KR20200141734A - 파이토플루엔 고생산성 재조합 미생물 및 이를 이용한 파이토플루엔의 제조방법 - Google Patents

파이토플루엔 고생산성 재조합 미생물 및 이를 이용한 파이토플루엔의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파이토플루엔 고생산성 재조합 미생물 및 이를 이용한 파이토플루엔의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 장파장 자외선 (UV 320~400nm) 흡수능이 우수하여 자외선 차단 및 미백 소재로 사용할 수 있는 파이토플루엔을 저가의 배지에서 고농도로 생산할 수 있다.

Description

파이토플루엔 고생산성 재조합 미생물 및 이를 이용한 파이토플루엔의 제조방법{Recombinant Microorganism Having Enhanced Phytofluene Producing Ability and Method for Preparing Phytofluene Using the Same}
본 발명은 파이토플루엔(phytofluene) 고생산성 재조합 미생물 및 이를 이용한 파이토플루엔의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 파르네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP) 생합성 경로를 내재적으로 가지고 있는 미생물에서, (i) 파르네실 피로포스페이트(FPP)를 제라닐제라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자; 및 (ii) 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 파이토엔(phytoene)으로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자; 및 (iii) 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 파이토플루엔 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 파이토플루엔의 제조방법에 관한 것이다.
카로티노이드(carotenoid)는 항산화 활성을 갖고 있는 탄소수 40개의 이소프레노이드(isoprenoid) 화합물로 자연계에 널리 분포되어 있다. 현재까지 6백여 종의 서로 다른 화학 구조를 가진 카로티노이드가 보고되어 있으며, 화학 구조에 따라 노란색, 주황색, 붉은색 등 화려한 색을 띠는 색소군이다. 대표적인 카로티노이드로는 라이코펜(lycopene), 베타-카로틴(β-carotene), 루테인(lutein), 아스타잔틴(astaxanthin), 지아잔틴(zeaxanthin) 등이 있으며 주로 영양 보충제, 의약품, 식용착색제 및 동물 사료 첨가제로 사용되고 있다. 이들 중 무색인 특징을 갖고 있는 카로티노이드로는 파이토엔과 파이토플루엔이 있으며, 공역화 이중결합(conjugated double bond)이 3개인 파이토엔은 UVB 영역(280~320nm)의 단파장 자외선 흡수능이 우수하고, 공역화 이중결합이 5개인 파이토플루엔은 UVA 영역(320~400nm)의 장파장 자외선 흡수능이 우수하다고 알려져 있다 (Antonio J. Melㅹndez-Martㅽnez et. al., Arch. Biochem. Biophys., 572:188-200, 2015). 또한 파이토엔과 파이토플루엔은 피부에 어떠한 부작용 없이 미백 효과가 우수함이 밝혀져 최근 화장품 및 건강기능식품 용도로 주목받고 있다 (한국등록특허 10-1448317).
카로티노이드 생합성 경로는 일반적인 이소프레노이드 경로의 중요한 중간 생성물인 FPP(farnesyl pyrophosphate)로부터 파생되는데, FPP는 MEP(2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate) 경로 혹은 MVA(mevalonate) 경로를 통해 만들어진 IPP(isopentenyl pyrophosphate)와 DMAPP(dimethylallyl pyrophosphate)를 출발물질로 하여 ispA(geranyl diphosphate/farnesyl diphosphate synthase) 중합 작용에 의해 GPP (geranyl pyrophosphate)를 거쳐 만들어진다 (도 1). 인간을 비롯한 대부분의 진핵생물과 일부 세균은 MVA 경로를 가지고 있고, 원핵생물과 대장균을 포함한 대부분의 세균은 MEP 경로를 가지고 있으며, 이렇게 생성된 IPP와 DMAPP는 idi(isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase)에 의해 상호 전환된다. FPP와 IPP는 crtE(geranylgeranyl pyrophosphate synthase)에 의해 GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate synthase)로 전환되고, 2 분자의 GGPP가 crtB(phytoene synthase)에 의해 중합되어 모든 카로티노이드 화합물의 전구체가 되는 무색의 파이토엔으로 전환된다. 그 후 파이토엔 불포화효소(phytoene desaturase)인 crtI에 의해 최종적으로 라이코펜(lycopene)으로 전환되는데, 카로티노이드 생합성 경로를 갖는 생명체의 종류에 따라 파이토엔 불포화효소의 특성이 달라 일부 파이토엔 불포화효소에 의해서는 라이코펜 전구체에 해당하는 파이토플루엔 및 제타-카로틴(ζ-carotene) 등의 중간 대사물이 만들어지기도 한다 (Antonio A. Iniesta et. al., FEBS J., 274:4306-4314, 2007). 즉, 판토에아 아글루메란스 (Pantoea agglomerans)와 같은 세균들은 한 종류의 파이토엔 불포화효소에 의해 파이토엔에서 라이코펜으로 전환되지만 (한국등록특허 10-1965330), 식물, 조류(algae), 남세균 (cyanobacteria) 등에서는 다양한 종류의 파이토엔 불포화효소가 동시에 존재하고 이들의 연쇄 반응에 의해 최종적으로 라이코펜으로 전환된다 (Antonio J. Melㅹndez-Martㅽnez et. al., Arch. Biochem. Biophys., 572:188-200, 2015).
한편, 파이토엔은 천연물에서의 직접 추출, 유기 화학적 합성, 미생물 발효를 통한 생산 등 다양한 방법으로 생산 가능함이 알려져 있고, 특히 대사 공학을 이용한 방법으로 다른 카로티노이드의 혼입 없이 고농도로 생산할 수 있음이 알려져 있다 (한국등록특허 10-1927892; WO 2018/109194 A1; Patrick Schaub et. al., PLoS ONE, 7:e39550, 2012). 하지만, 파이토플루엔은 살구, 오렌지, 복숭아, 토마토 등과 같은 과일에 소량 존재하는 것으로 알려져 있고, 현재 보고된 가장 높은 함량은 건조시키지 않은 과육 기준 2.4mg/100g 수준으로 건체 중량으로 환산한 경우 대략 0.08mg/g 수준에 불과하다. 또, 마이소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 파이토엔 불포화효소인 crtIa 유전자를 crtE 유전자, crtB 유전자와 함께 대장균에서 발현한 경우 세포 파쇄물 총 단백질 농도 기준 0.26mg/g 수준의 파이토플루엔이 생성된다고 보고되어 있는데, 이를 건세포 중량(dry cell wight)으로 환산한 경우 대략 0.13mg/g 수준에 불과하다 (Antonio A. Iniesta et. al., FEBS J., 274:4306-4314, 2007). 즉, 상기 예에서 언급한 파이토플루엔의 생산성은 매우 낮기 때문에 경제적인 생산 공정 개발이 불가능하다.
이에, 본 발명자들은 파이토플루엔을 고농도로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 파이토엔 생산에 필요한 효소를 코딩하는 유전자와 타이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 배양하는 경우, 저가의 최소 배지 조건에서 짧은 시간 동안 발효 배양을 통하여도 고농도로 파이토플루엔을 생산할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 장파장 자외선 (UV 320~400nm) 흡수능이 우수하여 자외선 차단 및 미백 소재로 사용할 수 있는 파이토플루엔을 고농도로 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 파이토플루엔을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 서열번호 21, 서열번호 33 및 서열번호 37 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 상기 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 이용하여, 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 단계; 및 (b) 상기 파이토플루엔을 수득하는 단계를 포함하는 파이토플루엔의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파르네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP) 생합성 경로를 내재적으로 가지고 있는 미생물에서,
(i) 파르네실 피로포스페이트(FPP)를 제라닐제라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자;
(ii) 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 파이토엔(phytoene)으로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자; 및
(iii) 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 파이토플루엔 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 파이토플루엔을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 파이토플루엔을 수득하는 단계를 포함하는 파이토플루엔의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 장파장 자외선 (UV 320~400nm) 흡수능이 우수하여 자외선 차단 및 미백 소재로 사용할 수 있는 파이토플루엔을 저가의 배지에서 고농도로 생산할 수 있다.
