CN113699173B

CN113699173B - HbACLB-1基因在提高原核表达菌生长速率、研究橡胶树产胶能力中的应用

Info

Publication number: CN113699173B
Application number: CN202111039513.XA
Authority: CN
Inventors: 龙翔宇; 胡斌; 房平昌; 方永军; 秦云霞; 阳江华; 肖小虎
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2021-09-06
Filing date: 2021-09-06
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2041-09-06
Also published as: CN113699173A

Abstract

本发明提供了一种如SEQ ID NO:2所示的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因及其编码蛋白和应用。本发明发现其将该基因转入原核表达菌株后，能够显著提高菌株在正常条件下的生长速率和抗抗钠、铝胁迫能力，将该原核表达菌株应用于工程菌，生长速度快，能显著提高效率，降低成本等；该基因在橡胶树库组织(胶乳)中高表达，受正常割胶影响蛋白表达上调，受强割影响基因表达上调，与橡胶树胶乳产量呈正相关，可作为靶基因应用在橡胶树产胶的研究中；该基因受乙烯利刺激出现表达下调，表明该基因可能参与外界应激反应，可作为靶基因应用在橡胶树抗逆境胁迫能力的研究中；该基因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他植物的基因工程中得到应用。

Description

HbACLB-1基因在提高原核表达菌生长速率、研究橡胶树产胶能力中的应用

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及HbACLB-1基因在提高原核表达菌生长速率、研究橡胶树产胶能力中的应用。

背景技术

在有机体中，二氧化碳还原的同化发生于羧酸循环过程，即同化四分子的CO2产生一分子的草酰乙酸。在每个循环中，乙酰辅酶A作为前体物质与草酰乙酸反应生成柠檬酸从而进行有机体的整个循环过程。作为这个循环的切入点，乙酰辅酶A是脂肪酸，胆固醇，异戊稀磷酸和某些氨基酸生物合成的基本构成要素，也是植物化学物质产生的必需中间物质。乙酰辅酶A不能直接从质体，线粒体和过氧化物酶体中产生，这是因为这三个胞内部位的膜边界对于辅酶A的衍生物是不可渗透的。由此取代的是，线粒体中的乙酰辅酶A需要在柠檬酸合酶的作用下转化为柠檬酸，然后被转运到细胞质中，从而被柠檬酸裂解酶再次裂解为乙酰辅酶A。另外，没有依据可以表明乙酰辅酶A合酶在胞质中存在以及它通过胞质糖酵解直接生成。因此，柠檬酸裂解酶是胞质辅酶A的主要来源，这个代谢过程是质体内脂肪酸链初始合成，胞质中类异戊二烯化合物和某些植物化学物质产生的关键通路(Fatland BL,KeJ,Anderson MD(2002)Molecular Characterization of a Heteromeric ATP-CitrateLyase That Generates Cytosolic Acetyl-Coenzyme A in Arabidopsis.PlantPhysiology 130(2):740-756；刘家仪,李杨瑞,杨丽涛(2014).ATP-柠檬酸裂解酶研究进展.南方农业学报045(002),P.204-208)。

柠檬酸裂解酶是酰基辅酶A合成酶超家族的成员，该酶是由催化琥珀酰辅酶A生物合成的琥珀酰辅酶A合成酶衍生而来。与琥珀酰辅酶A合成酶相似，柠檬酸裂解酶具有磷酸化的组氨酸基团，它形成了一个不稳定的柠檬酰磷酸中间物，进而在辅酶A的亲核攻击下生成草酰乙酸和乙酰辅酶A。该酶结晶的X射线研究表明，它可被分为氨基端酰基辅酶A合成酶同源结构域和碳端的柠檬酸合酶同源结构域，具有柠檬酸结合功能位点和催化柠檬酰辅酶A裂解生成乙酰辅酶A和草酰乙酸。在光和细菌中的生化研究表明，柠檬酸裂解酶是由大小两个亚基组成，且有不同的催化活性，这两个亚基在体外可重构成柠檬酸裂解酶全酶结构(Wonduck Kim and F.Robert Tabita(2006)Both Subunits of ATP-Citrate Lyase fromChlorobium tepidum Contribute to Catalytic Activity.Journal of Bacteriology188(18):6544-6552；Sun et al.(2010)Identification of the Citrate-binding Siteof Human TP-Citrate Lyase Using X-ray Crystallography.The Journal ofBiological Chemistry 285(35):27418-27428)。

