CN114134156A - 一种调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法 - Google Patents

一种调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法 Download PDF

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leu
lys
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肖小虎
方永军
唐朝荣
莫春演
隋金蕾
龙翔宇
秦云霞
阳江华
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Abstract

本发明提供一种调控HbCBL1和/或HbCIPK15基因表达的方法，具体为通过割胶刺激和/或乙烯利刺激树体调控橡胶树中HbCBL1和/或HbCIPK15基因表达，本发明克隆了橡胶树HbCIPK15和HbCBL1基因的全长cDNA，首次利用酵母双杂交实验证实HbCIPK15和HbCBL1两个蛋白具有较强的互作，基因表达分析表明二者的表达明显受到乙烯利刺激和割胶的影响，说明HbCBL1‑HbCIPK15调控因子在乳管信号接收和传递方面具有重要功能，可作为橡胶树转基因育种的重要靶基因，有望通过调控该基因的表达来合理调节乳管乙烯和割胶信号传递，进而调控橡胶树胶乳再生，挖掘橡胶树最大生产潜力。

Description

一种调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法
技术领域
本发明涉及基因表达技术领域，特别涉及一种调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法。
背景技术
钙离子(Ca2+)作为植物细胞第二信使，介导多种植物对外界刺激的应答反应，并广泛调节各种生理过程。植物细胞内Ca2+浓度处于不断的变化中，当遇到各种逆境信号，如高温、干旱、机械伤害、激素刺激等都会引起Ca2+浓度的改变，不同外界信号需要不同的Ca2+感受器接收并传递信号。钙结合蛋白，如钙调磷酸酶B类似蛋白(CBL)，就是植物中一种重要的Ca2+感受器。CBL没有激酶结构域，但它能够特异地与蛋白激酶CIPKs发生互作，进而共同调节植物的逆境胁迫应答和生长发育。CIPK蛋白由N端蛋白激酶结构域和C端调节结构域组成，CBLs通过C端与CIPKs相互作用，C端的部分区域在不同的CIPK成员之间具有保守性。
CBL-CIPKs广泛参与植物的各种胁迫应答反应。CBL和CIPK的生理作用首次在盐过度敏感(SOS)途径中被发现，在拟南芥中，SOS3(CBL4)和SOS2(CIPK24)协同作用激活拟南芥根中质膜Na+/H+逆向转运体SOS1的活性，促使高盐环境中细胞的Na+外流，从而增强植物的耐盐性。在拟南芥中，与CIPK24/SOS2相互作用的CBL10(SCaBP8)几乎只在芽和叶中表达并发挥作用，可能与盐向液泡的转运有关，从而控制细胞盐稳态。CBL1和CBL9都以CIPK23为互作蛋白，而CIPK23可以调节钾(K)的吸收和气孔运动。CBL2和CBL7与CIPK11相互作用，在调节质膜H+-ATP酶活性发面发挥不同的作用。关于CBLs和CIPKs的研究在多种植物中均有报道，如专利CN103555740A《一种小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子及其编码基因与应用》公开了CBL-CIPK在提高小麦抗逆性中的作用、如CN108342412A《CIPK2在提高水稻抗/耐汞能力中的应用》公开了CIPK2在提高水稻抗/耐汞能力中的应用，还有水稻、毛果杨、油菜、梨等，表明了它们在逆境胁迫和植物生长发育过程中的重要作用。然而，CBL和CIPK基因在橡胶树中的研究却未见报道。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法，采用割胶或乙烯利刺激调控HbCBL1和/或HbCIPK15在橡胶中表达的方法。
优选的，所述HbCBL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述HbCIPK15的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述调控为上调或下调HbCBL1和/或HbCIPK15表达量。
优选的，所述割胶的刀次为1～9刀。
优选的，通过割胶3～9刀次，下调PR107品系的橡胶树中HbCBL1和HbCIPK15的表达量，下调热研8-79品系的橡胶树中HbCBL1的表达量。
优选的，通过割胶7～9刀次，上调热研8-79品系的橡胶树中HbCIPK15的表达量。
优选的，通过采取乙烯利刺激上调HbCBL1和/或HbCIPK15在橡胶树中的表达量。
优选的，所述乙烯利的质量浓度为1.5％。
