CN101487007B - 成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子及其表达载体与应用 - Google Patents

Abstract

一种成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子，全长6241bp。通过培养、提取总DNA和PCR扩增后得到操纵子的序列为SEQ ID No 1。将该序列及其表达载体可以应用于β-胡萝卜素的生产。

Description

成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子及其表达载体与应用

技术领域

本发明涉及一种色素合成微生物操纵子，尤其涉及一种色素合成成团泛菌属微生物操纵子，更具体的是涉及一种成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子及其在合成β-胡萝卜素中的应用。

背景技术

类胡萝卜素是一种天然色素，是由8个类异戊二烯单位组成的一类碳氢化合物及其氧化衍生物的总称(J.Biotech.，1998，59，169)。

类胡萝卜素可分为四个亚族，包括胡萝卜素，如：α-、β-、γ-胡萝卜素，番茄红素；胡萝卜醇，如：叶黄素，玉米黄素，虾青素；胡萝卜醇的酯类，如：β-阿朴-8’-胡萝卜酸酯；胡萝卜酸，如：藏红素，胭脂树橙。类胡萝卜素的基本结构是番茄红素，其它类胡萝卜素是由其氧化、氢化、脱氢、环化以及碳架重排、降解而衍生。一般类胡萝卜素是C40分子，但也存在高类胡萝卜素(如：C45和C50)和降解的类胡萝卜素(如：C30)(Plant Cell，1995，7，1015)。类胡萝卜素在自然界中广泛存在，总数达600多种，而其中有50余种能形成维生素A。β-胡萝卜素、番茄红素和虾青素都是类胡萝卜素家族中对人类健康十分重要的三个主要成员(Nutr.Cancer.，1991，16，93)。

美国商业情报机构(Global Industry Analysts(GIA))公司发表了一份研究报告——《类胡萝卜素：全球战略经营报告》，据该报告预测，随着含天然营养成分的保健品在消费市场呈现出良好发展势头，到2010年，全球类胡萝卜素市场的规模预计将达到10.6亿美元。据调查，对类胡萝卜素这种抗氧化剂的需求之所以不断增长，主要原因是消费者对自身健康的日益关切以及老龄化人口的不断增加。GIA公司的研究报告对类胡萝卜素市场进行了全面分解，以弄清楚哪些类别的类胡萝卜素将可能在今后几年里获得最大的发展。

在类胡萝卜素的国际市场上，β-胡萝卜素是规模最大的一类产品。2006年，欧洲在β-胡萝卜素上占据的市场份额高达43.3％。研究报告预测，美国β-胡萝卜素市场的增长速度将超过欧洲。2007-2010年，美国市场的增速将略高于欧洲市场，其市场价值预计将增加859万美元。到2010年，β-胡萝卜素的市场将达到2.2亿美元。此外，预计到2010年，全球虾青素市场的规模将达到2.19亿美元；预计到2010年，全球虾青素市场的规模将达到4.5亿美元。此外，从2007年-2010年，叶黄素和角黄素的总销售额将增加2880万美元，叶黄素在欧洲市场的增长最为强劲。

所有类胡萝卜素都是通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成的。它是一类从乙酰CoA开始生物合成的次生代谢产物，合成过程为：3个乙酰CoA分子通过失去1个分子的羧基而缩合成3，5-二羟-3-甲基戊酸(MVA)，在酶的作用下磷酸化形成焦磷酸酯并经脱羧后形成异戊二烯焦磷酸(IPP)，IPP在IPP异构酶作用下异构为二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)，DMAPP依次与3分子的IPP在GGPS(GGPP合成酶)的作用下，缩合生成二甲基辛烯焦磷(GPP)、法尼基二磷酸(FPP)、二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸(GGPP)。2个GGPP在八氢番茄红素合成酶(PSY)作用下头对头进行二聚作用形成第1个无色的类胡萝卜素——八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续脱氢反应，共轭双键延长，直至形成链孢红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成α-胡萝卜素、β-胡萝卜素，α、β-胡萝卜素经引入、转化、环化、氧化等反应形成结构更复杂的虾青素、叶黄素、新黄质等(Curr.Opin.Plant Biol.，2001，4，210)。

到目前为止，分别从多种细菌、植物、藻类和真菌中克隆了近150个与类胡萝卜素合成有关的基因。1995年Misawa从欧氏杆菌杆菌中克隆获得GGPP合成酶基因(crtE)、玉米黄素转糖激酶(crtX)、番茄红素环化酶基因(crtY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(crtB)和β-胡萝卜素羟化酶基因(crtZ)，将这些基因分别转化到植物中能够使转基因植物合成不同类型的类胡萝卜素或前体物质(US5,429,939)。1996年Ausich等人从欧氏杆菌(Erwinia herbicola)克隆获得了牻牛儿基脚焦磷酸化酶基因、八氢番茄红素合成酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因以及番茄红素环化酶基因并分别将它们与叶绿素转运肽编码序列融合转化到植物中提高了植物类胡萝卜素总量(US5,530,188)。植物中也相继发现了类胡萝卜素合成相关基因。1994年Bird将番茄中克隆到参与类胡萝卜素合成的基因pTOM5(该基因与crtB同源)转化到植物中，并发现该基因能够调控植物中番茄红素的含量(US5,304,478)。1998年Cunningham从拟南芥中克隆到ε-番茄红素环化酶基因、IPP异构酶基因和β-胡萝卜素羟化酶基因，这些基因的功能在大肠杆菌中表达后获得了验证(US5,744,341)。此外Vainstein 1999发现其它与类胡萝卜素相关的蛋白，如黄瓜中的CHRC和CHRD蛋白(US6,551,793)。2002年Busch从烟草中克隆到ζ-胡萝卜素去饱和酶和番茄红素合成酶(EP1,156,117)。Wang等2006年从枸杞中克隆到与八氢番茄红素合成酶基因(CN1884547)和β-番茄红素环化酶同源基因(CN1884546)。

目前，还没有关于成团泛菌生产类胡萝卜素的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子，该操纵子源自于成团泛菌属(Pantoea sp.)。

本发明的另一个目的在于提供一种成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子的表达载体。

本发明的又一个目的在于提供一种成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子及其表达载体在生物合成β-胡萝卜素中的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

β-胡萝卜素合成操纵子源自于成团泛菌，其核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。

核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子的获取方法为：利用金氏B(KB)培养基，先从变色稻谷样中分离成团泛菌，选择菌落呈黄色细菌菌株；再将选择出来的菌落置于LB液体培养基中培养12小时以上；之后提取总DNA，再以总DNA为模板，采用长基因PCR扩增和克隆方法(Appl Environ Microbiol，1997，63，4504)克隆并得到β-胡萝卜素合成相关的操纵子。

一种核苷酸序列为SEQ ID No：1的成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子的具体获取方法为：

菌种分离

取变色稻谷加入无菌水，液氮中磨碎，稀释10-100倍后涂布在KB培养基上(2g/L蛋白胨，10g/L甘油，1.5g/L K₂HPO₄，1.5g MgSO₄·7H₂O，15g琼脂，pH7.2)，28℃培养16小时以上，筛选菌落呈黄色细菌菌株。

总DNA提取

将分离获得的细菌单株在液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养过夜(16小时)，菌体培养液以6,000g重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。先将这些沉淀在-20℃下冷冻1hr，之后使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)清洗一次，然后悬浮于浓度为10mg/mL溶菌酶的无菌水中，37℃摇床培养1hr。

接着向培养液中加入0.5M EDTA，10％(w/v)SDS和浓度为5M的NaCl并轻轻振荡混匀后，再加入浓度为20mg/mL蛋白激酶K，37℃培养1hr。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)提取DNA；水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)萃取，振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇，振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。

所得总DNA于4℃保存。

操纵子获取

用0.02-0.5u/μL浓度限制性核酸内切酶Sau3A酶切提取所得的成团泛菌总DNA，时间20-60分钟，然后0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为5-7kb的DNA片段，用胶试剂盒(上海生工生物工程有限公司)回收。选择pG251(CN1338515NCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI酶切并进行胶回收。

先对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后(Sambrook，分子克隆手册，1989)，再与外源的DNA片段(即长度为5-7kb的成团泛菌DNA片段)连接。反应温度16℃，连接时间为10-12h。

连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，点击参数为：电脉冲为2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5S。复苏后，将菌液涂布于LB固体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16hr，筛选颜色变黄的菌落。

连接前，将回收的部分酶解的细菌基因组DNA片段与pG251载体DNA，用琼脂糖凝胶电泳的方法(Sambrook，分子克隆手册，1989)估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。

