CN102174519B - 一种矮败水稻培育方法及其所用到的dna - Google Patents

Abstract

本发明通过基因工程获得雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株的培育方法。利用对水稻茎杆有伸长作用的赤霉素合成中GA20-氧化酶基因(OsGA20ox2)和对水稻花药绒毡层发育发挥关键作用的RTS基因，通过RNAi技术培育雄性发育基因和植株高度基因同时表达缺失的矮败水稻，所述矮败水稻雄性不育与矮秆性状同时出现，接收野生型植株花粉后能正常受精结实。所述矮败水稻可以广泛应用于水稻轮回选择育种，对水稻遗传育种和生产有着重要意义。

Description

一种矮败水稻培育方法及其所用到的DNA

技术领域

本发明涉及通过基因工程技术培育水稻植株的方法，具体为培育雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株的方法，更具体的涉及利用RNAi技术对水稻花药发育相关基因和对茎杆有伸长作用的基因的表达进行干扰并实现同时下调或沉默，使水稻植株同时表现出矮秆性状和雄性不育，并呈现完全连锁显性遗传。

背景技术

轮回选择是一种周期性的群体改良方法，以遗传背景丰富的群体为基础，经过周期性地反复异交和选择，集结有益基因，使群体内的优良或增效基因频率逐步增加，不良或减效基因频率不断降低；有利于打破优良基因与不良基因间的连锁，不断提高基因重组体水平；在群体不断改良的同时，保持较高的遗传多样性，为新的优良外缘基因最大表达提供广泛的背景基因型，既可快速有效地改良目标性状，又可提高新种质的利用率和适应性，进一步增加群体的遗传多样性和长期保持对重要农艺性状进行改良的遗传潜力^[1，2]，最终使群体得到改良的育种方法。轮回选择尤其适合于对呈数量遗传的性状进行改良，如提高产量及其构成因素、改善种子和植株品质、提高抗病虫性和对不良环境的耐受性等^[3]。如Sprague从1939年开始用轮回选择方法进行玉米改良，然后从不同轮的改良群体中陆续选出了B14、B37、B73、B84等一大批优良自交系。Illinois大学对玉米子粒成分的选择，从1896年开始，经过103轮对高蛋白(IHP)、高油(IHO)、低蛋白(ILP)、低油(ILO)的长期定向选择，证明选择对改变子粒化学成分的巨大作用^[4]。

在轮回选择整个过程中需要不同的植株进行大量的杂交和混合，玉米等异花授粉作物因容易操作，很早就开始大范围的应用并取得了显著的效果。水稻由于是自花授粉作物需要靠人工去雄授粉配制杂交组合，费工费时，杂交组合数量和分离群体规模受到很大限制。尽管目前水稻已经有很多不育系，但是利用雄性不育系时，正常品种需要具有育性恢复能力，有限的细胞质雄性不育系和恢复系资源制约着水稻轮回选择的广泛开展。而光敏核不育材料的利用虽可解决恢复系资源窄的问题，但其本身的育性易受环境影响、异交结实率低等问题又限制着轮回选择育种的快速发展^[5]。此外，单独的雄性不育，只有开花时才能辨认，很难在短时间内大规模地标记区分，势必限制规模的扩大。同时，不育株和可育株同高，导致在授粉时较高植株的花粉有更大的授粉几率，经过几轮选择后，群体有增高的趋势影响作物的丰产性^[6]。因此选择矮秆性状标记雄性不育，不仅可以提高不育株的异交率，又可同时防止群体的逐渐增高。

矮秆性状标记雄性不育性状必须是矮秆性状基因与雄性不育基因完全连锁或紧密连锁，才能达到矮秆性状的植株全是雄性不育，高秆的全是可育植株。但在自然界，矮秆性状基因和雄性不育基因在同一条染色体而且紧密连锁的概率非常低，通过常规的方法先找到显性雄性不育基因和矮秆性状基因再将两个基因聚合，一般很难实现。目前仅在小麦中通过常规杂交育种技术获得了矮败小麦。刘秉华等用太谷核不育小麦作材料，以“矮变一号”为标记供体，从杂交后代群体中筛选到显性不育基因Ms2与显性矮秆基因Rht10在4D染色体短臂呈紧密连锁遗传的材料，其交换率仅为0.18％^[7-10]。实践证明，在水稻中通过常规杂交技术，难以获得雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，创新性地通过基因工程技术获得雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻材料，即矮败水稻。因此，本发明的目的是通过RNAi干扰技术，针对水稻花药发育相关基因和茎杆伸长相关基因，使得两种基因表达下调或沉默，使水稻植株同时表现矮秆性状和雄性不育性状，并且表现为显现完全连锁。其中，本发明所述基因的概念是指包括基因的5’端非编码区、外显子、内含子和3’端非编码区。

