CN102146125B - 与铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于玉米的与植物根系铵盐吸收相关的蛋白ZmAMT1；3及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与玉米铵盐吸收相关的由1)衍生的蛋白质。该蛋白的编码基因ZmAMT1；3在拟南芥中的表达可以显著增强拟南芥的铵吸收能力。本发明为农作物的铵高效吸收研究提供了更有特色的基因资源，在基因工程改良植物的营养高效性能研究中将发挥重要作用。

Description

与铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中的一种蛋白质及其编码基因与应用，特别涉及与铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

氮素是植物必须的矿质营养元素之一，是合成蛋白质、核酸和许多生物活性物质的必需组分。氮素缺乏通常导致植物生长迟缓，成熟叶片失绿并伴随着花青素的积累(Diaz et al.，2006，Plant Cell Physiology 47：74-83)。氮肥在农业生产中的大量使用极大地提高了作物产量。当前全球每年施用大约8～9千万吨氮肥，经预测到2050年可增加至2.4亿吨(Tilman et al.，1999，Proc Natl Acad Sci USA96：5995-6000)。能源费用的提高导致了氮肥价格的不断上涨，从而增加了农业生产成本，同时氮肥的流失也在逐步恶化生态环境。基于经济效益和环境保护的双重考虑，在现代农业生产中种植氮高效作物品种已日益重要。

玉米是重要的饲料、经济及生物能源作物，其在国际范围内的需求量与日俱增。在我国玉米生产中，氮肥的施用量高、利用率低是普遍存在的现象(Ju et al.，2009，Proc Natl Acad Sci USA，106：3041-3046)。由于氮肥的大量施用，随之也带来了环境问题(张维理等，1995，植物营养与肥料学报1(2)：80-87)。种植氮高效的玉米品种，是解决氮肥利用率低，降低生产成本，减小环境污染的有效途径，也是农业可持续发展和增强产品国际竞争力的基本要求。传统选育新品种是个非常长期的过程，现如今基因工程，特别是玉米转基因技术的成熟，使得我们有可能通过基因工程的手段快速获得氮高效品种，但是能否快速有效地获得转基因氮高效新品种在很大程度上取决于是否具有良好的功能基因。

大量研究表明，在适度低氮供应条件下，玉米氮高效的主要限制因子是氮素吸收能力(Bohme，et al.，2002，Isotopes in Environmental Health Studies 38：95-102)。植物氮素吸收系统主要分为硝酸盐转运蛋白介导的硝酸盐吸收系统和铵转运蛋白介导的铵盐吸收系统，另外还有很少部分可能通过尿素转运蛋白吸收。生理学研究结果表明植物根内存在两种不同的氮素吸收系统：高亲和和低亲和氮素转运系统(Wang et al.，1993，Plant Physiology 103：1259-1267；Kronzucker et al.，1996，PlantPhysiology 110：773-779)。当生长介质浓度较低时，根系吸收铵/硝依赖于高亲和系统，具有饱和动力学特征(Km值通常低于100μM)。低亲和系统则在生长介质浓度达到毫摩尔范围才起主要作用。铵盐的浓度在土壤中通常很低(不超过50μM)，所以土壤中铵盐的吸收主要依赖高亲和系统。通过研究模式植物拟南芥得到的一系列证据表明，铵转运蛋白(AMT)介导了根系高亲和力的铵的吸收(Gazzarrini et al.，1999，Plant Cell 11：937-947；Yuan et al.，2007，Plant Cell 19：2636-2652)。所以在生产上克隆和利用铵转运蛋白基因对于提高植物对土壤中铵态氮素的吸收具有非常重要的实用价值。拟南芥中的铵转运蛋白AMT已经被克隆并被美国专利保护(专利号分别：United States Patent 6620610)。最近在小麦中的研究结果发现水通道蛋白家族中的一个分支TIP2也具有高亲和铵吸收的功能，相应的3个成员TaTIP2；1，TaTIP2；2和TaTIP2；3也被美国专利保护(专利号：US20090005296)。在中国，南开大学的王宁宁等人用AtPRP3启动子驱动拟南芥铵转运蛋白AtAMT1；1在拟南芥和番茄中表达来提高转基因植物对氮素的吸收效率(中国专利号：CN1737148)。而在玉米上，仅有通过酵母功能互补系统从玉米根cDNA文库中筛选得到了一个玉米铵转运蛋白ZmAMT1；1，并申请了中国专利(申请号：201010198912.6)，除此之外，没有其它的玉米铵转运蛋白被克隆，也没有其它的玉米铵转运蛋白的文章和专利报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与铵盐吸收相关蛋白，命名为ZmAMT1；3，来源于玉米属的玉米(Zea mays L.)，是如下1)或2)的蛋白：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与玉米铵盐吸收相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表序列1为ZmAMT1；3的氨基酸序列，包括488个氨基酸，在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占139个，亲水氨基酸占281个，碱性氨基酸占37个，酸性氨基酸占27个，该蛋白质的分子量为51.8KD，等电点为7.54。

为了使1)中的ZmAMT1；3便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述1)中的ZmAMT1；3蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的ZmAMT1；3衍生蛋白可人工合成，也可通过将序列表中序列2自5′末端第244-1710位碱基所示的DNA序列中缺失和/或增加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白的编码基因，命名为ZmAMT1；3，也属于本发明的保护范围之内。

上述编码基因是如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2自5’端第244-1710位所示的基因；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；

3)在高严谨条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因。

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列2由1974个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第244-1710位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的ZmAMT1；3蛋白，具有11个跨膜结构域。

上述高严谨条件为可用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因的表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

含有上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有ZmAMT1；3基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区，它们均具有上述类似功能。

