CN103255146A - 拟南芥硝酸盐转运体基因nrt2.1及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学与转基因相关技术领域。具体为拟南芥硝酸盐转运体基因NRT2.1耐低氮功能的验证，以及该基因在耐低氮和氮素营养高效植物新品种培育中的应用。本发明以模式植物拟南芥为材料，利用NRT2.1基因T-DNA插入突变体salk_008278的纯合株系研究NRT2.1基因在植物低氮高效方面的功能。实验结果显示：NRT2.1基因敲除突变体在高蔗糖/低氮素(7.5％sucrose，0.1mM NH₄NO₃)培养条件下，突变体侧根显著多于野生型(P＝0.044)。说明NRT2.1基因在植物应答低氮胁迫的信号转导途径中具有重要的作用，预计该基因的过量表达可提高植物的耐低氮能力并在植物氮素营养高效分子育种中具有较大的经济价值。

Description

拟南芥硝酸盐转运体基因NRT2.1及其编码蛋白与应用

所属技术领域：

本发明属于植物分子生物学与转基因相关技术领域。具体为拟南芥硝酸盐转运体(Nitrate transporters，NRTs)家族关键基因NRT2.1在低氮胁迫下的反应和作用机理，以及该基因在营养高效植物新品种培育中的应用。

背景技术：

氮是植物必需的营养元素之一，是植物体内蛋白质、核酸、叶绿素、酶等的组成成分。氮素供应不足会影响植物的生长发育，限制农作物的产量；而氮肥施用过量则使氮素利用率下降，不仅造成资源浪费，而且引起环境污染。通过挖掘植物自身遗传潜能，克隆耐低氮和氮素营养高效的基因，并利用转基因技术培育氮素利用效率提高的新品种是解决这一问题的重要途径之一。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科、芸薹属植物，它不仅是第一个完成基因组序列测定的模式植物(Athanasios Theologis.et al.，Nature，2000，408：791-826)，而且具有植株小，生长周期短，种子数量多，基因组小且易于进行遗传转化，自花授粉而又易于杂交等优点。因此在植物分子生物学及转基因相关技术领域中，拟南芥被作为模式植物广泛加以研究和应用。

硝酸盐转运体(Nitrate transporters，NRTs)是一类专司硝态氮吸收、运输的转运蛋白。研究发现拟南芥中存在一个由7个成员组成的NRT2基因家族。之前的研究证明NRT2.1基因为高亲和性硝酸盐转运体(Wenbin Li et al.，Plant Physio-logy，January2007，Vol.143，pp.425-433)。但至今还未见低氮条件下该基因调控根系发育的报道。

发明内容：

本发明提供一个拟南芥高亲和性硝酸盐转运体基因，以及该基因对低氮胁迫的反应和生理机制。

所提供的高亲和性硝酸盐转运体基因为NRT2.1(AT1G08090)。

上述基因具有SEQ ID No.1的碱基序列。

上述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。

NRT2.1基因的T-DNA插入突变体salk_008278是从ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center)定购获得。通过PCR鉴定获得纯合插入突变体，通过RT-PCR在mRNA水平上鉴定基因的敲除情况。

通过上述鉴定，获得NRT2.1基因T-DNA插入突变体salk_008278的纯合株系，并以之为材料进行低氮处理，观察低氮表型并拍照。然后分别统计野生型和突变体的侧根数量。

附图说明：

图1显示野生型和突变体PCR和RT-PCR检测的电泳结果，结果表明所获NRT2.1基因T-DNA插入突变体株系salk_008278为纯合插入株系，其转录本被敲除。

图2显示野生型和突变体低氮处理7天的表型照片及侧根数统计结果，结果表明在高蔗糖/低氮素(7.5％sucrose，0.1mM NH₄ ⁺，和0.1mM NO₃ ^-)的培养条件下，突变体侧根显著多于野生型(P＝0.044)。

具体实施方式：

下面结合实验方法和数据进一步阐述本发明。

1.拟南芥幼苗培养：

野生型和突变体种子分别用0.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，消毒后的种子放入4℃冰箱春化2天后点布于含1％琼脂的MS(Murashige and Skoog)固体培养基上，置于22℃光照培养箱中萌发生长。

2.纯合突变体的鉴定：

DNA提取：所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。取约0.5g拟南芥新鲜叶片，研磨成糊状，加400μl SDS提取液(0.5％SDS(W/V)；200mMTris-Hcl，PH＝8.0；250mM NaCl；25mM EDTA)；12,000r/min，离心3min；取上清，加等体积异丙醇轻轻摇晃，静置30min；13,000r/min，离心5min；弃上清，用1ml95％乙醇冲洗1-2次后，自然风干，加去离子水30μl，4℃保存备用。