首先，花药发育相关基因可以选择对花药发育有重要作用的基因，只要其表达下调或缺失即能导致花粉败育即可。本发明中，优选花药发育相关基因为RTS基因(Ricetapetum-specific gene)。RTS基因主要在减数分裂过程中花药的绒毡层表达，而在开花之前不再表达。其具有高度的特异性，在其他物种中RTS基因的启动子也能特异地在花药中启动基因表达。RTS对水稻花粉发育起关键作用，反义表达RTS基因影响花药的发育，引起绒毡层发育中断，形成无活力的畸形花粉，导致雄性不育。将RTS的启动子与植物内生菌RNA酶基因barnase或者RTS的反义链进行融合转化到水稻中，导致转基因植株的雄性不育，因此RTS基因及其启动子可以应用于培育水稻雄性不育系^[11]。

本发明中利用的对茎杆有伸长作用的基因，包括所有其表达下调或缺失就能导致水稻植株矮化的基因。本发明中，优选茎杆伸长相关基因为水稻赤霉素20氧化酶基因(GA20-氧化酶基因，OsGA20ox2)。决定植物株高的因素很多，但植株体内的赤霉素代谢水平是影响株高的最主要因素。其中，水稻OsGA20ox2基因的突变，导致水稻的半矮秆性状，其突变基因sd-1被称为水稻“绿色革命”基因^[12]。根据基因组全序列分析，水稻OsGA20ox基因家族有4个成员OsGA20ox1，OsGA20ox2，OsGA20ox3和OsGA20ox4，分别位于第3、1、7和5染色体上，其核酸序列同源性在30％-65％之间。其中，OsGA20ox2主要控制水稻茎秆节间的伸长，适度调矮的转基因水稻的其他农艺性状并不发生明显的改变^[12]，该基因已由Toyomasu等于1997年克隆^[13]。乔枫和赵开军等研究表明，OsGA20ox2-RNAi转基因水稻植株的OsGA20ox2表达水平明显下降，表现为半矮化且育性正常，且能稳定遗传^[14]。因此，OsGA20ox2基因非常合适于本发明。

因此利用RNAi技术，选择与株高相关的OsGA20ox2基因的特异片段，通过PCR扩增出。同时选择雄性发育相关基因RTS的特异片段，通过PCR扩增出。再通过重叠PCR技术将上述两个基因片段连接成一个大的片段，利用酶切和连接技术将此大片段转移到植物表达载体的质粒中，构建出发夹结构的RNAi表达载体。通过农杆菌介导法将此RNAi表达载体的发夹结构转到受体水稻基因组中，使雄性发育基因和植株高度基因表达下调或缺失，同时表现出雄性不育与矮秆性状，而其它性状正常或变化很小而不影响植株正常发育，接收野生型植株花粉后能正常受精结实，其后代一半为矮秆性状植株全部雄性不育，另一半植株株高正常全部可育。由此构建出的矮败水稻可以广泛应用到水稻的轮回选择中，对水稻的育种和生产具有积极而深远的影响。

下面对本发明的具体内容进行描述。

本发明提供一种DNA，该DNA包括：(a)整体有义编码DNA片段，它由编码对茎杆有伸长作用的基因任一区域的有义RNA的有义编码基因组DNA片段，与编码花药发育相关基因任一区域的有义RNA的有义编码DNA片段正向连接而成；(b)所述整体有义编码DNA片段的反向序列；(c)间隔区，所述整体有义编码DNA片段通过间隔区与所述整体有义编码DNA片段的反向序列连接；(d)启动子序列，它与通过间隔区连接之后的DNA片段可操作地连接。

