CN101845088A - 与铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米来源的与植物根系铵盐吸收相关的蛋白ZmAMT1；1及其编码基因与应用。该蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与玉米铵盐吸收相关的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白的编码基因ZmAMT1；1在拟南芥中的表达可以显著增强拟南芥的铵盐吸收能力。本发明为农作物的铵盐高效吸收研究提供了更有特色的基因资源，在基因工程改良植物的营养高效性能研究中将发挥重要作用。

Description

与铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中的一种蛋白质及其编码基因与应用，特别涉及与铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

氮素是植物必须的矿质营养元素之一，是合成蛋白质、核酸和许多生物活性物质的必需组分。氮素缺乏通常导致植物生长迟缓，成熟叶片失绿并伴随着花青素的积累(Diaz et al.，2006，Plant Cell Physiology 47：74-83)。氮肥在农业生产中的大量使用极大地提高了作物产量。当前全球每年施用大约8～9千万吨氮肥，经预测到2050年可增加至2.4亿吨(Ti lman et al.，1999，Proc Natl Acad Sci USA96：5995-6000)。能源费用的提高导致了氮肥价格的不断上涨，从而增加了农业生产成本，同时氮肥的流失也在逐步恶化生态环境。基于经济效益和环境保护的双重考虑，在现代农业生产中种植氮高效作物品种已日益重要。

玉米是重要的饲料、经济及生物能源作物，其在国际范围内的需求量与日俱增。在我国玉米生产中，氮肥的施用量过高，但利用率低是普遍存在的现象(Ju et al.，2009，Proc Natl Acad Sci USA，106：3041-3046)。由于氮肥的大量施用，随之也带来了环境问题(张维理等，1995，植物营养与肥料学报1(2)：80-87)。种植氮高效的玉米品种，是解决氮肥利用率低，降低生产成本，减小环境污染的有效途径，也是农业可持续发展和增强产品国际竞争力的基本要求。传统选育新品种是个非常长期的过程，现如今基因工程，特别是玉米转基因技术的成熟，使得我们有可能通过基因工程的手段快速获得氮高效品种。能否快速有效地获得转基因氮高效新品种在很大程度上取决于良好的功能基因。

大量研究表明，在适度低氮供应条件下，玉米氮高效的主要限制因子是氮素吸收能力(Bohme，et al.，2002，Isotopes in Environmental Health Studies 38：95-102；春亮等，2005，植物营养与肥料学报11(5)：615-619)。植物氮素吸收系统主要分为硝酸盐转运蛋白介导的硝酸盐吸收系统和铵转运蛋白介导的铵盐吸收系统，另外还有很少部分可能通过尿素转运蛋白吸收。生理学研究结果表明植物根内存在两种不同的氮素吸收系统：高亲和(high-affinity transport system，HATS)和低亲和氮素转运系统(low-affinity transport system，LATS)(Wang et al.，1993，Plant Physiology103：1259-1267；Kronzucker et al.，1996，Plant Physiology 110：773-779)。当生长介质浓度较低时，根系吸收铵/硝依赖于高亲和系统，具有饱和动力学特征(Km值通常低于100μM)。低亲和系统则在生长介质浓度达到毫摩尔范围才起主要作用。铵盐的浓度在土壤中通常很低(不超过50μM)，所以土壤中铵盐的吸收主要依赖高亲和系统。

发明内容

本发明的一个目的是提供与铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与铵盐吸收相关的蛋白，名称为ZmAMT1；1，来源于玉米属的玉米(Zea mays L.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与玉米铵盐吸收相关的由(a)衍生的蛋白质。

上述(a)中的ZmAMT1；1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的ZmAMT1；1衍生蛋白可人工合成，也可通过将序列表中序列2自5′末端第78-1574位碱基所示的DNA序列中缺失和/或增加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到编码基因，再进行生物表达得到。

与铵盐吸收相关蛋白的编码基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列2；

2)其编码序列是序列表中序列2自5′端第78-1574位所示；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列2由2020个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第78-1574位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的ZmAMT1；1蛋白。

上述严格条件为可用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有ZmAMT1；1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区，它们均具有上述类似功能。

使用ZmAMT1；1基因构建重组植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在pPT-HYG载体的多克隆位点间插入上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

本发明的又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将上述与铵盐吸收相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，对铵盐的吸收能力增强，和/或地上部分的生物量提高。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体可为拟南芥。

本发明从重要粮食作物玉米中获得了与铵盐吸收相关的蛋白ZmAMT1；1及其编码基因ZmAMT1；1基因。通过ZmAMT1；1基因在玉米响应铵供应后的定量和定性表达特性，证实该基因在玉米幼苗根表皮中表达，且被铵诱导。进而用转基因技术将ZmAMT1；1基因导入模式植物拟南芥4个铵转运蛋白基因(AtAMT1；1，AtAMT1；2，AtAMT1；3，AtAMT2；1)缺失的不吸铵突变体中，结果表明，ZmAMT1；1基因在拟南芥中的表达可以显著增强拟南芥的铵盐吸收能力。本发明为农作物的铵盐高效吸收研究提供了更有特色的基因资源，在基因工程改良植物的营养高效性能研究中将发挥重要作用。

附图说明

图1为cDNA文库筛选及其ZmAMT；1基因的获得。

其中，A为在酵母不吸铵突变体中筛选玉米根cDNA文库的筛选结果示范图，箭头所示是在含1mM NH₄Cl上能够生长的转基因酵母阳性克隆；B为根据酵母筛选获得的ZmAMT1；1序列，设计基因特异性引物P1-F和P1-R，以cDNA为模板扩增获得ZmAMT1；1的开放阅读框(ORF)，最左侧泳道M是DNA分子量标准，右侧两个泳道1和2是从不同的cDNA样品中扩增的结果。

图2为ZmAMT1；1开放阅读框(ORF)转酵母不吸铵突变体进行功能互补验证图。第一行为空载体pDR195的转基因酵母，设为对照；第二行为ZmAMT1；1转基因酵母。结果表明ZmAMT1；1在酵母系统中具有吸收铵的功能。

