CN100360559C

CN100360559C - 一种蜈蚣草abc转运蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN100360559C
Application number: CNB2004100808575A
Authority: CN
Inventors: 麻密; 何振艳; 徐文忠; 杨学习
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2004-10-12
Filing date: 2004-10-12
Publication date: 2008-01-09
Anticipated expiration: 2024-10-12
Also published as: CN1760204A

Abstract

本发明公开了一种蜈蚣草ABC转运蛋白及其编码基因与应用。本发明的蜈蚣草ABC转运蛋白，其氨基酸残基序列如序列表中的序列2所示。其编码基因是下述核苷酸序列之一：1)序列表中序列1的多核苷酸序列；2)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的蜈蚣草ABC转运蛋白基因在砷的吸收和积累中起重要作用，将在修复砷污染环境的生物技术中起到重要作用。

Description

一种蜈蚣草ABC转运蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种蜈蚣草ABC转运蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种蜈蚣草ABC转运蛋白及其编码基因，与该基因在治理砷污染中的应用。

背景技术

土壤是人类赖以生存的自然资源，但是，由于生活污水排放、污水灌溉、大气沉降、采矿冶炼、农药化肥大量施用等原因，加上土壤对于污染物的累积富集作用，土壤污染，尤其是重金属污染状况日趋严重。

传统的土壤污染治理方法主要有：基于机械物理或物理化学原理的工程措施，包括客土换土法、隔离法、清洗法、热处理法、电化学法等；基于污染物土壤地球化学行为的改良措施，如添加改良剂、抑制剂降低土壤污染物的水溶性、扩散性和生物有效性，以减轻污染物对生态环境的危害。土壤污染治理的工程学方法往往需要将污染土壤挖运后处理，不仅耗资巨大，而且破坏了土壤微生物及土壤结构，对于大规模、中强度的污染治理几乎无法实现。

近十年来，植物修复(Phytoremediation)技术成为土壤污染修复研究的热点。植物修复是利用可超富集重金属的植物吸收、积累环境中的污染物，并降低其毒害的环保生物技术。它具有传统环境修复技术所不具备的优点，表现为：治理效果的永久性、治理过程的原位性(对土壤环境扰动小)、治理成本的低廉性、环境美学的兼容性、后期处理的简易性等特点，而且修复过程一般无二次污染，某些金属元素甚至可回收利用。植物修复所独有的技术及经济优势，预示该项技术将发展成为污染治理领域的朝阳产业。

植物修复为从根本上解决土壤和水体金属污染提供了一种重要途径，因而植物修复在土壤金属污染治理中具有独特的作用和意义。然而，植物修复技术目前尚存在着一些不足：其一是重金属超富集植物是在重金属胁迫环境下长期诱导、驯化的一种适应性突变体，往往生长缓慢、生物量低，且常常受到杂草的竞争性威胁；其二是这些超富集植物多为野生型稀有植物，对生物气候条件的要求比较严格，区域性分布较强，严格的适生性使成功引种受到严重限制；其三是超富集植物的专一性很强，往往只对某种特定的重金属表现出超富集能力，且大部分仍处于试验阶段，到实际应用还有一定距离。从而严重制约了植物修复的效率及应用。体积较小或呈莲座形生长的植物往往影响机械收获，使得年收获的费用增加。

植物修复的长远发展依赖于超富集植物分子机制的阐明和新型超富集工程植物的研发。分子生物学在植物修复研究和应用领域扮演着越来越重要的角色。在阐明超富集植物分子机制的基础上，应用转基因工程技术，将自然界中超累积植物的耐重金属、超累积基因移殖到生物量大、生长速率快的植物中去，培育出具有实用价值的转基因植物，以克服天然超累积植物的缺点，提高植物修复的实用性。到目前为止，在Se、Hg、Cd、Zn等重金属元素转基因植物研究领域已取得了较大的成果。随着分子生物技术的突飞猛进，预期这方面研究一定会取得突破性的进展。

砷是一种致癌的化学元素。砷污染物主要是以砷化物的形式存在，它可从呼吸道、食物或皮肤进入人体，严重危害人类健康。砷化物通过抑制体内酶的活性，干扰人体正常新陈代谢，从而导致中枢神经系统发生紊乱，毛细血管扩张。人们若长时间暴露在含砷环境中，则会大大增加患肝癌、皮肤癌或膀胱癌等恶性疾病的机率。现在越来越多的皮肤癌、肾癌、肺癌或膀胱癌等癌症患者与长期饮用含砷量高的水有关。饮用水中砷的长期慢性作用可导致皮肤产生严重的色素沉着现象并且手、脚生成角质物质，进一步恶化则变为皮肤癌。长期饮用含砷量高的水，患肺癌、膀胱癌或其它癌症的几率高达10％。另外土壤和水体的砷污染还可导致粮食减产，从而造成严重的经济损失。天然水中仅含微量的砷，水中含砷量高，除了地质因素外，主要是工业废水和农药污染所致。面对全球砷污染的严重状况，亟需阐明超富集植物对砷吸收、转运和解毒的机理，研发出修复砷污染环境的生物技术，以尽快地消除土壤及水体的砷污染对人类健康的威胁。

然而，很久以来砷污染的植物修复技术一直是一个空白。直到2001年，Nature报道发现了世界上第一种能够大量富集砷的凤尾蕨属植物-蜈蚣草Pteris vittata L.，人们才开始对砷污染的植物修复技术进行研究。次年，陈同斌等在我国境内也发现了这种砷超富集植物。经研究表明，蜈蚣草具有典型的超富集植物的三大特征：高效的根部吸收、根到茎的高效转运，及植物细胞对砷的高抗性。蜈蚣草的地上部分可以富集22，630mg kg^-1砷，比土壤中砷浓度的10倍还高。

蜈蚣草属蕨类植物门、凤尾蕨科风尾蕨属。这种植物的适应能力强，喜阳，多生长在碱性环境中。Ma等在佛罗里达州中部一个铬酸铜和砷酸盐污染的地区发现了这种蕨类植物。他们的研究表明在砷浓度高达1,500ppm(mg/kg)的土地上蜈蚣草仍然可以正常生长，蜈蚣草地上部在两周内富集的砷浓度可以从29.4ppm(mg/kg)增加到15,861ppm(mg/kg)，生长在含砷6ppm(mg/kg)土地上的蜈蚣草可以富集755ppm(mg/kg)砷，其地上部富集的砷是土壤中的126倍。

