CN102190715A

CN102190715A - 一种植物砷抗性相关的蛋白及编码基因及其应用

Info

Publication number: CN102190715A
Application number: CN2010101163972A
Authority: CN
Inventors: 何振艳; 麻密; 徐文忠; 陈宏林
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2030-03-02
Also published as: CN102190715B

Abstract

本发明公开了一种植物砷抗性相关的蛋白及编码基因及其应用。该蛋白来源于蜈蚣草(Pteris vittata L.)，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗砷性相关的由1)衍生的蛋白质。实验证明：PvABCT1与PvLTP1在酵母体内，洋葱体内均是相互作用的，并且通过砷抗性检测发现将PvLTP1基因转入酵母菌株中，酵母菌株的砷抗性增强了，该结果表明PvLTP1基因与蜈蚣草砷抗性相关。

Description

一种植物砷抗性相关的蛋白及编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物砷抗性相关的蛋白及编码基因及其应用。

背景技术

脂质转移蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)广泛分布于植物、动物和微生物中，是植物生命活动中一类重要的活性蛋白质，占细胞可溶性蛋白的4％。在高等植物中，LTPs具有低分子量、高的位置保守性的特点。典型的LTPs是由4个二硫键连接而成的α螺旋形成的肽链折叠结构，内部的疏水穴贯穿于整个分子，疏水穴的存在有利于它结合疏水配体(如酰基链、磷脂)，并为配体的结合与释放提供信息。LTPs的等电点接近9，具有8个保守的半胱氨酸(Cys)位点，在N端具有典型的信号肽结构。植物LTPs一级结构在不同物种间的同源性相差较大，氨基酸序列同源性在30％-70％之间。尽管存在这种多态性，但它们都具有LTPs的结构特点和特性。

LTPs是在高等植物中广泛存在的一类小分子碱性蛋白。最初人们认为LTPs的主要功能是在膜的合成过程中参与胞内脂质流的传递，具有结合并转运脂质的特性，然而N端信号肽的发现和胞外定位的研究证实了它们并非脂质流的传递所必需，已有研究表明：LTPs在植物抵抗和适应胁迫环境中有着重要的作用，如水胁迫、重金属处理、寒冷、干旱或病原物侵染和盐胁迫等都会诱导LTPs基因的表达。这些研究结果充分表明了LTPs有对生物和非生物胁迫的防御功能。目前已从多种植物中分离到LTPs基因。随着研究的深入，其不同水平的转录本在不同植物的不同发育阶段和生理条件下的不同组织中被发现，但LTPs体内确切的生理、生化功能和作用机制尚不明确。

蜈蚣草(Pteris vittata L.)是一种超富集砷的蕨类植物。我们曾利用抑制消减杂交技术，分离到了一个与砷吸收相关的基因PvABCT1(已经申请国家发明专利)。发明人的实验结果表明，所获得的PvABCT1蛋白具有结合和水解ATP的活性，但其在酵母中作用依赖于砷不同价态相应转运蛋白的存在。那么，在蜈蚣草中又是哪些(个)蛋白在砷的转运、积累和解毒中与PvABCT1转运蛋白协同作用呢？目前并没有相关研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物砷抗性相关的蛋白，命名为PvLTP1，来源于蜈蚣草(Pteris vittata L.)。

本发明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗砷性相关的由1)衍生的蛋白质。

序列2由132个氨基酸组成，分子量为13028kD，等电点为8.47。

为了使1)中的PvLTP1便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的PvLTP1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的PvLTP1的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第9-404位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与植物抗砷性相关的蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

与植物抗砷性相关的蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第9-404位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

序列表中的序列1由551个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第9-404位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的PvLTP1蛋白。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增上述PvLTP1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与植物抗砷性相关蛋白的编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

上述重组载体具体可以是在pFL61的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种培育转基因酵母的方法。