使用ZmAMT1；3基因构建重组植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述重组表达载体的具体构建方法如下：是将上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因插入pPT-Hyg表达载体的多克隆位点之间构成的重组表达载体；该重组表达载体命名为pPT-ZmAMT1；3。

所述pPT-Hyg表达载体由本实验室自主构建，是将潮霉素抗性基因插入pPTKan表达载体的多克隆位点之间构成的载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，是将上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；该转基因植物对铵盐的吸收能力和/或生物量均高于上述目的植物。

本发明的方法中，上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因是通过上述重组表达载体pPT-ZmAMT1；3导入所述目的植物中的。该目的植物可以为双子叶植物或单子叶植物，如拟南芥或拟南芥不吸收铵突变体qko。

本发明的又一目的在于提供一种培育转基因酵母的方法。

本发明提供的培育转基因酵母的方法，是将上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因导入目的酵母中，得到转基因酵母；该转基因酵母对铵盐的吸收能力强于上述目的酵母。

上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因是通过重组载体导入所述目的酵母中的；所述重组载体的构建方法为：将上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因插入pDR195载体的多克隆位点之间构成的重组载体。该酵母可为酵母不吸铵突变体菌株31019b。

本发明利用同源克隆的策略，根据我们前期克隆的铵转运蛋白ZmAMT1；1序列(专利申请号：201010198912.6)在玉米基因组测序数据库(www.maizesequence.org)中进行同源比对，得到与其蛋白序列相似性达到86％的mRNA序列GRMZM2G028736_T01，命名为ZmAMT1；3(图1)。根据此序列信息，克隆得到玉米铵转运蛋白ZmAMT1；3的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。克隆得到的ZmAMT1；3ORF序列由1467个碱基组成，为序列表中自5′末端第244-1710位碱基，编码了含488个氨基酸的跨膜转运蛋白，其分子量51.8KD，等电点7.54，具有11个跨膜结构域。通过ZmAMT1；3基因在玉米响应铵供应后的定量和定性表达特性分析，证实该基因在玉米幼苗根表皮中高表达，且被铵诱导。进而用转基因技术将ZmAMT1；3基因ORF序列导入模式植物拟南芥4个铵转运蛋白基因(AtAMT1；1，AtAMT1；2，AtAMT1；3，AtAMT2；1)缺失的不吸铵突变体qko中，结果表明，ZmAMT1；3基因在拟南芥中的表达可以显著增强拟南芥的铵吸收能力。

本发明的ZmAMT1；3基因在酵母系统中具有铵吸收功能，即能够使酵母具有或提高酵母对铵盐的吸收能力。

本发明为农作物的铵高效吸收研究提供了更有特色的基因资源，在基因工程改良植物的营养高效性能研究中将发挥重要作用

附图说明

图1为ZmAMT1；3与ZmAMT1；1以及专利报道的拟南芥和小麦铵转运蛋白的序列同源性比对图。

图2为ZmAMT1；3基因的琼脂糖凝胶电泳结果。图中左侧泳道M是DNA分子量标准，泳道1是ZmAMT1；3基因的ORF序列的扩增结果，泳道2是阴性对照。

图3为植物过表达载体pPT-Hyg的构建流程。

图4为转ZmAMT1；3基因的拟南芥植株的RT-PCR转基因验证。qko为空载体对照拟南芥植株；13-1，13-15，和13-16为三个不同的独立转化转ZmAMT1；3基因的拟南芥株系。

图5为ZmAMT1；3蛋白对铵的吸收速度和亲和力测定结果图，图中qko为对照植株，qko+ZmAMT1；3为转基因ZmAMT1；3植株。

图6为转ZmAMT1；3基因的拟南芥对铵的吸收能力图。其中，A是琼脂培养体系中的植物表型图，左侧是在铵上的生长图，右侧是在硝酸盐上的生长图，设为负对照。图中qko+13-1，qko+13-15，和qko+13-16分别为三个转基因系，qko为对照植株。B是A图相应的植株地上部生物量统计结果图。结果表明在供应硝酸盐的情况下，三个转基因系(qko+13-1，qko+13-15，和qko+13-16)与qko对照植株相比没有明显的生长差异，但在供应铵盐的情况下，三个转基因系的地上部生物量都比对照qko大。

图7为ZmAMT1；3ORF转酵母不吸铵突变体酵母进行功能互补验证图。第一行为空载体pDR195的转基因酵母，设为对照；第二行为ZmAMT1；3转基因酵母。结果表明ZmAMT1；3在酵母系统中具有吸收铵的功能。

图8为荧光实时定量PCR分析ZmAMT1；3基因在玉米不同器官中的表达情况。结果表明ZmAMT1；3基因在玉米根中高表达。

图9为荧光实时定量PCR分析玉米根中ZmAMT1；3基因在缺氮和复供铵处理下的转录水平的表达变化情况。结果表明ZmAMT1；3基因受到铵处理的强烈诱导表达。

图10为原位杂交分析ZmAMT1；3基因在玉米根中的组织表达部位图。结果表明ZmAMT1；3基因在玉米根表皮和根尖细胞中表达。其中，A图为正义探针的杂交图，为负对照；B图为反义探针的杂交图。两图的左侧为根成熟区的纵切图，右侧为根成熟区的横切图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料的准备

1、菌株，工具质粒和植物材料

本发明实施例中所用到的材料包括：

1)大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌GV3101(均购自天根生化科技有限公司)；

2)pGEM-T easy载体购自Promega公司；

3)酵母表达载体pDR195和酵母不吸铵突变体菌株31019b从国外实验室免费获得(Javelle et al.，Molecular characterization of two ammonium transporters fromthe ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum，FEBS Lettetr 2001(505)：393-398)，公众可从中国农业大学获得)；