Ma等在研究蜈蚣草中砷的形态时发现，生长20周的蜈蚣草植株中大部分砷都以强毒性的无机形态存在，几乎检测不到有机砷。地上部(47-80％)As(III)的浓度远远高于根部(8.3％)，该结果表明当从根部运送到地上部时，砷从五价转变为三价。他们的研究还表明蜈蚣草不仅可以从不同浓度的土壤中清除砷，而且可以从土壤中清除不同形态的砷。此外，对于不能溶解的FeAsO₄和AlAsO₄，蜈蚣草地上部仍然可以富集136-315ppm(mg/L)砷，该浓度是土壤中砷浓度的3-6倍。Tu的研究结果也与之类似，在土壤中加入同一浓度不同形态的砷，包括砷酸盐(AsO₄ ^3-)、亚砷酸盐(AsO₂ ^1-)、二甲基砷酸(DMA)以及一甲基砷酸(MMA)，18周后检测结果表明土壤中可溶性的砷只有砷酸盐，而蜈蚣草植株中94％的砷都是亚砷酸盐。但在老叶和离体叶片中，亚砷酸盐又被氧化成砷酸盐。

在许多植物中，含低分子量巯基的化合物(如PCs)在重金属的解毒和积累方面都起重要的作用。Zhao等的研究结果表明砷超富集植物蜈蚣草中只有1-3％的砷形成As(III)-(PC₂)₂复合物。这说明PCs在砷的解毒和积累方面起很有限的作用。

1982年，在Giovanna Ames的实验室克隆到了第一个ABC转运蛋白(ATP-bindingcassette(ABC)transporter)一组氨酸透性酶(histidine permease)。至此以后，不同的ABC转运蛋白不断被发现，并成为生物体中最大的蛋白家族之一。大多数ABC蛋白转运伴随着ATP水解，其转运底物很多，包括脂质、无机离子、有机复合物、氨基酸、小肽、糖、次级代谢产物及蛋白等。

根据系统发生途径及其结构特点，ABC转运蛋白又分为多个亚家族。研究较多的三个亚家族分别是多效抗药性亚家族(pleiotropic drug resistance，PDR)、广谱抗药性亚家族(multidrug resistance，MDR)以及广谱抗药性相关蛋白亚家族(multidrug resistance-associated protein，MRP)。

虽然ABC转运蛋白的底物种类繁多，但在结构和机理上有很多共性，即它们都是通过以ATP为能量来源的泵或通道来执行功能。一个完整的有功能的ABC转运蛋白包括两个核苷结合结构域(nucleotide-binding domains，NBDs或ABC结构域)和两个跨膜结构域(transmembrane domains，TMDs)。NBD通常存在于细胞质中，具有与ATP结合的区域，TMD通常含有6个α螺旋跨膜区。了解ABC转运蛋白的蛋白结构对于研究ATP水解与底物转运的协同工作机理具有重要意义。

拟南芥的基因组研究发现，拟南芥基因组中共包含131个ABC转运蛋白，其中有54个全长ABC转运蛋白(即包含两个疏水区和两个亲水区)。水稻基因组测序结果表明含有45个全长ABC转运蛋白。1993年，Martinoia等研究了大麦液泡对谷胱甘肽的吸收，此吸收过程是由一个ABC转运蛋白介导的。但大多数植物的ABC转运蛋白的功能尚不清楚。

目前为止，人们对植物砷抗性和超富集机理的了解还非常有限。蜈蚣草能够超富集砷是近年的一个新发现。但目前仅对蜈蚣草中砷的吸收、形态、分布有一些初步的了解，关于蜈蚣草对砷的超富集机理以及解毒机制还不清楚，也没有任何相关分子机制的报道。

酵母的基因组较为简单，酵母中重金属抗性基因的研究相对较为清楚。ACR3基因定位于酵母细胞质膜上，可以将酵母细胞内的亚砷酸盐转运到细胞外，对酵母亚砷酸盐的转运起重要的作用。FD236-6A即是缺失ACR3基因的突变菌株，该菌株对亚砷酸盐的敏感度是野生型菌株的5倍，在含超过0.3mM亚砷酸盐的YPD固体培养基中便不能生长。利用FD236-6A酵母菌株，通过功能互补实验可以验证其它生物来源的基因在砷抗性中的功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种蜈蚣草ABC转运蛋白及其编码基因。

本发明所提供的蜈蚣草ABC转运蛋白，名称为PvABCT1，来源于蜈蚣草(Pterisvittata L.)是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的序列2；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有砷吸收作用的蛋白质。

序列表中的序列2由597个氨基酸残基组成。

编码上述蜈蚣草ABC转运蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

蜈蚣草ABC转运蛋白基因，命名为PvABCT1，可具有以下核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的多核苷酸序列；

2)与序列表中序列1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同活性的核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的序列1由2165个碱基组成，其编码序列为自序列1的5’端第163-1956位核苷酸。

含有本发明基因的表达载体、细胞系，如pESPM/PvABCT1，pGFP-2/PvABCT1和含有pESPM/PvABCT1的FD236-6A酵母菌株均属于本发明的保护范围。

扩增上述蜈蚣草ABC转运蛋白基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

PvABCT1具有两个ABC转运蛋白核苷结合结构域——ATP结合结构域，分别位于自N端第105-112位氨基酸残基和417-424位氨基酸残基；两个很小的跨膜结构域，分别位于序列表中序列2的自N端第252-257位氨基酸残基和自N端第515-519位氨基酸残基；ABC转运蛋白家族的信号区，位于序列表中序列2的自N端第217-231位氨基酸残基；ABC转运蛋白家族特征结构域，位于自N端第73-313位氨基酸残基。表明PvABCT1是一个ABC转运蛋白。同时对PvABCT1蛋白进行疏水性分析，表明该蛋白具有很强的亲水性，无明显的疏水区域。