其中，所述对茎杆有伸长作用基因是GA20-氧化酶基因OsGA20ox2，所述花药发育相关基因是RTS基因；OsGA20ox2基因的有义编码DNA片段长度为100bp以上至所述基因的全长序列，优选为300-1200bp，更优选为900--1200bp；RTS基因的有义编码DNA片段长度为100bp以上至所述基因的全长序列，优选为200bp以上至所述基因的全长序列。

进一步地，编码GA20-氧化酶基因有义编码DNA片段相应于GenBank登录号AF465255所示序列的第2400位到5182位碱基之间的满足上述长度的任意片段，优选为第2414位到3412位碱基之间上述长度的任意的片段；RTS基因的有义编码DNA片段相应于GenBank登录号U12171.1所示序列的第1225位到1600位碱基之间上述长度的任意的片段，优选为第1272位到1561位碱基之间上述长度的任意的片段。

所述间隔区可基于本领域技术人员的知识可以选择，其只要不影响正向序列和反向序列在表达后形成RNA发夹结构即可，通常而言所述接头长度为1～3000bp，优选为10～1000bp，更优选为400～600bp。

启动子可以采用任何有利于在水稻植株中启动基因表达的启动子，例如水稻肌动蛋白(actin)和玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子，优选为水稻源启动子。

本发明还提供含有上述DNA的表达载体，优选为植物表达载体.相应地，本发明进一步提供含有上述表达载体的细胞系，例如细菌和真菌细胞系。

本发明提供一种培育雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株的方法，利用上述表达载体转化水稻，在转化的水稻植株中选择雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株，优选包括进一步培育植株获得雄性不育与矮秆性状同时表现并能稳定遗传的水稻品种。

上述方法具体步骤包括：根据花药绒毡层发育关键基因RTS的序列，设计引物，通过PCR扩增获得相应片段。根据株高相关基因OsGA20ox的序列，设计引物，通过PCR扩增获得相应片段。然后，通过PCR或连接酶将上述两片段连接成一个大片段。通过正向和反向连接到RNAi表达载体中，构建载体称为发夹RNAi表达载体(因为在植物中转录形成的RNA可以形成发夹形状的结构)。接着，将此发夹RNAi表达载体转化到水稻基因组中，达到使矮秆植株为雄性不育并在遗传上呈现出完全连锁。

转化水稻的方法可根据本领域常规知识来选择，例如基因枪法、农杆菌介导法、PEG介导法或花粉管通道法等，本发明中采用的转化方法优选为农杆菌介导法。转化水稻的表达载体可根据选择的转化方法来确定。

转化水稻的原始品种可以是生产中需要的水稻品种，包括粳稻和籼稻，本发明优选的品种是水稻粳稻品种。

本发明的有益效果在于，首次利用RNAi技术培育出矮秆和雄性败育同时表现的水稻，而其它性状正常或变化很小而不影响植株正常发育，接收野生型植株花粉后能正常受精结实，其后代一半为矮秆植株全部雄性不育，另一半植株株高正常全部可育。本发明获得的矮败水稻可以广泛应用于水稻的轮回选择，可非常方便地用于培育水稻新品种。

附图说明

图1反向载体构建流程图。其中，1以水稻品种农院238(简称238)基因组DNA为膜板，利用带有酶切位点的引物扩增出RTS基因片段rtsR，其带有SacⅠ酶切位点和能与inf12R连接的序列inf；2以水稻品种QX1基因组DNA为膜板，利用带有酶切位点的引物扩增出OsGA20ox2基因片段inf12R，其带有SpeⅠ酶切位点和能与rtsR连接的序列Rts；3将rtsR与inf12R按1∶1混合，用引物RTSF-Sa/InfR-SP，通过重叠PCR技术将rtsR与inf12R连接成一个大的片段ira；4将ira与pGEM-T easy载体连接，获得的载体命名为IRA。