도 1은 파이토플루엔 생합성에 필요한 재조합 미생물의 내재 경로 및 인위적으로 도입한 외래 경로를 도식적으로 나타낸 것으로, 실선은 내재된 경로를 나타내고, 실선은 외부로부터 도입되는 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 파이토플루엔 생합성을 위해 인위적으로 도입한 유전자들을 포함하는 재조합 발현 플라즈미드들과 그 제작 과정을 도식화한 것이다.
도 3은 파이토플루엔 고생산성 재조합 대장균들을 플라스크 배양하였을 때 생산된 파이토플루엔의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다(a: HPLC 크로마토그램; b: HPLC 분석 피크의 UV 흡수 스펙트럼).
도 4는 파이토플루엔 고생산성 재조합 대장균들을 플라스크 배양하였을 때 생산된 파이토플루엔의 농도를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 기존의 방법으로는 생산성이 낮아 상업적 생산이 불가능하였던 파이토플루엔을 저가의 배지에서 고농도로 생산하는 방법을 개발하고자 하였으며, 파르네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP) 생합성 경로를 갖고 있는 미생물에, GGPP를 중합할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자, 파이토엔을 중합할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자 및 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입한 파이토플루엔 고생산성 재조합 미생물을 제조하고, 상기 재조합 미생물을 배양하는 경우, 파이토플루엔을 고농도로 생산할 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 파르네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP) 생합성 경로를 내재적으로 가지고 있는 미생물에서, (i) 파르네실 피로포스페이트(FPP)를 제라닐제라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자; 및 (ii) 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 파이토엔(phytoene)으로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자; 및 (iii) 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 파이토플루엔 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소는 Chromochloris zofingiensis 유래의 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 효소, Solanum lycopersicum 유래의 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 효소 또는 Synechocystis sp. 유래의 서열번호 37의 아미노산 서열로 표시되는 효소를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 파르네실 피로포스페이트(FPP)를 제라닐제라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)로 중합하는 효소는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신테이즈(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, CrtE)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 파르네실 피로포스페이트(FPP)를 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자는 crtE인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 파이토엔(phytoene)으로 중합하는 효소는 파이토엔 신테이즈(phytoene synthase, CrtB)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 파이토엔(phytoene)으로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자는 crtB인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소는 파이토플루엔 불포화효소 (phytoene desaturase, CrtI)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 crtI인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물에는 메발로네이트(mevalonate, MVA) 합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 추가로 도입할 수 있으며, 상기 메발로네이트(mevalonate, MVA) 합성 경로에 관여하는 효소는 hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mevalonate kinase, phosphomevalonate kinase 및 diphosphomevalonate decarboxylase로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 메발로네이트(mevalonate, MVA) 합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 mvaE, mvaS, mvaK1, mvaK2 및 mvaD로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물에는 IPP(isopentenyl pyrophosphate)와 DMAPP(dimethylallyl pyrophosphate)간의 상호 전환을 촉매하는 효소인 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머레이즈(isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase) 효소를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기기 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머레이즈(isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase) 효소를 코딩하는 유전자는 ipiHp1 및 idi인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 상기 재조합 대장균에 대하여, 플라스크 배양을 수행하여 48시간의 배양에서 건세포 중량 기준 10% 수준에 해당하는 97.6mg/g의 파이토플루엔 생산성을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 파이토플루엔을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 파이토플루엔을 수득하는 단계를 포함하는 파이토플루엔의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 본원발명의 표 2에 나타낸 파이토엔 불포화효소(phytoene desaturase) 유전자(crtI)가 도입된 재조합 미생물 중 서열번호 22의 crtI_chr, 서열번호 34의 crtI_sol, 서열번호 38의 crtI_syn의 파이토엔 불포화효소를 코딩하는 유전자가 효과적으로 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또다른 관점에서, (a) 서열번호 21, 서열번호 33 및 서열번호 37 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 상기 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 이용하여, 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 단계; 및 (b) 상기 파이토플루엔을 수득하는 단계를 포함하는 파이토플루엔의 제조방법에 관한 것이다..
파이토플루엔 고생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조
본 발명의 파이토플루엔 고생산성을 가지는 재조합 미생물은 도 1에 나타난 바와 같이, FPP(farnesyl pyrophosphate) 생합성 경로를 갖고 있는 미생물에, 파이토엔을 과량 생산할 수 있는 효소 유전자들과 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소 유전자를 도입한 것이다. 상기 설명한 바와 같이 파이토엔은 IPP와 그 구조 이성질체인 DMAPP 단량체를 전구체로 하는 일련의 중합 경로를 통해 만들어진다.
바람직하게 본 발명의 재조합 미생물은 MEP 경로를 포함하는 FPP 합성경로를 내재적으로 가지고 있으며, FPP와 IPP가 중합되어 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 합성하는 효소의 유전자, 즉 제라닐제라닐 피로포스페이트 신테이즈(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, CrtE)와 두 분자의 GGPP를 파이토엔으로 중합하는 파이토엔 신테이즈(phytoene synthase, CrtB)의 유전자가 도입된 것이다.
보다 바람직하게 본 발명의 재조합 미생물은 MEP 경로를 포함하는 FPP 합성경로를 내재적으로 가지고 있으며, FPP와 IPP가 중합되어 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 거쳐 파이토엔으로 중합하는 효소의 유전자들, 즉, crtE (granylgeranyl pyrophosphate synthase) 및 crtB (phytoene synthase)와 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소, 즉 crtI (phytoene desaturase)가 도입된 것이다.
더욱 바람직하게 발명의 재조합 미생물은 상기 도입한 외래 유전자들과 더불어 IPP 과생산을 위한 MVA 경로와 관련된 유전자들, 즉 mvaE(hydroxymethylglutaryl-CoA reductase), mvaS(hydroxymethylglutaryl-CoA synthase), mvaK1(mevalonate kinase), mvaK2(phosphomevalonate kinase) 및 mvaD(diphosphomevalonate decarboxylase)과 IPP와 DMAPP간의 상호 전환을 촉매하는 효소의 유전자(ipiHp1 및 idi)가 추가적으로 도입된 것이다.
파이토플루엔 합성에 필요한 외래 효소 유전자군
본 발명의 재조합 미생물은 한 분자의 FPP에 한 분자의 IPP가 중합되어 GGPP를 합성하는 효소의 유전자(crtE)와 두 분자의 GGPP가 중합되어 파이토엔을 합성하는 효소의 유전자(crtB)가 도입된 것이다. 상기 유전자는 crtE 또는 crtB 일 수 있으며(표 1), 서열번호 2 또는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 유전자 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 유전자, 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 효소 활성이 90% 이상 동일한 단백질을 코딩하는 유전자 등이다.
유전자 효소명 유래 미생물 유전자 서열
crtE geranylgeranyl pyrophosphate synthase Synechocystis sp. 서열번호 2
crtB phytoene synthase Pantoea agglomerans 서열번호 6
본 발명의 재조합 미생물은 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소 유전자(crtI)가 도입된 것이다. 상기 유전자는 crtI_aux, crtI_chl, crtI_chr, crtI_myx, crtI_pan, crtI_sol, crtI_syn에서 선택되어진 어느 하나일 수 있으며(표 2), 서열번호 14, 서열번호 18, 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 30, 서열번호 34, 서열번호 38의 염기서열을 포함하는 유전자 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 유전자, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 효소 활성이 90% 이상 동일한 단백질을 코딩하는 유전자 등이다.