柠檬酸裂解酶广泛存在于动植物、细菌和真菌中。不同于细菌中的裂解酶，柠檬酸裂解酶在动植物中催化分解柠檬酸需要ATP和辅酶A作为不可缺少的底物。在高碳水饮食的动物中，胞质型的柠檬酸裂解酶在脂肪酸的形成中发挥关键作用，这需要以从线粒体中转运出的柠檬酸作为底物。在发育中的大豆子叶中，乙酰辅酶A在脂肪酸合成中的底物来源是柠檬酸裂解酶分解柠檬酸。在成熟的芒果中，葫芦卜素含量的增加是伴随着柠檬酸裂解酶活性的增加(A.K.Matto and V.V.Modi(1970)Citrate cleavage enzyme in mangofruit.Biochemical and Biophysical Research Communications 39(5):895-904；T.M.Kaethner and T.ap Rees(1985)Intracellular location of ATP citrate lyasein leaves of Pisum sativum L.Planta 163:290-294)。

天然橡胶(cis-1,4-聚异戊二烯)是一个重要的工业原料，它是从高度特化的乳管细胞的细胞质(即胶乳)提炼而来。在橡胶树中，蔗糖是胶乳生物合成的主要前体物质。蔗糖在进入糖酵解通路、磷酸戊糖途径和三羧酸循环前需要通过中碱性转化酶裂解为葡萄糖和果糖，从而形成胶乳生物合成的三个基本单元：乙酰辅酶A，NADPH和ATP。在割胶过程中，大量的糖，酶，有机酸和异戊二烯化合物会随胶乳一并流出，为了胶乳产量的可持续性，这些物质需要在下次割胶前充分再生。在橡胶树中，乙酰辅酶A作为橡胶烃的前体物质，是橡胶生物合成的重要限制性因子之一。ACL在胞质中将柠檬酸催化裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸，从而实现线粒体乙酰辅酶A和胞质乙酰辅酶A的转运，此为胞质乙酰辅酶A的主要来源。ACL作为细胞柠檬酸代谢途径的关键酶，通过调控乙酰辅酶A的合成决定碳流分配，直接参与橡胶的生物合成。此外，橡胶树产胶能力与抵抗外界不良因素能力密切相关因此，分析ACL橡胶生物合成以及抵御非生物胁迫中的作用，如盐胁迫、金属离子胁迫，有助于进一步了解ACL的作用机制。目前橡胶树ACL基因相关分析未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，对橡胶树柠檬酸裂解酶基因HbACLB-1进行了基因表达分析和功能研究，发现对该基因转入原核表达菌株后获得的转基因菌株在正常条件下生长速率明显提高，且抗钠(NaCl)、铝(AlCl₃)胁迫能力明显提高，可应用于提高细菌生长速率和抗逆性，且该基因与橡胶树胶乳产量相关，可作为靶基因应用在橡胶树产胶和抗逆境胁迫能力的研究中。

本发明的第一个方面是提供一种橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因，其命名为HbACLB-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本发明第一个方面所述的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第三个方面是提供一种重组表达载体，其包含原始载体和本发明第一个方面所述的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因或其开放阅读框。

其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。其中，所述病毒载体可以选自腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、反转录病毒载体、腺伴随病毒载体、慢病毒载体中的一种，优选为腺病毒载体。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pMAL-c5E载体质粒或pMD18-T载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为pMAL-c5E载体质粒，本发明第一个方面所述的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因与pMAL-c5E载体质粒通过Kpn I和EcoR I双酶切连接。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白质、或者本发明第三个方面所述的重组表达载体在提高原核表达菌株生长速度中的应用。