本发明提供的方法是将上述的编码基因转入目的酵母菌株中，得到砷抗性强于所述目的酵母菌株的转基因酵母。

上述编码基因具体可以是通过所述的重组表达载体导入所述目的酵母菌株中的。

上述目的酵母菌株是啤酒酵母菌株或啤酒酵母菌株的突变体。

上述啤酒酵母菌株是BY4742，在Thermo Fisher Scientific公司的货号是YSC1049；啤酒酵母菌株的突变体是pho84Δ、fps1Δ、acr3Δ或ycf1Δ；所述pho84Δ、fps1Δ、acr3Δ或ycf1Δ在Thermo Fisher Scientific公司的货号分别为YSC1021-549348、YSC1021-546458、YSC1021-548603和YSC1021-547307。

实验证明：PvABCT1与PvLTP1在酵母体内，洋葱体内均是相互作用的，并且通过砷抗性检测发现将PvLTP1基因转入酵母菌株中，酵母菌株的砷抗性增强了，该结果表明PvLTP1基因与蜈蚣草砷抗性相关。

PvLTP1基因及其所编码的蛋白功能的解析不仅对深入了解蜈蚣草砷超富集的分子机制具有重要的理论意义，而且可以为利用基因工程技术培育用于砷污染环境修复的新型工程植物和通过分子设计培育低积累砷的农作物提供分子元件，因此同时具有应用价值。

附图说明

图1为小扁豆、苹果与蜈蚣草LTP1氨基酸序列比较。右边的数字表示每个氨基酸位置，黑色阴影部分表示相同的氨基酸残基，小扁豆、苹果相应的氨基酸多肽的序列的GenBank号分别是A0AT31和AAT80665。

图2为PvLTP1基因保守结构域分析。

图3为携带pGBKT7-PvABCT1和pGADT7-PvLTP1的克隆(图上和图下)与携带pGBKT7-PvABCT1和空对照质粒pGADT7的克隆(图左和图右)在SD/-His/-Ade/-Leu/-Trp平板上生长状况。

图4为携带pGBKT7-PvABCT1和17质粒的克隆(右图)与携带pGBKT7-PvABCT1和空对照质粒pGADT7的克隆(左图)的α-半乳糖苷酶活性分析。

图5为利用酵母突变体对PvLTP1基因的功能分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、基因的发现

一、文库构建与筛选

1、蜈蚣草RNA的提取

RNA样品的质量会直接影响所构建的文库质量以及最终的筛选结果，因此RNA提取过程要求严格规范。蜈蚣草富含多酚多糖，普通的RNA提取方法(如盐酸胍法，TRIZOL法等)很难获得高质量的RNA。为了获得高质量蜈蚣草RNA，将从温室收集的孢子，在砷酸钠2mM的培养基上培养45d，将形成的原叶体在砷酸钠2mM的培养基上继代一次，继代培养35d。挑取生长良好的原叶体提取RNA，将提取的RNA进行普通快速电泳，同时对样品的OD_260/280以及浓度进行测定，结果显示提取的RNA样品的纯度以及浓度均达到要求，可以继续后续的实验，样品的OD_260/280＝1.85，浓度为1.5ug/ul。

2、文库构建与筛选

阳性克隆的筛选：实验所用的酵母菌株AH109共携带有四个报告基因，即ADE2、HIS3、MEL1和lacZ，因此筛选结果最终确定的阳性克隆应该可以同时激活三个报告基因的表达。文库的筛选过程首先是在三缺(SD/-His/-Leu/-Trp)培养基平板上进行低严谨筛选，这一步筛选所得到的克隆数理论上认为是由于蛋白之间的相互作用而可以激活一个报告基因，即HIS3的表达，可以激活HIS3报告基因的表达的阳性克隆在三缺板上生长情况，经过第一轮筛选得到的阳性克隆数为280个。之后，将三缺板上筛选得到的280个阳性克隆进一步在SD/-His/-Ade/-Leu/-Trp四缺板上进行划线培养，进一步筛选可以同时激活两个两个报告基因的阳性克隆，培养3-4天后发现第一轮筛选所得到部分阳性克隆不能生长，这些克隆即被视为假阳性而予以放弃，这样经过第二轮筛选后保留的阳性克隆数为249个。将这249个克隆进行α-半乳糖苷酶分析，即验证这些克隆是否可以激活报告MEL1基因，结果保留下来的阳性克隆数为210个，即这210个克隆可以同时激活三个报告基因的表达，初步确定为最终筛选到的阳性克隆。