PCR扩增

以PCAR1：5’ATGATGACGGTCTGTGCAGAACAACA-3’和PCAR2：5’-ATCATATGGATATGTTGTGGATTTGGAATG-3’为扩增引物对β-胡萝卜素合成相关的操纵子进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶，扩增条件依次为：94℃30秒，68℃30秒，72℃600秒，扩增30个循环。接着加入2单位rtaq酶，在72℃延伸30分钟。

PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为6421bp的SEQID No：1序列。

一种核苷酸序列为SEQ ID No：1的成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子的基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)，利用PCR进行β-胡萝卜素合成操纵子全长扩增，在Taq DNA聚合酶存在的反应体系中，使用多个扩增引物和2个外侧引物完成。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30秒，50℃30秒，72℃延长10min，共25个循环。PCR结束后，0.8％(w/v)琼脂糖胶回收。

SEQ ID No：1序列与表达载体相连接后转入生物细胞中，能合成β-胡萝卜素。

SEQ ID No：1序列与表达载体相连接后转入微生物细胞中，能合成β-胡萝卜素。

SEQ ID No：1序列与表达载体相连接后转入原核微生物细胞中，能合成β-胡萝卜素。

表达载体应当包含编码与类胡萝卜素合成或代谢有关的一种或多种酶以及至少一个能通过现有技术(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1994)构建的启动子(promoter)。此外，表达载体还可以含有一些调节子(regulatory element)如：抑制子(repressor)、抗生素标记(如：氨苄青霉素、卡那霉素或新霉素等)或荧光标记(如：绿色荧光蛋白GFP基因)等。

一种表达载体，包括成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子SEQ ID No：1序列。

一种微生物表达载体，包括成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子SEQ IDNo：1序列。

一种SEQ ID No：1序列转入原核微生物细胞的方式，将SEQ ID No：1序列直接与表达载体pBAD/TOPO ThioFusion^TM(Invitrogen)相连，4℃连接2小时，然后将该载体转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞(Invitrogen)中。

含有成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子(SEQ ID No：1)的表达载体转入原核微生物细胞后，该细胞能合成β-胡萝卜素。将菌液涂布于LB固体培养基，经过培养能获得橘黄色菌落。

一种原核生物合成β-胡萝卜素的方法为，将SEQ ID No：1序列直接与与表达载体pBAD/TOPO ThioFusion^TM(Invitrogen)相连，4℃连接2小时，然后将该载体转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(Invitrogen)中，将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)，该细胞能合成β-胡萝卜素，经过培养能获得亮黄色菌落。

然后挑取呈亮黄色的大肠杆菌菌落于LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5，加入0.05％-0.2％(w/v)阿拉伯糖后，37℃继续振荡培养5-12小时。采用甲醇抽提细菌细胞中的β-胡萝卜素，使用分光光度计在439nm下的吸光值。根据标准曲线计算样品中β-胡萝卜素的含量。

本发明技术方案实现的有益效果

来自稻谷中内生的成团泛菌是一类高效合成β-胡萝卜素的细菌，克隆此类细菌中的β-胡萝卜素合成操纵子，有利于将来基因工程培育高效合成β-胡萝卜素的不同物种。通过培养、提取总DNA和PCR扩增后得到的SEQ ID No：1的序列及其表达载体可以应用于β-胡萝卜素的生产。

本发明所述的术语与其一般概念相同。

所述的“核苷酸”和“引物”序列均为5’端至3’端。

所述的“生物合成”指利用微生物、植物细胞或组织，以发酵或培养的方式合成目标产物，如：β-胡萝卜素。

所述的“生物细胞”指微生物、植物细胞或组织。

所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要为细菌；真核微生物为真菌或藻类，真菌主要指酵母菌。

附图说明

图1为以pG251质粒构建DNA表达单元示意图；

图2为PCR扩增所得序列为SEQ ID No：1的类胡萝卜素操纵子电泳图，其中泳道1为DNA分子量标记(Marker)；泳道2为从大肠杆菌扩增的对照组；泳道3为从成团泛菌扩增的β-胡萝卜素合成操纵子；

图3为含有序列为SEQ ID No：1大肠杆菌和不含SEQ ID No：1序列大肠杆菌在LB培养基上培养结果图，其中图的左半边为不含SEQ ID No：1序列大肠杆菌菌落，呈乳白色；图的右半边为含有序列为SEQ ID No：1大肠杆菌菌落，呈亮黄色。

图4为β-胡萝卜素在439nm附近吸收光谱。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。

实施例1菌种分离

取变色稻谷样中用70％(v/v)的乙醇表面消毒30秒，用无菌水冲洗后置于小研钵中研磨，将组织液在KB培养基(2g/L蛋白胨，10g/L甘油，1.5g/L K₂HPO₄，1.5g MgSO₄·7H₂O，15g琼脂，pH7.2)上画线分离，28℃培养24hr后，挑取单菌落纯化。挑取的黄色菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，不产生荧光色素，革兰氏染色反应为阴性的菌株；进一步通过显微镜筛选细胞呈直杆状，周生鞭毛，无芽孢的菌株。将获得的菌株稀释10⁴后反复2次在KB固体平板培养基上纯合。

实施例2总DNA的提取

将实施例1中分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物(Invitrogen)，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养16小时，菌体培养液以6,000g重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。先将这些沉淀在-20℃下冷冻1hr，之后使用TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)清洗一次，然后加入20μl溶菌酶(Sigma-Aldrich)浓度为10mg/mL的无菌水悬浮，在37℃下摇床培养1hr。

接着加入50μL浓度为0.5M EDTA，50μl浓度为10％(w/v)SDS和50μl浓度为5M的NaCl并轻轻振荡混匀后，再加入10μl浓度为20mg/mL蛋白激酶K(Takara日本)，反应物在37℃下培养1hr。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)萃取。振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇。振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。

所得总DNA储存于4℃下备用。

实施例3成团泛菌菌株同源性分析

以实施例2抽提的总DNA为模板，利用成团泛菌的16s rRNA特异性引物进行扩增。扩增引物为P16SF：5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’和P16SF：5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’。以KOD Plus(Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30秒，55℃30秒，72℃120秒，扩增30个循环。循环结束后，加入2个单位的rtaq酶(宝生物工程(大连)有限公司)，72℃延伸300秒，扩增片段长1500bp(如下，请补充序列)。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。

先将该载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再用ABI Prism BigDye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与成团泛菌中的16s rRNA(AF394539NCBI)有99％的同源性，从而证实分离菌株为成团泛菌。

实施例4β-胡萝卜素合成操纵子的获取

图1为以pG251质粒构建DNA表达单元示意图。通过表达单元获取β-胡萝卜素操纵子，具体方法如下：用不同浓度(0.02-0.5u/μL)限制性核酸内切酶Sau3A(宝生物工程(大连)有限公司)酶切实施例2提取所得的成团泛菌总DNA，时间20-60分钟，然后0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为5-7kb的DNA片段，用胶试剂盒(上海生工生物工程有限公司)回收。

选择pG251(CN1338515NCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI(宝生物工程(大连)有限公司)酶切并进行胶回收。

先对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后(Sambrook，分子克隆手册，1989)，再与外源的DNA片段(即长度为5-7kb的成团泛菌DNA片段)连接。连接前，将回收的部分酶解的细菌基因组DNA片段与pG251载体DNA，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16℃，连接时间为10-12h。

连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5S。复苏后，将菌液涂布于LB固体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16h，筛选颜色变黄的菌落。

利用逐步序列测定方法对筛选获得的重组子全序列进行DNA测序。测序的引物分别为：

Pcx1：5’-GATGTTTGATGTTATGGAGCAG-3’

Pcx2：5’-CTCATCAGGATGACGGGGAA-3’

Pcx3：5’-CGACGTCACGATCGGGTGATC-3’

Pcx4：5’-ACGCTGCGTAGCGCACATCG-3’

Pcx5：5’-CGTCAGAATATCAAAGACTATG-3’

Pcx6：5’-AGCGCCATTGAAGAGCTGTTC-3’

Pcx7：5’-GAACTGCTGAGCCAGCAAGCAG-3’

Pcx8：5’-CAACGATACGGCATCGCTGCA-3’

Pcx9：5’-AACGCCAGTCCACCAGCACG-3’