유전자 효소명 유래 미생물 유전자 서열
crtI_aux phytoene desaturase Auxenochlorella protothecoides 서열번호 14
crtI_chl phytoene desaturase Chlamydomonas reinhardtii 서열번호 18
crtI_chr phytoene desaturase Chromochloris zofingiensis 서열번호 22
crtI_myx zeta-carotene-forming phytoene desaturase Myxococcus xanthus 서열번호 26
crtI_pan phytoene desaturase Pantoea agglomerans 서열번호 30
crtI_sol 15-cis-phytoene desaturase Solanum lycopersicum 서열번호 34
crtI_syn 15-cis-phytoene desaturase Synechocystis sp. 서열번호 38
본 발명의 재조합 미생물은 HPP의 전구체인 IPP 과생산을 위해 외래 MVA 경로와 관련된 유전자들과 IPP와 DMAPP간의 상호 전환을 촉매하는 효소의 유전자가 추가적으로 도입된 것이다.
상기 유전자는 mvaE, mvaS, mvaK1, mvaK2, mvaD, idi, ipiHp1 일 수 있으며(표 3), 서열번호 42, 서열번호 46, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 58, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 유전자 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 유전자, 서열번호 41, 서열번호 46, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 58, 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 서열번호 41, 서열번호 46, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 58, 서열번호 9의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 41, 서열번호 46, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 58, 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 효소 활성이 90% 이상 동일한 단백질을 코딩하는 유전자 등이다.
유전자 효소명 유래 미생물 유전자 서열
mvaE hydroxymethylglutaryl-CoA reductase Enterococcus faecalis 서열번호 42
mvaS hydroxymethylglutaryl-CoA synthase Enterococcus faecalis 서열번호 46
mvaK1 mevalonate kinase Streptococcus pneumoniae 서열번호 50
mvaK2 phosphomevalonate kinase Streptococcus pneumoniae 서열번호 52
mvaD diphosphomevalonate decarboxylase Streptococcus pneumoniae 서열번호 54
idi isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase Escherichia coli 서열번호 58
ipiHp1 isopentenyl pyrophosphate isomerase Haematococcus lacustris 서열번호 10
상기 유전자들의 도입은 유전자 발현이 가능한 모든 형태일 수 있고, 예컨대 플라즈미드(plasmid)의 형태이거나 대상 미생물 유전체 상의 특정 유전자와의 대체나 특정 위치로의 삽입일 수 있다.
용어 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명의 목적 단백질의 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 어류 기원의 CHSE-214, FHM, RTG-2 및 EPC를 예시하였으나 물론 이에 제한되는 것은 아니다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 예는
오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 파이토플루엔 전환 효소(파이토엔 불포화효소)의 탐색
본 실시예에서는 상기 설명한 MEP 경로를 내재적으로 가지고 있는 대장균에, 파이토플루엔 합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자들과 전구체 IPP의 생산성을 높이기 위한 MVA 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자들을 플라즈미드 형태로 도입하여 파이토플루엔 고효율 생합성 가능성이 있는 재조합 대장균을 제작하였다. 파이토플루엔은 상기 설명한 바와 같이 파이토엔에서 파이토엔 불포화효소(phytoene desaturase)인 crtI에 의해 전환될 수 있는데, 파이토엔 불포화효소의 특성에 따라 중간 대사물 없이 최종 산물인 라이코펜을 생성하기도 하고 중간 대사물에 해당하는 파이토플루엔을 생성하기도 한다. 예컨대, 상기 표 2에 설명한 서열번호 30의 Pantoea agglomerans 유래 crtI_pan는 전환 산물로 라이코펜을 생성하는 것으로 알려져 있다 (한국등록특허 10-1965330). 이에 본 실시예에서는 우선 파이토엔 고효율 생합성이 가능하도록 하는 플라즈미드를 제작하고, 그 후 파이토플루엔 고효율 생합성이 가능한 파이토엔 불포화효소(phytoene desaturase) 탐색을 실시하였다.
본 실시예에서 사용된 파이토엔 및 파이토플루엔 합성 경로의 유전자들과 MVA 경로의 효소 유전자들은 최종 발현 플라즈미드의 유지 안정성을 고려하여 각각 pTrc99A 벡터(Pharmacia, Sweden, GenBank No. M22744)와 pSTV28 벡터(Takara Korea, 한국) 에 나누어 도입하였고, 이들 벡터는 서로 다른 Origin을 가지고 있기 때문에 하나의 대장균 내에서 공존 가능하다.
(1) 파이토엔 생합성과 관련된 효소 유전자들 발현을 위한 플라즈미드 제작
본 실시예에서 사용된 파이토엔 합성 경로와 관련된 효소를 코딩하는 유전자들과 IPP와 DMAPP간의 상호 전환을 촉매하는 효소 유전자 ipiHp1은 GenScript(NJ, USA)에서 합성하였고, 유전자 증폭을 위한 프라이머는 표 4와 같으며 오버랩핑 PCR을 수행하여 pTrc99A 벡터에 각각 도입하여 pT-Phytoene을 제작하였다 (도 2).
유전자 유전자 증폭을 위한 프라이머 서열
crtE 서열번호 3:
ATGGAATTCAAAATCTAGAAGAGGAGGCTAAACATGGTGGCGCAGCAAACCCGTACC
서열번호 4:
CCAGCAGCGGCGGCTGGCTCATAGTTTTACCTCCTTAATCTAGTTTAATATTTACGCGCAACAATG
crtB 서열번호 7:
CATTGTTGCGCGTAAATATTAAACTAGATTAAGGAGGTAAAACTATGAGCCAGCCGCCGCTGCTGG
서열번호 8:
CTCTGAGCAACGAACGAAGCATATTTTATTACCTCCTCTAGTTTAAACCGGACGTTGCCACAGG
ipiHp1 서열번호 11:
CCTGTGGCAACGTCCGGTTTAAACTAGAGGAGGTAATAAAATATGCTTCGTTCGTTGCTCAGAG
서열번호 12:
CGACGCGGCCGCTTATCACGCTTCGTTGATGTGATGCAC
(2) 파이토플루엔 불포화 효소 탐색을 위한 위한 플라즈미드 제작
본 실시예에서 사용된 파이토플루엔 합성과 관련된 효소를 코딩하는 유전자들은 GenScript(NJ, USA)에서 합성하였고, 유전자 증폭을 위한 프라이머는 표 5와 같으며 상기 제작한 pT-Phytoene 플라즈미드에 각각 도입하여 pT-Phyto-CrtIaux, pT-Phyto-CrtIchl, pT-Phyto-CrtIchr, pT-Phyto-CrtImyx, pT-Phyto-CrtIpan, pT-Phyto-CrtIsol, pT-Phyto-CrtIsyn을 제작하였다 (도 2).