对随机挑选的阳性克隆中文库质粒插入片段进行了PCR扩增：从可以同时激活三个报告基因的酵母阳性克隆中随机挑选50个克隆，从酵母中抽提质粒并将提取的混合质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后的菌液涂布LB+Amp平板，以筛选文库AD质粒。以文库质粒为模板用MATCHMAKER引物对插入片段进行扩增。

二、基因的分析

1、PvLTP1基因的蛋白序列分析和结构分析

对其中的17阳性克隆进行序列分析，结果表明阳性克隆中有一片段，该片段为一全长cDNA，该cDNA的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列1有551bp的碱基，其中开读框架是自5′末端第9-404位，共396bp，编码序列2所示的蛋白，序列2由132个氨基酸组成，分子量为13028kD，等电点为8.47。

序列1的基因所编码的蛋白中含有脂质转移蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)的特性结构域，因此命名为PvLTP1，其编码的蛋白命名为PvLTP1。

2、PvLTP1基因的同源性分析：PvLTP1氨基酸序列在数据库中与各种原核和真核生物的脂质转移蛋白有一定的同源性。图1为蜈蚣草PvLTP1氨基酸序列与小扁豆和苹果LTP1氨基酸序列比较，其同源性达40％以上。

3、PvLTP1基因的保守结构域和二级结构分析：在分析同源性的同时，我们在NCBI上同时对PvLTP1基因进行了保守结构域分析，结果如图2所示。从图中可以看出，该基因所编码的蛋白中含有脂质转移蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)的特性结构域。二级结构分析结果也验证了其特性结构域。

实施例2、基因的克隆与功能分析

一、基因的制备

人工合成以下一对引物：

上游引物：gacccgggatgatgatgagggcgcg(下划线为XmaI位点)

下游引物：cgggatccaggaatcgaggcacag(下划线为Bam HI位点)

以蜈蚣草(公众可购自亳州市保华药业有限公司)的cDNA(将提取的RNA反转录得到)为模板，用上述一对引物进行PCR扩增，结果得到412bp的扩增产物(带有酶切位点)。

二、基因的功能分析

1、重组酵母表达载体的构建

将上述步骤一的扩增产物用XmaI和Bam HI酶切后，与经同样酶切过的酵母超表达载体pFL61(可购自ATCC公司，ATCC Number：77215^TM)连接，构建成重组表达载体pFL61-PvLTP1，经测序验证，pFL61-PvLTP1是在pFL61的XmaI和Bam HI酶切位点间插入序列表中序列1的自5’端第9-404位所示的基因。

2、转基因酵母的构建以及砷抗性检测

1)转基因酵母的构建

利用酵母高效转化法(参考Clontech说明书PT3204酵母手册中酵母转化部分)把载体pFL61-PvLTP1分别转入WT、pho84Δ、fps1Δ、acr3Δ和ycf1Δ五个酵母菌株，构成重组菌株WT+pFL61-PvLTP1、pho84Δ+pFL61-PvLTP1、fps1Δ+pFL61-PvLTP1、acr3Δ+pFL61-PvLTP1和ycf1Δ+pFL61-PvLTP1。其中五个酵母菌株均购买于ThermoFisher Scientific公司，其商品号分别为BY4742、YSC1021-549348、YSC1021-546458、YSC1021-548603和YSC1021-547307。