4)植物表达载体pPTKan和pCAMBIA1302从国外实验室免费获得(Sutter et al.，Selective Mobility and Sensitivity to SNAREs Is Exhibited by the ArabidopsisKAT1 K1 Channel at the Plasma Membrane，2006，Plant Cell 18：935-954)，公众可公众可从中国农业大学获得)；

5)玉米自交系B73是美国Iowa州立大学培育的用于玉米基因组测序的优良自交系，由Iowa州立大学的Schnable教授赠送(Schnable et al.，The B73Maize Genome：Complexity，Diversity，and Dynamics，Science 2009：1112-1114，公众可从中国农业大学获得)；

6)拟南芥不吸收铵突变体qko(4个铵转运蛋白基因AtAMT1；1，AtAMT1；2，AtAMT1；3，AtAMT2；1同时缺失的，丧失90％高亲和铵吸收能力的突变体)从国外实验室免费获得(Yuan et al.，The Organization of High-Affinity Ammonium Uptake inArabidopsis Roots Depends on the Spatial Arrangement and Biochemical Properties ofAMT 1-Type Transporters，The Plant Cell 2007：2636-2652，公众可从中国农业大学获得)。

2、工具酶及生化试剂

本发明实施例中使用的各种限制性内切酶购自Promega公司；各种Taq酶和Trizol RNA小量提取试剂盒购自Takara公司；dNTP混合物购自上海生工；M-MLV反转酶、T4DNA连接酶购自Promega公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、壮观霉素(Spe)、利福平(Rif)均购自欣经科公司；不含氮源的酵母生长培养基(YNB)购自Difco公司。

3、本发明实施例中使用的PCR扩增引物

P1-F：5′-CCGAGATGGCGACGTGCGCTACGAC-3′

P1-R：5′-CACTAGAACTCGCCGCTGGCCGCGT-3′

P2-F：5′-GCAGTTCGTGGCGTACCTCATC-3′

P2-R：5′-CACCATGTGGACAACGCTGGAC-3′

P3-F：5′-CTGGTTTCTACCGACTTCCTTG-3′

P3-R：5′-CGGCATACACAAGCAGCAAC-3′

P4-F：5′-GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3′

P4-R：5′-CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3′

Hyg-F：5′-ACAGGATCCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3′

Hyg-R：5′-ACAGGATCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3′

13T7-F：5′-TAATACGACTCACTATAGGATTCCTGGCGCTCAACAAGATG-3′

13T7-R：5′-TAATACGACTCACTATAGGACCTGCTGCTCAAGCTCAAGTCG-3′

以上引物均由北京奥科合成。

实施例1、转基因ZmAMT1；3植物的获得及检测分析

一、转基因ZmAMT1；3拟南芥的获得

1、ZmAMT1；3基因的获得

本发明利用同源克隆的策略，根据我们前期克隆的铵转运蛋白ZmAMT1；1序列(专利申请号：201010198912.6)在玉米基因组测序数据库(www.maizesequence.org)中进行同源比对，得到与其蛋白序列相似性达到86％的mRNA序列GRMZM2G028736_T01，为序列表2中的第1-1974位碱基，命名为ZmAMT1；3(图1所示)。

图1为ZmAMT1；3进化树分析，由进化树可知玉米ZmAMT1；3基因属于AMT1亚家族成员，与模式植物拟南芥的AMT1亚家族成员和玉米ZmAMT1；1的同源性达到74％以上，其中与ZmAMT1；1的同源性最高，达到86％。

本发明根据玉米ZmAMT1；3mRNA序列，设计基因特异引物P1-F(P1-F：5′-CCGAGATGGCGACGTGCGCTACGAC-3′)和P1-R(P1-R：5′-CACTAGAACTCGCCGCTGGCCGCGT-3′)(其中P1-F包含翻译起始密码子ATG，P1-R包含翻译终止密码子TGA)，以玉米自交系B73的根来源的cDNA为模板，PCR扩增获得玉米铵转运蛋白ZmAMT1；3的编码序列。测序结果表明扩增得到的序列包含序列表中序列2的自5′末端第239-1712位碱基，其中ZmAMT1；3基因的开放阅读框(ORF)为序列2的自5′末端第244-1710位碱基，由1467个碱基组成，编码了488个氨基酸的跨膜转运蛋白，其编码蛋白的分子量为51.8KD，等电点7.54，具有11个跨膜结构域。其具体步骤如下：

1)总RNA的提取

将玉米自交系B73(Schnable et al.，The B73Maize Genome：Complexity，Diversity，and Dynamics，Science 2009：1112-1114)在润湿的滤纸上发芽，一周后收集幼苗根，用TRIzol总RNA提取试剂盒(Takara公司)提取总RNA，按照试剂盒说明操作。具体步骤如下：

取100mg新鲜玉米根系组织，在液氮中研磨；加入1ml试剂盒提供的TRIzol提取液，室温震荡5分钟；再加入200μl三氯甲烷，震荡15秒，4℃、12000转离心15分钟；取上清，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟，4℃、12000转离心10分钟；取沉淀，加入1ml 75％乙醇，震荡1分钟，4℃、7500转离心5分钟；吸弃上清，沉淀置通风橱中吹干，加入30μlDEPC水溶解沉淀。1％琼脂糖电泳检测RNA质量，同时用分光光度计测定RNA浓度，获得提取的总RNA。

2)cDNA的获得

取2μg上述步骤1)中获得的玉米根总RNA进行反转，反转录体系各组分按M-MLV反转录酶(Promega公司)的使用说明添加。

具体步骤如下：取总RNA 2μg，oligo d(T)₁₈ 1μg，DEPC水加至15μl，70℃温浴5分钟，立即在冰上冷却2分钟，再加入M-MLV buffer 5μl，dNTP(10mM)1.25μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.6μl，MLV反转录酶1μl，DEPC水补至25μl，42℃反应60分钟，获得cDNA。