所得SEQ ID No 1序列与来自泛球菌的类胡萝卜素合成操纵子序列(AY876938NCBI)同源性为92％(如下)。

实施例5β-胡萝卜素合成操纵子的扩增

以PCAR1：5’-ATGATGACGGTCTGTGCAGAACAACA-3’和PCAR2：5’-ATCATATGGATATGTTGTGGATTTGGAATG-3’为扩增引物，以实施例4中制得DNA(SEQ ID No：1)为模版，对β-胡萝卜素合成相关的操纵子进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，扩增条件依次为：94℃30秒，68℃30秒，72℃600秒，30个循环。然后加入2单位rtaq(宝生物工程(大连)有限公司)，在72℃延伸30分钟。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为6241bp的SEQ ID No：1核苷酸(见图2)。

取10μl直接与表达载体pBAD/TOPO ThioFusion^TM(Invitrogen)连接，4℃连接2小时，再将该载体转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen)感受态细胞中。菌液涂布于含有50μg/mL的氨苄青霉素LB固体培养基平板上，于37C培养12小时，获得亮黄色菌落。

实施例6β-胡萝卜素合成操纵子基因合成

通过基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)可以克隆实施例5所得得β-胡萝卜素操纵子，所用的引物如下：

1.EMPII-1：

ATG，ATG，ACG，GTC，TGT，GCA，AAA，CAA，CAC，GTC，AAA，AAC，ATA，CAC，AGG，CAT，GCA，GCC，AGC，CTG

2.EMPII-2：

CGG，TGG，AAG，CTG，ATC，AAG，CCG，TTC，CTC，AAT，GTC，GTT，CAA，CAG，GCT，GGC，TGC，ATG，CCT，GTG

3.EMPII-3：

CGG，CTT，GAT，CAG，CTT，CCA，CCG，GTT，GAA，AGC，GAA，CGT，GAC，TTA，GTG，GGC，GCT，GCA，ATG，CGC

4.EMPII-4：

CAG，TGG，ACG，GAT，ACG，CTG，GCC，TGT，TGC，CAG，CGC，ACC，GTC，GCG，CAT，TGC，AGC，GCC，CAC，TAA

5.EMPII-5：

GGC，CAG，CGT，ATC，CGT，CCA，CTG，CTG，TTG，TTG，CTG，CCC，GCG，CGC，GAT，CTG，TGC，TGC，AAC，GCC

6.EMPII-6：

CTC，TAC，TTC，GCA，GGC，GAG，ATC，AAG，CAG，GCC，GGC，CGG，CGT，GGC，GTT，GCA，GCA，CAG，ATC，GCG

7.EMPII-7：

GAT，CTC，GCC，TGC，GAA，GTA，GAG，ATG，GTG，CAT，GCA，AAA，TCA，CTG，ATT，CTG，GAT，GAC，ATG，CCC

8.EMPII-8：

GGT，CCG，ACG，TCC，GCG，TCG，CAG，TTG，TGC，GTC，ATC，CAT，GCA，GGG，CAT，GTC，ATC，CAG，AAT，CAG

9.EMPII-9：

CTG，CGA，CGC，GGA，CGT，CGG，ACC，ATT，CAA，TGC，CAG，TAT，GGT，GAA，CAT，GTC，GCG，ATT，CTG，GCC

10.EMPII-10：

AGC，GAC，CAC，GCC，GAA，TTT，CTT，ACT，CAG，CAG，GGC，CAC，TTC，GGC，CAG，AAT，CGC，GAC，ATG，TTC

11.EMPII-11：

AAG，AAA，TTC，GGC，GTG，GTC，GCT，GCG，GCA，GAA，GGC，TTA，ACG，GCA，ACC，ACC，AGA，GCC，GAC，GCT

12.EMPII-12：

CAG，CCC，CTG，CAT，GCC，GAC，TGC，GTG，GGA，TAA，TTC，TTT，CGC，AGC，GTC，GGC，TCT，GGT，GGT，TGC

13.EMPII-13：

GCA，GTC，GGC，ATG，CAG，GGG，CTG，GTG，CAG，GGA，CAG，TTA，ACG，GAT，CTT，TCA，GAA，GGT，GAC，AAG

14.EMPII-14：

ATA，GTG，ATT，CGT，CAT，CAG，TTT，GGC，GTC，AGC，GCT，GCG，TGC，CTT，GTC，ACC，TTC，TGA，AAG，ATC

15.EMPII-15：

AAA，CTG，ATG，ACG，AAT，CAC，TAT，ACC，ACC，AGC，ACC，CTG，CCA，TGC，GCC，TCC，ATG，CAG，ATG，GCC

16.EMPII-16：

CTG，TTC，GGT，TGC，TTC，ACC，TGA，GGC，TTC，AGT，TGC，GAT，AGA，GGC，CAT，CTG，CAT，GGA，GGC，GCA

17.EMPII-17：

TCA，GGT，GAA，GCA，ACC，GAA，CAG，CTG，CAC，CGT，TAA，ACG，CTT，AAT，CTC，GGT，CAG，GCT，TTC，CAG

18.EMPII-18：

TCC，GGT，GTC，GAC，CAT，GAA，GTC，AGT，GAG，ATC，GTC，CAG，GAG，CTG，GAA，AGC，CTG，ACC，GAG，ATT

19.EMPII-19：

GAC，TTC，ATG，GTC，GAC，ACC，GGA，ACC，GAT，GCT，CAT，CAG，GAT，GAC，GGG，GAA，TCA，ACG，CTG，GTG

20.EMPII-20：

GCG，CAG，TCG，CGT，GTC，AAC，CGC，CTG，TGG，TCC，CAG，CAG，ATT，CAC，CAG，CGT，TGA，TTC，CCC，GTC

21.EMPII-21：

GCG，GTT，GAC，ACG，CGA，CTG，CGC，GAT，CAT，CTG，CGC，TGC，GCC，AGC，GAG，CAT，CTG，TTA，TCG，GCC

22.EMPII-22：

GGC，CTG，AAC，ATT，TTG，GTG，TGT，GGC，ATA，ATC，GGC，CTG，GCA，GGC，CGA，TAA，CAG，ATG，CTC，GCT

23.EMPII-23：

ACA，CAC，CAA，AAT，GTT，CAG，GCC，TGG，TCC，GAG，AAA，CCC，CTC，GCT，GCC，GTC，AGT，TAA，GGA，TGC

24.EMPII-24：

ATA，GAA，CGG，CGG，TGC，AAT，GAC，CGG，TGA，GTG，GCT，CAT，GCA，GCA，TCC，TTA，ACT，GAC，GGC，AGC

25.EMPII-25：

GTC，ATT，GCA，CCG，CCG，TTC，TAT，AGC，CAT，GTG，CAG，GCG，CTT，CAG，CAC，CTT，AGC，CAG，GCC，TTA

26.EMPII-26：

CGT，CTG，CTG，GAT，GAA，AGT，GAT，CTG，GTG，TCC，GCG，TGC，GAT，TAA，GGC，CTG，GCT，AAG，GTG，CTG

27.EMPII-27：

ATC，ACT，TTC，ATC，CAG，CAG，ACG，AAC，GTT，AGC，GCG，CTA，CTC，ACC，GAG，AGC，CGT，ATC，GGC，AAT

28.EMPII-28：

CAG，ACT，GCC，CGC，CGG，ATG，CGA，GGC，TAG，GGC，CAG，CGG，GAA，ATT，GCC，GAT，ACG，GCT，CTC，GGT

29.EMPII-29：

TCG，CAT，CCG，GCG，GGC，AGT，CTG，GCA，CAC，ACC，CTG，CAA，CTG，GCG，CCG，CAT，CCT，CTC，GGC，CCT