图2用引物RTSF-Sa/RTSR-Inf进行PCR扩增，获得rtsR的电泳图。

图3用引物InfF-Rts/InfR-SP进行PCR扩增，获得inf12R的电泳图。

图4用引物RTSF-Sa/InfR-SP通过PCR扩增，将片段rtsR与inf12R连接成片段ira的电泳图。

图5将IRA质粒用限制性内切酶SacⅠ和SpeⅠ进行双酶切后的电泳图。

图6正向载体构建流程图。以IRA载体为模板，用引物RTSF-B/InfR-K进行PCR扩增，所得DNA片段命名为irs，其含有限制性内切酶酶切位点BamHⅠ和KpnⅠ；将irs与pGEM-T easy载体连接，获得的载体命名为IRS。

图7以IRA载体为模板，用引物RTSF-B/InfR-K进行PCR扩增irs的电泳图。

图8IRS质粒用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切的电泳图。

图9载体IRSACK构建流程图。将质粒IRA和质粒PTCK303用限制性内切酶Spe1/Sac1分别进行双酶切，分别回收IRA酶切小片段ira和PTCK303大片段，然后二者进行连接，所获载体命名为IRACK；将质粒IRS和质粒IRACK用限制性内切酶BamHⅠ/KpnⅠ分别进行双酶切，分别回收IRS酶切小片段ira(1289bp)和IRACK大片段，然后二者进行连接，所获发夹RNAi载体命名为IRSACK。

图10质粒IRA用限制性内切酶Spe1/Sac1进行双酶切后的小片段ira电泳图。

图11质粒PTCK303用限制性内切酶Spe1/Sac1进行双酶切的大片段电泳图。

图12IRACK质粒用限制性内切酶Spe1/Sac1双酶切的电泳图。

图13质粒IRS用限制性内切酶BamHⅠ/KpnⅠ进行双酶切后的小片段irs电泳图。

图14质粒IRACK用限制性内切酶BamHⅠ/KpnⅠ进行双酶切后的大片段电泳图。

图15IRSACK质粒用限制性内切酶BamHⅠ/KpnⅠ双酶切后的电泳图。

图16IRSACK质粒分别用限制性内切酶组合BamHⅠ/KpnⅠ、Spe1/Sac1、BamHⅠ/Spe1、KpnⅠ/Sac1和BamHⅠ/Sac1进行双酶切后的电泳图。其中，1(BamHⅠ/KpnⅠ)符合ira(1289bp)片段大小；2(Spe1/Sac1)符合irs(1289bp)片段大小；3(BamHⅠ/Spe1)符合ira+intron(1767bp)片段大小；4(KpnⅠ/Sac1)符合irs+intron(1767bp)片段大小；5(BamHⅠ/Sac1)符合ira+irs+intron(3056bp)片段大小。

图17转基因植株DNA用引物RTSF-B/In-cla进行PCR扩增后的电泳图。其中，泳道1、2、3、5和6为矮秆不育植株，泳道9为IRSACK质粒(阳性对照)，结果都扩增出预期的DNA片段(1371bp)。泳道4为非矮化可育植株，泳道7为农院238(阴性对照)，泳道8为吉粳88(阴性对照)，没有扩增出DNA片段。

图18矮秆不育植株。

图19矮秆不育植株的花药。

图20通过I₂-KI法对矮秆不育植株的花药染色镜检。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法和所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规方法和自常规生化试剂商店购买得到的。常规分子生物学实验方法可参见分子克隆：实验指南，J.Sambrook，等编著，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，N.Y.，1989。下述实施方式仅仅是示意性的，并不是意图对本发明保护范围进行限制，例如选择材料仅仅作为例子来使用，本发明并不局限于这些材料本身。

实施例一、发夹RNAi表达载体IRSACK的构建

一、材料

1、供试水稻品种：水稻粳稻市售品种：QX1、农院238、吉粳88。

2、菌株：大肠杆菌(Escheriehia coli)DH5a和DH10B。

3、载体：pGEM-Teasy载体购自promega公司；RNAi载体pTCK303，其构建方法可参见ZHENWANG et al.A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice (Oryzasativa L.).Plant Molecular Biology Reporter 22：409-417.December 2004