优选的，所述乙烯利的施用部位为橡胶树的叶片、树皮、根、种子、雄花和/或雌花。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种调控HbCBL1与HbCIPK15表达的方法，具体为通过割胶刺激和/或乙烯利刺激树体调控橡胶树中HbCBL1和/或HbCIPK15基因表达，本发明克隆了橡胶树HbCIPK15和HbCBL1基因的全长cDNA，首次利用酵母双杂交实验证实HbCIPK15和HbCBL1两个蛋白具有较强的互作，基因表达分析表明二者的表达明显受到乙烯利刺激和割胶的影响，说明HbCBL1-HbCIPK15调控因子在乳管信号接收和传递方面具有重要功能，可作为橡胶树转基因育种的重要靶基因，有望通过调控该基因的表达来合理调节乳管乙烯和割胶信号传递，进而调控橡胶树胶乳再生，挖掘橡胶树最大生产潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对附图作简单地介绍。
图1为本发明HbCIPK15与HbCBL1基因在割胶刀次刺激后的胶乳中的表达，图中A为HbCIPK15基因在PR107割胶不同刀次胶乳中的表达，B为HbCIPK15基因在热研8-79割胶不同刀次胶乳中的表达，C为HbCBL1基因在PR107割胶不同刀次胶乳中的表达，D为HbCBL1基因在热研8-79割胶不同刀次胶乳中的表达；
图2为本发明HbCIPK15与HbCBL1基因在乙烯利刺激后的胶乳中的表达，图中E为HbCIPK15基因在乙烯利刺激后胶乳中的表达，F为HbCBL1基因在乙烯利刺激后的胶乳中的表达；
图3为本发明HbCIPK15与HbCBL1蛋白互作检测(酵母双杂涂板)；
图4为本发明HbCIPK15与HbCBL1蛋白互作强弱分析(点斑实验)；
图5为本发明HbCIPK18与HbCBL1蛋白互作强弱分析(点斑实验)。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，并结合附图对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 HbCBL1-HbCIPK15及其编码基因的获得
分析已在NCBI登陆的拟南芥、杨树和蓖麻的CBL和CIPK的核苷酸序列，通过搜索我们建立的橡胶树胶乳转录组数据库，获得一条编码区长度为672bp的橡胶树钙调磷酸酶B类似蛋白(命名HbCBL1)cDNA序列和编码区长度为1380bp的CBL互作激酶蛋白(命名HbCIPK15)cDNA序列，设计特异性引物扩增得到这个两个基因的cDNA片段，获得包含完整读码框的cDNA全长序列。
具体方法如下：
<1>cDNA片段克隆
HbCBL1和HbCIPK15特异性引物设计如下：
HbCBL1F(5’端)：5’-GAA GTG GGA AAT GGT TAA CAG GTA T-3’；
HbCBL1R(3’端)：5’-CTC TCT TGC CCT TTA CAT CTG TTA G-3’。
HbCIPK15F(5’端)：5’-GCT GCT TCT ACT GTG CGT AAC TCT T-3’；
HbCIPK15R(3’端)：5’-GGA CAC ACA ACC ATA AGT CAT CAT T-3’。
以巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育)胶乳cDNA为模板(以OligdT引物反转录获得)，F和R为引物，其终浓度为0.4μmol/L，在20μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，30次循环；72℃延伸10min。获得和目标条带大小一致的条带。将PCR获得的片段连接到pMD18-T载体(TaKaRa)进行测序，测序表明上述获得的片段即为本发明的HbCBL1和HbCIPK15，其中SEQ ID NO.1为HbCBL1的CDS序列，SEQ ID NO.2为HbCBL1的氨基酸序列，SEQ ID NO.3为HbCIPK15的CDS序列，SEQ ID NO.4为HbCIPK15的氨基酸序列。
实施例2割胶对HbCBL1和HbCIPK15基因的表达影响
供试品种：未开割巴西橡胶树热研8-79和PR107
方法：以不同割胶刀次后采集的胶乳的RNA随机反转录的cDNA为模板(三天一刀，连续割9刀，采样其中第1、3、5、7和9刀，共五刀)，分别用HbCBL1基因特异引物和HbCIPK15基因特异引物进行实时荧光定量PCR。
结果表明，HbCIPK15在PR107(图1A)和热研8-79(图1B)割胶后的表达变化趋势基本一致，均为先下调表达后上调表达，其中在PR107中的下降趋势更加明显；HbCBL1在PR107(图1C)和热研8-79(图1D)割胶后的表达变化趋势也一致，同样是先下调后缓慢上升。
实施例3乙烯利刺激对HbCBL1和HbCIPK15基因表达的影响
供试品种：未开割巴西橡胶树热研7-33-97
方法：将质量浓度为1.5％乙烯利涂抹在橡胶树割线以及割线上方1cm割面处，并同时割胶1刀次，在乙烯利刺激0小时、3小时、12小时和24小时后采集胶乳，计算FPKM值(Fragments Per Kilobase per Million)，分析乙烯利刺激对HbCBL1和HbCIPK15基因表达的影响。
结果显示，在乙烯利刺激后，HbCIPK15(图2E)和HbCBL1(图2F)表达变化趋势基本一致，均在0到3小时上调表达，3到12小时下调表达，然后12到24小时上调表达；与0小时相比，在乙烯利刺激后HbCBL1和HbCIPK15基因均为上调表达。
实施例4 HbCIPK15与HbCBL1蛋白互作分析
利用酵母双杂交系统，我们构建了HbCIPK15-AD(pGADT7)和HbCBL1-BD(pGBKT7)酵母表达载体，将构建好的AD和BD载体转入酵母，在二缺、三缺和四缺培养基上培养，观察生长情况，具体方法如下：