图3为荧光实时定量PCR(qPCR)分析玉米根中ZmAMT1；1基因在缺氮和复供铵处理下的转录水平的表达变化情况，以及相对应的铵吸收速率。

图4为原位杂交分析ZmAMT1；1基因在玉米根中的组织表达部位图。

其中，A图为正义探针的杂交图，为负对照；B图为反义探针的杂交图。两图的左侧为根成熟区的纵切图，右侧为根成熟区的横切图。

图5为转ZmAMT1；1基因的拟南芥植株的RT-PCR转基因验证。1-7为不同的独立转化株系。

图6为ZmAMT1；1蛋白对铵的吸收速度和亲和力测定结果图。

图7为转ZmAMT1；1基因的拟南芥对铵的吸收能力图。

其中，A、B是琼脂培养体系中的植物表型图，C、D是相应的植株地上部生物量统计结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、玉米铵转运蛋白基因ZmAMT1；1的克隆

一、玉米cDNA文库的构建

提取玉米自交系B73(Schnable et al.，Science 2009：1112-1114；公众可从中国农业大学获得)苗期根RNA，构建cDNA文库。总RNA提取步骤、mRNA纯化步骤和cDNA文库构建步骤均按照各自试剂盒附带的说明书提供的方法操作。步骤简述如下：

1、总RNA提取

取200mg新鲜玉米根，在液氮中研磨；加入1ml RNA提取试剂盒(invitrogen公司，目录号15596-018)提供的Trizol提取液，室温震荡5分钟；再加入200μl三氯甲烷，震荡30秒，4℃、12000转，离心15分钟；取上清，加入0.5ml异丙醇，室温静置1小时，4℃、12000转离心15分钟；取沉淀，加入1ml 70％乙醇，震荡1分钟，4℃、10000转离心10分钟；吸弃上清，沉淀置通风橱中吹干，加入50μl DEPC水溶解沉淀。1％琼脂糖电泳检测RNA质量，同时用分光光度计测定RNA浓度。

2、mRNA纯化

取500μg总RNA加入到一新的无RNA酶离心管中，加入1ml试剂盒提供的结合液；置于65℃10分钟，然后立刻转到冰上放1分钟；液体转移到试剂盒提供的含oligo(dT)树脂的离心管中，室温轻摇20分钟，室温4000转离心10分钟，小心吸弃上清，重复2次；然后加入0.3ml结合液重悬树脂，转移到试剂盒提供的spin-column管中，加入500μl结合液洗涤，4000转室温离心10秒，测洗出液的OD₂₆₀，如果大于0.05，则再次加入500μl结合液洗涤，直至洗出液OD₂₆₀小于0.05；加入200μl洗脱液，柔和悬起树脂，将spin-column管转到一新的离心管上，室温4000转离心10秒收集mRNA。最后加入10μl 2mg/ml糖苷，30μl 2M醋酸钠，600μl无水乙醇，-80℃放置30分钟，4℃、14000转离心20分钟，弃上清，70％乙醇洗一次，用20μl TE溶解。取出0.5μl测定OD₂₆₀并计算浓度。

3、cDNA第一链合成

取5μg mRNA，用cDNA文库构建试剂盒(invitrogen公司，目录号18249-029)所带的反转录酶进行反转录。具体如下：取1μl试剂盒提供的Biotion-attB2-oligo(dT)加到10μL浓度为100ng/μl的步骤2纯化得到的mRNA溶液中，70℃放置5分钟，迅速转到冰上3分钟，然后加入以下成分：

5×反转录缓冲液                             5μL

dNTP混合物(每种10mM)                        2.5μL

RNasin核糖核酸酶抑制剂(浓度50U/μl)         1μL

AMV反转录酶(30U/μl)                        3μL

DEPC处理水                                  定容至25μL

参照试剂盒使用说明书设定如下反应条件：25℃10分钟，42℃60分钟，70℃10分钟，冰浴2分钟。

4、cDNA第二链合成

以反转录得到的cDNA第一链为模板，合成第二链。反应体系为：

5×第二链反应缓冲液                         30μL

dNTP混合物(每种10mM)                        3μL

E.Coli DNA连接酶(10U/μL)                   1μL

E.Coli DNA聚合酶(10U/μL)                   4μL

E.Coli RNase H(2U/μL)                      1μL

反转录产物(浓度为10ng/uL)                   5μL

灭菌水                                      定容至150μL

16℃静置2小时，然后加入2μl T4DNA聚合酶，16℃静置5分钟，补平cDNA的粘末端，最后加入10μL 0.5M EDTA终止反应。加入160μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1比例混合)混合液，轻摇30秒，14000转离心5分钟，小心取上清到一新离心管中，加入试剂盒提供的糖原20μg，7.5M醋酸铵80μl，无水乙醇600μl。-20℃放置5小时，14000转，4℃离心25分钟。小心吸弃上清，沉淀中加入150μl 70％乙醇洗一次，4℃14000转离心2分钟，吸弃上清，重复洗一次。离心管开盖常温放置10分钟吹干沉淀，加入18μl DEPC水溶解沉淀，获得双链cDNA。

5、构建cDNA文库

取获得的双链cDNA 18μl，加入如下成分进行末端attB1加尾：

5X接头缓冲液                      10μl

attB1接头(1μg/μl)               10μl

0.1M DTT                          7μl

T4DNA Ligase(1U/μl)              5μl

水补足                            50μl

混匀后16℃反应16-24小时。转入70℃反应15分钟使连接酶失活。

再加入如下成分进行重组反应，将文库DNA连入cDNA文库构建试剂盒提供的pDONR222载体(invitrogen公司，目录号18249-029)：

上步获得的加了attB接头的cDNA     30-40ng

pDONR222载体(150ng/μl)          1.67μl

5X BP Clonase反应缓冲液          2μl

BP Clonase酶                     3μl

TE缓冲液(pH 8.0)补足到           10μl

25℃反应16-20小时，然后加入2μl蛋白酶K，37℃15分钟使BP Clonase酶失活，然后置75℃10分钟，使蛋白酶K失活。然后加入糖原20μg，7.5M醋酸铵50μl，无水乙醇375μl。-20℃放置5小时以上，14000转，4℃离心25分钟。弃上清，加150μl 70％乙醇洗一次。溶于9μl TE中。每0.5μl DNA加入到50l大肠杆菌DH10B感受态中，混匀，转入预冷的电极杯中，2.0kV，200Ω，25μF电击一次，迅速加入1ml SOC液体培养基，37℃，250转培养45分钟，涂在灭菌的含卡那霉素抗性的SOC固体培养基上，37℃倒置培养20小时后，用TE溶液将平板上生长的菌体全部收集混合，提取质粒DNA，即为获得的cDNA文库。