30.EMPII-30：

GGT，GCT，GCG，GGC，CAT，CTC，ATT，GAT，CAG，TTT，CAG，CAT，TGA，AGG，GCC，GAG，AGG，ATG，CGG，CGC

31.EMPII-31：

AAT，GAG，ATG，GCC，CGC，AGC，ACC，GAT，ATG，CTC，TGC，CGT，GAA，CTG，CGG，GTG，GAG，CTG，AGG，AAG

32.EMPII-32：

AGG，CTC，CAT，CTG，ATC，GAC，GAT，CAC，GCC，ATC，TTT，CGC，CAG，CTT，CCT，CAG，CTC，CAC，CCG，CAG

33.EMPII-33：

ATC，GTC，GAT，CAG，ATG，GAG，CCT，GCC，GGT，GCA，CCG，GCA，ACA，GAA，GCG，CTG，AAC，CTG，CCT，CAT

34.EMPII-34：

CGC，TTC，ACG，GTT，AAG，TGG，CAG，CGC，ACA，GGC，AAC，CGT，AAC，ATG，AGG，CAG，GTT，CAG，CGC，TTC

35.EMPII-35：

CTG，CCA，CTT，AAC，CGT，GAA，GCG，GAT，TTC，GGG，CTG，GCC，GTG，ATG，CCG，AAA，GAC，TAT，GCC，AGG

36.EMPII-36：

AGG，TTC，ACT，GGT，GCG，ATA，GCG，TTC，GCT，TGC，CTG，ATC，GGT，CCT，GGC，ATA，GTC，TTT，CGG，CAT

37.EMPII-37：

CGC，TAT，CGC，ACC，AGT，GAA，CCT，ATC，TAT，GAC，TGG，CTG，ATG，CGA，CGT，CAC，GAT，CGG，GTG，ATC

38.EMPII-38：

GGC，CCG，TGG，AGC，TAA，TCC，GAT，CGC，ATG，AGC，GTT，GCC，GCC，GAT，CAC，CCG，ATC，GTG，ACG，TCG

39.EMPII-39：

ATC，GGA，TTA，GCT，CCA，CGG，GCC，CAA，CTG，CAT，CAC，TGA，AAT，TCA，CCG，CTG，GCG，GAG，AAC，AGC

40.EMPII-40：

CAA，CGC，CTG，GCT，TGG，ATA，ATC，CAG，ATC，CGG，AAT，CAA，CTG，GCT，GTT，CTC，CGC，CAG，CGG，TGA

41.EMPII-41：

GAT，TAT，CCA，AGC，CAG，GCG，TTG，CGG，GAT，CAT，TTC，GAT，ACG，GTT，GGC，TCG，CTG，CGT，ACC，ACT

42.EMPII-42：

CGG，GAA，GTA，GCG，AGG，CTG，CGC，CTC，GAA，GGG，TGC，GGG，TTC，AGT，GGT，ACG，CAG，CGA，GCC，AAC

43.EMPII-43：

GCG，CAG，CCT，CGC，TAC，TTC，CCG，CAT，GGC，GAC，AGA，CCG，CGC，AAT，TCC，GCT，TCC，CTC，GGC，ACG

44.EMPII-44：

GAC，GAT，GGT，GGT，AAA，CAG，GCC，GTA，GCG，ATG，TCC，CTG，CAG，CGT，GCC，GAG，GGA，AGC，GGA，ATT

45.EMPII-45：

GGC，CTG，TTT，ACC，ACC，ATC，GTC，CGC，GAA，CGC，CAG，GAG，ATC，GAC，GCT，CAG，TTA，TTG，CTG，GCG

46.EMPII-46：

CAG，TTT，CTC，CGC，CTG，GAA，AGG，TGA，CAA，CCG，ACC，GCT，TTG，CGC，CAG，CAA，TAA，CTG，AGC，GTC

47.EMPII-47：

CCT，TTC，CAG，GCG，GAG，AAA，CTG，GGC，CAG，GCC，AGC，CAT，GTT，CAG，GTG，GTC，GAT，TCC，GCC，GAC

48.EMPII-48：

CGT，AAT，GGC，TTG，ATC，GGC，CTG，CGC，CAG，TGC，AGC，CGC，CTG，GTC，GGC，GGA，ATC，GAC，CAC，CTG

49.EMPII49：

CAG，GCC，GAT，CAA，GCC，ATT，ACG，CAC，GGC，GGC，ATG，CCT，ACG，GTG，CTG，GAT，GGG，ATT，AAC，CAC

50.EMPII-50：

CTG，ATC，TTT，GGC，CAG，CGG，GAT，CGT，CAG，CAG，CGG，CGT，CAG，GTG，GTT，AAT，CCC，ATC，CAG，CAC

51.EMPII-51：

ATC，CCG，CTG，GCC，AAA，GAT，CAG，CCG，GGT，GTG，GCT，GCC，AGA，GTG，GTC，TGG，CAC，GGT，ATC，CGA

52.EMPII-52：

CGC，CAT，GGA，GTG，GCT，GGT，GGT，AAA，GCG，TGA，GGC，GCG，ACG，TCG，GAT，ACC，GTG，CCA，GAC，CAC

53.EMPII-53：

ACC，ACC，AGC，CAC，TCC，ATG，GCG，CGT，CAG，CTC，CAG，ACC，CCA，CTG，GCT，GAT，GAA，AGC，TAC，GAT

54.EMPII-54：

CGC，CTG，ACG，ATG，TGC，GCT，ACG，CAG，CGT，TTT，CAT，CTG，CTG，ATC，GTA，GCT，TTC，ATC，AGC，CAG

55.EMPII-55：

CGT，AGC，GCA，CAT，CGT，CAG，GCG，GGC，GGA，ACC，ATT，CTG，GCC，GGC，GAC，ATT，GTC，GAA，CAG，GCG

56.EMPII-56：

ATA，GTC，TCT，CCT，CCT，GAC，GAC，CGG，CTG，GCT，TGT，CAG，CAT，CGC，CTG，TTC，GAC，AAT，GTC，GCC

57.EMPII-57：

GTC，GTC，AGG，AGG，AGA，GAC，TAT，GCC，GAG，GTA，TGA，TCT，GAT，TCT，GGT，GGA，CGC，GCG，ACT，GGC

58.EMPII-58：

GGC，CGC，TGC，TGT，CTC，AGC，CGC，AGG，CCG，ATC，AGC，CCG，TTG，GCC，AGT，CGC，GCG，TCC，ACC，AGA

59.EMPII-59：

GCG，GCT，GAG，ACA，GCA，GCG，GCC，CTC，AAT，GCG，CAT，TCT，GCT，GAT，TGA，CGC，CGA，ACG，TGA，ACG

60.EMPII-60：

AGA，TCT，TCC，GCA，TGA，GGC，GAC，CAG，GTG，TGA，TTG，GCA，CCG，CGT，TCA，CGT，TCG，GCG，TCA，ATC

61.EMPII-61：

GTC，GCC，TCA，TGC，GGA，AGA，TCT，CAC，CGA，AAC，GCA，GCA，TCG，CTG，GAT，CGC，TCC，GCT，GGT，AGT

62.EMPII-62：

CGG，TGC，CGA，AAG，CGG，ACC，TCA，TAG，CCA，GGC，CAG，TGA，TGT，ACT，ACC，AGC，GGA，GCG，ATC，CAG

63.EMPII-63：

TGA，GGT，CCG，CTT，TCG，GCA，CCG，CAG，TCG，CAG，TCT，GAA，CAG，TGG，CTA，TTT，CTG，CGT，GAC，TGC

64.EMPII-64：

GGC，GCA，AAC，CTG，TCG，CGG，ATG，ACC，TGC，CGG，AAG，CGC，TCC，GCA，GTC，ACG，CAG，AAA，TAG，CCA

65.EMPII-65：

CAT，CCG，CGA，CAG，GTT，TGC，GCC，GGA，TCT，GCT，GCT，GAA，TAC，CCG，GGT，TGC，GAG，CAT，CGC，TTC