2004 InternationalSociety for Plant Molecular Biology.Printed in Canada。中国农业科学院作物研究所也有保存。

二、方法

1、引物设计

(1)根据RTS基因序列(参见GenBank登录号U12171.1)设计出能扩增出rts全部片段(长290bp)的一对引物RTSF和RTSR，序列如表1所示。

表1参考引物RTS

序列号	引物名称	5′-＞3′	长度
				SEQ ID NO.1	RTSF	GCAATGGTGAGAGTTGCTGCCG	22
SEQ ID NO.2	RTSR	AATCAGAGCGAGGTGGAGCAGC	22

(2)在RTSF引物的基础上，设计出分别含有限制性内切酶酶切位点BamHⅠ和SacⅠ的引物RTSF-B和RTSF-Sa；在RTSR引物的基础上，设计出不带酶切位点能和inf12片段连接的引物RTSR-Inf，其序列如表2所示。

表2RTS引物

(3)根据OsGA20ox2基因序列(参见GenBank登录号AF465255)，设计出分别含有限制性内切酶酶切位点KpnⅠ和SpeⅠ的引物InfR-K和InfR-Sp；设计出不带酶切位点能和rts片段连接的引物InfF-Rts，其序列如表3所示。

表3OsGA20ox2引物

2、载体构建

A.反向连接载体IRA的构建

具体构建流程参见图1。

(1)以水稻品种农院238的基因组DNA为模板，用引物RTSF-Sa/RTSR-Inf进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果扩增出的DNA片段与预计大小(290bp)一致(见图2)，其序列如SEQ ID NO.9中第12位至第301位所示[对应GenBank登录号为U12171.1中第1272位到第1561位]。此片段含有限制性内切酶酶切位点SacⅠ和能与inf12R连接序列，将此片段回收纯化，命名为rtsR(290bp)。其中，PCR反应参数如下：

PCR反应体系如下：

反应参数：94℃变性5分钟，然后进入PCR循环，即94℃1min，55℃50秒、72℃30秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。

(2)以水稻品种QXl基因组DNA为模板，用引物InfF-Rts/InfR-SP进行PCR扩增(反应体系见下表)，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果扩增出的DNA片段与预计大小(999bp)一致(见图3)，其序列如SEQ ID NO.10中第14位至第1012位[对应GenBank登录号为AF465255中第2414位到第3412位]，其含有限制性内切酶酶切位点SpeⅠ和能与rtsR连接片段，将此片段回收纯化，命名为inf12R。其中，PCR反应参数如下：

PCR反应体系如下：

反应参数：94℃变性5分钟，然后进入PCR循环，即94℃1min，56℃1min、72℃90秒，共进行39个循环，最后72℃延伸10分钟。

(3)将片段rtsR与inf12R按1∶1混合，以此为DNA模板，用引物RTSF-Sa/InfR-SP，通过重叠PCR技术连接成一个大的DNA片段，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果扩增出的DNA片段与预计大小(1289bp)一致(见图4)，其含有限制性内切酶酶切位点SacⅠ和SpeⅠ，将此片段回收纯化，并命名为ira。其中，PCR反应参数如下：

PCR反应体系如下：

反应参数：94℃变性5分钟，然后进入PCR循环，即94℃1min，56℃1min、72℃90秒，共进行39个循环，最后72℃延伸10分钟。

(4)将以上扩增的DNA片段从琼脂糖凝胶中回收，回收产物连接到pGEM-T easy载体上。将连接产物通过电激转化到DH5α感受态细胞，在含100mg/L Amp的LB培养基上生长14-20个小时，通过蓝白菌落筛选，挑选白色单菌落，培养过夜，提取质粒，用SacⅠ和SpeⅠ进行酶切，酶切产物在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳检测，结果编号为4(左数第3泳道)的质粒中含有的DNA片段与预计大小(1289bp)一致(见图5)。对这个克隆进行测序，BLASTN分析结果完全符合目标片段。用引物RTSF-Sa/InfR-SP将rtsR和inf12R链接成的片段与pGEM-T easy载体连接，所得重组载体命名为IRA。

B.正向连接载体IRS的构建

具体构建流程如图6所示。

(1)以IRA载体为模板，用引物RTSF-B/InfR-K进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果扩增出的DNA片段与预计大小(1289bp)一致(见图7)，其含有限制性内切酶酶切位点BamHⅠ和KpnⅠ，将此片段回收纯化，命名为irs。其中，PCR反应参数如下：