其中，所述原核表达菌株可以是基因重组领域中常用的原核表达菌株，本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原核表达菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

优选地，所述核表达菌株为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白质、或者本发明第三个方面所述的重组表达载体在提高原核表达菌株抗钠(NaCl)和/或抗铝(AlCl₃)胁迫能力中的应用。

本发明的第六个方面是提供一种重组大肠杆菌，其特征在于，其含有本发明第三个方面所述的重组表达载体。所述重组大肠杆菌的生长速度和抗钠(NaCl)、铝(AlCl₃)胁迫能力明显优于未重组前的大肠杆菌。

本发明的第七个方面是提供本发明的第六个方面所述的重组大肠杆菌在基因工程菌中的应用。

本发明的第八个方面是提供HbACLB-1基因作为靶基因在研究橡胶树抗逆境胁迫能力、和/或研究橡胶树的产胶能力中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明对橡胶树柠檬酸裂解酶基因HbACLB-1进行了基因表达分析和功能研究，发现其将其转入原核表达菌株后，能够显著提高菌株在正常条件下的生长速率和抗钠(NaCl)、铝(AlCl₃)胁迫能力，将携带HbACLB-1基因的原核表达菌株应用于工程菌，工程菌生长速度快，能显著提高效率，降低成本等，在微生物的基因工程中具有良好的应用前景；

(2)HbACLB-1基因在橡胶树库组织(胶乳)中高表达，受正常割胶体系影响蛋白表达上调，受强割影响基因表达上调，与橡胶树胶乳产量呈正相关，可为合理制定割胶体系提供理论依据，可作为靶基因应用在橡胶树产胶的研究中；

(3)HbACLB-1基因受乙烯利刺激表达下调，表明该基因可能参与外界应激反应，可作为靶基因应用在橡胶树抗逆境胁迫能力的研究中；

(4)HbACLB-1基因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他植物的基因工程中得到应用。

附图说明

图1为HbACLB-1基因的组织特异性表达分析结果(胶乳、花、茎、树皮、种子、叶片)。

图2为HbACL家族基因在胶乳中表达分析结果。

图3为正常割胶对胶乳HbACL蛋白活性的影响。

图4为正常割胶对HbACLB-1蛋白表达的影响。

图5为强割胶对HbACLB-1基因表达的影响。

图6为乙烯利对HbACLB-1基因表达的影响。

图7为HbACLB-1原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果。

图8为HbACLB-1原核表达蛋白活性检测结果。

图9为转基因工程菌在正常情况下、Na⁺和Al⁺胁迫下生长速率测定结果。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1.橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因(HbACL)的获得

分析已在NCBI登陆的拟南芥、水稻及麻风树的柠檬酸裂解酶(ACL)的核苷酸序列，通过搜索我们建立的橡胶树胶乳EST序列数据库，筛选并拼接一条2200bp左右的橡胶树柠檬酸裂解酶基因组装后序列(contig)，设计一对特异引物扩增得到包含完整读码框的cDNA全长序列。

cDNA克隆具体方法如下：

特异性引物设计如下：

F(5’端)：5'-CACTAGCGCATAAATTCCACTCTGTGAGCT-3'

R(3’端)：5'-ATGGCAACATTTCTCTGAATAAATGGTCGGAAC-3'

以巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)胶乳cDNA为模板(以随机引物反转录获得)，F和R为引物，其终浓度为0.4μmol/L，在20μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45S，68℃退火3min，共34次循环；72℃延伸10min。