66.EMPII-66：

CTC，TCC，AGC，ACC，CGG，CCA，TCG，TCC，AGC，GTA，ACC，GCG，CGT，GAA，GCG，ATG，CTC，GCA，ACC，CGG

67.EMPII-67：

CGA，TGG，CCG，GGT，GCT，GGA，GAG，TGA，CGC，AGT，GAT，TGA，TGG，CCG，TGG，CTA，CCA，GCC，CGA，TGC

68.EMPII-68：

TCC，TGT，CGG，ACG，GAC，GAC，TGG，AAG，CCC，ATG，CGC，AGC，GCG，GCA，TCG，GGC，TGG，TAG，CCA，CGG

69.EMPII-69：

CCA，GTC，GTC，CGT，CCG，ACA，GGA，GAG，GCA，GCT，CAG，CGA，GCC，ACA，TGG，CCT，GAC，CGC，GCC，GAT

70.EMPII-70：

CGA，TAG，CCT，GCC，TGC，TGA，TCT，ACC，GTG，GCA，TCC，ATT，TTG，ATC，GGC，GCG，GTC，AGG，CCA，TGT

71.EMPII-71：

AGA，TCA，GCA，GGC，AGG，CTA，TCG，CTC，CGT，CTA，CAG，CCT，GCG，AAA，ATC，TGC，AGA，CAC，CCT，GCT

72.EMPII-72：

TCC，AGC，GTG，GCG，TTA，TCA，ATG，TAG，TGG，GTA，TCT，TCA，TTC，AGC，AGG，GTG，TCT，GCA，GAT，TTT

73.EMPII-73：

CAT，TGA，TAA，CGC，CAC，GCT，GGA，AGG，CGA，TCG，CGC，CCG，TCA，GAA，TAT，CAA，AGA，CTA，TGC，CGA

74.EMPII-74：

TCT，TCG，CGT，ATG，TGC，CGG，TCT，AAT，CGC，CAT，CCC，TGC，TCT，TCG，GCA，TAG，TCT，TTG，ATA，TTC

75.EMPII-75：

AGA，CCG，GCA，CAT，ACG，CGA，AGA，GCA，AGG，CGC，GTT，ACC，CAA，TAC，GCT，GAC，CGG，CGA，CGT，GGA

76.EMPII-76：

TTT，CCG，CTG，CAG，GGC，AGA，TCG，TGT，TTC，TGC，CAG，AAG，GTT，TCC，ACG，TCG，CCG，GTC，AGC，GTA

77.EMPII-77：

CGA，TCT，GCC，CTG，CAG，CGG，AAA，GCG，TGC，CGG，GTG，GGT，CCA，TCG，TAC，CAC，CGG，CTA，TTC，TCT

78.EMPII-78：

ATC，TGC，GCC，AGC，CGA，TCA，GCC，AGC，TTG，ACC，GCC，AGC，GGC，AGA，GAA，TAG，CCG，GTG，GTA，CGA

79.EMPII-79：

GGC，TGA，TCG，GCT，GGC，GCA，GAT，GCA，GAC，GCC，AAC，CTC，TGA，GAC，CCT，GCA，CGC，CAC，CAT，TCA

80.EMPII-80：

AAG，AAG，CGC，TGT，TGC，TGC，CAT，GCC，TGA，CTG，GCG，AAT，TGC，TGA，ATG，GTG，GCG，TGC，AGG，GTC

81.EMPII-81：

ATG，GCA，GCA，ACA，GCG，CTT，CTT，CCA，AAT，GCT，GAA，CCG，TAT，GCT，GAA，TCT，GGC，GGG，TCC，AGC

82.EMPII-82：

AGG，CCG，TAA，GGA，CGT，TGC，ATA，ACC，TGC，CAG，CGC，TGG，TCA，GCT，GGA，CCC，GCC，AGA，TTC，AGC

83.EMPII-83：

TAT，GCA，ACG，TCC，TTA，CGG，CCT，TCC，CGA，AGG，TCT，GAT，CGC，CCG，TTC，CCA，TGC，GGG，TTT，ACT

84.EMPII-84：

GGC，TTG，CCG，CTT，AAG，ATG，GGC，AGC，CGA，TCA，GGC，ATT，GTG，AGT，AAA，CCC，GCA，TGG，GAA，CGG

85.EMPII-85：

GCC，CAT，CTT，AAG，CGG，CAA，GCC，GGA，GGT，CCC，CGT，TCT，GGC，GGC，GTT，ACA，GGC，TAT，TAT，GAC

86.EMPII-86：

TGT，AGT，TCT，ATT，CAT，TGC，ATC，GCC，TGT，TGA，CGG，TGA，CCA，GTC，ATA，ATA，GCC，TGT，AAC，GCC

87.EMPII-87：

GAT，GCA，ATG，AAT，AGA，ACT，ACA，GTA，ATT，GGC，GCA，GGC，TAC，CGT，GGT，CTG，GCT，CTG，GCA，ATT

88.EMPII-88：

CTC，CAG，CAG，TCC，GGT，TTG，AAC，GCC，TGA，CTT，CTG，AAG，GCG，AAT，TGC，CAG，AGC，CAG，ACC，ACG

89.EMPII-89：

GTT，CAA，ACC，GGA，CTG，CTG，GAG，CAG，CGT，GAC，AAG，TCT，GGC，GGC，AAA，GCT，TAT，GTC，TAT，CAG

90.EMPII-90：

GAT，TAC，CGT，GGG，GCC，GGC，ATC，ATT，CGT，GAA，GTT，CTG，ATG，CTG，ATA，GAC，ATA，AGC，TTT，GCC

91.EMPII-91：

GAT，GCC，GGC，CCC，ACG，GTA，ATC，ACC，GAT，CCC，AGC，GCC，ATT，GAA，GAG，CTG，TTC，ACC，CTC，GCG

92.EMPII-92：

CAC，CGG，CAT，CAG，CTC，GAC，ATA，GTC，AGA，GAG，CCC，TTT，ACC，CGC，GAG，GGT，GAA，CAG，CTC，TTC

93.EMPII-93：

TAT，GTC，GAG，CTG，ATG，CCG，GTG，AAG，CCG，AAA，TAC，CAA，CGG，TGC，TGG，GAG，TCG，GTC，AAG，GTG

94.EMPII-94：

CTG，CGC，TTC，CAC，CGC，CGG，CTG，ATC，GTT，GTC，ATA，ACT，GAA，CAC，CTT，GAC，CGA，CTC，CCA，GCA

95.EMPII-95：

CAG，CCG，GCG，GTG，GAA，GCG，CAG，ATT，GCC，GCG，TCC，AAT，CCG，CGT，GAC，GTT，GAA，GGA，TAT，CGT

96.EMPII-96：

GCC，TTC，AGC，CTG，CAC，CGC，TCG，GGA，ATA，GGC，CAG，AAA，GCG，ACG，ATA，TCC，TTC，AAC，GTC，ACG

97.EMPII-97：

CGA，GCG，GTG，CAG，GCT，GAA，GGC，TAT，CTG，AAG，CTT，GGC，ACC，GTG，CCA，TTT，CTG，TCA，TTC，CGC

98.EMPII-98：

CTG，AAG，AAA，TGC，CAG，CTG，TCG，CGC，TTG，CCG，CAG，CAT，GTC，GCG，GAA，TGA，CAG，AAA，TGG，CAC

99.EMPII-99：

CGA，CAG，CTG，GCA，TTT，CTT，CAG，GCA，TGC，AGC，AGC，GAA，TAC，AGG，GAA，GTG，GCG，AGC，TAC，ATT

100.EMPII-100：

TGA，GTG，GTC，GGA，GAA，GGC，CTG，ACG，CAG，ATG，CTC，ATC，TTC，AAT，GTA，GCT，CGC，CAC，TTC，CCT

101.EMPII-101：

CAG，GCC，TTC，TCC，GAC，CAC，TCA，CTG，CTG，GTG，GAA，GGA，AAT，CCG，TTT，GGA，ACT，TCC，TCA，ATC