RNA提取：所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研钵、枪头、离心管等一应物品事先用1％DEPC水浸泡过夜后高温高压灭菌备用。取新鲜幼苗约1g左右，于液氮中研磨成粉状，加1ml TRIZOL提取液混匀，静置10min；4℃下12,000r/min离心10min；取上清加300μl氯仿混匀，静置10min后4℃下12,000r/min离心15min，样品分为3层，RNA位于上层水相中；取500μl水相转移到新离心管中，加等体积异丙醇沉淀10-20min；12,000r/min离心10min，弃上清；用75％酒精洗涤1-2次，7,000r/min离心2min，晾干1min左右，加60μl无RNase水，轻轻震荡使RNA溶解，-70℃冰箱保存备用。

RT-PCR：所用反转录试剂盒(#k1621)购自Fermentas。First strand cDNAsynthesis：管中加入RNA1μl，oligo(dT)18primer1μl，RNase-free water1μl，65℃处理5min后迅速冰浴冷却；然后再加5×Reaction buffer4μl，Ribolock^TMRNase inhibitor(20u/μl)1μl，10mM dNTP Mix2μl，RevertAid^TM H MinusM-MuLV Reverse Transcriptase(200u/μl)1μl，42℃反应60min；70℃终止反应5min，产物于-20℃冰箱保存备用。

PCR检测：所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我们设计了2对引物，1对用于T-DNA插入检测(LP1：5′-TTTGATAGGTTTTACGGACGG-3′，RP1：5′-AGGCATCATCTCGGGTTTAAC-3′)并结合T-DNA左边界通用引物LBb1.3：5′-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3′，通过PCR鉴定获得纯合插入突变体。另外1对用于转录本检测(LP2：5′-GTCACCGGTAGAGAACAAAGC-3′；RP2：5′-CTCTGTACCTTTCACTGGATCTGT-3′)。PCR反应体系如下：10×buffer buffer2μl，dNTP0.8μl，Primer LP/RP各1μl，DNA1μl，dH2O14μl，Taq酶0.2μl。PCR程序如下：94℃，3min；(94℃，45sec；58℃，45sec；72℃，60sec)×30cycles；72℃，5min。产物采用1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳分离，恒压100V电泳20min，用BIO-RAD凝胶成像扫描仪拍照记录检测结果。

PCR和RT-PCR检测的结果表明我们鉴定到NRT2.1基因T-DNA插入突变体salk_008278的纯合插入株系，其转录本被敲除。

3.低氮处理：

在含1％琼脂的固体MS培养基上生长5天的幼苗，转移到含有0.1mM NH₄ ⁺、0.1mM NO₃ ^-和7.5％蔗糖的培养基上，野生型和突变体各转5-6株，排列整齐以便于观察表型。低氮培养基包括1mM KH₂PO₄，1mM MgSO₄，0.25mM CaCl₂，0.1mM Na-Fe-ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)，1mM KCl，30mMH₃BO₃，5mM MnSO₄，1mM ZnSO₄，1mM CuSO₄，0.7mM Na₂MoO₄，0.1mMNH₄ ⁺、0.1mM NO₃ ^-和7.5％蔗糖，用NaOH调PH值至5.7-5.75。22℃光照培养7天后拍照，统计侧根量等指标。

结果表明在高蔗糖/低氮素(7.5％sucrose，0.1mM NH₄ ⁺，和0.1mM NO₃ ^-)培养条件下，突变体侧根显著多于野生型(P＝0.044)。这说明高蔗糖/低氮素条件刺激了突变体侧根的发育，有助于对氮素的吸收。

Claims (5)

1.拟南芥硝酸盐转运体基因NRT2.1，其碱基序列如SEQ ID No1。

2.权利要求1所述的拟南芥硝酸盐转运体基因NRT2.1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No2。

3.权利要求1所述的拟南芥硝酸盐转运体基因NRT2.1敲除突变体的低氮处理方法及条件。

4.权利要求1所述的拟南芥硝酸盐转运体基因NRT2.1敲除突变体在低氮处理下所获得的表型及其相关试验数据。

5.权利要求1所述的拟南芥硝酸盐转运体基因NRT2.1在制备耐低氮及氮素营养高效转基因植物中的应用。

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