将该PCR获得的片段连接到pMD18-T载体(TaKaRa)进行测序，测序表明上述获得的片段即为本发明的柠檬酸裂解酶基因，该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，序列表中序列2全长为2253个核苷酸，包含一个长度为1827个核苷酸的开放阅读框(ORF，自序列2的5’端第221-2047位核苷酸序列)、220个核苷酸的5’-UTR(自序列2的5’端第1-220位核苷酸序列)和206个核苷酸的3’-UTR(自序列2的5’端第2048-2253位核苷酸序列)，编码一个长度为608(不包含终止密码子编码的氨基酸)的氨基酸(序列表中序列1)、分子量约为66kDa的蛋白，即为柠檬酸裂解酶，将该基因命名为HbACLB-1。将上述含有序列表中序列2的核苷酸的pMD18-T重组载体命名为pMD18-HbACLB-1。除此之外，利用亚细胞定位在线软件分析该蛋白的氨基酸序列，发现该蛋白定位于细胞质中，因此HbACLB-1可能属于橡胶树胞质型蛋白。

2.原核表达与HbACLB-1基因的功能验证

利用pMAL-c5E表达载体(pMAL-c5E(质粒)表达载体购自New England Biolabs公司)构建了HbACLB-1基因的原核表达载体(本实施例中表达载体仅为举例，本发明也可以采用其他表达质粒和病毒载体等)，同时利用大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)(菌株购自TransGen Biotech公司)诱导重组蛋白，测定重组蛋白活性及其对BL21生长速率的影响，具体方法如下：

<1>含HbACLB-1基因编码区重组载体的获得

设计HbACLB-1基因编码区引物(F：5'-GACGATGACAAGGTACCGCATATGGCCACTGGACAACTC-3'，R：5'-ATTACCTGCAGGGAATTCGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGATGCTTGGTGTAGAGAACATCTTC-3'，以pMD18-HbACLB-1为模版，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性45S，68℃退火2min，共34次循环；72℃延伸5min。将扩增产物与pMAL-c5E表达载体进行Kpn I和EcoR I双酶切并连接，得到重组载体，利用基因特异引物(HbACLB-1基因编码区引物)进行PCR鉴定，确保柠檬酸裂解酶编码片段克隆到表达载体。重组载体进行测序鉴定，将鉴定表明正确的含有序列表中序列2的第221-2047位核苷酸序列、读框准确的重组表达载体命名为pMAL-c5E-HbACLB-1。

<2>HbACLB-1基因的原核表达

将获得的重组载体pMAL-c5E-HbACLB-1以及对照载体pMAL-c5E-Empty(空载体)导入E.coli BL21(DE3)中(感受态购自天根生化科技有限公司)，得到重组表达菌，将鉴定正确的重组菌在含100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中培养至OD600＝0.4～0.6，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为1mM，16℃下诱导培养8-12h，离心收集菌体，菌体蛋白进行12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图7所示。结果表明，在IPTG诱导下HbACLB-1基因实现了在胞质中的高效异源表达，且重组蛋白包含了HbACLB-1以及胞质融合蛋白MBP(麦芽糖结合蛋白)，总分子量大约为115kDa(HbACLB-1大约为70kDa，MBP大约45kDa)。

<3>HbACLB-1重组蛋白纯化后活性检测

按照“<2>HbACLB-1基因的原核表达”上述方法收集菌体，低温超声破碎，离心收集上清，待纯化过后测定柠檬酸裂解酶活性。活性测定于正常条件下进行(30℃，pH 7.0)，测定体系如下(以下均为工作浓度)：100mM Tris-Hcl,5mM MgCl₂,10mM柠檬酸钾,0.2mM辅酶A,10mM ATP,40U苹果酸脱氢酶,1mM DTT,10μl ACLB-1(根据实际的蛋白浓度加量)，补充ddH₂O至200μl。使用酶标仪在340nm波长下连续测定30min内的吸光度值变化，检测NADH的减少量。测定结果如图8所示：含有pMAL-c5E-HbACLB-1的菌株其吸光度值变化明显高于含有pMAL-c5E-Empty对照菌株，这说明HbACLB-1基因编码的蛋白确实具有柠檬酸裂解酶的催化活性。