将cDNA文库从pDONR222载体上转移到pDR195载体(Rentsch et al.，1995 FEBSLett 370：264-268，公众可从中国农业大学获得)上，具体操作为在一新离心管中加入：

文库质粒DNA                   5ug

10 X Not I酶反应缓冲液         10μl

Not I酶                        5μl

加水补足到                     100μl

同时在一离心管中加入：

pDR195质粒DNA                  2ug

10 X Not I酶反应缓冲液         10μl

Not I酶                        5μl

加水补足到                     100μl

37℃放置10-16小时后，两管分别加入1/10体积的10M醋酸铵，2倍体积的无水乙醇，混匀，4℃，14000转离心15分钟，75％乙醇洗一次，吹干后分别用50μl水溶解。pDR195载体酶切后进行去磷酸化，方法：

取上步得到的50μl酶切后的pDR195质粒       50μl

10X去磷酸化酶反应缓冲液                   10μl

去磷酸化酶                                5μl

补水至                                    100μl

37℃放置5-8小时，加入1/10体积的10M醋酸铵，2倍体积的无水乙醇，混匀，4℃，14000转离心15分钟，75％乙醇洗一次，20μl水溶解。

从pDONR222载体上切下来的cDNA文库和pDR195载体连接，反应为：

文库质粒DNA                    50μl

去磷酸化的PDR195载体DNA        20μl

10XT4 DNA连接酶缓冲液          10μl

T4 DNA连接酶                   5μl

补水至                         100μl

16℃连接16-20小时后，每5μl转入100μl DH5α感受态细胞(购自天根生化科技有限公司)中，涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养20小时，收集所有菌体混匀，提取质粒DNA即为获得的在pDR195载体上的cDNA文库。

二、酵母不吸铵突变体功能互补实验，获得玉米与铵盐吸收相关蛋白ZmAMT1；1的基因序列

1、文库滴度测定

取构建好的文库1μl转化酵母铵吸收功能缺失突变体(31019b)感受态(Marini etal.，1997，Mol Cell Biol 17：4282-4293，公众可从中国农业大学获得)中，涂在含2％葡萄糖和1mM精氨酸(Arg)的固体YNB培养基上(YNB培养基也叫无氮源培养基，购自Dickinsonand Company公司，目录号：7277179)，30℃黑暗培养3天，获得长出的独立菌斑数，并计算滴度。结果表明每1μl文库质粒可以获得10,000个菌斑，即滴度为10⁴个/μl。

上述酵母感受态制备和转化方法：

挑取-80℃保存的酵母菌，涂布在YPD固体培养基(1％酵母提取液，2％蛋白胨，2％葡萄糖)上，30℃培养2天，然后挑单斑入20ml YPD液体培养基中，30℃230rpm振荡培养2天至饱和；

转接入75ml液体YPD培养基中至终浓度OD₆₀₀＝0.1；

30℃230rpm振荡培养5-10小时，至OD₆₀₀＝0.5-0.8；

取50ml菌液，4500rpm常温离心5分钟收集菌体；

加50ml无菌水洗菌体，4500rpm常温离心5分钟收集菌体；

重悬到45ml无菌水中，加入5ml 10×LiAc-TE溶液(1M LiAc，100mM Tris-Cl，20mM EDTA，pH7.5，灭菌)；

4500rpm常温离心5分钟，弃大部分上清，留200μl上清，并将菌体重悬起来；

每20μl菌液中加入20μg新变性的鲑鱼精DNA，70μl 50％PEG4000，8μl 10×LiAc-TE，1μl质粒DNA，混匀；

PCR仪上进行如下循环：28℃30分钟，42℃13分钟，28℃保存；

涂布在固体培养基上生长。

2、筛选文库，获得与铵盐吸收相关蛋白基因ZmAMT1；1

根据文库滴度，取10μl文库DNA(含100,000个独立克隆)，转化至酵母铵吸收功能缺失突变体中，涂在含2％葡萄糖和1mM氯化铵(NH₄Cl)的YNB培养基上，30℃黑暗培养5天，获得长出的独立菌斑38个。

3、酵母质粒DNA的提取、测序

从获得的38个独立酵母菌斑中提取质粒DNA并测序，结果表明从38个阳性克隆中获得38个质粒DNA，其中14个是同一个基因，我们将此基因命名为ZmAMT1；1。

上述酵母质粒DNA提取方法：

挑取生长菌斑入0.5ml含1mM Arg的YNB液体培养基中，30℃，230rpm振荡培养过夜；

4,000rpm离心5分钟收集菌体；

倒掉上清液，用新鲜的液体培养基重悬菌体(总体积约50μl)，然后每管加入10μl浓度10mg/ml的溶菌酶溶液，充分振荡使溶液与菌体完全混匀；

将试管在30℃，230rpm振荡培养60分钟；

每管加入10μl 20％SDS，剧烈振荡1分钟使充分混匀；

将样品放到-20℃2小时，取出再融解，剧烈振荡使充分裂解；

用TE缓冲液(pH7.0)将每管体积补充到200μl；

加200μl酚∶仿∶异戊醇(25∶24∶1)，剧烈振荡5分钟；

14,000rpm离心10分钟，将上清转移到新离心管中；

加8μl 10M NH₄Ac和500μl无水乙醇；

在-70℃冰箱中放1小时，14,000rpm离心10分钟；

弃去上清，吹干沉淀，用20μl H₂O溶解沉淀；

取0.5μl质粒转到E.coli感受态细胞(DH5α菌株)中，37℃摇菌，提取质粒，酶切鉴定后送公司测序。

实施例2、ZmAMT1；1基因的克隆，酵母表达载体的构建、转化及其酵母功能互补

一、全长ZmAMT1；1基因cDNA的扩增

根据酵母筛选得到的ZmAMT1；1序列，设计一对引物P1-F和P1-R，序列如下：

P1-F：5’-GAAAGATGTCGACGTGCGCGGCGGA-3’；

P1-R：5’-TTTTACACCTGGCTGCTGGTCGCCG-3’。

其中P1-F恰好包含翻译起始密码子ATG，P1-R包含翻译终止密码子TAA；以玉米自交系B73根总RNA反转录的cDNA为模板，使用高保真pfu酶(Promega公司，目录号：M7745)扩增获得包含完整开放阅读框架的ZmAMT1；1基因片段(其核苷酸序列是序列2的自5′末端的第78位至第1574位核苷酸)。