在实际应用中，可通过将蜈蚣草ABC转运蛋白基因转入其它生物量大、生长速率快的植物中，培育出具有富集砷特性的转基因植物，以克服天然超累积植物的缺点，提高植物修复的实用性。

研究表明本发明的蜈蚣草ABC转运蛋白基因在砷的吸收和积累中起重要作用，因而将在修复砷污染环境的生物技术中起到重要作用，以尽快消除土壤及水体的砷污染对人类健康的威胁，同时对其它重金属环境污染的治理也具有重要的启示意义，本发明具有较大的实际意义。

附图说明

图1为蜈蚣草ABC转运蛋白序列的同源序列检索的结果

图2A为经不同重金属处理的蜈蚣草PvABCT1基因转录水平表达变化柱状图

图2B为经不同重金属处理的蜈蚣草PvABCT1基因转录水平表达的电泳图

图3为三种酵母菌株对砷吸收量的测定结果

具体实施方式

实施例1、PvABCT1及其编码基因PvABCT1的获得

一、砷处理蜈蚣草的SSH文库的构建

1、蜈蚣草的砷处理

蜈蚣草(Pteris vittata L.)采自湖北省矿区，移栽在温室培养。取未经砷处理的蜈蚣草嫩叶(对照)和经5mM NaAsO₂处理4周后的蜈蚣草嫩叶(盆栽条件下，在土壤中加入NaAsO₂溶液，使其终浓度为5mM，处理4周后取嫩叶)，用液氮速冻后保存于-70℃待用。

2、蜈蚣草RNA的提取

用改进的RNA提取方法分别提取步骤1中未经处理的和用NaAsO₂处理后的蜈蚣草的总RNA，具体步骤如下：

1)将0.5ml提取缓冲液A(含100mmol/L Tris-HCl，pH8.3；500mmol/L EDTA，pH8.3；500mmol/L NaCl，2％SDS，5mmol/L DTT)加入到1.5ml离心管中，加入1.5％体积的β-巯基乙醇；

2)将100mg蜈蚣草叶片用液氮冷冻研磨后，迅速转到温浴的离心管中，剧烈震荡离心管，使组织与提取缓冲液A充分混匀，70℃温浴6min，迅速置于冰上；

3)待混合物冷却后，12000g离心10min，小心取出上清液；

4)将上清液中加入0.1ml 5mol/L NaCl，混匀后，加入溶液1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿，置于震荡器上剧烈震荡2min，12000g离心10min，小心取出上清液；

5)向上清液中加入1/4体积的2-丁氧乙醇和1.5％体积的β-巯基乙醇，混匀，冰浴10min；

6)将混合物2000g离心10min，小心取出上清液；

7)向上清液中加入等体积的2-丁氧乙醇和1.5％体积的β-巯基乙醇，充分混匀后静置10min，12000g离心10min，弃上清，沉淀即为总RNA；

8)将步骤7)中的沉淀用50％的2-丁氧乙醇洗涤两次，加入适量的DEPC处理水溶解总RNA。

3、mRNA的纯化及浓缩

1)使用Oligotex mRNA Spin-Column Kit(Clontech公司)并参照其说明书分别对步骤1获得的未经砷处理和经砷处理蜈蚣草的总RNA进行纯化，得到含有未经砷处理和经砷处理蜈蚣草mRNA的溶液；

2)将含有经砷处理的蜈蚣草mRNA的溶液中加入1/10体积的3M NaAc和2倍体积的乙醇。-20℃下放置1h；8000g离心15min，弃上清；向沉淀中加1ml 70％乙醇，混匀后8000g离心15min，弃上清；将沉淀在空气中干燥10min，用不含核酸酶的蒸镏水溶解，得到砷处理蜈蚣草mRNA的浓缩液；

3)用与步骤2)相同的方法得到含有未经砷处理蜈蚣草mRNA的浓缩液。

4、抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)文库的构建及同源序列的检索与比较

以步骤3获得的砷处理蜈蚣草的mRNA为实验方(tester)、未经砷处理蜈蚣草的mRNA为驱动方(driver)，使用Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(Clontech公司)并参照其说明书按常规方法得到实验方和驱动方的SSH PCR产物。

将实验方和驱动方经消减杂交后的抑制性PCR产物克隆至载体pGEM-Teasy(Promega公司)中，建立两个差异SSH文库，具体步骤如下：

1)将实验方和驱动方消减杂交后的抑制性PCR产物用T₄ DNA连接酶(TaKaRa公司)分别与载体pGEM-Teasy连接，形成重组载体，将含有实验方抑制性PCR产物基因的重组载体命名为pGEM-Tester，将含有驱动方抑制性PCR产物基因的重组载体命名为pGEM-Driver。

2)将重组载体pGEM-Tester和pGEM-Driver分别用CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，将两种重组菌接种于LB抗性培养平板(含氨苄青霉素100μg/ml，浓度为20mg/ml的X-Gal 40μl，浓度为200mg/ml的IPTG 4μl)进行蓝白筛选，挑取白色单菌落为模板，用菌落PCR的方法做进一步筛选，PCR反应体系如下：

灭菌水 16.5μl

10×PCR反应缓冲液 2μl

dNTP(10mM) 0.5μl(TaKaRa公司)

SP6(20pmol/ml) 0.25μl(TaKaRa公司)

T7(20pmol/ml) 0.25 μl(TaKaRa公司)

rTaq DNA聚合酶 0.5μl(TaKaRa公司)

总共 20μl

PCR反应条件为：94℃ 25sec；94℃ 10sec，55℃ 30sec，72℃ 1.5min，27个循环。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，选取阳性克隆，用双脱氧核糖核酸法进行测序。测序完毕后，在NCBI(htttp://www.ncbi.hlm.nib.gov/BLAST)的蛋白数据库(Blastp)中进行蛋白序列的同源序列检索，对其中一些序列进行保守结构域分析。结果在以砷处理蜈蚣草为实验方、未经砷处理蜈蚣草为驱动方的cDNA文库中，筛选到的一条385bp的cDNA片段，该片段含有ABC转运蛋白(ATP-bindingcassette transporter)的核苷结合结构域，并且与杨树、拟南芥、水稻的ABC转运蛋白基因的同源性都在80％以上。