<4>HbACLB-1转基因工程菌在Na⁺和Al⁺胁迫下的生长增幅

按照“<2>HbACLB-1基因的原核表达”上述方法活化菌株，并将含有pMAL-c5E-HbACLB-1和pMAL-c5E-Empty的菌株培养至相同OD600＝0.4，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为1mM，37℃下培养OD600至0.8-1.0，吸取部分菌液，用LB培养基补充至100ml(初始OD值如表1)，添加IPTG至终浓度为1mM。在无离子胁迫、100mM NaCl胁迫、300mM NaCl胁迫及50mM AlCl₃胁迫下，37℃培养0h、4h及8h后分别测定其OD600值(如表1，如图9)，分别计算4h、8h相对0h时间点下的生长增幅，其中4h的生长增幅为(OD600_4h-OD600_0h)/OD600_0h×100％；8h的生长增幅为(OD600_8h-OD600_0h)/OD600_8h×100％，并进行pMAL-c5E-HbACLA-1和pMAL-c5E-Empty菌株的对比(如表2)。

在无离子胁迫时(图9A)，含有pMAL-c5E-HbACLB-1的菌株生长增幅明显高于pMAL-c5E-Empty对照菌株，4小时提升增幅70.148％，8小时提升增幅423.756％，说明HbACLB-1基因编码的蛋白能够提高菌株在正常条件下的生长。在100mM Na⁺(图9B)胁迫时，含有pMAL-c5E-HbACLB-1的菌株比pMAL-c5E-Empty对照菌株4小时提升增幅32.377％，8小时提升增幅319.399％；在300mM Na⁺(图9C)胁迫时，含有pMAL-c5E-HbACLB-1的菌株比pMAL-c5E-Empty对照菌株4小时提升增幅78.994％，8小时提升增幅216.127％；在50mM Al⁺(图9D)胁迫时，含有pMAL-c5E-HbACLB-1的菌株比pMAL-c5E-Empty对照菌株4小时提升增幅13.829％，8小时提升增幅22.680％；以上的实验结果表明，HbACLB-1基因编码的蛋白可以提升原核表达菌的生长,以及在Na⁺、Al⁺胁迫下的生长。

表1 pMAL-c5E-HbACLB-1的菌株(HbACLB-1)及pMAL-c5E-Empty对照菌株(Empty)在无处理、100mM NaCl处理、300mM NaCl处理、以及50mM AlCL₃处理下生长OD600变化情况

表2 pMAL-c5E-HbACLB-1的菌株(HbACLB-1)及pMAL-c5E-Empty对照菌株(Empty)在无处理、100mM NaCl处理、300mM NaCl处理、以及50mM AlCL₃处理下生长4h、8h增幅情况

“HbACLB-1:Empty”表示相对于pMAL-c5E-Empty对照菌株，含有pMAL-c5E-HbACLB-1的菌株的生长增幅的提升情况

3.HbACLB-1表达模式分析

<1>HbACLB-1基因组织特异性表达

以橡胶树7-33-97胶乳、花、茎、树皮、种子和叶片等六种组织RNA随机反转录cDNA为模板，用HbACLB-1基因特异引物(F:5'-TCAATTCATCAATCGGCGAGT-3'；R:5'-GGATGGGAAGCTGCTTGTAATT-3')进行实时荧光定量PCR，结果如图1所示(相对表达量以种子的表达量为对照)，HbACLB-1基因在胶乳、种子、花中高表达，树皮、茎及叶片中表达相对较低。进一步对胶乳ACL家族基因转录组数据分析发现，如图2所示，HbACLB-1是次最高表达的基因。

<2>割胶对胶乳ACL活性及HbACLB-1蛋白表达的影响

未开割巴西橡胶树热研7-33-97在进行割胶后收集胶乳，进行胶乳中C-乳清的ACL活性分析。如图3所示，在前三刀，ACL的活性变化不明显，而在第五、七、九刀时，ACL活性明显增加。对第一、三、五、七刀的蛋白表达分析发现，如图4所示，HbACLB-1蛋白在第一、三刀时的表达无明显变化，而在第五、七刀时的蛋白表达量明显增加。这表明HbACLB-1蛋白可能与总ACL活性有关。