3)、玉米ZmAMT1；3基因的PCR扩增

根据玉米ZmAMT1；3基因mRNA序列，设计基因特异性引物P1-F(P1-F：5′-CCGAGATGGCGACGTGCGCTACGAC-3′)和P1-R(P1-R：5′-CACTAGAACTCGCCGCTGGCCGCGT-3′)，以上述步骤2)中获得的cDNA为模板，用Pfu高保真酶(Promega公司)扩增玉米ZmAMT1；3的ORF序列，扩增反应如下：

试剂               用量

总RNA反转录cDNA    1.0μl

2×GC Buffer II    25.0μl

P1-F(10μM)        1.0μl

P1-R(10μM)        1.0μl

dNTP mix(10mM each)1.0μl

pfu酶(5U/μl)      0.5μl

补H₂O至                           50μl

PCR反应条件：94℃预变性4分钟；然后94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，30个循环；之后加入1μlTaq酶，72℃延伸和加尾20分钟。

取10μl PCR产物，于1.0％琼脂糖凝胶上电泳检测，检测结果如图2所示，回收目的条带，回收产物连接于pGEM-T easy载体(Promega公司)上，构成的载体名名为T-ZmAMT1；3，转化大肠杆菌DH5α(均购自天根生化科技有限公司)感受态细胞，提取质粒并测序验证。测序结果表明，所获得的序列是序列表中序列2的自5′末端第239-1712位碱基的序列，其中5′末端第244-1710位碱基为ZmAMT1；3基因的开放阅读框(ORF)，共1467bp，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID 1所示，编码了488个氨基酸的跨膜转运蛋白，其分子量51.8KD，等电点7.54，具有11个跨膜结构域。玉米ZmAMT1；3基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID 2所示。

2、重组载体的获得

1)过表达载体pPT-Hyg的构建

利用引物Hyg-F和Hyg-R，用Pfu高保真酶，以pCAMBIA1302载体为模板扩增潮霉素抗性基因Hygromycin B phosphotransferase的ORF序列，PCR反应条件：94℃预变性4分钟；然后94℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟，25个循环。由于在引物Hyg-F和Hyg-R中加入了BamH I酶切位点，PCR扩增产物经BamHI酶切后，连入同样经BamH I酶切后的植物表达载体pPTKan，经酶切和测序鉴定挑取Hygromycin抗性基因以正确方向连入的克隆，构建得到含潮霉素抗性筛选标记的植物过表达载体pPT-Hyg(图3)。

2)重组表达载体pPT-ZmAMT1；3的构建

使用Not I酶切上述实施例1中的重组载体T-ZmAMT1；3，电泳回收ZmAMT1；3片段，连入pPT-Hyg载体的Apa I酶切位点处(Apa I与Not I是同尾酶)，得到重组表达载体，命名为pPT-ZmAMT1；3，此载体可以使ZmAMT1；3基因在35S启动子下组成型表达，并且携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。

3、得到转基因ZmAMT1；3植物

1)转化农杆菌感受态细胞

取200μl农杆菌GV3101感受态细胞(购自天根生化科技有限公司)，加入1μg上述步骤2中步骤2)获得的pPT-ZmAMT1；3质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1ml YEB培养基，28℃慢速振荡培养4小时；1000rpm离心30秒，弃上清，重悬于0.1ml YEB培养基中，涂布于含有100μg/ml潮霉素和125μg/ml利福平的YEB平板上，28℃培养48小时。

2)转化农杆菌阳性克隆的PCR鉴定

挑取上述步骤1)中平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液中(含100μg/ml卡那霉素和125μg/ml利福平，卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)均购自欣经科公司)，28℃培养过夜。以菌液为模板，用引物P1-F和P1-R进行PCR扩增鉴定阳性重组农杆菌(能扩增出约1500bp条带的菌液为阳性重组菌)。

3)转化目的植物拟南芥

用上述步骤2)中鉴定得到的含有重组表达载体pPT-ZmAMT1；3的阳性重组农杆菌转化拟南芥不吸收铵突变体qko。具体方法：取上述步骤2)中已经鉴定为阳性的农杆菌菌液0.5ml接种于500ml YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD₆₀₀到0.5。5000rpm 4℃离心15分钟收集菌体。用200ml的渗入缓冲液(1×MS大量元素，5％蔗糖)重悬菌体，加silwet L-77(购自GE公司，货号：S5505)至终浓度0.2‰。上述1×MS大量元素含有1.65g/L NH₄NO₃，1.9g/L KNO₃，0.44g CaCl₂.2H₂O，0.37g/L MgSO₄.7H₂O和0.17g/L KH₂PO₄。将抽苔后刚刚开花的拟南芥qko的花浸于重悬液中侵染10秒。用保鲜袋包裹植株，避光16℃下放置24小时，然后正常生长。

4)筛选转基因阳性植株

由于转入pPT-ZmAMT1；3载体的拟南芥植株具有潮霉素抗性，所以上述步骤3)中进行转化实验的植株，转化成功的在含有潮霉素的MS固体培养基上可以正常生长，而未转入该基因的野生型种子不能正常生长并死亡。

筛选上述步骤3)中转基因阳性植株过程为：转化当代转基因植株为T0代，由该T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。混合收集T1代种子，播种于含50μg/ml潮霉素的MS固体培养基上，筛选能正常生长的植株移栽于盆内继续生长，单株收种。T2代种子再经过1次潮霉素抗性筛选后单株收获T3代种子。同样再经过一次抗性筛选，所有个体都能生长的为转pPT-ZmAMT1；3的纯合体植株，即为转基因阳性植株(转基因拟南芥)，将其留下备用。