二、RACE法克隆砷处理蜈蚣草PvABCT1及其编码基因Pv4BCT1

用SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)参照说明书克隆出砷处理蜈蚣草ABC转运蛋白基因，具体步骤如下：

1、合成第一链cDNA

1)取2个PCR管，分别用来合成5’-RACE-Ready cDNA和3’RACE Ready cDNA，两个反应体系如下：

5’-RACE-Ready cDNA反应体系：

1μg砷处理蜈蚣草mRNA

1μl 5’-CDS引物(试剂盒中自带)

1μl SMART II A oligo(试剂盒中自带)；

3’-RACE Ready cDNA反应体系：

1μg砷处理蜈蚣草mRNA

1μl 3’-CDS引物A(试剂盒中自带)

1μl SMART II A oligo(试剂盒中自带)；

两个反应体系均用灭菌水补至5μl，混匀后离心；

2)用PCR仪70℃反应2分钟，冰浴2分钟，短暂离心；

3)将两个反应管中再分别加入以下试剂：

2μl 5×第一链缓冲液

1μl DTT(20mM)

1μl dNTP(10mM)

1μl PowerScript逆转录酶(试剂盒中自带)；

混匀后离心；

4)用PCR仪42℃反应1.5个小时；

5)用Tricine-EDTA(试剂盒中自带)缓冲液将上述反应液稀释10倍；

6)用PCR仪72℃加热7分钟，获得第一链cDNA。

2、RACE反应

根据得到的砷处理蜈蚣草ABC转运蛋白基因片段的序列，设计合成了基因特异引物(Gene Specific Primer，GSP)，分别为：

GSP1：5’-TATGTCCAAACCCGTGAAGAGCTGG-3’

GSP2：5’-GGTTTCAACAAAAGCATGCAACAG-3’

NGSP1：5’-CGGGATTTTTCAGGCGGCTGGAG-3’

NGSP2：5’-GGGATTTTTCAGGCGGCTGGAGA-3’

1)分别以GSP1和GSP2为引物进行5’-RACE和3’-RACE反应，均按说明书操作配置反应体系；反应条件如下：

5’-RACE反应条件为：95℃1min，64℃1min，72℃50sec，30个循环。

3’-RACE反应条件为：95℃1min，64℃1min，72℃2min，35个循环。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测，表明5’RACE和3’RACE分别得到750bp和1500bp大小的条带，再用引物NGSP1和NGSP2进行验证，均得到预期长度的片段。然后对5’RACE和3’RACE片段进行测序，并根据测序的结果，即根据cDNA的5’端和3’端序列再次设计引物(引物序列如下)，进行砷处理蜈蚣草ABC转运蛋白的cDNA全长基因的克隆。

引物3’-1：5’ CTACAAGAAGAAAGTGTTATAAATATTGATCAGA3’

引物5’-1：5’ GCTTTTTAGTTTTCCCCAACCCTCA3’

砷处理蜈蚣草ABC转运蛋白的cDNA全长基因克隆的PCR反应体系如下：

灭菌水 15μl

蜈蚣草cDNA(1ng/μl) 1μl

10×LA PCR反应缓冲液 2μl(TaKaRa公司)

dNTP(10 mM) 0.5μl(TaKaRa公司)

引物3’-1(20pmol/ml) 0.5μl(上海博亚生物技术有限公司合成)

引物5’-1(20pmol/ml) 0.5μl(上海博亚生物技术有限公司合成)

LA Taq DNA聚合酶 0.5μl(TaKaRa公司)

总共 20μl

PCR循环条件为：95℃30sec，62℃30sec，72℃2.5min，30个循环。

3、砷处理蜈蚣草ABC转运蛋白基因的cDNA的序列分析

将步骤2克隆得到的砷处理蜈蚣草ABC转运蛋白的cDNA全长基因进行测序，将测序结果用DNAMAN4.0软件和NCBI的BLAST进行序列比较、同源性分析、疏水性分析以及结构域预测，并用PPSEARCH软件进行蛋白结构域的预测。

1)DNA测序结果表明：砷处理蜈蚣草ABC转运蛋白的eDNA序列全长为2165bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列，其编码序列(开放阅读框架)长度为1794bp，是自序列1的5’端的第163-1956位核苷酸，编码具有序列表中序列2(597个氨基酸残基)的氨基酸残基序列的蛋白质。5’端的非翻译区长度为162bp，3’端的终止区长度为209bp，含一个长度为20bp的polyA尾。将该基因命名为PvABCT1，其编码蛋白命名为PvABCT1。

2)PvABCT1的蛋白序列分析及同源性比较

PvABCT1蛋白质的分子量约为67284kD，等电点为6.38。PvABCT1在数据库中与各种原核和真核生物的ABC转运蛋白有较高的同源性。如图1所示，PvABCT1氨基酸序列与杨树、拟南芥以及水稻ABC Transporter氨基酸序列比较，其同源性达80-85％。

3)PvABCT1的保守结构域分析

对PvABCT1进行生物信息学分析，结果表明：PvABCT1具有ABC转运蛋白家族的特征。其中自N端第217-231位氨基酸残基为ABC转运蛋白家族的信号区；自N端第105-112位氨基酸残基和417-424均为ATP结合结构域；自N端第73-313位氨基酸残基为ABC转运蛋白家族特征结构域。表明PvABCT1是一个ABC转运蛋白。

PvABCT1氨基酸序列在GenBank数据库中与各种原核和真核生物的ABC转运蛋白有较高的同源性。如图1所示，蜈蚣草PvABCT1氨基酸序列与杨树、拟南芥以及水稻ABC转运蛋白氨基酸序列比较，其同源性达80-85％。图1中，右边的数字表示每个氨基酸位置。黑色阴影部分表示相同的氨基酸残基。拟南芥、水稻、杨树转运蛋白在GenBank的序列号分别是NP 200887，BAC55994和AB041505.1。