<3>强割对HbACLB-1基因表达的影响

对未开割巴西橡胶树热研7-33-97进行强割处理，共五个时间点，0h，0.5h，1h，2h，4h。以不同强割刀次的胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbACLB-1基因的特异引物(F:5'-TCA ATT CAT CAA TCG GCG AGT-3'；R:5'-GGA TGG GAA GCT GCT TGT AAT T-3')进行实时荧光定量PCR。如图5所示，表明强割明显影响HbACLB-1基因的表达，与0h相比，0.5h和1h的强割处理使HbACLB-1的表达部分下调；与0.5h相比，在2h和4h时的处理诱导HbACLB-1表达明显上调(P<0.05)。

<4>乙烯利对HbACLB-1基因表达的影响

选取已开割橡胶树，将乙烯利涂于橡胶树割线以及割线上方1cm割面处进行刺激处理，刺激分为三个时间段，12h、24h及48h。以胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbACLB-1基因特异引物(F:5'-TCA ATT CAT CAA TCG GCG AGT-3'；R:5'-GGA TGG GAAGCTGCT TGT AAT T-3')进行实时荧光定量PCR。如图6所示，乙烯利刺激12h，24h，48h后HbACLB-1基因的表达量均明显低于未处理的，以12h时的表达下降最为明显，在24h和48h时其表达量有较弱的连续增加。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> HbACLB-1基因在提高原核表达菌生长速率、研究橡胶树产胶能力中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 608

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Met Ala Thr Gly Gln Leu Phe Ser Arg Thr Thr Gln Ala Leu Phe Tyr