5)转基因拟南芥的PCR检测

分别提取上述步骤4)中T3代转pPT-ZmAMT1；3基因拟南芥纯合植株的总RNA，在oligo(dT)引导下反转录成第一链cDNA，以P1-F和P1-R为引物进行RT-PCR，检测转基因拟南芥中ZmAMT1；3基因的表达水平。结果如图4所示，获得的13-1，13-15和13-16为转pPT-ZmAMT1；3基因的3个独立转化株系，即为得到的转基因ZmAMT1；3植物。

二、转基因ZmAMT1；3植物的检测分析

1、转基因植株增强铵吸收能力的鉴定

为了鉴定转ZmAMT1；3基因的拟南芥植株的铵吸收能力，水培上述步骤一中获得的3个独立转化系(13-1，13-15和13-16)的拟南芥、对照qko拟南芥以及空载体对照植株(空载体对照：按照获得ZmAMT1；3过量表达株系的方法，将pPT-Hyg载体导入拟南芥qko突变体植株中，获得的转pPT-Hyg载体的拟南芥)，将上述进入莲座期的T3代拟南芥植株转入缺氮培养液(成分K₂SO₄ 0.5mM，MgSO₄.7H₂O 0.6mM，KH₂PO4 0.1mM，CaCl₂.2H₂O 0.5mM，H₃BO₃ 1μM，MnSO₄.H₂O 0.5μM，ZnSO₄.7H₂O 0.5μM，CuSO₄.5H₂O 0.2μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.07μM，NaFe-EDTA 0.1mM，NH₄NO₃0mM，pH为5.7)进行4天缺氮处理，之后收样进行铵吸收速率测定，方法如下：

收样时，植物根先在CaSO₄中浸泡1分钟洗去根表吸附的培养基，然后转入已加入带¹⁵N标记的(¹⁵NH₄)₂SO₄(¹⁵NH₄ ⁺标记浓度分别设为：0，25，50，75，100，150，200，300，400和500μM)的缺氮营养液(成分同上述培养用的缺氮培养液)中浸泡6分钟(即吸收6分钟时间)，再转入CaSO₄中洗涤1分钟。用吸水纸快速吸干根系表面水，装入预先写好编号的纸袋中。同样方法做不加¹⁵N标记氮源的吸收做本底对照。将纸带敞开口放入冷冻干燥器干至恒重。用球磨机(型号Retsch MM400)磨样。每个样品称取1.5-2.0mg，锡杯包裹，放入元素分析仪(Thermo公司，型号DELTAPLUS XP)测定¹⁵N含量，根据¹⁵N含量计算出吸入的铵的摩尔数，然后除以吸收时间6分钟和样品干重，即得出单位根单位时间内的铵吸收速率。最后以¹⁵NH₄ ⁺的浓度为横坐标，对应的吸收速率为纵坐标绘制吸收动力学曲线，并并根据米式方程得到吸收动力学参数Vmax和Km。

结果如图5(由于空载体对照和对照qko拟南芥的表型基本一致，因此图5中只给出了对照qko拟南芥的结果)所示，转入ZmAMT1；3基因的拟南芥铵吸收能力明显提高，在低铵浓度(0-500μM，高亲和力铵吸收范围)下，其吸收动力学曲线呈现饱和趋势，最大吸收速率Vmax＝264.93±31.28mmol h^-1g^-1；亲和力Km＝51.31±21.63mM。而对照qko和空载体对照植株在低铵浓度(0-500μM，高亲和力铵吸收范围)下，其吸收动力学曲线呈也呈饱和趋势，但最大吸收速率仅有Vmax＝97.90±18.07mmol h^-1g^-1；亲和力Km＝90.51±47.15mM。这说明ZmAMT1；3是一个高亲和力的铵盐吸收相关蛋白。导入外源ZmAMT1；3基因能够显著增强拟南芥的高亲和力铵吸收能力。

2、转ZmAMT1；3基因植株的生物量提高的鉴定

上述步骤1的鉴定可知，转入ZmAMT1；3基因可以明显提高拟南芥qko的铵吸收能力，为了进一步研究提高铵吸收能力后是否能改善植株氮营养状况，又取上述步骤一中获得的转入ZmAMT1；3转基因拟南芥T3代纯合体(13-1，13-15和13-16)、对照qko和空载体对照植株的种子，在无氮源的1/2MS(组成：KH₂PO₄ 0.625mM，MgSO₄.7H₂O0.75mM，CaCl₂ 1.5mM，MnSO₄·H₂O 50μM，H₃BO₃ 50μM，KI 2.5μM，ZnSO₄·7H₂O 15μM，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5μM，CuSO₄·5H₂O 0.05μM，CoCl₂·6H₂O 0.05μM，Fe-EDTA 50μM)外加5mM KNO₃的固体培养基上预培养7天，再移到1/2MS加500μM NH₄ ⁺或NO₃ ^-的固体培养基上，继续生长10天后，用剪刀在拟南芥茎基部(茎根连接处)剪一刀，取地上部到万分之一天平上直接称鲜重，即为地上部生物量。

结果如图6A和6B(由于空载体对照和对照qko拟南芥的表型基本一致，因此图6中只给出了对照qko拟南芥的结果)所示，在500μM NO₃ ^-为唯一氮源条件下，拟南芥qko和空载体对照植株与各转基因系长势和地上部生物量无差异。而在500μM NH₄ ⁺为唯一氮源条件下，各转基因系长势和地上部生物量显著高于拟南芥qko和空载体对照植株。这些结果说明了ZmAMT1；3基因转入拟南芥qko可以提高转基因植株的吸铵能力，从而增强植株在有铵态氮源的环境中的氮利用能力。