4)PvABCT1蛋白的跨膜结构预测

通过PSORT软件对PvABCT1蛋白的跨膜结构进行预测，结果表明：PvABCT1具有两个ABC转运蛋白核苷结合结构域——ATP结合结构域，分别位于自N端第105-112位氨基酸残基和417-424位氨基酸残基；两个很小的跨膜结构域，分别位于序列表中序列2的自N端第252-257位氨基酸残基和自N端第515-519位氨基酸残基；ABC转运蛋白家族的信号区，位于序列表中序列2的自N端第217-231位氨基酸残基；ABC转运蛋白家族特征结构域，位于自N端第73-313位氨基酸残基。表明PvABCT1是一个ABC转运蛋白。同时对PvABCT1蛋白进行疏水性分析，表明该蛋白具有很强的亲水性，无明显的疏水区域。

实施例2、用RT-PCR的方法进行PvABCT1表达模式的研究

分别收集经5mM NaAsO₂、1mM CdCl₂和1mM CuSO₄处理蜈蚣草4周的蜈蚣草嫩叶(盆栽条件下，在土壤中加入NaAsO₂(使其终浓度为5mM)、CdCl₂(使其终浓度为1mM)或CuSO₄(使其终浓度为1mM)处理溶液，处理4周后取嫩叶)，用液氮速冻后保存于-70℃，用于下述RT-PCR检测。

1、蜈蚣草actin基因片段的克隆：

根据拟南芥等植物actin基因的保守区设计一对简并引物，其序列为：

引物3：5’-TTTGCTGGAGATGATGCTCC-3’

引物4：5’-GTGGTACGACCACTGGCATA-3’

以蜈蚣草的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到一条400 bp左右大小的条带，经测序并与其他植物的actin基因序列进行比较，证明它是蜈蚣草的actin基因片段。因为actin基因的表达比较稳定，不因外界环境刺激或组织不同而变化，是很好的RT-PCR的内参。

2、cDNA的合成：

应用mRNA选择性PCR试剂盒(mRNA Selective PCR Kit，购自TaKaRa)合成cDNA。其中，反转录反应体系为：

2×mRNA选择性PCR缓冲液(试剂盒中自带) 25μl

MgCl₂(试剂盒中自带) 10μl

dNTP(试剂盒中自带) 5μl

RNase抑制剂(试剂盒中自带) 1μl

AMV反转录酶(试剂盒中自带) 1μl

下游特异引物(CAGTTCCAGTCTGACCGAAAG)(20pmol/ml) 1μl

不同重金属处理的蜈蚣草RNA(1μg/μl) 1μl

dH₂O 6μl

反转录反应条件为：30℃10min，45℃30min，5℃5min。合成不同处理的cDNA。

3、PCR反应

根据PvABCT1的序列，设计一对特异引物：

引物5：5’ ATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT 3’

引物6：5’ CAGTTCCAGTCTGACCGAAAG 3’

以5mM NaAsO₂、1mM CdCl₂和1mM CuSO₄处理的蜈蚣草cDNA为模板，按以下程序进行：95℃ 40秒，60℃ 50秒，72℃ 50秒，23个循环。

取等量的PCR产物进行电泳，电泳条带经凝胶成像系统Alphaimager(AlphaInnotech公司，型号：LCS NO.00182)扫描并积分定量。同法测定对应的actin基因表达量，所有数据均以actin的表达量取得一致，并将两者进行比较，得到不同处理的PvABCT1基因的表达差异。结果如图2A和图2B所示，表明在未经重金属处理的蜈蚣草叶片中，PvABCT1基因有较低水平的表达。蜈蚣草经过5mM Na₃AsO₃、1mM CdCl₂以及1mM CuSO₄处理后，该基因表达量均有所提高。砷处理条件下该基因的表达量是未处理的7倍，而铜离子和镉离子处理条件下其表达量是未处理的2倍左右。实验结果表明该基因的表达受砷的诱导，但铜离子和镉离子对其表达也有一定影响。图2A和2B中，CK表示对照，As表示经过5mM Na₃AsO₃处理，Cd表示经1mM CdCl₂处理，Cu表示经1mM CuSO₄处理。

实施例3、PvABCT1基因的亚细胞定位(基因瞬时表达)

1、瞬时表达载体的构建

引物序列如下：

引物7：5’GC CTCGAGATGGCGTCAGATGCAA3’ (划线部分的核苷酸序列为XhoI)

引物8：5’CC GGTACCAAGGCCTGCTTTTGCT3’ (划线部分的核苷酸序列为KpnI)

以蜈蚣草PvABCT1基因的全长cDNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系为：

灭菌水 15μl

蜈蚣草cDNA(1 ng/μ l) 1μl

10×LA PCR反应缓冲液 2μl(TaKaRa公司)

dNTP(10mM) 0.5μl(TaKaRa公司)

引物7(20pmol/ml) 0.5μl(上海博亚生物技术有限公司合成)

引物8(20pmol/ml) 0.5μl(上海博亚生物技术有限公司合成)

LA Taq DNA聚合酶 0.5μl(TaKaRa公司)

总共 20μl

PCR循环条件为：95℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 2.5min，30个循环。

经PCR反应，扩增出了PvABCT1，并在PvABCT1两端引入了XhoI和KpnI的酶切位点。将基因瞬时表达载体pGFP-2(M.J.Varagona，R.J.Schmidt and N.V.Raikhel，Nuclear localization signals required for nuclear targeting of the maizeregulatory protein Opaque-2.Plant Cell 4(1992)，1213-1227.)与引入了XhoI和KpnI位点的PvABCT1用XhoI和KpnI进行双酶切，将酶切产物用玻璃奶回收试剂盒(博大泰克公司)回收后再用T₄DNA连接酶连接，得到含有PvABCT1的重组载体pGFP-2/PvABCT1。将重组载体pGFP-2/PvABCT1用XhoI和KpnI限制性内切酶进行酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳结果表明构建的重组载体pGFP-2/PvABCT1正确。

2、植物材料准备

剥取洋葱内表皮于MS培养基中，室温放置备用。

3、转基因植物的制备及PvABCT1的亚细胞定位

将步骤1构建的含有PvABCT1的重组载体pGFP-2/PvABCT1及载体pGFP-2(对照)用基因枪转化法导入步骤2的洋葱表皮细胞中，导入后将其在MS培养基上培养24小时，然后用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达情况。结果表明，GFP荧光在用pGFP-2轰击的洋葱表皮的整个表皮细胞中均可观察到。在用pGFP-2/PvABCT1轰击的洋葱表皮中，观察到的GFP荧光主要集中在细胞质中，从而证明PvABCT1是在细胞质中表达。