유전자 유전자 증폭을 위한 프라이머 서열
crtI_aux 서열번호 15:
TAAGCGGCCGCGAGGAGGTATAAAGGATGCAGAGCACCACCATGAGCAGC
서열번호 16:
GACGCGGCCGCTCACGCCAGCGCTTTCTCCTTCGCC
crtI_chl 서열번호 19:
TAAGCGGCCGCGAGGAGGTATAAAGGATGCAAACCCAGGTTAAACCG
서열번호 20:
GACGCGGCCGCTCAACGGCCAAAACCAACCAGAC
crtI_chr 서열번호 23:
TAAGCGGCCGCGAGGAGGTATAAAGGATGCAGCAAGCGCTGGGCCAATG
서열번호 24:
GACGCGGCCGCTCACGCGGTCGCCAGCGCCGGTT
crtI_myx 서열번호 27:
TAAGCGGCCGCGAGGAGGTATAAAGGATGAGCGCGAGCACCCAGGGTCG
서열번호 28:
GACGCGGCCGCTCACGCCGCAACACCCTCCAGC
crtI_pan 서열번호 31:
TAAGCGGCCGCGAGGAGGTATAAAGGATGAAAAAAACCGTTGTGATTGG
서열번호 32:
GACGCGGCCGCTCATTGCAGATCCTCAATCATCAGGC
crtI_sol 서열번호 35:
TAAGCGGCCGCGAGGAGGTATAAAGGATGCCGCAGATCGGCCTGGTTAG
서열번호 36:
GACGCGGCCGCTCAAACCACGCTCGCCTCGCTCAGT
crtI_syn 서열번호 39:
TAAGCGGCCGCGAGGAGGTATAAAGGATGCGTGTGGTTATTGCGGGTGC
서열번호 40:
GACGCGGCCGCTCAACCAACGGTCACAATTTCACG
(3) IPP 과생산을 위한 MVA 경로의 효소 유전자들 발현을 위한 플라즈미드 제작
본 실시예에서 사용된 IPP 과생산을 위한 MVA 경로와 관련된 효소를 코딩하는 유전자들과 IPP와 DMAPP간의 상호 전환을 촉매하는 효소 유전자 idi는 GenScript(NJ, USA)에서 합성하였고, 유전자 증폭을 위한 프라이머는 표 6에 나타내었으며 오버랩핑 PCR을 수행하여 pSTV28 벡터에 각각 도입하여 pS-MVA를 제작하였다. mvaK1, mvaK2 및 mvaD 유전자는 해당 균주 Streptococcus pneumonia 염색체상에 오페론으로 존재하여 전체를 합성하여 PCR 증폭 후 사용하였다 (도 2).
유전자 유전자 증폭을 위한 프라이머 서열
mvaK1-mvaD-mvaK2 서열번호 55:
ACCCGGGGATCCTGCGATAACGGAAAAAACGATAAGGAGGTATTCTATGACAAAAAAAGTTGGTGTCGG
서열번호 56:
CAAACCTCCTTAAACTATTACGAGACCTTACGATTTGTCGTCATGTCCTATCC
idi 서열번호 59:
GTCTCGTAATAGTTTAAGGAGGTTTGTTATGCAAACGGAACACGTCATTTTA
서열번호 60:
CCTTATACCTGTTTATCAAATCTAGATTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATA
mvaE 서열번호 43:
AATCTAGATTTGATAAACAGGTATAAGGAGGTATTTTATGAAAACAGTAGTTATTATTG
서열번호 44:
CATAAAAATACCTCCTTATTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAAT
mvaS 서열번호 47:
CAATAATAAGGAGGTATTTTTATGACAATTGGGATTGATAAAATT
서열번호 48:
GCATGCCTGCAGGTCGACTTAGTTTCGATAAGAGCGAACGGTAT
(4) 형질전환된 재조합 대장균의 제작
상기 제작한 pT-Phytoene, pT-Phyto-CrtIaux, pT-Phyto-CrtIchl, pT-Phyto-CrtIchr, pT-Phyto-CrtImyx, pT-Phyto-CrtIpan, pT-Phyto-CrtIsol, pT-Phyto-CrtIsyn 및 pS-MVA 재조합 플라즈미드의 도입 유전자 염기서열은 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였으며, 야생형 대장균 균주인 E. coli MG1655 (KCCM 41310)에 화학적 형질전환법을 사용하여 도입하여 아래 표 7과 같은 조합의 재조합 대장균들을 제작하였다. 즉, 제작한 8종의 재조합 대장균들은 모두 공통적으로 pS-MVA를 함유하고 있으며, 대조군으로 제작한 PTS-MG는 파이토엔 불포화효소인 crtI가 도입되지 않아 파이토엔만 생성하도록 재조합되어 있고, 또 다른 대조군인 PTFpanS-MG는 파이토엔에서 라이코펜을 생성하는 crtI_pan가 도입되어 라이코펜만 생성하도록 재조합되어 있다.
재조합 대장균명 도입 플라즈미드 도입 유전자
PTS-MG pT-Phytoene, pS-MVA crtE, crtB, ipiHp1, mvaK1, mvaD, mvaK2, idi, mvaE, mvaS
PTFauxS-MG pT-Phyto-CrtIaux, pS-MVA crtE, crtB, ipiHp1, crtI_aux, mvaK1, mvaD, mvaK2, idi, mvaE, mvaS
PTFchlS-MG pT-Phyto-CrtIchl, pS-MVA crtE, crtB, ipiHp1, crtI_chl, mvaK1, mvaD, mvaK2, idi, mvaE, mvaS
PTFchrS-MG pT-Phyto-CrtIchr, pS-MVA crtE, crtB, ipiHp1, crtI_chr, mvaK1, mvaD, mvaK2, idi, mvaE, mvaS
PTFmyxS-MG pT-Phyto-CrtImyx, pS-MVA crtE, crtB, ipiHp1, crtI_myx, mvaK1, mvaD, mvaK2, idi, mvaE, mvaS
PTFpanS-MG pT-Phyto-CrtIpan, pS-MVA crtE, crtB, ipiHp1, crtI_pan, mvaK1, mvaD, mvaK2, idi, mvaE, mvaS
PTFsolS-MG pT-Phyto-CrtIsol, pS-MVA crtE, crtB, ipiHp1, crtI_sol, mvaK1, mvaD, mvaK2, idi, mvaE, mvaS
PTFsynS-MG pT-Phyto-CrtIsyn, pS-MVA crtE, crtB, ipiHp1, crtI_syn, mvaK1, mvaD, mvaK2, idi, mvaE, mvaS
(5) 플라스크 배양을 통한 파이토플루엔 생산 확인
상기 제작한 재조합 대장균들을 플라스크 수준에서 배양하여 파이토플루엔의 생산성을 비교하였다. 각 재조합 균주들을 아래 표 8 조성의 최소 배지(pH 7.0)에 접종하여 30ㅀC, 200rpm 에서 24시간 동안 배양하였으며, 배양 중 1ml의 샘플을 채취하여 OD(optical density) 600을 측정하고, 원심분리 후 균체를 건조하여 건세포 중량(dry cell wight, DCW)을 측정하였다. 재조합 대장균이 생산한 파이토플루엔의 농도는 채취한 샘플에 19배 부피의 에탄올을 첨가하여 상온에서 추출 및 여과한 후 HPLC (Agilent Infinity series 1260, C18 packing column, UV 347nm)로 분석하였다.
본 발명에 사용한 파이토플루엔 표준품(Carbosynth, 영국, product code FH31684)은 트랜스형(trans isomer)과 시스형(cis isomer)의 혼합물이며, HPLC 분석 결과 서로 다른 보유시간(retention time)에서 2개의 피크(peak 1과 peak 2)를 보였다. 각 피크는 파이토플루엔의 특징인 최대 흡수 파장 331nm, 347nm, 365nm의 동일한 UV 흡수 스펙트럼 (Antonio J. Melendez-Martinez et. al., Arch. Biochem. Biophys., 572:188-200, 2015)을 보였으며, 이를 통해 본 발명의 HPLC 분석 상 두 개의 피크 모두 파이토플루엔의 이성질체임을 확인할 수 있었다 (도 3).