综上，本发明的表达外源玉米ZmAMT1；3基因在拟南芥中可以提高拟南芥对铵的吸收能力，从而增强拟南芥在铵营养上的生长。

实施例2、转ZmAMT1；3基因酵母菌的获得及其检测分析

一、获得转ZmAMT1；3基因酵母菌

1、ZmAMT1；3基因的获得

由于pGEM T-Easy载体的两端含有Not I酶切位点，因此选用NotI酶，将ZmAMT1；3基因从上述实施例1中步骤1中获得的T-ZmAMT1；3载体上切下来，电泳回收，得到目的基因ZmAMT1；3，测序结果表明，回收片段包含有序列表中序列2的自5′末端第239-1712位碱基，其中包括ZmAMT1；3基因的开放阅读框，为序列2的自5′末端第244-1710位碱基。

2、酵母感受态细胞制备

(1)挑取-80℃保存的酵母不吸铵突变体菌株31019b，涂布在YPD固体培养基(1％酵母提取液，2％蛋白胨，2％葡萄糖)上，30℃培养2天，然后挑单斑入20ml YPD液体培养基中，30℃230rpm振荡培养2天至饱和；

(2)将步骤(1)中得到的菌液转接入75ml液体YPD培养基中至终浓度OD₆₀₀＝0.1；接着30℃230rpm振荡培养5-10小时，至OD₆₀₀＝0.5-0.8；再取50ml菌液，4500rpm常温离心5分钟收集菌体；然后加50ml无菌水洗菌体，4500rpm常温离心5分钟收集菌体；重悬到45ml无菌水中，加入5ml 10×LiAc-TE溶液(1M LiAc，100mM Tris-Cl，20mM EDTA，pH7.5，灭菌)；4500rpm常温离心5分钟，弃大部分上清，留200μl上清，并将菌体重悬起来，获得酵母感受态细胞菌液。

3、转化酵母感受态细胞

将上述步骤1中回收得到的ZmAMT1；3基因连入pDR195载体上的Not I酶切位点处，经测序选取正向连入的表达载体，命名为pDR-ZmAMT1；3，通过PEG介导的酵母转化方法转入酵母不吸铵突变体菌株31019b中。

PEG介导的酵母转化方法的具体步骤如下：

取上述步骤2中每20μl菌液中加入20μg新变性的鲑鱼精DNA，70μl 50％PEG4000，8μl 10×LiAc-TE，1μl质粒DNA(重组载体pDR-ZmAMT1；3或对照载体pDR195)，混匀；然后在PCR仪上进行如下循环：28℃30分钟，42℃13分钟，28℃保存；以获得转化的酵母感受态细胞。

二、检测鉴定

将上述步骤一中转化的酵母感受态细胞和转空载体pDR195的酵母(设为对照)分别涂布在含1mM氯化铵的YNB培养基上，进行功能互补实验验证。

具体步骤为：将上述步骤一中转化的酵母感受态细胞和转空载体pDR195的酵母分别涂布在含1mM精氨酸的YNB固体培养基上，2天后挑取单斑接种到5ml含1mM精氨酸的YNB液体培养基中，震荡培养至OD₆₀₀＝1到1.5之间，然后依次稀释到OD₆₀₀＝1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，取出其中的5ul点到含1mM氯化铵的YNB固体培养基上。培养3-7天后观察酵母生长情况。

实验结果如图7所示，第一行为转空载体pDR195的酵母生长图，设为对照；第二行为转玉米ZmAMT1；3基因(pDR195-ZmAMT1；3)的酵母生长图。5个不同列表示菌液浓度由高到底分别为OD₆₀₀＝1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4。从图中可以看出转了ZmAMT1；3的酵母突变体可以利用1mM的氯化铵作为唯一氮源生长，说明获得的ZmAMT1；3基因在酵母系统中具有铵吸收功能。

实施例3、玉米ZmAMT1；3基因的表达特性分析

一、ZmAMT1；3基因的在植物器官中的表达特性

选用玉米自交系B73，分别提取大田生长的玉米苗期根部、苗期地上部、授粉前新叶、授粉前老叶、授粉前穗位叶、授粉前雌穗、授粉前雄穗、授粉后15天新叶、授粉后15天老叶、授粉后15天穗位叶、授粉后15天穗轴、授粉后15天籽粒样品，提取总RNA。所得总RNA经过DNase I酶去除总RNA中的DNA污染后，用M-MLV反转录酶和oligo d(T)₁₈反转录成cDNA第一链。利用Real-time PCR的方法(方法附后)，以引物P2-F和P2-R扩增玉米ZmAMT1；3基因，以P3-F和P3-R扩增玉米GAPDH基因作为内参对照，用同一样品中的ZmAMT1；3基因的表达量除以GAPDH基因的表达量作为ZmAMT1；3基因的相对表达量，研究ZmAMT1；3基因在玉米不同组织部位中表达特性。结果如图8所示，表明玉米ZmAMT1；3基因主要在玉米根部表达。