<1>HbCIPK15-AD和HbCBL1-BD酵母表达载体构建
设计HbCIPK15基因编码区引物(F:5'-GGA ATT CAT GGA AAA TAA ACC CAG TATCTT G-3'，R:5'-CGG ATC CCT ATG TCA TTG CTG CAG CTG CTG CT-3')，以pMD18-HbCIPK15为模版，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火2min，共30次循环；72℃延伸5min。将扩增产物双酶切与同样双酶切回收的pGADT7酵母表达载体进行连接，得到重组载体HbCIPK15-AD，提质粒送往公司测序验证。
按同样流程构建HbCBL1-BD载体，HbCBL1-AD引物(F:5'-CCA TAT GAT GTT GCAGTG CAT AGA GGG AT-3'，R:5'-GCG TCG ACT TAC ATG TCA TCA ACT TGT GAG T-3')，以pMD18-HbCBL1为模版，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火1min，共30次循环；72℃延伸5min。将扩增产物双酶切与同样双酶切回收的pGBKT7酵母表达载体进行连接，得到重组载体HbCBL1-BD，提质粒送往公司测序验证。
<2>HbCIPK15-AD和HbCBL1-BD酵母双杂交
将获得的载体HbCIPK15-AD和HbCBL1-BD共同转化酵母菌株中，分别涂在二缺(SD/-Leu/Trp)和四缺(SD/-Leu/Trp/-His/-Ade)培养基上观察生长情况。另外，同时设置HbCIPK15-AD加BD空载和HbCBL1-BD加AD空载作为对照。
从图3中可以看出，HbCIPK15-AD加BD空载和HbCBL1-BD加AD空载的对照组实验均是在二缺培养基上生长，而四缺培养基上不生长，而HbCIPK15-AD加HbCBL1-BD共同转化酵母菌株在二缺和四缺培养基上均能生长，并且在四缺培养基上面长出了较多的斑，说明HbCIPK15和HbCBL1之间有较强的互作。
<3>HbCIPK15和HbCBL1互作强度验证
将转化HbCIPK15-AD加HbCBL1-BD的酵母菌株分不同稀释梯度(10-1，10-2，10-3，10-4)分别涂在二缺，三缺，三缺加3-AT和四缺培养基上观察酵母生长情况。
从实验结果可以看出，虽然转化HbCIPK15-AD加HbCBL1-BD的酵母在三缺和四缺培养基上的生长受到抑制，但仍能很好地生长，说明HbCIPK15和HbCBL1互作较强(图4)，同时我们还做了HbCIPK18和HbCBL1的互作验证，转化后HbCIPK18-AD加HbCBL1-BD的酵母仅能在二缺培养基生长，三缺和四缺培养基上均不生长，说明HbCIPK18和HbCBL1之间不互作，从侧面说明HbCIPK15和HbCBL1互作较强(图5)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所
<120> 一种调控HbCBL1与HbCIPK15表达的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 672
<212> DNA/RNA
<213> Hevea brasiliensis
<400> 1
atgttgcagt gcatagaggg attcattact tccctactgc ggtgttgtga tcttgattta 60
tataaacaat caagaggcct tgaagaccct gaacgtcttg ccagggagac tgtgttcagt 120
gtgagtgaaa tagaggcact gtatgagctc tttaagaaga tcagcagcgc cgtgattgat 180
gacggcctga tcaacaagga ggagtttcaa ttagcattgt tcaagacaaa caagaaagag 240
agcttatttg ctgatcgggt ctttgatttg tttgatacaa aacataatgg gatcctagga 300
tttgaagagt ttgctcgtgc cctctctgtt tttcatccaa atgcccccat tgatgataag 360
attgaatttt cttttcaatt gtatgatctc aaacagcaag gttttattga gagacaggag 420
gtgaaacaaa tggtagttgc tactctagct gaatctggta tgaacctttc agatgatgtc 480
atcgagagta taattgacaa gacctttgag gaagctgata caaaacatga cggcaagatt 540
gacaaggaag agtggagaag ccttgttctg cgccatccat ctcttctgaa gaatatgact 600
cttcagtatc taaaggatat tactactaca ttcccaagtt ttgtgttcca ctcacaagtt 660
gatgacatgt aa 672
<210> 2
<211> 223
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 2