以空载体pFL61转入WT、pho84Δ、fps 1Δ、acr3Δ和ycf1Δ五个酵母菌株，构成对照的重组菌株WT+pFL61、pho84Δ+pFL61、fps1Δ+pFL61、acr3Δ+pFL61和ycf1Δ+pFL61。

2)RT-PCR鉴定和砷抗性检测

转化的酵母菌株涂到缺相应氨基酸的SD培养基上(见表2)，30℃培养72小时。挑取阳性克隆。对阳性克隆进行菌落PCR鉴定。引物序列如下：

F：5’ATGATGATGAGGGCGCGGA3’

R：5’GGAGTAAGCTCAVTGCTGGT3’

用RT-PCR鉴定成功的菌落进行砷抗性检测。挑取转化的酵母单菌落于30℃培养酵母24-48hr；调节酵母的浓度至OD值1.0，然后分别稀释10倍、100倍、1000倍后，各取1μl于含有不同浓度NaAsO₂的SD固体培养基上。30℃培养72hr；观察结果。结果见图5，无论对于WT还是突变体菌株，转基因酵母对砷的抗性均明显增加，该结果表明PvLTP1基因与蜈蚣草砷抗性相关。

三、机理分析

1、酵母体内PvABCT1与PvLTP1相互作用的验证(所有试剂和质粒均购自TaKaRa公司Clontech产品；实验方法均参考该试剂盒说明书)

1)两个重组质粒的构建

诱饵质粒载体pGBKT7-PvABCT1的构建：制备出序列表中序列3所示的核苷酸，在其两端分别加上BamHI及EcoRI酶切位点，然后插入pGBKT7诱饵质粒载体(购自TaKaRa公司Clontech产品)的BamHI及EcoRI酶切位点之间。从得到的大肠杆菌阳性克隆中提取质粒DNA，对其中的插入片段PvABCT1经PCR、EcoRI和BamHI的双酶切鉴定。且测序结果表明构建的诱饵载体pGBKT7-PvABCT1序列完全正确。

2)转化酵母及其检测

制备酵母AH109菌株的感受态细胞，将pGADT7-PvLTP1(也即实施例1中的17号质粒)转化后的酵母克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析，结果表明pGADT7-PvLTP1不具有对报告基因的自激活特性。

将pGBKT7-PvABCT1转化酵母AH109菌株，然后用经转化后携带质粒pGBKT7-PvABCT1的酵母制备感受态，再分别将pGADT7-PvLTP1以及不含PvLTP1只表达GAL4AD的空对照质粒pGADT7转入感受态细胞，将二者转化后的菌液涂布SD/-Leu/-Trp平板，并将两个SD/-Leu/-Trp平板上的克隆分别在SD/-His/-Ade/-Leu/-Trp平板上划线培养，结果表明在SD/-Leu/-Trp平板上生长良好的携带pGBKT7-PvABCT1和pGADT7-PvLTP1的克隆在SD/-His/-Ade/-Leu/-Trp平板上仍然可以正常生长，而在SD/-Leu/-Trp平板上生长良好的携带pGBKTT-PvABCT1和空对照质粒pGADT7的克隆在SD/-His/-Ade/-Leu/-Trp平板上不能生长(图3)。

进一步的α-半乳糖苷酶活性分析结果表明，携带pGBKT7-PvABCT1和pGADT7-PvLTP1的克隆可以激活MEL1报告基因的表达，菌线为蓝色，而携带pGBKT7-PvABCT1和空对照质粒pGADT7的克隆不能激活MEL1报告基因的表达，菌线无颜色变化(图4)。说明携带pGBKT7-PvABCT1和pGADT7-PvLTP1的克隆对三个报告基因HIS3，ADE2，MEL1的激活是由于PvABCT1与PvLTP1相互作用的结果。