实施例4、酵母功能互补实验

利用FD236-6A酵母菌株(Bobrowicz P，Wysocki R，Owsianik G，Goffeau A，Ulaszewski S.Isolation of three contiguous genes，ACR1，ACR2 and ACR3，involved in resistance to arsenic compounds in the yeast Saccharomycescerevisiae.Yeast，1997，13：819-28.)，通过功能互补实验以验证其它生物来源的基因在砷抗性中的功能。将PvABCT1基因转入对As敏感的酵母菌株FD236-6A中，分别检测其对砷、铜、镉三种重金属的抗性，以验证其是否能够互补ACR3基因的功能。

1、设计引物

引物序列如下：

引物9：5’GC CTCGAGATGGCGTCAGATGCAA3’ (划线部分的核苷酸序列为XhoI)

引物10：5’AC GGATCCTCAAAGGCCTGCTTTT3’ (划线部分的核苷酸序列为BamHI)

以蜈蚣草PvABCT1的全长cDNA为模板，在引物9和引物10的引导下进行PCR反应，PCR反应体系以及PCR循环条件同实施例1步骤二中的砷处理蜈蚣草ABC转运蛋白的cDNA全长基因克隆。经PCR反应，扩增出了PvABCT1，并在PvABCT1两端引入了XhoI和BamHI的酶切位点。将酵母超表达载体pESPM(Xin Wang，Wen-Zhong Xu，Yun-YuanXu，Kang Chong，Zhi-Hong Xu and Gui-Xian Xia，Wheat RAN1，a nuclear small Gprotein，is involved in regulation of cell division in yeast.Plant Science，2004：67，6，1183-1190)与引入XhoI和BamHI位点的PvABCT1用XhoI和BamHI限制性内切酶进行双酶切，将酶切产物用玻璃奶回收试剂盒(博大泰克公司)回收后再用T₄DNA连接酶连接，得到含有PvABCT1的重组载体pESPM/PvABCT1。将重组载体pESPM/PvABCT1用XhoI和BamHI限制性内切酶进行酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳结果表明构建的重组载体pESPM/PvABCT1正确。

2、转化酵母

将构建的重组载体pESPM/PvABCT1转化酵母(FD236-6A)，具体步骤如下：

1)将该酵母菌株接种于5ml液体YPD培养基中，30℃下振荡培养12-24小时；

2)测定培养物的细胞密度，当细胞密度达到约5×10⁶个/ml时，将其接种于100ml液体YPD培养基中，30℃，200转/min继续振荡培养；

3)当细胞密度达到约2×10⁷个/ml时，停止培养，3000g离心5min，收获细胞，弃培养液；

4)将收获的细胞悬浮于25ml无菌水中，3000g离心5min，收获细胞；

5)把收获的细胞悬浮在1ml的100mmol/L的醋酸锂中，将悬浮物转到一个无菌1.5ml的离心管中，离心5sec沉淀细胞，吸出醋酸锂；

6)用100mmol/L醋酸锂溶液悬浮细胞至终体积为500μl；

7)将1ml单链单体DNA样品(Clontech公司)煮沸5分钟，快速在冰水中冷却；

8)振荡步骤6)的细胞悬浮液，取50μl细胞悬浮液加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，除去醋酸锂；

9)配制“转化混合液”，成分如下：

240μl PEG(50％)

36μl 1.0mol/L醋酸锂

25μl 单链载体DNA(2.0mg/ml)(Clontech公司)

50μl 水和质粒(含0.1-10μg的步骤1构建的载体pESPM/PvABCT1)；剧烈振荡至每个反应管内的细胞完全混匀；

10)将转化混合液30℃保温30min；

11)将转化混合液42℃热激20-25min；

12)将转化混合液6000-8000g离心15秒，除去转化混合液；

13)将1-2ml的无菌水加到每个反应管中，轻轻悬浮沉淀。

3、筛选转化子

将200μl含有转化的酵母菌株FD236-6A的转化混合液涂到去除亮氨酸的SD(购于Clontech公司)培养平板30℃培养72小时筛选转化子。挑取阳性克隆，分别在含有300μmol/L As³⁺(用50mmol/L MES缓冲液配制)和500μmol/L As³⁺的1/2YPD培养基上划线培养，进行二次筛选。

以经两次筛选获得的阳性克隆为模板，用PvABCT1的特异引物进行菌落PCR鉴定。PvABCT1的特异引物序列为：

引物11：5’-ATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT-3’

引物12：5’-CAGTTCCAGTCTGACCGAAAG-3’

菌落PCR程序如下：95℃2min；95℃30sec，60℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃10min。得到表达有PvABCT1基因的酵母菌株。

4、酵母抗性检测

利用酵母功能互补实验分别检测经过鉴定的转化子对砷、铜、镉三种重金属的抗性，结果表明在本实验条件下，FD236-6A酵母菌株在添加0.25mM NaAsO₂的1/2YPD培养基中可以正常生长。PvABCT1转入到FD236-6A后，该酵母对砷的敏感性提高。在添加0.125mM NaAsO₂的1/2YPD培养基中生长减慢，在0.25mM NaAsO₂条件下该酵母就完全不能生长。酵母功能互补实验表明PvABCT1不仅不能与ACR3基因的功能互补，反而使酵母对砷的敏感性增加，说明PcABCT1基因的功能与ACR3基因不同。

同时还检测了把PvABCT1转入到FD236-6A后该酵母对铜、镉的抗性反应。结果表明在本实验条件下，FD236-6A酵母菌株在添加4mM CuSO₄的1/2YPD培养基中可以正常生长，在添加6mM CuSO₄的1/2YPD培养基中，FD236-6A酵母菌株生长减慢，在8mM CuSO₄条件下该酵母就完全不能生长。而PvABCT1转入到FD236-6A后，在8mM CuSO₄条件下该酵母还可以正常生长，说明PvABCT1基因的表达可以提高酵母细胞对铜的抗性，这可能是由于该基因与铜的转运有关。