Met Leu Gln Cys Ile Glu Gly Phe Ile Thr Ser Leu Leu Arg Cys Cys
1 5 10 15
Asp Leu Asp Leu Tyr Lys Gln Ser Arg Gly Leu Glu Asp Pro Glu Arg
20 25 30
Leu Ala Arg Glu Thr Val Phe Ser Val Ser Glu Ile Glu Ala Leu Tyr
35 40 45
Glu Leu Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ala Val Ile Asp Asp Gly Leu Ile
50 55 60
Asn Lys Glu Glu Phe Gln Leu Ala Leu Phe Lys Thr Asn Lys Lys Glu
65 70 75 80
Ser Leu Phe Ala Asp Arg Val Phe Asp Leu Phe Asp Thr Lys His Asn
85 90 95
Gly Ile Leu Gly Phe Glu Glu Phe Ala Arg Ala Leu Ser Val Phe His
100 105 110
Pro Asn Ala Pro Ile Asp Asp Lys Ile Glu Phe Ser Phe Gln Leu Tyr
115 120 125
Asp Leu Lys Gln Gln Gly Phe Ile Glu Arg Gln Glu Val Lys Gln Met
130 135 140
Val Val Ala Thr Leu Ala Glu Ser Gly Met Asn Leu Ser Asp Asp Val
145 150 155 160
Ile Glu Ser Ile Ile Asp Lys Thr Phe Glu Glu Ala Asp Thr Lys His
165 170 175
Asp Gly Lys Ile Asp Lys Glu Glu Trp Arg Ser Leu Val Leu Arg His
180 185 190
Pro Ser Leu Leu Lys Asn Met Thr Leu Gln Tyr Leu Lys Asp Ile Thr
195 200 205
Thr Thr Phe Pro Ser Phe Val Phe His Ser Gln Val Asp Asp Met
210 215 220
<210> 3
<211> 1380
<212> DNA/RNA
<213> Hevea brasiliensis
<400> 3
atggaaaata aacccagtat cttgacacaa aaatatgaga tagggagatt gcttggccaa 60
ggcacctttg caaaggttta ttatgcaagg agtatcagaa cgtatcaaag tgtggcaatt 120
aaggtgattg acaaagagaa gattttaagg gtagggcttg ttgatcagat caagagggaa 180
atatctgtga tgagaattgt tagacaccct aatattgtgc agctttatga ggtcatggca 240
accaaaagta agatttactt tgtaatggag tattgtaaag gtggtgaact ctttaacaag 300
gttgctaaag gaaagctaaa ggaggatgtt gcatgcaagt attttcaaca gttgatcaat 360
gcagttgatt tctgccacag caggggtgtt tatcatcgag acataaagcc agaaaaccta 420
ttgttggatg agaatgagaa tctaaagata agtgactttg ggttaagtgc acttgctgaa 480
tccaaacacc aagatggact actccataca acttgtggga cacctgcata cgtagctccg 540
gaagtgatca acaggaaagg ctatgatggg gcgaaagctg atatatggtc ttgtggtgtg 600
gttttatttg ttctactggc aggttatctt ccatttcatg attcaaactt gatggagatg 660
tacagaaaaa ttggcaaagc tgagttcaaa tgccctaatt ggtttcctca tgaagctcgt 720
aggctgctgt ttaagatgct tgatccaagc cccactacta ggatttccat ggataagata 780
aaagaaagtt cttggtatag aaaaggattg aactctaaac agaagaaaac tgaaacagaa 840
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100 105 110
Lys Tyr Phe Gln Gln Leu Ile Asn Ala Val Asp Phe Cys His Ser Arg
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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Ala Asp Ile Trp Ser Cys Gly Val Val Leu Phe Val Leu Leu Ala Gly