2、植物体内PvABCT1与PvLTP1相互作用的验证

利用双分子荧光互补技术(BiFC)检测了PvABCT1与PvLTP1在植物体内的相互作用。本步骤利用基因枪转化法，将PvABCT1(序列3编码的蛋白)的C端与YFP的N端融合，PvLTP1(序列2所示的蛋白)的C端与YFP的C端融合，然后将二者共转化入洋葱表皮，培养24小时后用激光共聚焦荧光显微镜进行检测。结果表明35S::nYFP-PvABCT1与35S::cYFP-PvLTP1共转化的洋葱表皮具有很强的荧光信号，而在同样的检测条件下对照没有检测到任何信号，表明PvABCT1与PvLTP1在植物体内也存在着相互作用。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

<120>一种植物砷抗性相关的蛋白及编码基因及其应用

<160>3

<210>1

<211>551

<212>DNA

<213>蜈蚣草(Pteris vittata L.)

<400>1

ggggcaggat gatgatgagg gcgcggagat catccagctc ttcgtccagt gctgcggtgg 60

cgatggtggt ggtggcgctg gtggcggcgg cgtggctggt ggcggaggga gaggcggcga 120

tatcgtgcca gacggtgggc ggcaatctgt cgggttgcgt gtcgtacgtg acgagtgcaa 180

cgcaaacgag tccgtcagca acctgctgca gcggggtgac agggctgtac aaggccaccc 240

gcgggtccaa gcccgaccgc atcaccgcct gcggctgcat caagagcctg gccgctgccc 300

tcggcagcaa actgcaagcc tccaaaatcg cctcccttcc cggcaagtgt ggcgtcaatc 360

tgggctactc catcagcacc tccaccaact gtgcctcgat tccttgaaaa tgcagatatc 420

gggcctttct ccaaccaagg caacgcacca gtacacgctt attaacactg cagtactccc 480

tgctaattat tatatcaccg caccatgatc atgaagctca ccagcagtga gcttactcca 540

taaaaatccg t 551

<210>2

<211>132

<212>PRT

<213>蜈蚣草(Pteris vittata L.)

<400>2

Met Met Met Arg Ala Arg Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala

1 5 10 15

Val Ala Met Val Val Val Ala Leu Val Ala Ala Ala Trp Leu Val Ala

20 25 30

Glu Gly Glu Ala Ala Ile Ser Cys Gln Thr Val Gly Gly Asn Leu Ser

35 40 45

Gly Cys Val Ser Tyr Val Thr Ser Ala Thr Gln Thr Ser Pro Ser Ala

50 55 60

Thr Cys Cys Ser Gly Val Thr Gly Leu Tyr Lys Ala Thr Arg Gly Ser

65 70 75 80

Lys Pro Asp Arg Ile Thr Ala Cys Gly Cys Ile Lys Ser Leu Ala Ala

85 90 95

Ala Leu Gly Ser Lys Leu Gln Ala Ser Lys Ile Ala Ser Leu Pro Gly

100 105 110

Lys Cys Gly Val Asn Leu Gly Tyr Ser Ile Ser Thr Ser Thr Asn Cys

115 120 125

Ala Ser Ile Pro

130

<210>3

<211>2165

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gctttttagt tttccccaac cctcaacgtt gtcgcggagg gaaaggccac cagttttgtt 60