PCR反应体系如下：

反应参数：94℃变性5min，然后进入PCT循环，即94℃1min，56℃1min、72℃120秒，共进行39个循环，最后72℃延伸10分钟。

(2)将irs扩增片段电泳检测，回收纯化，连接到PGEM-T easy载体上，经测序验证，重组载体命名为IRS。具体操作如下：

将图7中扩增的DNA片段从琼脂糖凝胶中回收，回收产物连接到pGEM-T easy载体上。将连接产物通过电激转化到DH5α感受态细胞，在含100mg/L Amp的LB培养基上生长14-20个小时，通过蓝白菌落筛选，挑选白色单菌落，培养过夜，提质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ进行酶切，酶切产物在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳检测，结果编号为1、3、4和5的质粒中含有的DNA片段与预计大小(1289bp)一致(见图8)。将编号为1(左数第1泳道)的克隆进行测序，BLASTN分析结果完全符合目标片段。IRA为模板用引物RTSF-B/InfR-K扩增的片段与pGEM-T easy载体连接，所得重组载体命名为IRS。

C.发夹RNAi表达载体IRSACK的构建

具体构建流程如图9所示。

(1)将质粒IRA和质粒pTCK303用限制性内切酶Spe1/Sac1分别进行双酶切，在1％的琼脂糖凝胶中检测，分别回收IRA酶切小片段ira(1289bp)(见图10)和pTCK303大片段(见图11)，然后二者进行连接。将连接产物电激转化到DH10B感受态细胞中，在50mg/L Kan的LB平板上筛选阳性克隆。挑取单菌落，抽提质粒，选其中的4个，用限制性内切酶Spe1/Sac1双酶切检测连接效果，结果显示4个克隆连接上目的片段(见图12)，且命名其中一个质粒为IRACK。

(2)将质粒IRS和质粒IRACK用限制性内切酶BamHⅠ/KpnⅠ分别进行双酶切，在1％的琼脂糖凝胶检测，分别回收IRS酶切小片段irs(1289bp)(见图13)和IRACK大片段(见图14)，然后二者进行连接。将连接产物电激转化到DH10B感受态细胞中，在50mg/L Kan的LB平板上筛选阳性克隆。挑取单菌落，抽提质粒，再用限型内切酶BamHⅠ/KpnⅠ双酶切检测连接效果，结果显示其中的1个克隆连接上目的片段(图15，左数第3泳道)，将这个质粒命名为IRSACK。

(3)对IRSACK质粒，分别用限制性内切酶组合BamHⅠ/KpnⅠ、Spe1/Sac1、BamHⅠ/Spe1、KpnⅠ/Sac1和BamHⅠ/Sac1进行双酶切，酶切产物在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳检测，结果显示出的酶切片段与预计大小一致：ira：1289bp、irs：1289bp、ira+intron：1767bp(478+1289)、irs+intron：1767bp(478+1289)、ira+irs+intron：3056(1289+1289+478)(见图16)。最后对IRSACK质粒进行测序验证，经BLASTN分析测序结果完全符合目标片段。

在上述构建发夹RNAi表达载体过程所用的实验操作方法，基本参考目前已知的常规技术，例如可以参见冷泉港实验室编著的《分子克隆实验指南》中提供的实验操作方法。为了完整披露本发明信息以更好理解本发明，下面描述本发明在上述载体构建过程中所用到的实验方法，但具体实施本发明时并不局限于这些具体的实验方法。

1、水稻总DNA的提取

(1)取水稻叶片3-5g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉末，倒入50ml离心管中。

(2)加入20ml预热到65℃的CTAB提取液(2％(W/V)CTAB，100m mol/L Tris·cl，PH8.0，20m mol/L EDTA，PH8.0，1.4mol/LnaCI)，摇匀。65℃水浴保温30分钟，并时不时摇动几下。

(3)7500g，离心15分钟；转移上清液至另一离心管中。

(4)加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，在摇床上摇动20分钟；7500g，离心15分钟；转移上清液至另一离心管中。

(5)加入等体积的氯仿，在摇床上摇动20分钟；7500g，离心15分钟；转移上清液至另一离心管中。

(6)加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)(用800ml水溶解408.3克三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，用水定容至1L，并经高压灭菌)，2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，混匀后放置-20℃过夜。