该基因对酵母细胞镉的抗性无明显作用。

实施例5、PvABCT1功能的进一步验证

1、液体培养基中酵母砷的抗性检测

为进一步验证PvABCT1的功能，将对照菌株(FD236-6A酵母菌株)、插入空载体(pESPM)的菌株和表达PvABCT1基因的酵母菌株在1/2YPD液体培养基中30℃，200r/分钟培养至OD₆₀₀＝0.5，添加0.125mM砷于培养基中，继续培养24小时。分别测定它们的OD₆₀₀值。测定结果表明，对照菌株、插入空载体的菌株和表达PvABCT1基因的酵母菌株在未添加砷的液体培养基中生长状况几乎一样。在添加0.125mM砷的培养基中，三个菌株的生长都受到了抑制，而表达PvABCT1基因的酵母菌株比对照菌株和插入空载体的菌株的生长明显缓慢，可见该基因的表达增加了酵母菌株的敏感性。

2、酵母对砷的吸收量测定

挑取对照菌株(FD236-6A酵母菌株)、插入空载体的酵母菌株(pESPM)和经上述菌落PCR鉴定表达有PvABCT1基因的酵母菌株分别接种于1/2YPD液体培养基中30℃，200r/分钟培养至OD₆₀₀＝0.5。添加0.125mM砷于培养基中，继续培养24小时。离心三种酵母细胞，收集上清，用10mM的EDTA将收集的酵母细胞洗涤三次，50℃烘干酵母细胞。消解矿化后用等离子体发射光谱仪(Induced coupled plasma，ICP)测定菌体中的砷含量。结果如图3所示，表明表达PvABCT1基因的酵母菌株在As含量为0.125mM的1/2YPD液体培养基中的生长24小时后，吸收砷的量是对照菌株和插入空载体菌株的1.73倍。这表明在转入该基因后，酵母细胞增强了对砷的吸收。FD236-A缺失了ACR3基因，向胞外运输砷能力减弱，PvABCT1基因的表达增加了酵母对砷的吸收，因而细胞更易受伤害。实验结果表明，该基因的功能与ACR3基因的功能不同，因而证明该基因与砷的吸收有关。

序列表

<160>2

<210>1

<211>2165

<212>DNA

<213>蜈蚣草(Pteris vittata L.)

<400>1

gctttttagt tttccccaac cctcaacgtt gtcgcggagg gaaaggccac cagttttgtt 60

caatttcgca aatcctgttc ttcctttgcg ctgtcgtctc agttgccgcc cttctacttg 120

caggaagaag ctcacgtaga agaaaatatt tagtgcagaa atatggcgtc agatgcaagc 180

aagaagaagg cagctcaaaa gaaggcagct gctgcagcta agcgcggttc caaagccact 240

gctactaatg caacctcgtc taaaactaat ggggtttcca attcatcccc aaatgaagtt 300

gcagatgaga tggcctatat gcagataact gataggacat gtacaggaat ccttgcttcc 360

catccacaat caagagatat tcatatcgaa agtctaacgg tgacatttca tggccatgat 420

ctcattgtag attcgagcct cgaactcaac tatagaaggc gttatggatt gcttgggctg 480

aatggttgtg gaaagtcgac tctcctgtca gccataggtt gccgtgagct acccattcca 540

gagcatatgg atatttacca tttaactcgg gaaattgaag caactgactt gacctctctg 600

caagccgttg taaacgtaga tgaagaaagg atcaagctag aaaaagaggc tgaaatgcta 660

gctgctcagg atgatggtgg tggtgaggtt ctagaaagat tatatgagcg tttggaggct 720

atggatgcag ctacagcaga gaagagggca gctgaaattt tgtatggtct gggtttcaac 780

aaaagcatgc aacagaagaa gacccgggat ttttcaggcg gctggagaat gaggattgca 840

ttagccagag cattgttcat gaacccaact attttactgc ttgatgaacc aacgaaccat 900

cttgatctcg aagcctgtgt gtggcttgag gaaacattga agaagtttga ccgcattctt 960

gtcgttgtat cacactctca ggattttctt aatggcatct gcacaaacat tatacatatg 1020

caaagtaaga agctgaagtt ctacacagga aattacgacc aatatgtcca aacccgtgaa 1080

gagctggaag aaaatcagat gaagcagtat aagtgggaac aagagcagat agcaaacatg 1140

aaagagtaca ttgccaggtt tgggcatggc tctgctaaac tagccaggca ggcacagagc 1200

aaggagaaga cattggcaaa gatggaaaga gggggtctca cagagagggt ggttaaggac 1260

aaggtgcttg ttttccgatt tactgacgtt ggcaagttac ccccaccagt tctacaattt 1320

gtggaggtgg actttggtta cactccagaa catatgatat acaagaaaat tgactttgga 1380

gttgacctgg attcgaggat agctttggtt ggtcccaatg gagcaggtaa gagcactctt 1440

ttgaagctta tgacgggcga attgtctccc attgatggca tggtgcggcg ccacaaccat 1500

ttacggattg cgcagtttca ccagcatttg gcagataagc tgaatcttga tatgcctgcc 1560

ctacagtaca tgatgtcgga atatcctggc ttagaagaag aaaagatgcg ggcagcgatt 1620

ggaaggtttg ggctgactgg aaaggctcaa atcatgccca tgagaaatct atccgacggt 1680

cagaggagtc gtgttatttt tgcttggtta gcttggcggt tacctcatat gctcctgctt 1740

gatgaaccta cgaatcatct tgatattgag acaatagatg ctttggctga tgcattaaat 1800

gaatgggatg gagggcttgt gcttgtgggt catgatttta ggcttatcaa ccaggtggcc 1860

aaggagatct gggtttgtga gaaccaaaca gtgtcaaggt gggaaggtga cattatggac 1920

ttcaaacagc acctaaaagc aaaagcaggc ctttgagatg gtgttgctta gaagattgaa 1980

cttgagaggc catagccata tctactttta ataaagtagt aaagattttg cttttgatat 2040

gaattattct caagatacga gaatgcctac ttggaagctc gtaatgaagc tttttatatt 2100

gcttcatcat ttctgatcaa tatttataac actttcttct tgtagaaaaa aaaaaaaaaa 2160

aaaaa 2165

<210>2

<211>597

<212>PRT

<213>蜈蚣草(Pteris vittata L.)