102.EMPII-102：

GAC，GTT，CCA，TTC，ACG，AAC，CAG，CGC，ATC，CAT，CAT，TGT，ATA，GAT，TGA，GGA，AGT，TCC，AAA，CGG

103.EMPII-103：

CTG，GTT，CGT，GAA，TGG，AAC，GTC，TGG，TTC，TCG，CGC，GGT，GGC，ACG，AGC，GCG，CGC，GTG，CAG，GGC

104.EMPII-104：

CTC，CAC，TTC，GCC，GCC，GAG，ATC，TTC，AAA，CAG，TCC，CAC，CAT，GCC，CTG，CAC，GCG，CGC，GCT，CGT

105.EMPII-105：

GAT，CTC，GGC，GGC，GAA，GTG，GAG，CTC，AAT，GCC，AGC，GTT，GCA，AGG，CTG，GAG，ACC，CAG，GAT，TTC

106.EMPII-106：

GAA，GAC，CCG，GCC，ATC，TGG，CAG，GTG，TAC，CGC，GGT，AAT，CCT，GAA，ATC，CTG，GGT，CTC，CAG，CCT

107.EMPII-107：

CTG，CCA，GAT，GGC，CGG，GTC，TTC，CCG，ACG，CGC，GCG，CGT，GCC，TCC，AAC，GCA，GAT，GTG，TTT，CAC

108.EMPII-108：

CTG，CGA，AGC，TGC，TTG，CTG，GCT，CAG，CAG，TTC，GCG，GTA，GGT，GTG，AAA，CAC，ATC，TGC，GTT，GGA

109.EMPII-109：

AGC，CAG，CAA，GCA，GCT，TCG，CAG，GCG，CAG，GGA，CGG，TCA，CTG，CAG，AAC，AGA，CGC，ATG，AGC，AAC

110.EMPII-110：

GTG，ATG，ATG，ATT，CAG，GCC，AGA，ATA，GAT，CAC，ATT，TGG，CGA，GTT，GCT，CAT，GCG，TCT，GTT，CTG

111.EMPII-111：

TCT，GGC，CTG，AAT，CAT，CAT，CAC，GAT，CAG，CTG，GCG，CAC，CAC，ACG，GTC，TGC，TTT，GGT，CCG，CGC

112.EMPII-112：

GCC，ATC，TAA，GTT，GGG，GAT，TTC，ATC，AAT，CAA，CTC，TCG，ATA，GCG，CGG，ACC，AAA，GCA，GAC，CGT

113.EMPII-113：

GAA，ATC，CCC，AAC，TTA，GAT，GGC，CTG，GCA，GAG，GAC，TCA，TCG，CTC，TAT，CTG，CAT，GCG，AAC，TGC

114.EMPII-114：

GCT，GCC，GCA，GGC，AAC，CGG，TGC，CAG，TGA，GCC，ATC，GGT，CAC，GCA，GTT，CGC，ATG，CAG，ATA，GAG

115.EMPII-115：

GCA，CCG，GTT，GCC，TGC，GGC，AGC，TAC，TAC，GTG，CTG，GCG，CGC，GTA，CCG，CAC，CTC，GAC，ACC，GAA

116.EMPII-116：

ATC，GCA，CAG，CGG，CGG，TGC，TTC，AAC，GGC，CCA，GTC，GAT，CTC，TTC，GGT，GTC，GAG，GTG，CGG，TAC

117.EMPII-117：

GAA，GCA，CCG，CCG，CTG，TGC，GAT，CGC，ATA，CTC，GAC，TAT，CTG，GAA，CAG，CAT，TAC，ATG，CCG，AAC

118.EMPII-118：

CGG，CGT，GAA，GAT，GCG，ATG，CGT，GAC，CCT，CTG，GCT，ACT，CAG，GTT，CGG，CAT，GTA，ATG，CTG，TTC

119.EMPII-119：

ACG，CAT，CGC，ATC，TTC，ACG，CCG，AAA，GAT，TTC，CGC，GAT，GAG，CTG，AAT，GCG，TAT，CAG，AGC，TCG

120.EMPII-120：

CCA，TTC，GCT，TTG，CGT，CAG，GAT，CGG，CTC，CAC，CGA，GAA，GGC，CGA，GCT，CTG，ATA，CGC，ATT，CAG

121.EMPII-121：

ATC，CTG，ACG，CAA，AGC，GAA，TGG，AAC，CGG，CCT，CAC，AAC，CGC，GAT，ACC，CAT，ATT，GAG，AAT，CTC

122.EMPII-122：

GAT，ACT，TGC，GCC，AGG，ATG，AGT，GGT，AGC，ACC，GAC，CAG，ATA，GAG，ATT，CTC，AAT，ATG，GGT，ATC

123.EMPII-123：

ACT，CAT，CCT，GGC，GCA，AGT，ATC，CCA，GGG，GTG，ATT，GGC，TCG，GCC，AAG，GCT，ACC，GCA，GGA，TTG

124.EMPII-124：

CGG，GCA，GTG，ACC，CTC，TAT，TCA，AGC，CAG，ATG，GGC，CAG，CAT，CAA，TCC，TGC，GGT，AGC，CTT，GGC

125.EMPII-125：

TGA，ATA，GAG，GGT，CAC，TGC，CCG，ATC，ATG，CCG，TAG，ACA，CCA，TGG，AGG，TGG，GAT，CGA，AAA，GAA

126.EMPII-126：

GTC，CGG，TAA，AGG，CAT，CAT，GCA，GAA，ATG，ACG，CGG，TGG，CAA，TTC，TTT，TCG，ATC，CCA，CCT，CCA

127.EMPII-127：

TGC，ATG，ATG，CCT，TTA，CCG，GAC，GCA，GCG，TGC，TGA，TGC，TCT，ACG，AAT，GGT，GCC，GTC，ACT，GTG

128.EMPII-128：

CGT，TGC，TGC，GTC，CCA，GTA，CCT，GAT，CGT，CAA，TCA，CAT，CTG，CAC，AGT，GAC，GGC，ACC，ATT，CGT

129.EMPII-129：

AGG，TAC，TGG，GAC，GCA，GCA，ACG，ATA，CGG，CAT，CGC，TGC，AAT，CTG，GAG，AAC，AGC，GCC，TGG，CGC

130.EMPII-130：

GGG，ATC，CGG，CAT，AGG，CCT，GAC，GCG，AAT，TCA，TCT，CCA，GCT，GCG，CCA，GGC，GCT，GTT，CTC，CAG

131.EMPII-131：

GTC，AGG，CCT，ATG，CCG，GAT，CCC，AGA，TGC，ATG，AGC，CCG，CCT，TTG，CTT，CCT，CCC，AGG，AGG，TGG

132.EMPII-132：

GAT，CAG，TAG，CGT，AAG，CAG，GCA，GAA，TCT，CGT，GTG，CCA，TTG，CCA，CCT，CCT，GGG，AGG，AAG，CAA

133.EMPII-133：

TGC，CTG，CTT，ACG，CTA，CTG，ATC，ATC，TGG，CCT，ACT，TAC，CGA，TGG，ACG，TGC，CAG，AGA，CAC，GCT

134.EMPII-134：

CGT，GGT，AAC，AGT，AAC，GCA，GCG，TAT，CAT，CCA，GCG，TCT，GAT，AGC，GTG，TCT，CTG，GCA，CGT，CCA

135.EMPII-135：

CGC，TGC，GTT，ACT，GTT，ACC，ACG，TTG，CAC，GAG，TGG，TTG，GCC，TGA，TGA，TGG，CGC，AGA，TTA，TGG

136.EMPII-136：

ACT，CGC，AGG，CTG，GAT，CCA，GCG，TGG，CGT，TGT，GTT，GTA，CGC，CCA，TAA，TCT，GCG，CCA，TCA，TCA