caatttcgca aatcctgttc ttcctttgcg ctgtcgtctc agttgccgcc cttctacttg 120

caggaagaag ctcacgtaga agaaaatatt tagtgcagaa atatggcgtc agatgcaagc 180

aagaagaagg cagctcaaaa gaaggcagct gctgcagcta agcgcggttc caaagccact 240

gctactaatg caacctcgtc taaaactaat ggggtttcca attcatcccc aaatgaagtt 300

gcagatgaga tggcctatat gcagataact gataggacat gtacaggaat ccttgcttcc 360

catccacaat caagagatat tcatatcgaa agtctaacgg tgacatttca tggccatgat 420

ctcattgtag attcgagcct cgaactcaac tatagaaggc gttatggatt gcttgggctg 480

aatggttgtg gaaagtcgac tctcctgtca gccataggtt gccgtgagct acccattcca 540

gagcatatgg atatttacca tttaactcgg gaaattgaag caactgactt gacctctctg 600

caagccgttg taaacgtaga tgaagaaagg atcaagctag aaaaagaggc tgaaatgcta 660

gctgctcagg atgatggtgg tggtgaggtt ctagaaagat tatatgagcg tttggaggct 720

atggatgcag ctacagcaga gaagagggca gctgaaattt tgtatggtct gggtttcaac 780

aaaagcatgc aacagaagaa gacccgggat ttttcaggcg gctggagaat gaggattgca 840

ttagccagag cattgttcat gaacccaact attttactgc ttgatgaacc aacgaaccat 900

cttgatctcg aagcctgtgt gtggcttgag gaaacattga agaagtttga ccgcattctt 960

gtcgttgtat cacactctca ggattttctt aatggcatct gcacaaacat tatacatatg 1020

caaagtaaga agctgaagtt ctacacagga aattacgacc aatatgtcca aacccgtgaa 1080

gagctggaag aaaatcagat gaagcagtat aagtgggaac aagagcagat agcaaacatg 1140

aaagagtaca ttgccaggtt tgggcatggc tctgctaaac tagccaggca ggcacagagc 1200

aaggagaaga cattggcaaa gatggaaaga gggggtctca cagagagggt ggttaaggac 1260

aaggtgcttg ttttccgatt tactgacgtt ggcaagttac ccccaccagt tctacaattt 1320

gtggaggtgg actttggtta cactccagaa catatgatat acaagaaaat tgactttgga 1380

gttgacctgg attcgaggat agctttggtt ggtcccaatg gagcaggtaa gagcactctt 1440

ttgaagctta tgacgggcga attgtctccc attgatggca tggtgcggcg ccacaaccat 1500

ttacggattg cgcagtttca ccagcatttg gcagataagc tgaatcttga tatgcctgcc 1560

ctacagtaca tgatgtcgga atatcctggc ttagaagaag aaaagatgcg ggcagcgatt 1620

ggaaggtttg ggctgactgg aaaggctcaa atcatgccca tgagaaatct atccgacggt 1680

cagaggagtc gtgttatttt tgcttggtta gcttggcggt tacctcatat gctcctgctt 1740

gatgaaccta cgaatcatct tgatattgag acaatagatg ctttggctga tgcattaaat 1800

gaatgggatg gagggcttgt gcttgtgggt catgatttta ggcttatcaa ccaggtggcc 1860

aaggagatct gggtttgtga gaaccaaaca gtgtcaaggt gggaaggtga cattatggac 1920

ttcaaacagc acctaaaagc aaaagcaggc ctttgagatg gtgttgctta gaagattgaa 1980

cttgagaggc catagccata tctactttta ataaagtagt aaagattttg cttttgatat 2040

gaattattct caagatacga gaatgcctac ttggaagctc gtaatgaagc tttttatatt 2100

gcttcatcat ttctgatcaa tatttataac actttcttct tgtagaaaaa aaaaaaaaaa 2160

aaaaa 2165

Claims

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在载体pFL61的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任一片段的引物对。

7.一种培育转基因酵母的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的酵母菌株中，得到砷抗性强于所述目的酵母菌株的转基因酵母。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入所述目的酵母菌株中的。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述目的酵母菌株是啤酒酵母菌株或啤酒酵母菌株的突变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述啤酒酵母菌株是BY4742，在Thermo Fisher Scientific公司的货号是YSC1049；啤酒酵母菌株的突变体是pho84Δ、fps1Δ、acr3Δ或ycf1Δ；所述pho84Δ、fps1Δ、acr3Δ或ycf1Δ在Thermo FisherScientific公司的货号分别为YSC1021-549348、YSC1021-546458、YSC1021-548603和YSC1021-547307。