二、ZmAMT1；3基因在玉米根中受氮素处理的表达特性

水培玉米自交系B73幼苗，用Hoagland营养液(成分为K₂SO₄ 0.5mM，MgSO₄.7H₂O0.6mM，KH₂PO4 0.1mM，CaCl₂.2H₂O 0.5mM，NH₄NO₃ 2mM，H₃BO₃ 1μM，MnSO₄.H₂O 0.5μM，ZnSO₄.7H₂O 0.5μM，CuSO₄.5H₂O 0.2μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.07μM，NaFe-EDTA 0.1mMpH为5.7)培养，每2天换一次营养液。生长到三叶期时(萌发后20天)，移入不含硝酸铵的Hoagland营养液中进行缺氮4天的预处理，然后分别转入含4mM硝酸钾(KNO₃)和2mM(NH₄)₂SO₄中进行处理，培养0、1、3、6、12、24小时后收取根。一部分根用于测定铵吸收速率，另一部分根用于提取总RNA，各自以oligo(dT)为引物反转录获cDNA第一链，用引物P2-F和P2-R进行Real-Time PCR检测ZmAMT1；3基因的表达量。同时，以同样的体系，以P4-F和P4-R为引物扩增玉米看家基因ZmTub1为内参对照。以同一个样品中的ZmAMT1；3基因的表达量除以ZmTub1基因的表达量作为ZmAMT1；3基因的相对表达量。

结果如图9所示，在玉米根中，缺氮4天的玉米根系恢复供硝酸钾后，ZmAMT1；3基因的表达变化也不明显。但是恢复供硫酸铵1小时后，ZmAMT1；3基因的表达活性明显诱导提高，加铵3小时后的铵吸收速率基本上达到最高峰，比对照提高30多倍。总之，Real-Time PCR结果表明在玉米根中，ZmAMT1；3基因的表达水平被供铵强烈诱导表达。

上述Real-Time PCR操作的具体步骤如下：

1)提取不同处理样品根中的总RNA(方法同实施例1中总RNA的提取方法一致)；

2)取上述步骤1)中获得的总RNA 50μg，用DNase I去除基因组DNA，方法如下：

反应体系(50μl)：

总RNA                 50μg

10×DNase I反应缓冲液 5μl

DNase I(5u/μl)       2μl

DEPC水                至终体积50μl

37℃反应30分钟；

加入150μl DEPC水，加入200μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀；

4℃，12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加入200μl氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀；

4℃12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加20μl的3M NaAc(pH5.2)，加500μl预冷无水乙醇，-20℃放置60分钟；

4℃，12000rpm离心15分钟，回收沉淀，70％预冷乙醇洗沉淀2次；每次4℃，7500rpm离心5分钟；

吹干，DEPC水重溶。

3)常规方法反转录合成cDNA第一链(方法同实施例1中cDNA第一链的合成方法)。

4)Real-time PCR检测基因丰度，本实施例中试剂选用TOYOBO公司的SYBR GreenRealtime PCR Master Mix(目录号91620F3)，定量PCR仪器型号为ABI7500，反转产物稀释10倍作为Real-time PCR模板，反应体系：

SYBR Mix：13μl

Primer1：1μl

Primer2：1μl

灭菌水加至25μl；

PCR反应程序：50℃2分钟，95℃10分钟，45个循环(95℃15秒，61℃30秒，72℃1分钟)；

融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环。

三、ZmAMT1；3基因被铵诱导后在根中的组织表达部位

采用原位杂交方法分析玉米ZmAMT1；3基因被铵诱导后在根中的组织表达部位。通过上述步骤一和步骤二的器官特异性表达分析和氮处理分析发现ZmAMT1；3基因在玉米根中表达，而且铵诱导后3-12个小时之间表达丰度最高，因此原位杂交分析ZmAMT1；3组织表达特性中的选用铵处理6小时的玉米根为材料。

上述原位杂交方法的具体步骤如下：

1)植物材料的准备

水培玉米自交系B73，三叶期玉米幼苗先缺氮处理4天，然后重新供2mM(NH₄)₂SO₄12小时后取样。迅速剪取不同根段放入FAA固定液中(每100ml固定液含：50％乙醇90ml，冰醋酸5ml，甲醛5ml)；然后进行植物材料脱水、透明、浸蜡，方法如下：

弃去FAA固定液，DEPC水洗两次；

50％乙醇，50％乙醇+10％叔丁醇，50％乙醇+20％叔丁醇，50％乙醇+35％叔丁醇，50％乙醇+50％叔丁醇，25％乙醇+75％叔丁醇，25％乙醇+75％叔丁醇+0.1％伊红Y，100％叔丁醇依次各处理2小时；

转入2/3叔丁醇+1/3石蜡油中放置4小时；

倒出1/3叔丁醇石蜡油混合液，补充同体积60℃融化的石蜡于上层，形成凝固的蜡盖，60℃放置12小时，(重复3次)；

倒出全部液体，加入纯的融化石蜡，60℃，8小时，(重复2次)；

然后在65℃烫板上包埋。

2)探针的合成和纯化

在准备植物材料的同时进行RNA探针合成，参考Takara公司的T7-RNA polymerase(目录号：P2075)的使用方法，简述如下：

合成含T7启动子和ZmAMT1；3部分序列的正向引物13T7-F和反向引物13T7-R。分别以13T7-F或13T7-R为引物，用pfu酶从T-AMT1；3质粒上扩增出含有T7启动子的DNA模板，体外转录成RNA反义或正义探针，反应体系如下：

质粒DNA模板：                8.5μl

10×DIG Labeling Mix：       2.5μl

5×Transcriptional Buffer：  4μl

DTT(100mM)：                 2μl

T7-RNA polymerase(19u/μl)： 3μl

共20μl，混匀，在37℃反应2小时；

再加入4μl DNase I(TaKaRa公司，目录号D2215)37℃反应15分钟去除DNA；

反应结束后放置冰上，加0.8μl 0.5M EDTA(pH＝8.0)终止反应；

加入2μl 5M LiCl，75μl无水乙醇(-20℃预冷)，混匀后放置于-20℃2小时；

13000rpm，4℃离心15分钟；

弃去上清，加入50μl70％预冷的乙醇洗涤沉淀，13000rpm 4℃离心5分钟；

弃去上清，吹干沉淀；

加24μlDEPC-H₂O溶解，-70℃保存备用。

3)探针浓度检测

剪下一块膜，在膜上用铅笔画格，然后按一定比例用RNA稀释缓冲液(DEPC水∶20XSSC∶37％甲醛混合液，按5∶3∶2体积比混合而成)稀释合成的RNA探针，小心点到膜上格子内，点样后，在超净台中吹干，然后80℃烘箱中烤膜2小时；