反应体系为：

2μg总RNA反转录cDNA        5.0μl

2×GC Buffer II            25.0μl

P1-F(10μM)                2.0μl

P1-R(10μM)                2.0μl

dNTP mix(10mM each)        2.0μl

pfu酶(5U/μl)              0.5μl

补H₂O至                    50μl

PCR反应条件：94℃预变性1分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃3分钟，35个循环；之后加入1μl Taq酶，72℃延伸和加尾20分钟。

取8μl PCR产物，于1.0％琼脂糖凝胶上电泳检测，检测结果如图1中B所示，回收目的条带，连接回收产物于pGEM T-Easy载体(购自Promega公司)上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒并测序验证。测序结果表明，获得1497bp的开放读码框，比对发现这一序列与筛库得到的序列(2020bp)可以完全匹配。ZmAMT1；1的核苷酸序列如序列表中序列2所示；其编码的氨基酸序列如序列表中序列1所示。将含有ZmAMT1；1的重组载体命名为pGEM T-ZmAMT1；1。

pGEM T-Easy载体的两端含有Not I酶切位点，因此选用NotI(购自Promega公司)，将ZmAMT1；1基因从pGEM T-ZmAMT1；1上切下来，电泳回收，连入pDR195载体上的Not I酶切位点处，经测序选取正向连入的克隆，通过PEG介导的酵母转化方法转入不吸铵突变体中，涂布在含1mM氯化铵的YNB培养基上，进行功能互补实验验证，结果如图2所示，第一行为转空载体pDR195的酵母生长图，设为对照；第二行为转玉米ZmAMT1；1基因(pDR195-ZmAMT1；1)的酵母生长图。5个不同列表示菌液浓度由高到底分别为OD₆₀₀＝1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4。从图中可以看出转了ZmAMT1；1的酵母突变体可以利用1mM的氯化铵作为唯一氮源生长，说明获得的ZmAMT1；1基因在酵母系统中具有铵吸收功能。

实施例3、Real-Time PCR分析玉米ZmAMT1；1基因的铵诱导表达特性

水培玉米自交系B73幼苗，用Hoagland营养液(成分为K₂SO₄ 0.5mM，MgSO₄.7H₂O0.6mM，KH₂PO4 0.1mM，CaCl₂.2H₂O 0.5mM，NH₄NO₃ 2mM，H₃BO₃ 1μM，MnSO₄.H₂O 0.5μM，ZnSO₄.7H₂O 0.5μM，CuSO₄.5H₂O 0.2μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.07μM，NaFe-EDTA 0.1mMpH为5.7)培养，每2天换一次营养液。生长到三叶期时(萌发后20天)，移入不含硝酸铵的Hoagland营养液中进行缺氮4天的预处理，然后分别转入含4mM硝酸钾(KNO₃)和2mM(NH₄)₂SO₄中进行处理，培养0、1、3、6、12、24小时后收取根。一部分根用于测定铵吸收速率，另一部分根用于提取总RNA，各自以oligo(dT)为引物反转录获cDNA第一链，用引物P2-F和P2-R进行Real-Time PCR检测ZmAMT1；1基因的表达量，引物序列如下所述：

P2-F：5’-GTGGCGGGCTGCTGGTCAAGAT-3’；

P2-R：5’-CGACCGTCAAAGCCGCTAGATTG-3’。

同时，以同样的体系，以P3-F和P3-R为引物扩增玉米看家基因ZmTub1为内参对照，引物序列如下：

P3-F：5’-GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3’；

P3-R：5’-CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3’。

以同一个样品中的ZmAMT1；1基因的表达量除以ZmTub1基因的表达量作为ZmAMT1；1基因的相对表达量。

结果如图3所示，在玉米根中，缺氮4天的玉米根系恢复供硝酸钾后，铵吸收速率变化不明显，ZmAMT1；1基因的表达变化也不明显。但是恢复供硫酸铵1小时后，铵吸收能力明显提高，同时ZmAMT1；1基因的表达活性明显诱导提高，加铵12小时后的铵吸收速率提高2.7倍，ZmAMT1；1的表达量相当于0小时表达量的7.0倍，达到最大诱导倍数。总之，Real-Time PCR结果表明在玉米根中，ZmAMT1；1基因的表达水平被供铵诱导提高，同时铵吸收速率也得到了提高。

上述铵吸收实验步骤如下：

收样时，先在CaSO₄中浸泡根1分钟，然后转入已加入带¹⁵N标记的200μM(¹⁵NH₄)₂SO₄的缺氮Hoagland营养液中浸泡6分钟，再转入CaSO₄中洗涤1分钟。用吸水纸快速吸干根系表面水，装入预先写好编号的纸袋中。同样方法做不加¹⁵N标记氮源的吸收做本底对照。将纸带敞开口放入冷冻干燥器干至恒重。用球磨机(型号Retsch MM400)磨样。每个样品称取1.5-2.0mg，锡杯包裹，放入元素分析仪(Thermo公司，型号DELTAPLUSXP)测定¹⁵N含量，用Flash EA 1112 Series软件分析结果。

上述Real-Time PCR操作步骤如下：

1、提取不同处理样品根中的总RNA(方法同实施例1中总RNA的提取方法)；

2、取50μg总RNA，用DNase I(TaKaRa公司，目录号：D2215)去除基因组DNA，方法如下：

反应体系(50μl)：

总RNA                      50μg

10×DNase I反应缓冲液      5μl

DNase I(5u/μl)            2μl

DEPC水                     至终体积50μl

37℃反应30分钟；

加入150μl DEPC水，加入200μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀；

4℃，12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加入200μl氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀；

4℃12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加20μl的3M NaAc(pH5.2)，加500μl预冷无水乙醇，-20℃放置60分钟；