<400>2

Met Ala Ser Asp Ala Ser Lys Lys Lys Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Lys Arg Gly Ser Lys Ala Thr Ala Thr Asn Ala Thr Ser

20 25 30

Ser Lys Thr Asn Gly Val Ser Asn Ser Ser Pro Asn Glu Val Ala Asp

35 40 45

Glu Met Ala Tyr Met Gln Ile Thr Asp Arg Thr Cys Thr Gly Ile Leu

50 55 60

Ala Ser His Pro Gln Ser Arg Asp Ile His Ile Glu Ser Leu Thr Val

65 70 75 80

Thr Phe His Gly His Asp Leu Ile Val Asp Ser Ser Leu Glu Leu Asn

85 90 95

Tyr Arg Arg Arg Tyr Gly Leu Leu Gly Leu Asn Gly Cys Gly Lys Ser

100 105 110

Thr Leu Leu Ser Ala Ile Gly Cys Arg Glu Leu Pro Ile Pro Glu His

115 120 125

Met Asp Ile Tyr His Leu Thr Arg Glu Ile Glu Ala Thr Asp Leu Thr

130 135 140

Ser Leu Gln Ala Val Val Asn Val Asp Glu Glu Arg Ile Lys Leu Glu

145 150 155 160

Lys Glu Ala Glu Met Leu Ala Ala Gln Asp Asp Gly Gly Gly Glu Val

165 170 175

Leu Glu Arg Leu Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Met Asp Ala Ala Thr Ala

180 185 190

Glu Lys Arg Ala Ala Glu Ile Leu Tyr Gly Leu Gly Phe Asn Lys Ser

195 200 205

Met Gln Gln Lys Lys Thr Arg Asp Phe Ser Gly Gly Trp Arg Met Arg

210 215 220

Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Phe Met Asn Pro Thr Ile Leu Leu Leu

225 230 235 240

Asp Glu Pro Thr Asn His Leu Asp Leu Glu Ala Cys Val Trp Leu Glu

245 250 255

Glu Thr Leu Lys Lys Phe Asp Arg Ile Leu Val Val Val Ser His Ser

260 265 270

Gln Asp Phe Leu Asn Gly Ile Cys Thr Asn Ile Ile His Met Gln Ser

275 280 285

Lys Lys Leu Lys Phe Tyr Thr Gly Asn Tyr Asp Gln Tyr Val Gln Thr

290 295 300

Arg Glu Glu Leu Glu Glu Asn Gln Met Lys Gln Tyr Lys Trp Glu Gln

305 310 315 320

Glu Gln Ile Ala Asn Met Lys Glu Tyr Ile Ala Arg Phe Gly His Gly

325 330 335

Ser Ala Lys Leu Ala Arg Gln Ala Gln Ser Lys Glu Lys Thr Leu Ala

340 345 350

Lys Met Glu Arg Gly Gly Leu Thr Glu Arg Val Val Lys Asp Lys Val

355 360 365

Leu Val Phe Arg Phe Thr Asp Val Gly Lys Leu Pro Pro Pro Val Leu

370 375 380

Gln Phe Val Glu Val Asp Phe Gly Tyr Thr Pro Glu His Met Ile Tyr

385 390 395 400

Lys Lys Ile Asp Phe Gly Val Asp Leu Asp Ser Arg Ile Ala Leu Val

405 410 415

Gly Pro Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Leu Lys Leu Met Thr Gly

420 425 430

Glu Leu Ser Pro Ile Asp Gly Met Val Arg Arg His Asn His Leu Arg

435 440 445

Ile Ala Gln Phe His Gln His Leu Ala Asp Lys Leu Asn Leu Asp Met

450 455 460

Pro Ala Leu Gln Tyr Met Met Ser Glu Tyr Pro Gly Leu Glu Glu Glu

465 470 475 480

Lys Met Arg Ala Ala Ile Gly Arg Phe Gly Leu Thr Gly Lys Ala Gln

485 490 495

Ile Met Pro Met Arg Asn Leu Ser Asp Gly Gln Arg Ser Arg Val Ile

500 505 510

Phe Ala Trp Leu Ala Trp Arg Leu Pro His Met Leu Leu Leu Asp Glu

515 520 525

Pro Thr Asn His Leu Asp Ile Glu Thr Ile Asp Ala Leu Ala Asp Ala

530 535 540

Leu Asn Glu Trp Asp Gly Gly Leu Val Leu Val Gly His Asp Phe Arg

545 550 555 560

Leu Ile Asn Gln Val Ala Lys Glu Ile Trp Val Cys Glu Asn Gln Thr

565 570 575

Val Ser Arg Trp Glu Gly Asp Ile Met Asp Phe Lys Gln His Leu Lys

580 585 590

Ala Lys Ala Gly Leu

595

Claims

1、蜈蚣草ABC转运蛋白，其氨基酸残基序列如序列表中的序列2所示。

2、根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述序列表中序列2具有两个ABC转运蛋白核苷结合结构域——ATP结合结构域，分别位于自N端第105-112位氨基酸残基和417-424位氨基酸残基；两个跨膜结构域，分别位于序列表中序列2的自N端第252-257位氨基酸残基和自N端第515-519位氨基酸残基；ABC转运蛋白家族的信号区，位于序列表中序列2的自N端第217-231位氨基酸残基；ABC转运蛋白家族特征结构域，位于自N端第73-313位氨基酸残基。

3、编码权利要求1所述蜈蚣草ABC转运蛋白的基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述蜈蚣草ABC转运蛋白基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的多核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述蜈蚣草ABC转运蛋白基因的编码序列为自序列1的5’端第163-1956位核苷酸。

6、含有权利要求3、4或5所述的蜈蚣草ABC转运蛋白基因的表达载体。

7、含有权利要求3、4或5所述的蜈蚣草ABC转运蛋白基因的转基因细胞系。

8、权利要求3、4或5所述的蜈蚣草ABC转运蛋白基因在治理砷污染中的应用。