(7)用毛细管勾起DNA，将DNA转移到1.5ml离心管中，经70％乙醇漂洗2次，超净台上吹干，溶解于0.1-0.2ml 1xTE。

(8)用紫外分光光度计测定A₂₆₀、A₂₈₀及其比值。取1μl溶液，稀释10倍，用已知浓度的λDNA通过琼脂糖电泳，检测DNA浓度和质量。

2、特异片段的回收纯化

采用宝生物工程(大连)有限公司产品(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2)将PCR产物回收纯化。具体操作方法如下：

(1)使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

(2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

(3)碎胶块，胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。

(4)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μl进行计算。

(5)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。

(6)均匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热)。此时应间断震荡混合，使胶块充分融化(约6-10分钟)。

(7)向上述胶块融化液加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400bP的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。

(8)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

(9)将上述操作7的溶液转移至Spin Colunm中，3600rpm，1分钟(如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1分钟)，弃滤液。

(10)将500μl的Rinse A加入Spin Colunm中，3600rpm，30秒，弃滤液。

(11)将700μl的Rinse B加入Column中，3600rpm，30秒，弃滤液。

(12)重复步骤11，然后12000rpm，1分钟。

(13)将Spin Colunm安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Colunm膜的中央处加入25μl的水或洗脱液，室温静置1分钟。其中，把水或洗脱液加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。

(14)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。

3、回收产物的连接

将回收纯化的PCR产物连接到

-T Easy Vector(Promega)，连接反应如下：

(1)离心

-T Easy Vector数秒，收集离心管底部内含物，2×Ripid LigationBuffer使用前剧烈摇动。

(2)0.5ml离心管中加入：10×Rapid Ligation Buffer，1.0μl、

-T Easy载体(10ng/μl)，1.0μl、PCR产物，7.0μl、T₄DNA连接酶(3U/μl)，1.0μl，总计10.0μl。离心几秒，混合。

(3)将上述混合液放到16℃水浴锅中16h。

(4)取5μl连接液至透析膜上对灭菌双蒸水30分钟。吸取透析液加入0.5ml离心管中，冰上进行。

(5)从-70℃取出感受态细胞，置于冰浴中，直到融化，约5分钟。轻轻混匀细胞后取20μl细胞转移到步骤4的离心管中，轻轻混合，置于冰上。

(6)采用电激法转化，在2KΩ。，330μF，330-350v进行电激。将转化液转入装有SOC液体培养基的离心管中，37℃，约180rpm，培养40分钟。

(7)取100μl培养液于LB/Amp/IPTG/X-Gal培养皿，37℃培养16-20小时。

(8)观察结果，挑选白菌落。

其中用到的试剂如下：

Amp(50mg/ml)：100mg Amp加2ml去离子水500ml，过滤灭菌；IPTG(0.IM)：1.2gIPTG加水50ml，过滤，4℃贮存；X-Gal(50mg/ml)：100mg 5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷溶于2ml二甲基甲酰胺溶液。用铝箔包裹以防因光照而被破坏，-20℃贮存，须过滤。

LB培养基(IL)：10g trypton，5g酵母抽提物，5g NaCl，再用Na0H调pH至7.0(固体时再加15g琼脂)；SOC培养基(100ml)：2.0g trytone，0.5g酵母抽提物，1.0ml 1MNaCl，0.25ml 1M KCl，1.0ml lM Mg²⁺母液，1.0ml 2M glucose。

LB/Amp：终浓度为100μg/ml的Amp浓度，将平板置于4℃保存；LB/Amp/IPTG/X-Gal：在LB/Amp上加100μl的0.1MIPTG和20μl的50mg/m1X-Gal。

4、DH5α感受态细胞的制备

(1)取菌DH5α于LB固体培养基上划平板，37℃，培养过夜。

(2)当天晚上配置SOB培养基(SOB培养基：tryptone，20g、酵母抽提物，5g、5M NaCl，2.0ml、1M KCl，2.5ml，加去离子水1000ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌)，10％甘油灭菌(10％甘油：639丙三醇(约50ml)加去离子水至500ml，灭菌)。