4℃，12000rpm离心15分钟，回收沉淀，70％预冷乙醇洗沉淀2次；每次4℃，7500rpm离心5分钟；

吹干，DEPC水重溶。

3、常规方法反转录合成cDNA第一链(方法同实施例1中cDNA第一链的合成方法)。

4、Real-time PCR检测基因丰度，试剂选用TOYOBO公司的SYBR Green RealtimePCR Master Mix(目录号91620F3)，定量PCR仪器型号为ABI7500，反转产物稀释10倍作为Real-time PCR模板，反应体系：

SYBR Mix： 13μl

Primer1：  1μl

Primer2：  1μl

灭菌水加至 25μl；

PCR反应程序：50℃2分钟，95℃10分钟，45个循环(95℃15秒，61℃30秒，72℃1分钟)；

融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环；

以ZmTub1为内参，采用相对定量算法计算ZmAMT1；1在不同处理中的相对表达量。

实施例4、培育铵吸收高效植物

1、重组植物表达载体的构建

使用Not I酶切实施例2中的重组载体pGEM T-ZmAMT1；1，电泳回收ZmAMT1；1片段，连入pPT-HYG载体(Sutter et al.，2006Plant Cell 18：935-954，公众可从中国农业大学获得)，的Apa I酶切位点处(此酶与Not I是同尾酶)，得到重组表达载体pPT-ZmAMT1；1。此载体可以使ZmAMT1；1基因在35S启动子下组成型表达，并且携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。

2、ZmAMT1；1基因转化拟南芥qko植株

A、重组表达载体pPT-ZmAMT1；1转化农杆菌感受态细胞

取200μl农杆菌GV3101感受态细胞(购自天根生化科技有限公司)，加入1μg pPT-ZmAMT1；1质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1ml YEB培养基，28℃慢速振荡培养4小时；1000rpm离心30秒，弃上清，重悬于0.1ml YEB培养基中，涂布于含有100μg/ml潮霉素和125μg/ml利福平的YEB平板上，28℃培养48小时。

B、转化农杆菌阳性克隆的PCR鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液中(含100μg/ml卡那霉素和125μg/ml利福平)，28℃培养过夜。以菌液为模板，用引物

P1-F：5’-GAAAGATGTCGACGTGCGCGGCGGA-3’；

P1-R：5’-TTTTACACCTGGCTGCTGGTCGCCG-3’

进行PCR扩增鉴定阳性重组农杆菌，能扩增出约1500bp条带的菌液为阳性重组菌。

C、拟南芥的转化

用含有重组表达载体pPT-ZmAMT1；1的阳性重组农杆菌转化拟南芥qko突变体(qko突变体为AtAMT1；1，AtAMT1；2，AtAMT1；3，AtAMT2；1四个基因同时突变产生的突变体，此突变体丧失95％的铵吸收能力)(Yuan et al.，2007，The Plant Cell19：2636-2652，公众可从中国农业大学获得)具体方法：取已经鉴定为阳性的农杆菌菌液0.5ml接种于500ml YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5。5000rpm4℃离心15分钟收集菌体。用200ml的渗入缓冲液(1×MS大量元素，5％蔗糖)重悬菌体，加silwet L-77(GE公司，货号：S5505)至终浓度0.2‰。所述1×MS大量元素含有1.65g/L NH₄NO₃，1.9g/L KNO₃，0.44g CaCl₂.2H₂O，0.37g/L MgSO₄.7H₂O和0.17g/L KH₂PO₄。将抽苔后刚刚开花的拟南芥的花浸于重悬液中侵染10秒。用保鲜袋包裹植株，避光16℃下放置24小时，然后正常生长。

D、转基因阳性植株的筛选

由于转入pPT-ZmAMT1；1载体的拟南芥植株具有潮霉素抗性，所以在含有潮霉素的MS固体培养基上可以正常生长，而未转入该基因的野生型种子不能正常生长并死亡。转化当代转基因植株为T0代，由该T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。混合收集T1代种子，播种于含50μg/ml潮霉素的MS固体培养基上，筛选能正常生长的植株移栽于盆内继续生长，单株收种。T2代种子再经过1次潮霉素抗性筛选后单株收获T3代种子。同样再经过一次抗性筛选，所有个体都能生长的为转pPT-ZmAMT1；1的纯合体植株，留下备用。

E、转基因拟南芥的分子检测

PCR检测：分别提取T3代转pPT-ZmAMT1；1基因拟南芥纯合植株的总RNA，在oligo(dT)引导下反转录成第一链cDNA，以P4-F和P4-R为引物进行RT-PCR，检测转基因拟南芥中ZmAMT1；1基因的表达水平。引物序列如下所述：

P4-F：5’-CGACGAGATGTCCGGCATGG-3’；

P4-R：5’-CGGCTCGACACGGTTCTGC-3’。

结果如图5所示，1-7为转pPT-ZmAMT1；1基因的7个独立转化株系。检测结果表明7个株系有6个为阳性株系，其中1和6号的表达丰度相对较低。

3、转基因植株增强铵吸收能力的鉴定

为了鉴定转ZmAMT1；1基因的拟南芥植株的铵吸收能力，选取6号(line 6)作为低丰度表达、4和7号(line 4和line 7)为高丰度表达的转基因系及对照qko进行下一步的功能验证。水培拟南芥，将进入莲座期的T3代拟南芥植株转入缺氮培养基进行4天缺氮处理，之后进行铵吸收速率测定，其测定方法与上文实施例3中玉米铵吸收速率测定方法一样。¹⁵NH₄ ⁺标记浓度分别为：0，25，50，75，100，150，200，300μM，结果如图6所示，转入ZmAMT1；1基因的拟南芥铵吸收能力明显提高，在低铵浓度(0-300μM，高亲和力铵吸收范围)下，其吸收动力学曲线呈现饱和趋势，最大吸收速率Vmax＝348.12±43.90mmol h^-1 g^-1，亲和力Km＝46.94±19.79mM。而qko在低铵浓度(0-300μM，高亲和力铵吸收范围)下，其吸收动力学曲线呈也呈饱和趋势，但最大吸收速率仅有Vmax＝97.91±18.10mmol h^-1 g^-1，亲和力Km＝90.52±47.23mM。这说明ZmAMT1；1是一个高亲和力的铵盐吸收相关蛋白。导入外源ZmAMT1；1基因能够显著增强拟南芥的高亲和力铵盐吸收能力，比对照qko的铵盐吸收能力提高约3.5倍。