137.EMPII-137：

CGC，TGG，ATC，CAG，CCT，GCG，AGT，TCG，GTC，TGG，CGA，AAC，ACC，TGA，CCA，ACA，TTG，CGC，GCG，ATC

138.EMPII-138：

CGG，GCA，GAT，AGC，AGC，GTC，CCG，CTT，CAG，CAT，CTT，CAA，CGC，GAT，CGC，GCG，CAA，TGT，TGG，TCA

139.EMPII-139：

CGG，GAC，GCT，GCT，ATC，TGC，CCG，CTG，CGT，GGC，TGG，CTG，AAG，AGC，CGC，TGA，CCC，GAG，AGA，ATC

140.EMPII-140：

CGA，CGC，TTC，TGA，GTG，CCT，GGC，GAC，TGT，GCG，GAT，CGG，CGA，GAT，TCT，CTC，GGG，TCA，GCG，GCT

141.EMPII-141：

GCC，AGG，CAC，TCA，GAA，GCG，TCG，CAA，GTC，GGC，TGG，TGG，AAA，CGG，CGG，AGC，CCT，ATT，ATC，GAT

142.EMPII-142：

CTG，AAC，GCA，GCG，GTA，AAC，CAA，GCA，GGC，CAG，CCG，ACG，CCG，ATC，GAT，AAT，AGG，GCT，CCG，CCG

143.EMPII-143：

TTG，GTT，TAC，CGC，TGC，GTT，CAG，CGT，GCA，CGA，TTG，CTA，CCG，CGC，AGC，AGG，TCT，ATC，GTA，AAA

144.EMPII-144：

CCC，ACG，CCT，GTG，AAC，CCG，CCT，GAA，CCA，CCG，TCA，TAC，CGA，TTT，TAC，GAT，AGA，CCT，GCT，GCG

145.EMPII-145：

AGG，CGG，GTT，CAC，AGG，CGT，GGG，AGC，AAC，GCC，AGT，CCA，CCA，GCA，CGC，CAG，AGT，TAC，TGG，CAC

146.EMPII-146：

CCC，GGG，AAG，TAA，CCG，CCT，GAC，CCG，ATG，CTT，CCA，CCA，GCA，GTG，CCA，GTA，ACT，CTG，GCG，TGC

147.EMPII-147：

GTC，AGG，CGG，TTA，CTT，CCC，GGG，TGC，AAC，GTC，ACG，CTC，CAC，GCT，CCA，ATG，ATC，TCT，GGC，AGC

148.EMPII-148：

CAG，GCG，ACG，CTG，CGA，GAA，CGT，CAT，GGC，GTT，AAA，CGT，CTC，GCT，GCC，AGA，GAT，CAT，TGG，AGC

149.EMPII-149：

ACG，TTC，TCG，CAG，CGT，CGC，CTG，CAG，ACA，TGA，CAG，CGC，ACG，AGA，GTA，AAG，AAA，GCC，AAA，CGA

150.EMPII-150：

CGC，ATG，CAT，CAT，GCG，GTA，CGA，GGC，AAA，GAT，TGC，TGT，GTC，TCG，TTT，GGC，TTT，CTT，TAC，TCT

151.EMPII-151：

TCG，TAC，CGC，ATG，ATG，CAT，GCG，GTG，CGC，CAT，ATA，ACA，ACT，GCG，TAA，ATA，ACG，GAT，TCG，CGG

152.EMPII-152：

GAC，GGC，CTG，GTG，CAT，CAG，CGC，TGG，GGT，GTC，CGC，TAT，GTT，CCG，CGA，ATC，CGT，TAT，TTA，CGC

153.EMPII-153：

GCG，CTG，ATG，CAC，CAG，GCC，GTC，ATG，CAC，AAT，AAG，CCA，GAG，CAG，GCC，GTA，GAG，CGT，CAT，ACC

154.EMPII-154：

GGC，AGC，ACT，CGT，GTC，TGG，CCC，TTG，CAG，TGG，ATC，GGC，GCG，GGT，ATG，ACG，CTC，TAC，GGC，CTG

155.EMPII-155：

GGG，CCA，GAC，ACG，AGT，GCT，GCC，CAG，ATA，AAT，GAG，CGC，GAT，CGA，CAG，AGC，GGC，GAA，CAC，TGC

156.EMPII-156：

CCG，CAT，ACA，GGC，TGG，TTT，GAG，GTT，AAT，GAC，CTC，TAT，GCC，GCA，GTG，TTC，GCC，GCT，CTG，TCG

157.EMPII-157：

CTC，AAA，CCA，GCC，TGT，ATG，CGG，TTC，ATG，ATG，TGA，CAG，ATG，CCA，GCC，CCA，ACG，ACA，GCC，ATG

158.EMPII-158：

ATG，GAG，ATA，ACG，GCA，ACA，CTG，GCG，CAC，AGA，TAC，AAT，GTG，CAT，GGC，TGT，CGT，TGG，GGC，TGG

159.EMPII-159：

CAG，TGT，TGC，CGT，TAT，CTC，CAT，TGG，GAT，AAC，GAG，GAC，CAG，AAC，CGA，AAG，GGC，ATT，CCA，AAT

160.EMPII-160：

TCA，TAT，GGA，TAT，GAA，CTG，GAT，TTG，GAA，TGC，CCT，TTC，GGT，T

利用PCR进行β-胡萝卜素全长操纵子扩增，在100μl反应体系中，EMPII-2-EMPII-159共158个引物的添加量为2ng，外侧引物EMPII-1和EMPII-160添加量为30ng。以KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)为TaqDNA聚合酶。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃10min，使用的，共25个循环。

PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。高效转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得阳性克隆。

实施例7β-胡萝卜素合成操纵子在大肠杆菌中表达

将实施例5所得的含有SEQ ID No：1序列的大肠杆菌与不含SEQ ID No1序列大肠杆菌共同涂布于LB固体培养基(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)，28℃培养24小时，结果见图3，其中图的左半边为不含SEQ ID No：1序列大肠杆菌菌落，呈乳白色；图的右半边为含有序列为SEQ ID No：1大肠杆菌菌落，呈亮黄色。

实施例8大肠杆菌生产β-胡萝卜素

挑取实施例7当中呈亮黄色的大肠杆菌菌落于20ml LB液体培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5，再加入0.05％-0.2％(w/v)阿拉伯糖，37℃继续振荡培养5-12小时。之后培养液在5,000g重力加速度下离心5min，无菌水清洗1次。所得的细胞沉淀用2ml浓度为1M磷酸缓冲液(113g/L K₂HPO₄，47g/L KH₂PO₄)重悬浮，然后将其转移到微量离心管中，以12,000g再次离心5min。沉淀用浓度为5ml/g的甲醇重悬浮后，以12,000g再次离心5min，去除上清液后，沉淀于铝箔中保存。

用甲醇抽提沉淀四次，每次的上清液分别装入试管中保存。对每个样品测定其在439nm下的吸光值(根据β-胡萝卜素吸收光谱确定，见图4)。将各部分收集到一起混匀，0.22μm膜过滤灭菌，测定混合液在439nm下的吸光值。根据标准曲线计算样品中β-胡萝卜素含量。每克湿重细胞β-胡萝卜素含量达到0.56mg。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子及其表达载体与应用