1 5 10 15

Asn Tyr Lys Gln Leu Pro Ile Gln Arg Met Leu Asp Phe Asp Phe Leu

20 25 30

Cys Gly Arg Glu Thr Pro Ser Val Ala Gly Ile Ile Asn Pro Gly Ala

35 40 45

Glu Gly Phe Gln Lys Leu Phe Phe Gly Gln Glu Glu Ile Ala Ile Pro

50 55 60

Val His Ser Thr Ile Glu Val Ala Cys Ala Ala His Pro Thr Ala Asp

65 70 75 80

Val Phe Ile Asn Phe Ala Ser Phe Arg Ser Ala Ala Val Ser Ser Met

85 90 95

Ala Ala Leu Lys Gln Pro Thr Ile Arg Val Val Ala Ile Ile Ala Glu

100 105 110

Gly Val Pro Glu Ser Asp Thr Lys Gln Leu Ile Ala Tyr Ala Arg Ser

115 120 125

Asn Asn Lys Val Val Ile Gly Pro Ala Thr Val Gly Gly Ile Gln Ala

130 135 140

Gly Ala Phe Lys Ile Gly Asp Thr Ala Gly Thr Ile Asp Asn Ile Ile

145 150 155 160

Ala Cys Lys Leu Tyr Arg Pro Gly Ser Val Gly Phe Val Ser Lys Ser

165 170 175

Gly Gly Met Ser Asn Glu Leu Tyr Asn Thr Ile Ala Arg Val Thr Asp

180 185 190

Gly Ile Tyr Glu Gly Ile Ala Ile Gly Gly Asp Val Phe Pro Gly Ser

195 200 205

Thr Leu Ser Asp His Val Leu Arg Phe Asn Asn Ile Pro Gln Val Lys

210 215 220

Met Met Val Val Leu Gly Glu Leu Gly Gly Arg Asp Glu Tyr Ser Leu

225 230 235 240

Val Glu Ala Leu Lys Gln Gly Lys Val Thr Lys Pro Val Val Ala Trp

245 250 255

Val Ser Gly Thr Cys Ala Arg Leu Phe Lys Ser Glu Val Gln Phe Gly

260 265 270

His Ala Gly Ala Lys Ser Gly Gly Glu Met Glu Ser Ala Gln Ala Lys

275 280 285

Asn Gln Ala Leu Lys Asp Ala Gly Ala Val Val Pro Thr Ser Tyr Glu

290 295 300

Ala Phe Glu Thr Ala Ile Lys Glu Thr Phe Gln Lys Leu Val Glu Glu

305 310 315 320

Gly Lys Ile Thr Pro Val Lys Glu Ile Lys Pro Pro Gln Ile Pro Glu

325 330 335

Asp Leu Asn Thr Ala Ile Lys Ser Gly Lys Val Arg Ala Pro Thr His

340 345 350

Ile Ile Ser Thr Ile Ser Asp Asp Arg Gly Glu Glu Pro Cys Tyr Ala

355 360 365

Gly Val Pro Met Ser Ser Ile Val Glu Gln Gly Tyr Gly Val Gly Asp

370 375 380

Val Ile Ser Leu Leu Trp Phe Lys Arg Ser Leu Pro Arg Tyr Cys Thr

385 390 395 400

His Phe Ile Glu Ile Cys Ile Met Leu Cys Ala Asp His Gly Pro Cys

405 410 415

Val Ser Gly Ala His Asn Thr Ile Val Thr Ala Arg Ala Gly Lys Asp

420 425 430

Leu Val Ser Ser Leu Val Ser Gly Leu Leu Thr Ile Gly Pro Arg Phe

435 440 445

Gly Gly Ala Ile Asp Asp Ala Ala Arg Tyr Phe Lys Asp Ala Tyr Asp

450 455 460

Arg Gly Leu Thr Pro Tyr Glu Phe Val Glu Ser Met Lys Lys Lys Gly

465 470 475 480

Ile Arg Val Pro Gly Ile Gly His Arg Ile Lys Arg Gly Asp Asn Arg

485 490 495

Asp Lys Arg Val Glu Leu Leu Gln Leu Phe Ala Arg Thr His Phe Pro

500 505 510

Ser Val Lys Tyr Met Glu Tyr Ala Val Gln Val Glu Thr Tyr Thr Leu

515 520 525

Ser Lys Ala Asn Asn Leu Val Leu Asn Val Asp Gly Ala Ile Gly Ser

530 535 540

Leu Phe Leu Asp Leu Leu Ala Gly Ser Gly Met Phe Thr Lys Pro Glu

545 550 555 560

Ile Asp Glu Ile Val Glu Ile Gly Tyr Leu Asn Gly Leu Phe Val Leu

565 570 575

Ala Arg Ser Ile Gly Leu Ile Gly His Thr Phe Asp Gln Lys Arg Leu

580 585 590

Lys Gln Pro Leu Tyr Arg His Pro Trp Glu Asp Val Leu Tyr Thr Lys

595 600 605

<210> 3

<211> 2253

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

cactagcgca taaattccac tctgtgagct aactactggg ggccacgtga ccagctcctt 60

cctccctctt ctcctcacgt ggcagctgca attttcttct accattctcc cctatatatt 120

tgatatttcc ctctcaattc atcaatcggc gagttttgct tttgggaagc ttaattaacc 180

gagtctctcc atttctcttc aggtctgttg agcctacacc atggccactg gacaactctt 240

ctctcgtact acacaggctc tgttttacaa ttacaagcag cttcccatcc agcgcatgct 300

cgatttcgat ttcctttgcg ggagagaaac tccatctgtg gctggaatta ttaaccctgg 360

tgcagaggga ttccagaaac tcttctttgg tcaagaggaa attgcgatcc ctgtacattc 420

aactattgag gtggcttgtg ctgctcaccc aactgctgat gtatttatta actttgcatc 480