4、转ZmAMT1；1基因提高植株生物量的鉴定

转入ZmAMT1；1基因可以明显提高拟南芥qko的铵吸收能力，为了进一步研究提高铵吸收能力后是否能改善植株氮营养状况，又取转入ZmAMT1；1基因的拟南芥T3代纯合体和qko种子，在无氮源的1/2MS外加5mM KNO₃的固体培养基上预培养7天，再移到1/2MS加250μM NH₄ ⁺或NO₃ ^-的固体培养基上，继续生长10天后，用剪刀在拟南芥茎基部(茎根连接处)剪一刀，取地上部到万分之一天平上直接称鲜重，即为地上部生物量。

无氮源1/2MS组成：KH₂PO₄ 0.625mM，MgSO₄.7H₂O 0.75mM，CaCl₂ 1.5mM，MnSO₄·H₂O50μM，H₃BO₃ 50μM，KI 2.5μM，ZnSO₄·7H₂O 15μM，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5μM，CuSO₄·5H₂O0.05μM，CoCl₂·6H₂O 0.05μM，Fe-EDTA 50μM。

结果如图7所示，在250μM NO₃ ^-为唯一氮源条件下，qko和各转基因系长势和地上部生物量无差异。而在250μM NH₄ ⁺为唯一氮源条件下，各转基因系长势和地上部生物量显著高于qko。这些结果说明了ZmAMT1；1基因转入拟南芥qko可以提高转基因植株的吸铵能力，从而增强植株在有铵态氮源的环境中的氮利用能力。另外，如图7中B所示，6号转基因植物增加的生物量稍低于其它两个株系，考虑到6号株系中ZmAMT1；1基因的丰度低于其它株系(如图5所示)，更进一步说明了ZmAMT1；1基因的表达与铵盐吸收及其地上部生物量之间的直接关系。

本发明证明表达外源玉米ZmAMT1；1基因在拟南芥中可以提高拟南芥对铵盐的吸收能力，从而增强拟南芥在铵营养上的生长。

实施例5、原位杂交分析玉米ZmAMT1；1基因被铵诱导后在根中的表达部位

1、植物材料的准备

植物培养用Hoagland培养液(方法同实施例3)，三叶期玉米幼苗先缺氮处理4天，然后重新供2mM(NH₄)₂SO₄ 12小时后取样。迅速剪取不同根段放入FAA固定液中(每100ml固定液含：50％乙醇90ml，冰醋酸5ml，甲醛5ml)；然后进行植物材料脱水、透明、浸蜡，方法如下：

弃去FAA固定液，DEPC水洗两次；

50％乙醇，50％乙醇+10％叔丁醇，50％乙醇+20％叔丁醇，50％乙醇+35％叔丁醇，50％乙醇+50％叔丁醇，25％乙醇+75％叔丁醇，25％乙醇+75％叔丁醇+0.1％伊红Y，100％叔丁醇依次各处理2小时；

转入2/3叔丁醇+1/3石蜡油中放置4小时；

倒出1/3叔丁醇石蜡油混合液，补充同体积60℃融化的石蜡于上层，形成凝固的蜡盖，60℃放置12小时，(重复3次)；

倒出全部液体，加入纯的融化石蜡，60℃，8小时，(重复2次)；

然后在65℃烫板上包埋。

2、探针的合成和纯化

在准备植物材料的同时进行RNA探针合成，参考Takara公司的T7-RNA polymerase(目录号：P2075)的使用方法，简述如下：

上海生工合成含T7启动子和ZmAMT1；1的

正向引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGAGTGGCGGGCTGCTGGTCAAGAT-3′，和

反向引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGACGACCGTCAAAGCCGCTAGATTG-3′；

用pfu酶从质粒上扩增出含有T7启动子的DNA模板，体外转录成RNA探针，反应体系如下：

质粒DNA模板：                  8.5μl

10×DIG Labeling Mix：         2.5μl

5×Transcriptional Buffer：    4μl

DTT(100mM)：                   2μl

T7-RNA polymerase(19u/μl)：   3μl

共20μl，混匀，在37℃反应2小时；

加入4μl DNase I(TaKaRa公司，目录号D2215)37℃反应15分钟去除DNA；

反应结束后放置冰上，加0.8μl 0.5M EDTA(pH＝8.0)终止反应；

加入2μl 5M LiCl，75μl无水乙醇(-20℃预冷)，混匀后放置于-20℃2小时；

13000rpm，4℃离心15分钟；

弃去上清，加入50μl 70％预冷的乙醇洗涤沉淀，13000rpm 4℃离心5分钟；

弃去上清，吹干沉淀；

加24μl DEPC-H₂O溶解，-70℃保存备用。

3、探针浓度检测

剪下一块膜，在膜上用铅笔画格，然后按一定比例用RNA稀释缓冲液(DEPC水∶20X SSC∶37％甲醛混合液，按5∶3∶2体积比混合而成)稀释合成的RNA探针，小心点到膜上格子内，点样后，在超净台中吹干，然后80℃烘箱中烤膜2小时；

将膜装入杂交袋中，洗膜液(100mM顺丁烯二酸，150mM NaCl pH7.5，0.3％(V/V)土温20)中浸泡10分钟；

在10ml封闭液(100mM顺丁烯二酸，150mM NaCl pH7.5，1/10体积试剂盒提供的10X Blocking solution)中室温摇30分钟；

在10ml抗体溶液(试剂盒提供的Anti-DIG-AP按1∶10000用封闭液稀释)中室温摇30分钟；

在10ml洗膜液中洗膜两次，每次15分钟；

在10ml显色缓冲液(100mM Tris-HCl pH9.5，100mM NaCl，50mM MgCl₂)中平衡5分钟；

膜样品面朝上放置于滤纸上，加入2ml显色液(现配先用，2ml显色缓冲液中加入20μl试剂盒提供的NBT/BCIP)，静止显色，不时观察，蓝色斑点清晰后，倒掉显色液，无菌水洗2-3次，每次5分钟，晾干后，照相或夹在滤纸中保存于4℃。