将膜装入杂交袋中，洗膜液(100mM顺丁烯二酸，150mM NaCl pH7.5，0.3％(V/V)土温20)中浸泡10分钟；

在10ml封闭液(100mM顺丁烯二酸，150mM NaCl pH7.5，1/10体积试剂盒提供的10X Blocking solution)中室温摇30分钟；

在10ml抗体溶液(试剂盒提供的Anti-DIG-AP按1∶10000用封闭液稀释)中室温摇30分钟；

在10ml洗膜液中洗膜两次，每次15分钟；

在10ml显色缓冲液(100mM Tris-HCl pH9.5，100mM NaCl，50mM MgCl₂)中平衡5分钟；

膜样品面朝上放置于滤纸上，加入2ml显色液(现配先用，2ml显色缓冲液中加入20μl试剂盒提供的NBT/BCIP)，静止显色，不时观察，蓝色斑点清晰后，倒掉显色液，无菌水洗2-3次，每次5分钟，晾干后，照相或夹在滤纸中保存于4℃。

4)制片：

包埋好的腊块，用上海红宇QP-4型切片机切出8-10μm片子。截取合适位置的蜡带(含有植物样品)粘在多聚赖氨酸的载片(Sigma公司，目录号P0425-72EA)上，将蜡带放入DEPC水中45℃烤片台上展片，展片充分后吸去多余的水，40℃烘箱中烤片24-48小时，使切片充分干燥。

切片脱蜡：片子在二甲苯中洗3次各5分钟，无水乙醇2次各2分钟，95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇依次各1分钟，DEPC水洗2次，每次1分钟。

蛋白酶K处理：在一个染色缸中加入蛋白酶K反应缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5，50mM EDTA)和蛋白酶K至终浓度1μg/ml，放入预处理好的片子，37℃保温20分钟；

用DEPC水洗载玻片2次，每次1分钟；

乙酰化处理：将载玻片置于染色缸中，加入40ml溶有100μl乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺溶液(pH＝8.0)，室温放置10分钟；倒掉溶液，2×SSC溶液洗涤两次，每次7分钟；

在室温下，依次用不同稀释度的乙醇水溶液(30％，50％，70％，85％和95％)洗涤片子，每级1分钟，使组织切片脱水。然后用新的无水乙醇洗2次，每次2分钟。室温晾干。

5)杂交

杂交液组成：每张片子用200μl杂交液，包含：100μl去离子甲酰胺，20μl10×杂交缓冲液(100mM Tris pH 7.5，10mM EDTA，3M NaCl)，24μl50％硫酸葡聚糖，20μl 10×Blocking Solution，250μg鲑鱼精DNA，5μl探针，36.5μl 50×Denhardt’s溶液。避光杂交16-30小时。

冲洗：片子浸入2×SSC中使盖片脱落，然后室温放置30分钟；换新的2×SSC，65℃1小时；0.1×SSC，65℃1小时。

封闭：用吸水纸擦干载玻片背面，放在湿盒中，每片加2ml 1％封闭液(每400毫了含有Boehringer Block reagent 2g，0.1M Tris-HCl，pH＝7.5；和0.15MNaCl)，室温放置1小时。

平衡：去掉封闭液，每片加1ml洗片液(100mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.3％Triton X-100，1％BSA)平衡15分钟。

抗体吸附：去掉平衡液，加入400μl抗体溶液(每400μl抗体溶液含：399μl洗片液，1.32μl试剂盒提供的Anti-DIG-AP)，室温杂交2小时或4℃过夜。

洗片：玻片在洗片液中洗3次，每次10分钟。

显色前平衡：在显色缓冲液中浸5分钟(1ml显色缓冲液配方：100μl1M Tris-HClpH9.5，20μl 5M NaCl，860μl ddH₂O，0.1g聚己烯醇)。

显色：显色缓冲液中加入20μl NBT/BCIP，每片滴加200-500μl显色液，湿盒中室温黑暗处显色0.5-4h，当镜检时阳性信号为浅红或红棕色，而背景无明显色时即可停止反应，用水冲洗3次，每次5分钟。经中性树胶封片后，红棕色的阳性信号变为蓝色或蓝紫色。

结果如图10所示，A为正义探针杂交图，作为负对照；B为反义探针杂交结果，两图的左侧为根尖纵切图，右侧是根尖成熟区横切图。结果表明ZmAMT1；3主要在玉米根部的表皮组织中表达，这与其介导根从环境吸收铵盐的生物学功能是一致的。

Claims (5)

1.一种培育转基因酵母的方法，是将序列表中序列1所示蛋白的编码基因导入目的酵母中，得到转基因酵母；所述转基因酵母对铵盐的吸收能力强于所述目的酵母。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1）或2）所示：

1）其编码序列是序列表中序列2自5’端第244-1710位所示的基因；

2）其核苷酸序列是序列表中的序列2。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组载体导入所述目的酵母中的；所述重组载体的构建方法为：将所述基因插入pDR195载体的多克隆位点之间构成的重组载体。

4.一种培育转基因植物的方法，是将序列表中序列1所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物对铵盐的吸收能力和/或生物量均高于所述目的植物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1）或2）所示：

1）其编码序列是序列表中序列2自5’端第244-1710位所示的基因；

2）其核苷酸序列是序列表中的序列2。

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