재조합 대장균들의 배양물 분석 결과, 상기 표 7의 재조합 대장균들 모두 비슷한 생장을 보였으며, 파이토플루엔을 생산하는 재조합 대장균은 PTFchrS-MG, PTFsolS-MG, PTFsynS-MG로 각각 서열번호 22의 crtI_chr, 서열번호 34의 crtI_sol, 서열번호 38의 crtI_syn의 파이토엔 불포화효소가 포함된 플라즈미드로 재조합된 대장균들이었다 (표 9). 이들 재조합 대장균 배양물에는 파이토플루엔 표준품과 동일하게 2개의 이성질체(peak 1과 peak 2)가 공존하고 있으며, 각 피크는 동일하게 파이토플루엔 고유의 UV 흡수 스펙트럼을 보였다 (도 3). 대조군으로 사용한 PTS-MG는 동일한 배양 조건에서 예상처럼 파이토플루엔의 전구체인 파이토엔만을 276.6mg/L (24.5mg/g DCW) 수준으로 생산하였다. 또 다른 대조군인 라이코펜 생산 균주 PTFpanS-MG는 495.5mg/L (50.6mg/g DCW) 수준의 라이코펜만을 생산하였다. 즉, 서열번호 22의 crtI_chr, 서열번호 34의 crtI_sol, 서열번호 38의 crtI_syn의 파이토엔 불포화효소가 효과적으로 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환할 수 있음을 확인하였다.
성분 최종 농도
Glycerol 50.0 g/L
MgSO4·7H2O 1.2 g/L
(NH4)2HPO4 4.0 g/L
KH2PO4 13.3 g/L
Citric acid 1.7 g/L
Yeast extract 5 g/L
Trace metal solution* 3 ml/L
Trace metal solution (per liter): 2.8g EDTA, 4.33g Zn(CH3COO)2·2H2O, 5g MnCl2·4H2O, 1g H3PO3, 33.33g Fe(III)Citrate, 0.5g CuCl2, 0.83g CoCl2·6H2O, 0.83g Na2MoO4·2H2O
재조합 대장균명 파이토플루엔 생산 농도 (mg/L) 건체 중량
(g DCW/L culture broth)		 파이토플루엔 특이 생산성 (mg/g DCW)
PTS-MG Not detected 11.3 Not detected
PTFauxS-MG Not detected 10.3 Not detected
PTFchlS-MG Not detected 11.4 Not detected
PTFchrS-MG 106.7 9.9 10.8
PTFmyxS-MG Not detected 10.9 Not detected
PTFpanS-MG Not detected 9.8 Not detected
PTFsolS-MG 102.0 10.1 10.1
PTFsynS-MG 145.0 10.5 13.8
실시예 2: 파이토플루엔 고생산성 균주 제작 및 생산성 확인
실시예 1에서 파이토플루엔 생산에 적합한 파이토엔 불포화효소의 탐색을 위해 제작한 재조합 대장균들(표 7)은 모두 IPP 과생산을 위한 pS-MVA를 함유하고 있으며, pS-MVA를 함유하지 않는 재조합 대장균의 경우 파이토엔 혹은 그 유도체(파이토플루엔과 라이코펜)의 생산농도가 낮아 정확한 HPLC 분석을 위해 농축 과정이 필요하다. 예컨대, pT-Phytoene과 pS-MVA가 동시에 도입된 재조합 대장균 (PTS-MG)는 24시간 배양에 276.6mg/L 수준의 파이토엔을 생산하지만, pT-Phytoene만 도입된 재조합 대장균은 같은 조건에서 8mg/L 수준의 파이토엔만을 생산할 뿐이었다. 즉, 본 발명의 대상이 되는 파이토플루엔 과생산을 위해서는 효과적인 IPP 및 DMAPP의 공급이 중요함을 확인할 수 있었다. 이에 추가적인 IPP 과생산을 위하여 MVA 경로 중 하부 경로에 해당하는 mvaK1, mvaK2 및 mvaD 유전자가 표 10과 같이 대장균 E. coli MG1655 염색체 내 다양한 위치에 삽입된 재조합 대장균 균주들을(한국공개특허 10-2018-0124777) 파이토플루엔 고생산성 재조합 대장균 제작을 위해 사용하였으며, 재조합 대장균 제작 방법은 실시예 1과 동일하다 (표 11). 또, 상기 제작한 재조합 대장균들은 실시예 1에서와 같은 조건에서 60시간 동안 플라스크 배양하여 파이토플루엔의 생산성을 비교하였다 (도 4).
재조합 대장균명 하부 경로 삽입 위치 설명 출처
MG1655(DE3) DadhE::MVA bottom adhE DadhE (::PcTrc-SN12Didi-ter) 한국공개특허
10-2018-0124777
MG1655(DE3) DldhA::MVA bottom ldhA DldhA (::PcTrc-SN12Didi-ter)
MG1655(DE3) DpoxB::MVA bottom poxB DpoxB (::PcTrc-SN12Didi-ter)
MG1655(DE3) DatoDA::MVA bottom atoDA DatoDA (::PcTrc-SN12Didi-ter)
재조합 대장균명 도입 플라즈미드 기본 대장균
PTFchrS-MGAB pT-Phyto-CrtIchr, pS-MVA MG1655(DE3) DadhE::MVA bottom
PTFsolS-MGAB pT-Phyto-CrtIsol, pS-MVA
PTFsynS-MGAB pT-Phyto-CrtIsyn, pS-MVA
PTFchrS-MGLB pT-Phyto-CrtIchr, pS-MVA MG1655(DE3) DldhA::MVA bottom
PTFsolS-MGLB pT-Phyto-CrtIsol, pS-MVA
PTFsynS-MGLB pT-Phyto-CrtIsyn, pS-MVA
PTFchrS-MGPB pT-Phyto-CrtIchr, pS-MVA MG1655(DE3) DpoxB::MVA bottom
PTFsolS-MGPB pT-Phyto-CrtIsol, pS-MVA
PTFsynS-MGPB pT-Phyto-CrtIsyn, pS-MVA
PTFchrS-MGTB pT-Phyto-CrtIchr, pS-MVA MG1655(DE3) DatoDA::MVA bottom
PTFsolS-MGTB pT-Phyto-CrtIsol, pS-MVA
PTFsynS-MGTB pT-Phyto-CrtIsyn, pS-MVA
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, MVA 하부 경로가 강화된 대장균을 기본 균주로 사용할 경우 야생형의 E. coli MG1655를 사용한 경우보다 높은 파이토플루엔 생산성을 보였고, 서열번호 38의 crtI_syn의 파이토엔 불포화효소가 도입된 재조합 대장균의 경우 사용한 모든 기본 균주에서 90mg/g DCW 수준의 파이토플루엔 생산성을 보였다. 이들 중 가장 높은 파이토플루엔 생산성을 보인 균주는 PTFsynS-MGLB로 E. coli MG1655 염색체 내 ldhA(락테이트 디하이드로게나아제, lactate dehydrogenase) 위치에 MVA 하부 경로에 해당하는 유전자(mvaK1, mvaK2, mvaD)가 오페론 형태로 삽입된 MG1655(DE3) DldhA::MVA bottom 기본 균주에 2개의 파이토플루엔 생산용 플라즈미드 pT-Phyto-CrtIsyn와 pS-MVA가 동시에 도입된 균주이며, 48시간 배양에서 97.6mg/g DCW (1,122mg/L) 수준의 파이토플루엔 생산성을 확인하였다.
한편, Antonio A. Iniesta 등은 마이소코커스 잔투스 유래 파이토엔 불포화효소를 사용한 재조합 대장균에서 대략 0.13mg/g DCW 수준의 파이토플루엔 생산을 보고하고 있으나 (Antonio A. Iniesta et. al., FEBS J., 274:4306-4314, 2007), 본 발명에서 상기 문헌에서와 동일한 파이토엔 불포화효소인 crtI_myx를 함유한 pT-Phyto-CrtImyx를 사용한 경우 생성된 파이토플루엔의 농도가 매우 낮아 HPLC 분석 조건에서 검출되지 않았다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의항 정의된다고 할 것이다.