4、制片：

包埋好的腊块，用上海红宇QP-4型切片机切出8-10μm片子。截取合适位置的蜡带(含有植物样品)粘在多聚赖氨酸的载片(Sigma公司，目录号P0425-72EA)上，将蜡带放入DEPC水中45℃烤片台上展片，展片充分后吸去多余的水，40℃烘箱中烤片24-48小时，使切片充分干燥。

切片脱蜡：片子在二甲苯中洗3次各5分钟，无水乙醇2次各2分钟，95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇依次各1分钟，DEPC水洗2次，每次1分钟。

蛋白酶K处理：在一个染色缸中加入蛋白酶K反应缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5，50mM EDTA)和蛋白酶K至终浓度1μg/ml，放入预处理好的片子，37℃保温20分钟；

用DEPC水洗载玻片2次，每次1分钟；

乙酰化处理：将载玻片置于染色缸中，加入40ml溶有100μl乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺溶液(pH＝8.0)，室温放置10分钟；倒掉溶液，2×SSC溶液洗涤两次，每次7分钟；

在室温下，依次用不同稀释度的乙醇水溶液(30％，50％，70％，85％和95％)洗涤片子，每级1分钟，使组织切片脱水。然后用新的无水乙醇洗2次，每次2分钟。室温晾干。

5、杂交

杂交液组成：每张片子用200μl杂交液，包含：100μl去离子甲酰胺，20μl 10×杂交缓冲液(100mM Tris pH 7.5，10mM EDTA，3M NaCl)，24μl 50％硫酸葡聚糖，20μl 10×Blocking Solution，250μg鲑鱼精DNA，5μl探针，36.5μl 50×Denhardt’s溶液。避光杂交16-30小时。

冲洗：片子浸入2×SSC中使盖片脱落，然后室温放置30分钟；换新的2×SSC，65℃1小时；0.1×SSC，65℃1小时。

封闭：用吸水纸擦干载玻片背面，放在湿盒中，每片加2ml 1％封闭液(每400毫升含有Boehringer Block reagent 2g，0.1M Tris-HCl，pH＝7.5；和0.15MNaCl)，室温放置1小时。

平衡：去掉封闭液，每片加1ml洗片液(100mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.3％Triton X-100，1％BSA)平衡15分钟。

抗体吸附：去掉平衡液，加入400μl抗体溶液(每400μl抗体溶液含：399μl洗片液，1.32μl试剂盒提供的Anti-DIG-AP)，室温杂交2小时或4℃过夜。

洗片：玻片在洗片液中洗3次，每次10分钟。

显色前平衡：在显色缓冲液中浸5分钟(1ml显色缓冲液配方：100μl 1M Tris-HClpH9.5，20μl 5M NaCl，860μl ddH₂O，0.1g聚己烯醇)。

显色：显色缓冲液中加入20μl NBT/BCIP，每片滴加200-500μl显色液，湿盒中室温黑暗处显色0.5-4h，当镜检时阳性信号为浅红或红棕色，而背景无明显色时即可停止反应，用水冲洗3次，每次5分钟。经中性树胶封片后，红棕色的阳性信号变为蓝色或蓝紫色。

结果如图4所示，A为正义探针杂交图，作为负对照；B为反义探针杂交结果，两图的左侧为根尖纵切图，右侧是根尖成熟区横切图。结果表明ZmAMT1；1主要在玉米根部的表皮组织中表达，这与其介导根从环境吸收铵盐的生物学功能是一致的。

序列表

<110>中国农业大学

 

<120>与铵盐吸收相关的蛋白及其编码基因与应用

 

<130>CGGNARG102391

 

<160>2

 

<210>1

<211>498

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays L.)

 

<400>1

 

Met Ser Thr Cys Ala Ala Asp Leu Ala Pro Leu Leu Gly Pro Ala Ala

1               5                   10                  15

Ala Asn Ala Thr Asp Tyr Leu Cys Gly Gln Phe Ala Asp Thr Ala Ser

            20                  25                  30

Ala Val Asp Ala Thr Tyr Leu Leu Phe Ser Ala Tyr Leu Val Phe Ala

        35                  40                  45

Met Gln Leu Gly Phe Ala Met Leu Cys Ala Gly Ser Val Arg Ala Lys

    50                  55                  60

Asn Thr Met Asn Ile Met Leu Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Ala Gly

