu Ala Ala Ser His Leu Tyr Ala Gly Ile Gly Arg Ala 225 230 235 240 Ile Ala Ala Glu His Ala Gln Ser Trp Gln Gln Arg Lys Val Leu Ser 245 250 255 Gly Ser Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ala Ala Ala Val Ala Glu Phe Ala 260 265 270 Thr Arg Pro Arg Leu Trp Arg Tyr Tyr Ala Gln Pro Ser Phe Gly Lys 275 280 285 Pro Ala Glu Arg Ile Ala Ala Ser Val Gly Ser Glu Gly Leu 290 295 300 <210> 5 <211> 1485 <212> DNA <213> crtI of meta genome from sea water <400> 5 atgcaaacag ttgttattgg tggaggctta ggtggtatcg cagcggcgtt gcgagcccgt 60 gcaaaaggcc atcaagtcac cctaatagaa aaaaatcagc agttaggtgg ccgtgcgcaa 120 gtatttgaac gtgagggttt tcgttttgat gccggcccca ccgtgattac tgcaccattc 180 ttgtttgatg agctatttga attatttggc aaaaaacgcc aagactatgt cgagtttatt 240 ccgctcaatc cgtggtacca attttactac agtgacgaca agtcgcgctt caactatggt 300 ggaagtgtcg atgacacctt gcaagaaatt gctaaaattg agccaagtga ccaggccaat 360 tatctgcgtt taatcgagca tagcaaaaag atctacaaaa tcggctttga gcaactcgcc 420 gatcagccgt ttcacaagct ttccaccatg ttaaagcaaa ttccccattt gggccggctg 480 cgcgctgacc gcacggtttg gaatatggtt agtcgctatc ttaaaaatga caaactacgc 540 caagcttttt ctattcagtc attgctagta ggtggtaacc catttgatac caccagtatt 600 tatggactga ttcattattt agagcgggaa tatggcattc atttcgccat gggcggcacc 660 ggtgccatta ttgatgcatt acacaagctg atgctcgaag agggtatcga ggtgcgcacg 720 aactgctgtg tcaccgactt tcatagcagc ccgagccgca ttgagagcgc agtgattaat 780 cagcacgagg tgctatctgc tgactacttt atttttaatg gcgacccact gtatttgtat 840 aaacacctgt tacctgaaag ttctgctaat ttgcaattac ggttgaaggt tgatcacagt 900 aaacgctcaa tgggtctata tgtgctgttt tttggcacca ccaaacaata tccagaggtt 960 gagcatcaca ctatttggct gggcaagcgt tatcagcaat tattagcaga aatttttgcc 1020 gaaaaatcat tacccgatga tttttcactt tatgtacata gaccaactgc ttcggatcca 1080 tcctttgcgc cggctggttg cgacagcttt tatgtgttag ctccggtgcc caatctgcgg 1140 gcagatatag attggcaggt tgaggaaccc aagttgcgac aacggatcat cgacgcgcta 1200 gcagatacct tattgccggg cttacatgac tgtattaccg ctgagtttgc gatgacccca 1260 gaacagttta aaagcgatta tttgagtgtc gatggcgctg gcttttccat tgcacccaaa 1320 tttactcagt cggcgtggtt ccgttttcat aatctgtcgg aaaaatatag caacttatta 1380 ctcgctggtg ccggaacgca cccaggtgct ggcatgccgg gcgtactctg ttcggcaaaa 1440 gtcattgaaa aactgctccc tgtggtgact gcggagcagc catga 1485 <210> 6 <211> 494 <212> PRT <213> Phytoene Desaturase <400> 6 Met Gln Thr Val Val Ile Gly Gly Gly Leu Gly Gly Ile Ala Ala Ala 1 5 10 15 Leu Arg Ala Arg Ala Lys Gly His Gln Val Thr Leu Ile Glu Lys Asn 20 25 30 Gln Gln Leu Gly Gly Arg Ala Gln Val Phe Glu Arg Glu Gly Phe Arg 35 40 45 Phe Asp Ala Gly Pro Thr Val Ile Thr Ala Pro Phe Leu Phe Asp Glu 50 55 60 Leu Phe Glu Leu Phe Gly Lys Lys Arg Gln Asp Tyr Val Glu Phe Ile 65 70 75 80 Pro Leu Asn Pro Trp Tyr Gln Phe Tyr Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Arg 85 90 95 Phe Asn Tyr Gly Gly Ser Val Asp Asp Thr Leu Gln Glu Ile Ala Lys 100 105 110 Ile Glu Pro Ser Asp Gln Ala Asn Tyr Leu Arg Leu Ile Glu His Ser 115 120 125 Lys Lys Ile Tyr Lys Ile Gly Phe Glu Gln Leu Ala Asp Gln Pro Phe 130 135 140 His Lys Leu Ser Thr Met Leu Lys Gln Ile Pro His Leu Gly Arg Leu 145 150 155 160 Arg Ala Asp Arg Thr Val Trp Asn Met Val Ser Arg Tyr Leu Lys Asn 165 170 175 Asp Lys Leu Arg Gln Ala Phe Ser Ile Gln Ser Leu Leu Val Gly Gly 180 185 190 Asn Pro Phe Asp Thr Thr Ser Ile Tyr Gly Leu Ile His Tyr Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Tyr Gly Ile His Phe Ala Met Gly Gly Thr Gly Ala Ile Ile 210 215 220 Asp Ala Leu His Lys Leu Met Leu Glu Glu Gly Ile Glu Val Arg Thr 225 230 