<110> GenoFocus Industry-Academic Cooperation Foundation Gyeongsang National University <120> Recombinant Microorganism Having Enhanced Phytofluene Producing Ability and Method for Preparing Phytofluene Using the Same <130> P19-B158 <160> 60 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 302 <212> PRT <213> crtE protein Synechocystis sp. <400> 1 Met Val Ala Gln Gln Thr Arg Thr Asp Phe Asp Leu Ala Gln Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Val Lys Lys Gly Val Val Glu Ala Ala Leu Asp Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Ile Ala Arg Pro Glu Lys Ile Tyr Glu Ala Met Arg Tyr Ser Leu Leu 35 40 45 Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Ile Leu Cys Ile Thr Ala Cys Glu 50 55 60 Leu Cys Gly Gly Asp Glu Ala Leu Ala Leu Pro Thr Ala Cys Ala Leu 65 70 75 80 Glu Met Ile His Thr Met Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser Met 85 90 95 Asp Asn Asp Asp Phe Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Tyr 100 105 110 Gly Glu Asp Ile Ala Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu Ala Tyr Ala 115 120 125 Phe Glu Tyr Val Val Thr His Thr Pro Gln Ala Asp Pro Gln Ala Leu 130 135 140 Leu Gln Val Ile Ala Arg Leu Gly Arg Thr Val Gly Ala Ala Gly Leu 145 150 155 160 Val Gly Gly Gln Val Leu Asp Leu Glu Ser Glu Gly Arg Thr Asp Ile 165 170 175 Thr Pro Glu Thr Leu Thr Phe Ile His Thr His Lys Thr Gly Ala Leu 180 185 190 Leu Glu Ala Ser Val Leu Thr Gly Ala Ile Leu Ala Gly Ala Thr Gly 195 200 205 Glu Gln Gln Gln Arg Leu Ala Arg Tyr Ala Gln Asn Ile Gly Leu Ala 210 215 220 Phe Gln Val Val Asp Asp Ile Leu Asp Ile Thr Ala Thr Gln Glu Glu 225 230 235 240 Leu Gly Lys Thr Ala Gly Lys Asp Val Lys Ala Gln Lys Ala Thr Tyr 245 250 255 Pro Ser Leu Leu Gly Leu Glu Ala Ser Arg Ala Gln Ala Gln Ser Leu 260 265 270 Ile Asp Gln Ala Ile Val Ala Leu Glu Pro Phe Gly Pro Ser Ala Glu 275 280 285 Pro Leu Gln Ala Ile Ala Glu Tyr Ile Val Ala Arg Lys Tyr 290 295 300 <210> 2 <211> 906 <212> DNA <213> crtE DNA Synechocystis sp. <400> 2 atggtggcgc agcaaacccg taccgacttc gatctggcgc aatacctgca agttaagaaa 60 ggtgtggttg aagcggcgct ggacagcagc ctggcgatcg cgcgtccgga gaaaatttac 120 gaagcgatgc gttatagcct gctggcgggt ggcaagcgtc tgcgtccgat cctgtgcatt 180 accgcgtgcg agctgtgcgg tggcgacgaa gcgctggcgc tgccgaccgc gtgcgcgctg 240 gaaatgatcc acaccatgag cctgattcac gacgatctgc cgagcatgga taacgacgat 300 ttccgtcgtg gtaaaccgac caaccacaag gtgtatggcg aggacatcgc gattctggcg 360 ggtgatggcc tgctggcgta tgcgtttgaa tatgtggtta cccatacccc gcaagcggac 420 ccgcaggcgc tgctgcaagt gattgcgcgt ctgggtcgta ccgttggtgc ggcgggcctg 480 gtgggtggcc aggttctgga cctggagagc gaaggccgta ccgatatcac cccggaaacc 540 ctgaccttca ttcacaccca caaaaccggt gcgctgctgg aggcgagcgt gctgaccggt 600 gcgatcctgg cgggtgcgac cggtgaacag caacagcgtc tggcgcgtta cgcgcagaac 660 attggtctgg cgtttcaagt ggttgacgat atcctggaca ttaccgcgac ccaggaagag 720 ctgggcaaga ccgcgggcaa ggatgttaaa gcgcaaaagg cgacctatcc gagcctgctg 780 ggtctggagg cgagccgtgc gcaagcgcag agcctgatcg accaggcgat tgttgcgctg 840 gagccgtttg gtccgagcgc ggaaccgctg caagcgatcg cggagtacat tgttgcgcgt 900 aaatat 906 <210> 3 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtE F primer <400> 3 atggaattca 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Arg Asp Glu Arg Val Leu Asp Arg 145 150 155 160 Ala Cys Asp Leu Gly Leu Ala Phe Gln Leu Thr Asn Ile Ala Arg Asp 165 170 175 Ile Ile Asp Asp Ala Ala Ile Asp Arg Cys Tyr Leu Pro Ala Glu Trp 180 185 190 Leu Gln Asp Ala Gly Leu Thr Pro Glu Asn Tyr Ala Ala Arg Glu Asn 195 200 205 Arg Ala Ala Leu Ala Arg Val Ala Glu Arg Leu Ile Asp Ala Ala Glu 210 215 220 Pro Tyr Tyr Ile Ser Ser Gln Ala Gly Leu His Asp Leu Pro Pro Arg 225 230 235 240 Cys Ala Trp Ala Ile Ala Thr Ala Arg Ser Val Tyr Arg Glu Ile Gly 245 250 255 Ile Lys Val Lys Ala Ala Gly Gly Ser Ala Trp Asp Arg Arg Gln His 260 265 270 Thr Ser Lys Gly Glu Lys Ile Ala Met Leu Met Ala Ala Pro Gly Gln 275 280 285 Val Ile Arg Ala Lys Thr Thr Arg Val Thr Pro Arg Pro Ala Gly Leu 290 295 300 Trp Gln Arg Pro Val 305 <210> 6 <211> 927 <212> DNA <213> crtB DNA Pantoea agglomerans <400> 6 atgagccagc cgccgctgct ggaccatgcg acccaaacca tggcgaacgg tagcaagagc 60 ttcgcgaccg cggcgaaact gtttgatccg gcgacccgtc gtagcgtgct gatgctgtac 120 acctggtgcc gtcactgcga cgatgttatc gacgatcaga cccatggttt tgcgagcgag 180 gcggcggcgg aggaagaggc gacccaacgt ctggcgcgtc tgcgtaccct gaccctggcg 240 gcgtttgagg gtgcggagat gcaggacccg gcgtttgcgg cgtttcaaga ggtggcgctg 300 acccacggta ttaccccgcg tatggcgctg gaccacctgg atggcttcgc gatggacgtg 360 gcgcagaccc gttatgttac ctttgaagat accctgcgtt actgctatca cgtggcgggt 420 gtggttggcc tgatgatggc gcgtgtgatg ggtgttcgtg acgagcgtgt tctggaccgt 480 gcgtgcgatc tgggcctggc gttccagctg accaacatcg cgcgtgacat cattgacgat 540 gcggcgattg atcgttgcta cctgccggcg gaatggctgc aagatgcggg tctgaccccg 600 gaaaactatg cggcgcgtga gaaccgtgcg gcgctggcgc gtgttgcgga acgtctgatt 660 gatgcggcgg agccgtacta tattagcagc caagcgggtc tgcatgatct gccgccgcgt 720 tgcgcgtggg cgattgcgac cgcgcgtagc gtgtaccgtg aaatcggcat taaggttaag 780 gcggcgggtg gcagcgcgtg ggatcgtcgt cagcacacca gcaagggcga gaaaattgcg 840 atgctgatgg cggcgccggg tcaagtgatt cgtgcgaaga ccacccgtgt taccccgcgt 900 ccggcgggcc tgtggcaacg tccggtt 927 <210> 7 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtB F primer <400> 7 cattgttgcg cgtaaatatt aaactagatt aaggaggtaa aactatgagc cagccgccgc 60 tgctgg 66 <210> 8 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtB R primer <400> 8 ctctgagcaa