195 200 205
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210 215 220
Gly Lys Ala Glu Phe Lys Cys Pro Asn Trp Phe Pro His Glu Ala Arg
225 230 235 240
Arg Leu Leu Phe Lys Met Leu Asp Pro Ser Pro Thr Thr Arg Ile Ser
245 250 255
Met Asp Lys Ile Lys Glu Ser Ser Trp Tyr Arg Lys Gly Leu Asn Ser
260 265 270
Lys Gln Lys Lys Thr Glu Thr Glu Ser Gln Asp Val Leu Asp Arg Asn
275 280 285
Gly Ser Gly Pro Ser Glu Asn Ser Ser Met Ser Leu Glu Ala Lys His
290 295 300
Glu Ser Val Glu Pro Pro Lys Leu Asn Ala Phe Asp Ile Ile Ser Leu
305 310 315 320
Ser Ala Gly Phe Asn Leu Ser Gly Leu Phe Asp Glu Asn Ser Gln Leu
325 330 335
Arg Glu Ala Arg Phe Thr Ser Val Gln Pro Ala Ser Val Ile Ile Ser
340 345 350
Lys Leu Glu Asp Val Ala Lys Arg Leu Arg Leu Lys Ile Met Lys Lys
355 360 365
Glu Ala Gly Leu Leu Lys Met Glu Gly Leu Gln Glu Gly Arg Lys Gly
370 375 380
Pro Leu Ser Ile Asp Ala Glu Ile Phe Glu Val Thr Pro Asn Phe Tyr
385 390 395 400
Leu Val Glu Val Lys Lys Ser Ser Gly Asp Thr Met Glu Tyr Gln Lys
405 410 415
Val Leu Lys Glu Asp Ile Lys Pro Ala Leu Gln Asp Ile Val Trp Val
420 425 430
Trp Gln Ser Glu Gln Leu Gln Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln
435 440 445
Glu Thr Thr Leu Ala Ala Ala Ala Ala Met Thr
450 455

Claims (8)

1.一种调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法，所述HbCBL1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述HbCIPK15的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其特征在于，采用割胶或乙烯利刺激调控HbCBL1和/或HbCIPK15在橡胶中表达的方法。
2.根据权利要求1所述的调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法，其特征在于，所述调控为上调或下调HbCBL1和/或HbCIPK15表达量。
3.根据权利要求2所述的调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法，其特征在于，所述割胶的刀次为1～9刀。
4.根据权利要求3所述的调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法，其特征在于，通过割胶3～9刀次，下调PR107品系的橡胶树中HbCBL1和HbCIPK15的表达量，下调热研8-79品系的橡胶树中HbCBL1的表达量。
5.根据权利要求3所述的调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法，其特征在于，通过割胶7～9刀次，上调热研8-79品系的橡胶树中HbCIPK15的表达量。
6.根据权利要求2所述的调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法，其特征在于，通过采取乙烯利刺激上调HbCBL1和/或HbCIPK15在橡胶树中的表达量。
7.根据权利要求6所述的调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法，其特征在于，所述乙烯利的质量浓度为1.5％。
8.根据权利要求7所述的调控HbCBL1和/或HbCIPK15表达的方法，其特征在于，所述乙烯利的施用部位为橡胶树的叶片、树皮、根、种子、雄花和/或雌花。
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