atttagaagt gcggccgtat catccatggc tgccctgaag cagcctacca ttcgagttgt 540

ggctataata gctgaaggag ttcctgagtc tgacaccaaa cagttaattg cgtatgcacg 600

atctaacaat aaggttgtca ttggcccagc tactgtcgga ggcattcagg ctggagcatt 660

caagataggt gacactgctg gaacaattga caacataatt gcttgcaagc tgtacaggcc 720

tggatccgtt ggatttgtgt ccaaatctgg tggtatgtca aatgagctat acaatacaat 780

cgctcgtgta acagatggca tatatgaagg tattgcaatt ggaggagatg tgtttccagg 840

ctccactctt tctgatcatg ttttgcggtt taataatatc ccacaggtta agatgatggt 900

tgtactcggg gaacttggtg gacgagacga gtattccctt gttgaagctc tcaaacaagg 960

aaaggtgacc aaaccagtag ttgcttgggt cagtggaaca tgtgcacggc tcttcaaatc 1020

agaagtgcaa tttggccatg ctggtgctaa aagtggtggt gagatggagt ctgctcaagc 1080

aaaaaatcaa gcattaaagg atgctggagc tgtagttccc acttcgtacg aggcttttga 1140

gactgcaatt aaggaaacat ttcaaaagct ggtggaagag ggtaagatta cacctgtaaa 1200

ggagattaaa cctccacaaa tccctgagga tcttaacaca gcaattaaga gtggcaaagt 1260

tcgggctcca actcatatta tttccacaat ttctgatgac agaggtgaag agccatgcta 1320

tgctggtgtg ccaatgtcat ccattgttga acagggttat ggtgttggtg atgtcatctc 1380

tcttttgtgg ttcaagcgca gccttccacg atactgtact cattttattg agatatgcat 1440

catgctatgt gctgaccatg gtccttgtgt ctctggtgct cacaacacta tagtaacagc 1500

tagagctgga aaggacctag tttccagcct tgtctcaggt ttgctcacaa ttggtccccg 1560

atttggtggt gctattgatg atgctgctcg atactttaag gatgcatatg acaggggtct 1620

aacaccctat gagtttgttg aaagcatgaa aaagaagggt attcgtgtcc ctggaattgg 1680

gcacaggatc aagagaggtg acaacagaga taaaagggta gagctcttac agctatttgc 1740

tcgcacacat ttcccttccg taaagtacat ggagtatgct gttcaagttg aaacctatac 1800

tctatcgaag gccaataacc tggtgcttaa tgttgatggt gcgattgggt cccttttctt 1860

ggatcttctt gctggcagtg gaatgtttac caaaccggag atagatgaga ttgttgagat 1920

tggttatttg aatgggctct ttgtgttggc acgctccatt ggtctgattg ggcacacatt 1980

cgaccagaag agattgaaac agccactgta ccgtcaccca tgggaagatg ttctctacac 2040

caagtgagag aaatgcagat agcaggtgca atgctgacct gctttataca agcttttcaa 2100

tttcgaaatt tgatgagttt gcaatttgct gcgatgcatg ttcagttgtt agattagtgt 2160

tgtactgtgg taggctgagg accataattt gtaacttgta ccagaagtcg acaagttggg 2220

ttccgaccat ttattcagag aaatgttgcc ata 2253

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

cactagcgca taaattccac tctgtgagct 30

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

atggcaacat ttctctgaat aaatggtcgg aac 33

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

gacgatgaca aggtaccgca tatggccact ggacaactc 39

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

attacctgca gggaattcgg atcctcaatg gtgatggtga tgatgcttgg tgtagagaac 60

atcttc 66

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

tcaattcatc aatcggcgag t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

ggatgggaag ctgcttgtaa tt 22

Claims

1.一种核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因、或者氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质、或者重组表达载体在提高原核表达菌株生长速度中的应用；所述的重组表达载体包含原始载体和所述的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因或其开放阅读框。

2.一种核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因、或者氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质、或者重组表达载体在提高原核表达菌株抗钠和/或抗铝胁迫能力中的应用；所述的重组表达载体包含原始载体和所述的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因或其开放阅读框。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述原始载体为pMAL-c5E载体质粒，所述的橡胶树柠檬酸裂解酶编码基因与pMAL-c5E载体质粒通过Kpn I和EcoR I双酶切连接。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述原核表达菌株为大肠杆菌E. coliBL21（DE3）。

5.HbACLB-1基因作为靶基因在研究橡胶树抗逆境胁迫能力、和/或研究橡胶树的产胶能力中的应用，所述的HbACLB-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。