cgaacgaagc atattttatt acctcctcta gtttaaaccg gacgttgcca 60 cagg 64 <210> 9 <211> 305 <212> PRT <213> ipiHp1 protein Haematococcus lacustris <400> 9 Met Leu Arg Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr His Ile Pro Arg Val Asn 1 5 10 15 Ser Ala Gln Gln Pro Ser Cys Ala His Ala Arg Leu Gln Phe Lys Leu 20 25 30 Arg Ser Met Gln Met Thr Leu Met Gln Pro Ser Ile Ser Ala Asn Leu 35 40 45 Ser Arg Ala Glu Asp Arg Thr Asp His Met Arg Gly Ala Ser Thr Trp 50 55 60 Ala Gly Gly Gln Ser Gln Asp Glu Leu Met Leu Lys Asp Glu Cys Ile 65 70 75 80 Leu Val Asp Val Glu Asp Asn Ile Thr Gly His Ala Ser Lys Leu Glu 85 90 95 Cys His Lys Phe Leu Pro His Gln Pro Ala Gly Leu Leu His Arg Ala 100 105 110 Phe Ser Val Phe Leu Phe Asp Asp Gln Gly Arg Leu Leu Leu Gln Gln 115 120 125 Arg Ala Arg Ser Lys Ile Thr Phe Pro Ser Val Trp Thr Asn Thr Cys 130 135 140 Cys Ser His Pro Leu His Gly Gln Thr Pro Asp Glu Val Asp Gln Leu 145 150 155 160 Ser Gln Val Ala Asp Gly Thr Val Pro Gly Ala Lys Ala Ala Ala Ile 165 170 175 Arg Lys Leu Glu His Glu Leu Gly Ile Pro Ala His Gln Leu Pro Ala 180 185 190 Ser Ala Phe Arg Phe Leu Thr Arg Leu His Tyr Cys Ala Ala Asp Val 195 200 205 Gln Pro Ala Ala Thr Gln Ser Ala Leu Trp Gly Glu His Glu Met Asp 210 215 220 Tyr Ile Leu Phe Ile Arg Ala Asn Val Thr Leu Ala Pro Asn Pro Asp 225 230 235 240 Glu Val Asp Glu Val Arg Tyr Val Thr Gln Glu Glu Leu Arg Gln Met 245 250 255 Met Gln Pro Asp Asn Gly Leu Gln Trp Ser Pro Trp Phe Arg Ile Ile 260 265 270 Ala Ala Arg Phe Leu Glu Arg Trp Trp Ala Asp Leu Asp Ala Ala Leu 275 280 285 Asn Thr Asp Lys His Glu Asp Trp Gly Thr Val His His Ile Asn Glu 290 295 300 Ala 305 <210> 10 <211> 915 <212> DNA <213> ipiHp1 DNA Haematococcus lacustris <400> 10 atgcttcgtt cgttgctcag aggcctcacg catatccccc gcgtgaactc cgcccagcag 60 cccagctgtg cacacgcgcg actccagttt aagctcagga gcatgcagat gacgctcatg 120 cagcccagca tctcagccaa tctgtcgcgc gccgaggacc gcacagacca catgaggggt 180 gcaagcacct gggcaggcgg gcagtcgcag gatgagctga tgctgaagga cgagtgcatc 240 ttggtggatg ttgaggacaa catcacaggc catgccagca agctggagtg tcacaagttc 300 ctaccacatc agcctgcagg cctgctgcac cgggccttct ctgtgttcct gtttgacgat 360 caggggcgac tgctgctgca acagcgtgca cgctcaaaaa tcaccttccc aagtgtgtgg 420 acgaacacct gctgcagcca ccctttacat gggcagaccc cagatgaggt ggaccaacta 480 agccaggtgg ccgacggaac agtacctggc gcaaaggctg ctgccatccg caagttggag 540 cacgagctgg ggataccagc gcaccagctg ccggcaagcg cgtttcgctt cctcacgcgt 600 ttgcactact gtgccgcgga cgtgcagcca gctgcgacac aatcagcgct ctggggcgag 660 cacgaaatgg actacatctt gttcatccgg gccaacgtca ccttggcgcc caaccctgac 720 gaggtggacg aagtcaggta cgtgacgcaa gaggagctgc ggcagatgat gcagccggac 780 aacgggctgc aatggtcgcc gtggtttcgc atcatcgccg cgcgcttcct tgagcgttgg 840 tgggctgacc tggacgcggc cctaaacact gacaaacacg aggattgggg aacggtgcat 900 cacatcaacg aagcg 915 <210> 11 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ipiHp1 F primer <400> 11 cctgtggcaa cgtccggttt aaactagagg aggtaataaa atatgcttcg ttcgttgctc 60 agag 64 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ipiHp1 R primer <400> 12 cgacgcggcc gcttatcacg cttcgttgat gtgatgcac 39 <210> 13 <211> 551 <212> PRT <213> crtI_aux protein Auxenochlorella protothecoides <400> 13 Met Gln Ser Thr Thr Met Ser Ser Ala Gly Val Ser Ala Thr Val Cys 1 5 10 15 Arg Arg Gln Gly Gly Phe Lys Ala Ala Met Arg Gly Gln Ala Val Ala 20 25 30 Gln Gln His His Ala Arg Ala Gly Arg Ser Ser Leu Arg Val Val Ala 35 40 45 Arg Asp Phe Pro Lys Pro Asp Phe Glu Lys Glu Lys Thr Phe Gln Glu 50 55 60 Met Ala Ala Ile Ser Ala Ala Val Lys Ala Ala Pro Arg Pro Lys Glu 65 70 75 80 Pro Leu Thr Val Val Ile Ala Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Gly His Lys Pro Ile Val Leu Glu Ala 100 105 110 Arg Asp Val Leu Gly Gly Lys Val Ala Ala Trp Lys Asp Glu Asp Gly 115 120 125 Asp Trp Tyr Glu Thr Gly Leu His Ile Phe Phe Gly Ala Tyr Pro Asn 130 135 140 Leu Met Asn Leu Phe Lys Glu Leu Asn Ile Glu Asp Arg Leu Gln Trp 145 150 155 160 Lys Gln His Ser Met Ile Phe Ala Val Arg Asp Ser Pro Gly Glu Phe 165 170 175 Ser Arg Phe Asp Phe Pro Asp Leu Pro Ala Pro Leu Asn Gly Ile Val 180 185 190 Ala Ile Leu Arg Asn Asn Gln Met Leu Ser Trp Pro Glu Lys Ile Gln 195 200 205 Phe Ala Leu Gly Leu Leu Pro Ala Ile Val Tyr Gly Gln Pro Tyr Val 210 215 220 Glu Ala Gln Asp Asp Lys Thr Val Thr Glu Trp Met Val Lys Gln Gly 225 230 235 240 Val Pro Ala Arg Val Asn Asp Glu Val Phe Ile Ala Met Ala Lys Ala 245 250 255 Leu Asn Phe Ile Asp Pro Asp Glu Leu Ser Met Ile Cys Val Leu Ile 260 265 270 Ala Leu Asn Arg Phe Leu Gln Glu Arg His Gly Ser Lys Met Ala Phe 275 280 285 Leu Asp Gly Cys Pro Pro Glu Arg Leu Cys Gln Pro Met Val Asp Tyr 290 295 300 Val Thr Ala Arg Gly Gly Glu Val Arg Met Lys Ala Gly Ile Lys Asn 305 310 315 320 Ile Glu Leu Asn Glu Asp Gly Ser Val Lys Gln Tyr Asn Leu Leu Ser 325 330 335 Gly Glu Ser Ile Thr Ala Asp Leu Tyr Val Ser Ala Val Pro Val Asp 340 345 350 Ile Phe Lys Arg Leu Leu Pro Ala Pro Trp Tyr Gln Gln Gln Phe Phe 355 360 365 Ser Lys Leu Asp Lys Leu Val Gly Val Pro Val Ile Asn Ile His Ile 370 375 380 Trp Phe Asp Arg Lys Leu Thr Thr Val Asp His Leu Leu Phe Ser Arg 385 390 395 400 Ser Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Asp Met Ser Thr Thr Cys Arg Glu 405 410 415 Tyr Phe Asp Thr Glu Arg Ser Met Leu Glu Leu Val Phe Ala Pro Ala 420 425 430 Glu Lys Trp Ile Gly Arg Pro Asp Glu Glu Ile Ile Ala Ala Thr Met 435 440 445 Lys Glu Leu Glu Asn Leu Phe Pro Thr Glu Ile Ala Ala Asp Gly Ser 450 455 460 Lys Ala Gln