235 240 Asn Cys Cys Val Thr Asp Phe His Ser Ser Pro Ser Arg Ile Glu Ser 245 250 255 Ala Val Ile Asn Gln His Glu Val Leu Ser Ala Asp Tyr Phe Ile Phe 260 265 270 Asn Gly Asp Pro Leu Tyr Leu Tyr Lys His Leu Leu Pro Glu Ser Ser 275 280 285 Ala Asn Leu Gln Leu Arg Leu Lys Val Asp His Ser Lys Arg Ser Met 290 295 300 Gly Leu Tyr Val Leu Phe Phe Gly Thr Thr Lys Gln Tyr Pro Glu Val 305 310 315 320 Glu His His Thr Ile Trp Leu Gly Lys Arg Tyr Gln Gln Leu Leu Ala 325 330 335 Glu Ile Phe Ala Glu Lys Ser Leu Pro Asp Asp Phe Ser Leu Tyr Val 340 345 350 His Arg Pro Thr Ala Ser Asp Pro Ser Phe Ala Pro Ala Gly Cys Asp 355 360 365 Ser Phe Tyr Val Leu Ala Pro Val Pro Asn Leu Arg Ala Asp Ile Asp 370 375 380 Trp Gln Val Glu Glu Pro Lys Leu Arg Gln Arg Ile Ile Asp Ala Leu 385 390 395 400 Ala Asp Thr Leu Leu Pro Gly Leu His Asp Cys Ile Thr Ala Glu Phe 405 410 415 Ala Met Thr Pro Glu Gln Phe Lys Ser Asp Tyr Leu Ser Val Asp Gly 420 425 430 Ala Gly Phe Ser Ile Ala Pro Lys Phe Thr Gln Ser Ala Trp Phe Arg 435 440 445 Phe His Asn Leu Ser Glu Lys Tyr Ser Asn Leu Leu Leu Ala Gly Ala 450 455 460 Gly Thr His Pro Gly Ala Gly Met Pro Gly Val Leu Cys Ser Ala Lys 465 470 475 480 Val Ile Glu Lys Leu Leu Pro Val Val Thr Ala Glu Gln Pro 485 490 <210> 7 <211> 867 <212> DNA <213> crtE of Rhodobacter sphaeroides <400> 7 atggcgtttg aacagcggat tgaagcggca atggcagcgg cgatcgcgcg gggccagggc 60 tccgaggcgc cctcgaagct ggcgacggcg ctcgactatg cggtgacgcc cggcggcgcg 120 cgcatccggc ccacgcttct gctcagcgtg gccacgcgct gcggcgacag ccgcccggct 180 ctgtcggacg cggcggcggt ggcgcttgag ctgatccatt gcgcgagcct cgtgcatgac 240 gatctgccct gcttcgacga tgccgagatc cggcgcggca agcccacggt gcatcgcgcc 300 tattccgagc cgctggcgat cctcaccggc gacagcctga tcgtgatggg cttcgaggtg 360 ctggccggcg ccgcggccga ccgaccgcag cgggcgctgc agctggtgac ggcgctggcg 420 gtgcggacgg ggatgccgat gggcatctgc gcggggcagg gctgggagag cgagagccag 480 atcaatctct cggcctatca tcgggccaag accggcgcgc tcttcatcgc cgcgacccag 540 atgggcgcca ttgccgcggg ctacgaggcc gagccctggg aagagctggg agcccgcatc 600 ggcgaggcct tccaggtggc cgacgacctg cgcgacgcgc tctgcgatgc cgagacgctg 660 ggcaagcccg cggggcagga cgagatccac gcccgcccga gcgcggtgcg cgaatatggc 720 gtcgagggcg cggcgaaggg gctgaaggac atcctcggcg gcgccatcgc ctcgatcccc 780 tcctgcccgg ccgaggcgat gctggccgag atggtccgcc gctatgccga caagatcgtg 840 ccggcgcagg tcgcggcccg cgtctga 867 <210> 8 <211> 909 <212> DNA <213> crtE of Synechocystis sp. PCC 6803 <400> 8 atggttgccc aacaaacacg aaccgacttt gatttagccc aatacttaca agttaaaaaa 60 ggtgtggtcg aggcagccct ggatagttcc ctggcgatcg cccggccgga aaagatttac 120 gaagccatgc gttattctct gttggcgggg ggcaaacgat tgcgaccgat tttatgcatt 180 acggcctgcg aactgtgtgg cggtgatgaa gccctggcct tgcccacggc ctgtgccctg 240 gaaatgatcc acaccatgtc cctcatccat gatgatttgc cctccatgga taatgacgat 300 ttccgccggg gtaaacccac taaccacaaa gtgtacgggg aagacattgc cattttggcc 360 ggggatggac tgctagccta tgcgtttgag tatgtagtta cccacacccc ccaggctgat 420 ccccaagctt tactccaagt tattgcccgt ttgggtcgca cggtgggggc cgccggttta 480 gtggggggac aagttctaga cctggaatcg gaggggcgca ctgacatcac cccggaaacc 540 ctaactttta tccataccca taaaaccggg gcattgctgg aagcttccgt gctcacaggc 600 gcaattttgg ccggggccac tggggaacaa caacagagac tggcccgcta tgcccagaat 660 attggcttag cttttcaagt ggtggatgac atcctcgaca tcaccgccac ccaggaagag 720 ttgggtaaaa ccgctggtaa agatgtcaaa gcccaaaaag ccacctatcc cagtctcctc 780 ggtttggaag cttcccgggc ccaggcccaa agtttgattg accaggccat tgtcgccctg 840 gaaccctttg gcccctccgc cgagcccctc caggcgatcg ccgaatatat tgttgccaga 900 aaatattga 909