65                  70                  75                  80

Ala Leu Phe Tyr Tyr Leu Phe Gly Phe Ala Phe Ala Phe Gly Thr Pro

                85                  90                  95

Ser Asn Gly Phe Ile Gly Lys Gln Phe Phe Gly Leu Lys His Leu Pro

            100                 105                 110

Arg Thr Gly Phe Asp Tyr Asp Phe Phe Leu Tyr Gln Trp Ala Phe Ala

        115                 120                 125

Ile Ala Ala Ala Gly Ile Thr Ser Gly Ser Ile Ala Glu Arg Thr Gln

    130                 135                 140

Phe Val Ala Tyr Leu Ile Tyr Ser Ala Phe Leu Thr Gly Phe Val Tyr

145                 150                 155                 160

Pro Val Val Ser His Trp Phe Trp Ser Ala Asp Gly Trp Ala Gly Ala

                165                 170                 175

Ser Arg Thr Ser Gly Pro Leu Leu Phe Gly Ser Gly Val Ile Asp Phe

            180                 185                 190

Ala Gly Ser Gly Val Val His Met Val Gly Gly Ile Ala Gly Leu Trp

        195                 200                 205

Gly Ala Leu Ile Glu Gly Pro Arg Ile Gly Arg Phe Asp His Ala Gly

    210                 215                 220

Arg Ser Val Ala Leu Lys Gly His Ser Ala Ser Leu Val Val Leu Gly

225                 230                 235                 240

Thr Phe Leu Leu Trp Phe Gly Trp Tyr Gly Phe Asn Pro Gly Ser Phe

                245                 250                 255

Thr Thr Ile Leu Lys Ser Tyr Gly Pro Ala Gly Thr Val His Gly Gln

            260                 265                 270

Trp Ser Ala Val Gly Arg Thr Ala Val Thr Thr Thr Leu Ala Gly Ser

        275                 280                 285

Val Ala Ala Leu Thr Thr Leu Phe Gly Lys Arg Leu Gln Thr Gly His

    290                 295                 300

Trp Asn Val Val Asp Val Cys Asn Gly Leu Leu Gly Gly Phe Ala Ala

305                 310                 315                 320

Ile Thr Ala Gly Cys Ser Val Val Glu Pro Trp Ala Ala Val Ile Cys

                325                 330                 335

Gly Phe Val Ser Ala Trp Val Leu Ile Gly Ala Asn Ala Leu Ala Ala

            340                 345                 350

Arg Phe Arg Phe Asp Asp Pro Leu Glu Ala Ala Gln Leu His Gly Gly

        355                 360                 365

Cys Gly Ala Trp Gly Val Leu Phe Thr Gly Leu Phe Ala Arg Arg Lys

    370                 375                 380

Tyr Val Glu Glu Ile Tyr Gly Ala Gly Arg Pro Tyr Gly Leu Phe Met

385                 390                 395                 400

Gly Gly Gly Gly Lys Leu Leu Ala Ala Gln Ile Ile Gln Ile Leu Val

               405                 410                 415

Ile Ala Gly Trp Val Ser Cys Thr Met Gly Pro Leu Phe Tyr Ala Leu

            420                 425                 430

Lys Lys Leu Gly Leu Leu Arg Ile Ser Ala Asp Asp Glu Met Ser Gly

        435                 440                 445

Met Asp Leu Thr Arg His Gly Gly Phe Ala Tyr Val Tyr His Asp Glu

    450                 455                 460

Asp Pro Gly Asp Lys Ala Gly Val Gly Gly Phe Met Leu Lys Ser Ala

465                 470                 475                 480

Gln Asn Arg Val Glu Pro Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Thr Ser Ser

                485                 490                 495

Gln Val

 

<210>2

<211>2020

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays L.)

 

<400>2

cccaatcccc tccccctcgc gtatccacac ttttcacacg cgacgccgga gagacagagc    60

gcgcgcgcgc ccgaaagatg tcgacgtgcg cggcggacct ggcgccgctg ctcggcccgg    120

cggcggcgaa cgccacggac tacctgtgcg ggcagttcgc ggacacggcc tccgcggtgg    180

acgccacgta cctgctcttc tcggcctacc tcgtgttcgc catgcagctc ggcttcgcca    240

tgctgtgcgc cggctccgtc cgcgccaaga acaccatgaa catcatgctc accaacgtgc    300

tcgacgccgc cgcgggggcg ctcttctact acctcttcgg cttcgccttc gccttcggca    360

cgccctccaa cggcttcatc ggcaagcagt tcttcgggct caagcacctg cccaggaccg    420

gcttcgacta cgacttcttc ctctaccagt gggccttcgc catcgccgcc gcgggcatca    480

cgtcgggctc catcgccgag cggacccagt tcgtcgccta cctcatctac tccgcgttcc    540

tgacggggtt cgtctacccc gtggtgtcgc actggttctg gtccgccgac ggctgggccg    600

gcgccagccg cacgtccggc ccgctgctct tcgggtccgg cgtcatcgac ttcgccggct    660

ccggcgtcgt ccacatggtc ggcggcatcg cggggctgtg gggcgcgctc atcgagggcc    720

cccgcatcgg gcgcttcgac cacgccggcc gctccgtggc gctcaagggc cacagcgcgt    780

cgctcgtggt gctcggcacc ttcctgctgt ggttcggctg gtacgggttc aaccccgggt    840

ccttcaccac catcctcaag tcgtacggcc ccgccgggac cgtccacggg cagtggtcgg    900

ccgtgggccg caccgccgtc accaccaccc tcgccggcag cgtcgccgcg ctcaccacgc    960

tgttcgggaa gcggctccag acgggccact ggaacgtggt ggacgtctgc aacggcctcc    1020

tcggcgggtt cgcggccatc acggccgggt gcagcgtggt ggagccgtgg gcggccgtca    1080

tctgcgggtt cgtgtccgcg tgggtgctca tcggcgccaa cgccctcgcg gcgcgcttca    1140

ggttcgacga cccgctggag gcggcgcagc tgcacggcgg gtgtggcgcc tggggcgtcc    1200

tcttcacggg gctcttcgcg aggcgaaagt acgtggagga gatctacggc gccgggaggc    1260

cctacgggct gttcatgggc ggcggcggga agctcctcgc cgcgcagatc atccagatcc    1320

tggtgatcgc cgggtgggtg agctgcacca tgggcccgct cttctacgcg ctcaagaagc    1380

tgggcctgct gcgcatctcg gccgacgacg agatgtccgg catggacctg acccggcacg    1440

gcggcttcgc ctacgtctac cacgacgagg accctggcga caaggccggg gttggtgggt    1500

tcatgctcaa gtccgcgcag aaccgtgtcg agccggcggc ggcggtggcg gcggcgacca    1560

gcagccaggt gtaaaaaaaa aaatcaggag caaattgaaa ccgagctgaa gttacgtgct    1620

tgcctttttc agtatgttgt cgcgtatcac gtttgaggtg gatcgtatct gccggtcagt    1680

acgcagtgtt tgggcaaata cttggctact tgggagtcgc aagaaattgt gtaaattata    1740

tagaggagga tggcgacgaa gcacgcatgt gttacgtagt tggggtttgt gtgcacatgg    1800

tggtgggcag gggctaggag agggtttatc tttaggttat tttcgtagtg gaatgaatct    1860

tatgatcgga tatccatcgt cggaaggtgt ggcgggctgc tggtcaagat aggtggcttc    1920

tatgactatg agggttgaaa caacaagtgg acgattctgt cctgtggtca ctgctcatca    1980

tccaatctag cggctttgac ggtcgtgcct ttttagtatc                          2020

Claims (8)

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与玉米铵盐吸收相关的由(a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列2；

2)其编码序列是序列表中序列2第78-1574位所示；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；

4)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求2或3所述的编码基因在增强酵母对铵盐吸收能力中的应用。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，对铵盐的吸收能力增强，和/或地上部分的生物量提高。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入目的植物中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。

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