<130>0911006

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID No 1

<211>6241

<212>DNA

<213>成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子

<400>1

atgatgacgg tctgtgcaaa acaacacgtc aaaaacatac acaggcatgc agccagcctg    60

ttgaacgaca ttgaggaacg gcttgatcag cttccaccgg ttgaaagcga acgtgactta    120

gtgggcgctg caatgcgcga cggtgcgctg gcaacaggcc agcgtatccg tccactgctg    180

ttgttgctgc ccgcgcgcga tctgtgctgc aacgccacgc cggccggcct gcttgatctc    240

gcctgcgaag tagagatggt gcatgcaaaa tcactgattc tggatgacat gccctgcatg    300

gatgacgcac aactgcgacg cggacgtcgg accattcaat gccagtatgg tgaacatgtc    360

gcgattctgg ccgaagtggc cctgctgagt aagaaattcg gcgtggtcgc tgcggcagaa    420

ggcttaacgg caaccaccag agccgacgct gcgaaagaat tatcccacgc agtcggcatg    480

caggggctgg tgcagggaca gttaacggat ctttcagaag gtgacaaggc acgcagcgct    540

gacgccaaac tgatgacgaa tcactatacc accagcaccc tgccatgcgc ctccatgcag    600

atggcctcta tcgcaactga agcctcaggt gaagcaaccg aacagctgca ccgttaaacg    660

cttaatctcg gtcaggcttt ccagctcctg gacgatctca ctgacttcat ggtcgacacc    720

ggaaccgatg ctcatcagga tgacggggaa tcaacgctgg tgaatctgct gggaccacag    780

gcggttgaca cgcgactgcg cgatcatctg cgctgcgcca gcgagcatct gttatcggcc    840

tgccaggccg attatgccac acaccaaaat gttcaggcct ggtccgagaa acccctcgct    900

gccgtcagtt aaggatgctg catgagccac tcaccggtca ttgcaccgcc gttctatagc    960

catgtgcagg cgcttcagca ccttagccag gccttaatcg cacgcggaca ccagatcact    1020

ttcatccagc agacgaacgt tagcgcgcta ctcaccgaga gccgtatcgg caatttcccg    1080

ctggccctag cctcgcatcc ggcgggcagt ctggcacaca ccctgcaact ggcgccgcat    1140

cctctcggcc cttcaatgct gaaactgatc aatgagatgg cccgcagcac cgatatgctc    1200

tgccgtgaac tgcgggtgga gctgaggaag ctggcgaaag atggcgtgat cgtcgatcag    1260

atggagcctg ccggtgcacc ggcaacagaa gcgctgaacc tgcctcatgt tacggttgcc    1320

tgtgcgctgc cacttaaccg tgaagcggat ttcgggctgg ccgtgatgcc gaaagactat    1380

gccaggaccg atcaggcaag cgaacgctat cgcaccagtg aacctatcta tgactggctg    1440

atgcgacgtc acgatcgggt gatcggcggc aacgctcatg cgatcggatt agctccacgg    1500

gcccaactgc atcactgaaa ttcaccgctg gcggagaaca gccagttgat tccggatctg    1560

gattatccaa gccaggcgtt gcgggatcat ttcgatacgg ttggctcgct gcgtaccact    1620

gaacccgcac ccttcgaggc gcagcctcgc tacttcccgc atggcgacag accgcgcaat    1680

tccgcttccc tcggcacgct gcagggacat cgctacggcc tgtttaccac catcgtccgc    1740

gaacgccagg agatcgacgc tcagttattg ctggcgcaaa gcggtcggtt gtcacctttc    1800

caggcggaga aactgggcca ggccagccat gttcaggtgg tcgattccgc cgaccaggcg    1860

gctgcactgg cgcaggccga tcaagccatt acgcacggcg gcatgcctac ggtgctggat    1920

gggattaacc acctgacgcc gctgctgacg atcccgctgg ccaaagatca gccgggtgtg    1980

gctgccagag tggtctggca cggtatccga cgtcgcgcct cacgctttac caccagccac    2040

tccatggcgc gtcagctcca gaccccactg gctgatgaaa gctacgatca gcagatgaaa    2100

acgctgcgta gcgcacatcg tcaggcgggc ggaaccattc tggccggcga cattgtcgaa    2160

caggcgatgc tgacaagcca gccggtcgtc aggaggagag actatgccga ggtatgatct    2220

gattctggtg gacgcgcgac tggccaacgg gctgatcggc ctgcggctga gacagcagcg    2280

gccctcaatg cgcattctgc tgattgacgc cgaacgtgaa cgcggtgcca atcacacctg    2340

gtcgcctcat gcggaagatc tcaccgaaac gcagcatcgc tggatcgctc cgctggtagt    2400

acatcactgg cctggctatg aggtccgctt tcggcaccgc agtcgcagtc tgaacagtgg    2460

ctatttctgc gtgactgcgg agcgcttccg gcaggtcatc cgcgacaggt ttgcgccgga    2520

tctgctgctg aatacccggg ttgcgagcat cgcttcacgc gcggttacgc tggacgatgg    2580

ccgggtgctg gagagtgacg cagtgattga tggccgtggc taccagcccg atgccgcgct    2640

gcgcatgggc ttccagtcgt ccgtccgaca ggagaggcag ctcagcgagc cacatggcct    2700

gaccgcgccg atcaaaatgg atgccacggt agatcagcag gcaggctatc gctccgtcta    2760

cagcctgcga aaatctgcag acaccctgct gaatgaagat acccactaca ttgataacgc    2820

cacgctggaa ggcgatcgcg cccgtcagaa tatcaaagac tatgccgaag agcagggatg    2880

gcgattagac cggcacatac gcgaagagca aggcgcgtta cccaatacgc tgaccggcga    2940

cgtggaaacc ttctggcaga aacacgatct gccctgcagc ggaaagcgtg ccgggtgggt    3000

ccatcgtacc accggctatt ctctgccgct ggcggtcaag ctggctgatc ggctggcgca    3060

gatgcagacg ccaacctctg agaccctgca cgccaccatt cagcaattcg ccagtcaggc    3120

atggcagcaa cagcgcttct tccaaatgct gaaccgtatg ctgaatctgg cgggtccagc    3180

tgaccagcgc tggcaggtta tgcaacgtcc ttacggcctt cccgaaggtc tgatcgcccg    3240

ttcccatgcg ggtttactca caatgcctga tcggctgccc atcttaagcg gcaagccgga    3300

ggtccccgtt ctggcggcgt tacaggctat tatgactggt caccgtcaac aggcgatgca    3360

atgaatagaa ctacagtaat tggcgcaggc taccgtggtc tggctctggc aattcgcctt    3420

cagaagtcag gcgttcaaac cggactgctg gagcagcgtg acaagtctgg cggcaaagct    3480

tatgtctatc agcatcagaa cttcacgaat gatgccggcc ccacggtaat caccgatccc    3540

agcgccattg aagagctgtt caccctcgcg ggtaaagggc tctctgacta tgtcgagctg    3600

atgccggtga agccgaaata ccaacggtgc tgggagtcgg tcaaggtgtt cagttatgac    3660

aacgatcagc cggcggtgga agcgcagatt gccgcgtcca atccgcgtga cgttgaagga    3720

tatcgtcgct ttctggccta ttcccgagcg gtgcaggctg aaggctatct gaagcttggc    3780

accgtgccat ttctgtcatt ccgcgacatg ctgcggcaag cgcgacagct ggcatttctt    3840

caggcatgca gcagcgaata cagggaagtg gcgagctaca ttgaagatga gcatctgcgt    3900

caggccttct ccgaccactc actgctggtg gaaggaaatc cgtttggaac ttcctcaatc    3960

tatacaatga tggatgcgct ggttcgtgaa tggaacgtct ggttctcgcg cggtggcacg    4020

agcgcgcgcg tgcagggcat ggtgggactg tttgaagatc tcggcggcga agtggagctc    4080

aatgccagcg ttgcaaggct ggagacccag gatttcagga ttaccgcggt acacctgcca    4140

gatggccggg tcttcccgac gcgcgcgcgt gcctccaacg cagatgtgtt tcacacctac    4200

cgcgaactgc tgagccagca agcagcttcg caggcgcagg gacggtcact gcagaacaga    4260

cgcatgagca actcgccaaa tgtgatctat tctggcctga atcatcatca cgatcagctg    4320

gcgcaccaca cggtctgctt tggtccgcgc tatcgagagt tgattgatga aatccccaac    4380

ttagatggcc tggcagagga ctcatcgctc tatctgcatg cgaactgcgt gaccgatggc    4440

tcactggcac cggttgcctg cggcagctac tacgtgctgg cgcgcgtacc gcacctcgac    4500

accgaagaga tcgactgggc cgttgaagca ccgccgctgt gcgatcgcat actcgactat    4560

ctggaacagc attacatgcc gaacctgagt agccagaggg tcacgcatcg catcttcacg    4620

ccgaaagatt tccgcgatga gctgaatgcg tatcagagct cggccttctc ggtggagccg    4680

atcctgacgc aaagcgaatg gaaccggcct cacaaccgcg atacccatat tgagaatctc    4740

tatctggtcg gtgctaccac tcatcctggc gcaagtatcc caggggtgat tggctcggcc    4800

aaggctaccg caggattgat gctggcccat ctggcttgaa tagagggtca ctgcccgatc    4860

atgccgtaga caccatggag gtgggatcga aaagaattgc caccgcgtca tttctgcatg    4920

atgcctttac cggacgcagc gtgctgatgc tctacgaatg gtgccgtcac tgtgcagatg    4980

tgattgacga tcaggtactg ggacgcagca acgatacggc atcgctgcaa tctggagaac    5040

agcgcctggc gcagctggag atgaattcgc gtcaggccta tgccggatcc cagatgcatg    5100

agcccgcctt tgcttcctcc caggaggtgg caatggcaca cgagattctg cctgcttacg    5160

ctactgatca tctggcctac ttaccgatgg acgtgccaga gacacgctat cagacgctgg    5220

atgatacgct gcgttactgt taccacgttg cacgagtggt tggcctgatg atggcgcaga    5280

ttatgggcgt acaacacaac gccacgctgg atccagcctg cgagttcggt ctggcgaaac    5340

acctgaccaa cattgcgcgc gatcgcgttg aagatgctga agcgggacgc tgctatctgc    5400

ccgctgcgtg gctggctgaa gagccgctga cccgagagaa tctcgccgat ccgcacagtc    5460

gccaggcact cagaagcgtc gcaagtcggc tggtggaaac ggcggagccc tattatcgat    5520

cggcgtcggc tggcctgctt ggtttaccgc tgcgttcagc gtgcacgatt gctaccgcgc    5580

agcaggtcta tcgtaaaatc ggtatgacgg tggttcaggc gggttcacag gcgtgggagc    5640

aacgccagtc caccagcacg ccagagttac tggcactgct ggtggaagca tcgggtcagg    5700

cggttacttc ccgggtgcaa cgtcacgctc cacgctccaa tgatctctgg cagcgagacg    5760

tttaacgcca tgacgttctc gcagcgtcgc ctgcagacat gacagcgcac gagagtaaag    5820

aaagccaaac gagacacagc aatctttgcc tcgtaccgca tgatgcatgc ggtgcgccat    5880

ataacaactg cgtaaataac ggattcgcgg aacatagcgg acaccccagc gctgatgcac    5940

caggccgtca tgcacaataa gccagagcag gccgtagagc gtcatacccg cgccgatcca    6000

ctgcaagggc cagacacgag tgctgcccag ataaatgagc gcgatcgaca gagcggcgaa    6060

cactgcggca tagaggtcat taacctcaaa ccagcctgta tgcggttcat gatgtgacag    6120

atgccagccc caacgacagc catgcacatt gtatctgtgc gccagtgttg ccgttatctc    6180

cattgggata acgaggacca gaaccgaaag ggcattccaa atccagttca tatccatatg    6240

a                                                                    6241

Claims (5)

1.一种成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.权利要求1所述的成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子在大肠杆菌合成β-胡萝卜素中的应用。

3.一种包含权利要求1所述成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子的表达载体。

4.根据权利要求3所述的含有成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pBAD/TOPO载体，其通过与SEQ ID No：1序列直接连接形成。

5.权利要求3所述的含有成团泛菌β-胡萝卜素合成操纵子的表达载体在大肠杆菌合成β-胡萝卜素中的应用。

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