Ile Arg Lys Tyr Lys Val Val Lys Thr Pro Leu Gly Val 465 470 475 480 Tyr Lys Thr Val Pro Glu Cys Glu Pro Cys Arg Pro Thr Gln Arg Thr 485 490 495 Pro Thr Arg Asn Phe Tyr Leu Ala Gly Asp Tyr Thr Lys Gln Arg Tyr 500 505 510 Leu Ala Ser Met Glu Gly Ala Thr Phe Ser Gly Lys Leu Cys Ala Gln 515 520 525 Ala Ile Ala Glu Asp Trp Asn Thr Ser Ala Val Lys Pro Ser Gln Pro 530 535 540 Ala Lys Glu Lys Ala Leu Ala 545 550 <210> 14 <211> 1653 <212> DNA <213> crtI_aux 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Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Phe Cys Gln Glu Lys 275 280 285 Asp Leu Glu His Leu Ser Glu Ile Phe Gly His Arg Tyr Arg Leu Ile 290 295 300 Val Ser Lys Thr Lys Asp Leu Ser Gln Asp Asp Cys Cys 305 310 315 <210> 54 <211> 951 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mvaD DNA <400> 54 atggatagag agcctgtaac agtacgttcc tacgcaaata ttgctattat caaatattgg 60 ggaaagaaaa aagaaaaaga gatggtgcct gctactagca gtatttctct aactttggaa 120 aatatgtata cagagacgac cttgtcgcct ttaccagcca atgtaacagc tgacgaattt 180 tacatcaatg gtcagctaca aaatgaggtc gagcatgcca agatgagtaa gattattgac 240 cgttatcgtc cagctggtga gggctttgtc cgtatcgata ctcaaaacaa tatgcctacg 300 gcagcgggtc tgtcctcaag ttctagtggt ttgtccgccc tggtcaaggc ttgtaatgct 360 tatttcaagc ttggattgga tagaagtcag ttggcacagg aagccaaatt tgcctcaggt 420 tcttcttctc ggagttttta tggaccacta ggagcctggg ataaggatag tggagaaatt 480 taccctgtag agacagactt gaaactagct atgattatgt tggtgctaga ggacaagaaa 540 aaaccaatct ctagccgtga cgggatgaaa ctttgtgtgg 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Leu His 20 25 30 Leu Ala Phe Ser Ser Trp Leu Phe Asn Ala Lys Gly Gln Leu Leu Val 35 40 45 Thr Arg Arg Ala Leu Ser Lys Lys Ala Trp Pro Gly Val Trp Thr Asn 50 55 60 Ser Val Cys Gly His Pro Gln Leu Gly Glu Ser Asn Glu Asp Ala Val 65 70 75 80 Ile Arg Arg Cys Arg Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ile Thr Pro Pro Glu 85 90 95 Ser Ile Tyr Pro Asp Phe Arg Tyr Arg Ala Thr Asp Pro Ser Gly Ile 100 105 110 Val Glu Asn Glu Val Cys Pro Val Phe Ala Ala Arg Thr Thr Ser Ala 115 120 125 Leu Gln Ile Asn Asp Asp Glu Val Met Asp Tyr Gln Trp Cys Asp Leu 130 135 140 Ala Asp Val Leu His Gly Ile Asp Ala Thr Pro Trp Ala Phe Ser Pro 145 150 155 160 Trp Met Val Met Gln Ala Thr Asn Arg Glu Ala Arg Lys Arg Leu Ser 165 170 175 Ala Phe Thr Gln Leu Lys 180 <210> 58 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> idi DNA <400> 58 atgcaaacgg aacacgtcat tttattgaat gcacagggag ttcccacggg tacgctggaa 60 aagtatgccg cacacacggc agacacccgc ttacatctcg cgttctccag ttggctgttt 120 aatgccaaag gacaattatt agttacccgc cgcgcactga gcaaaaaagc atggcctggc 180 gtgtggacta actcggtttg tgggcaccca caactgggag aaagcaacga agacgcagtg 240 atccgccgtt gccgttatga gcttggcgtg gaaattacgc ctcctgaatc tatctatcct 300 gactttcgct accgcgccac cgatccgagt ggcattgtgg aaaatgaagt gtgtccggta 360 tttgccgcac gcaccactag tgcgttacag atcaatgatg atgaagtgat ggattatcaa 420 tggtgtgatt tagcagatgt attacacggt attgatgcca cgccgtgggc gttcagtccg 480 tggatggtga tgcaggcgac aaatcgcgaa gccagaaaac gattatctgc atttacccag 540 cttaaa 546 <210> 59 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> idi primer F <400> 59 gtctcgtaat agtttaagga ggtttgttat gcaaacggaa cacgtcattt ta 52 <210> 60 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> idi primer R <400> 60 ccttatacct gtttatcaaa tctagattat ttaagctggg taaatgcaga ta 52

Claims (10)

  1. 파르네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP) 생합성 경로를 내재적으로 가지고 있는 미생물에서,
    (i) 파르네실 피로포스페이트(FPP)를 제라닐제라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자;
    (ii) 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 파이토엔(phytoene)으로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자; 및
    (iii) 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 파이토플루엔 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소는 서열번호 21, 서열번호 33 및 서열번호 37 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 파르네실 피로포스페이트(FPP)를 제라닐제라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자는 crtE인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP)를 파이토엔(phytoene)으로 중합하는 효소를 코딩하는 유전자는 crtB인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 메발로네이트(mevalonate, MVA) 합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 메발로네이트(mevalonate, MVA) 합성 경로에 관여하는 효소는 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소(hydroxymethylglutaryl-CoA reductase), 하이드록시메틸글루타릴-CoA 씬테이즈(hydroxymethylglutaryl-CoA synthase), 메발로네이트 카이네이즈(mevalonate kinase), 포스포메발로네이트 카이네이즈(phosphomevalonate kinase) 및 디포스포메발로네이트 디카르복실레이즈(diphosphomevalonate decarboxylase)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제1항에 있어서, IPP(isopentenyl pyrophosphate)와 DMAPP(dimethylallyl pyrophosphate)간의 상호 전환을 촉매하는 효소인 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머레이즈(isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase) 효소를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머레이즈(isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase) 효소를 코딩하는 유전자는 ipiHp1 또는 idi인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 다음 단계를 포함하는 파이토플루엔의 제조방법:
    (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 파이토플루엔을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 파이토플루엔을 수득하는 단계.
  10. 다음 단계를 포함하는 파이토플루엔의 제조방법:
    (a) 서열번호 21, 서열번호 33 및 서열번호 37 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 효소를 이용하여, 파이토엔을 파이토플루엔으로 전환하는 단계; 및
    (b) 상기 파이토플루엔을 수득하는 단계.
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