Claims

라이코펜 생합성 관련 유전자인 crtE, crtB, crtI 을 포함하되, 상기 유전자 crtE, crtB 및 crtI 중 적어도 하나는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 crtE, 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 crtB, 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 crtI 로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

상기 재조합 벡터를 대장균에 형질도입하는 단계; 및

형질도입된 대장균 형질전환체를 배양하여 그 배양액으로부터 라이코펜을 회수하는 단계

를 포함하는 라이코펜의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 재조합 벡터는 라이코펜 생합성 관련 유전자인 crtE, crtB, crtI와 함께 mvaK1, mvaD, mvaK2, mvaE, mvaS 및 idi를 더 포함하되, 상기 유전자 crtE, crtB 및 crtI 중 적어도 하나는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 crtE, 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 crtB, 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 crtI 로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 라이코펜의 생산 방법.
제 2항에 있어서, 재조합 벡터는 crtE, crtB, crtI, mvaK1, mvaD, mvaK2, mvaE, mvaS 및 idi로 구성된 그룹으로부터 선택된 최소 하나의 유전자를 포함하는 적어도 한 개 이상의 별도의 벡터로 제조되며, 상기 별도의 재조합 벡터들에 포함된 유전자를 조합하면 crtE, crtB, crtI, mvaK1, mvaD, mvaK2, mvaE, mvaS 및 idi가 모두 포함되는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 생산 방법.
제 3항에 있어서, 상기 mvaK , mvaD , mvaK2 , mvaE 및 mvaS 유전자와 crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자를 포함하는 각각의 재조합 벡터를 제조한 후 대장균에 형질도입하는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 생산 방법.
제 4항에 있어서, crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자를 포함하는 상기 재조합 벡터는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 crtE 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 crtB 유전자, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 crtI 유전자 및 대장균의 idi 유전자를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 생산 방법.
제 4항에 있어서, crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자를 포함하는 상기 재조합 벡터는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 갖는 crtE 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 crtB 유전자, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 crtI 유전자 및 대장균의 idi 유전자를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 생산 방법.
제 4항에 있어서, crtE, crtB, crtI 및 idi 유전자를 포함하는 상기 재조합 벡터는 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola)에서 유래된 crtE 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 crtB 유전자, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 crtI 유전자 및 대장균의 idi 유전자를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 crtB 및 crtI 유전자는 각각 서열번호 3 및 5로 표시되는 염기서열을 가지며, 상기 crtE 유전자는 서열번호 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 갖거나 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola)에서 유래된 것을 특징으로 하는 라이코펜의 생산 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환체는 배양 온도 25-35℃, 멸균 전 배양액의 pH는 7.0-7.5, 교반속도 200-1,000rpm, 그리고 용존산소의 농도 20-30%가 유지되는 배양 조건하에서 배양되는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 생산 방법.
제 1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환체를 유가식 배양 방법으로 배양함으로써 라이코펜을 대량으로 생산하는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 생산 방법.