(3)次日上午接种：接单菌落到2mlSOB培养基里，37℃，200-250rpm振荡培养6小时。

(4)上述菌液加入到400ml SOB的1L大烧瓶内，37℃，250rpm，约3小时后，测OD₅₅₀值，以后每几分钟测一次。OD₅₅₀在0.65-0.77时，立即停止摇荡，取出放于冰水中迅速摇动至完全冷却。以下操作必须在冰上进行。

(5)将上述菌液分装于50ml离心管中，2,200g(g＝rcf)，0℃，离心11分钟。

(6)倒出上清，加30ml 10％灭菌甘油，在冰水中摇荡至沉淀完全溶解，2,400g，0℃离心，13分钟。

(7)重复第6步，倒去上清，待有絮状菌体出现时停止倾倒，把所有絮状菌体转入同一个50ml离心管中，再次离心。

(8)用枪吸去上清夜，仅留少部分甘油，和沉淀物充分混匀，约800-900μl(400ml SOB约制备800-900μl感受态细胞)。以40μl/管的剂量分装入1.5ml的离心管中，放置-80℃保存即可。

5、重组子鉴定

A.质粒提取及酶切鉴定

采用SDS碱裂解法制备质粒DNA，所用试剂如下：

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·CI(PH8.0)，10mmol/L EDTA(PH8.0)；灭菌，4℃贮存。

溶液II：0.2mol/LNaOH(临用前用10mmol/L贮存液现用现稀释)，1％SDS；混匀，置于室温。

溶液III：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，加水28.5ml混匀，置于冰上。

无DNA酶的胰RNA酶：将胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/L Tris(pH7.5)，15mmol/LNaCI中配成10mg/ml浓度，于100℃，加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

B.细胞的制备

(1)2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml并通气良好(不盖紧)的试管中，然后接入一单菌落，于37℃，250rpm剧烈振摇下培养过夜。

(2)取1.5ml培养物倒入微量离心管中，4℃以12,000g离心30秒(或6.000g，2分钟)。将剩余的培养物加等体积的40％甘油，贮存于-20℃(可用于测序)。

(3)倒去上清夜，后稍离心数秒，用枪头吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

C.细胞的裂解

(4)将细菌沉淀悬浮于120μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

(5)170μl新配制的溶液II，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，切勿振荡。(将离心管放置于冰上)。

(6)170μl用冰预冷的溶液III，小心颠倒离心管数次，使溶液m在粘稠的细菌裂解物中分散均匀将管置于冰上10分钟以上。

(7)加等体积(460μl)的氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈振荡混合有机相和水相，然后4℃以12,000g离心5分钟。将上清液转移到另一离心管中。

D.质粒DNA的回收

(8)加1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)，再加2倍体积的无水乙醇沉淀核酸，振荡混合。于-20℃放置30分钟(或-70℃，15分钟)。

(9)用微量离心机于4℃以12,0009离心12分钟，收集沉淀的核酸。

(10)小心吸去上清液，将离心管置于纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。

(11)加1ml 70％乙醇于沉淀中并将盖紧的试管颠倒数次，4℃(放置1小时更好)以12，000g离心2分钟，回收DNA。

(12)重复步骤10，11。

(13)小心吸去上清液，将离心管置于纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。

(14)在空气中干燥核酸沉淀(大片段DNA)，或热板50℃(小片段DNA)5-10分钟。

(15)用30-50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的1xTE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。

E.酶切检测质粒

在1.5ml离心管中加入：质粒DNA 3.0μl，10×H Buffer 2.0μl，EcoR I(5U/μl)1.0μl，加ddH₂O 14.0μl，总计20.0μl，于37℃，酶切l小时。

菌液PCR检测和酶切检测质粒符合预期结果后进行测序。

6、表达载体的构建

A.提取质粒DNA

用于构建载体的质粒采用UltraPure^TM质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒。具体操作方法如下：

(1)将3-5ml菌液13,000rpm离心30秒收集沉淀(菌体)。如果用1.5ml或2ml离心管则需反复离心2-3次。

(2)倒掉上清，将沉淀(菌体)完全悬浮于100μl悬浮液(溶液I)中。上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干或短暂离心后吸去上清。

(3)加入200μl裂解液(溶液II)，轻柔地颠倒混匀4-6次，溶液逐渐变得粘稠、清亮。不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂；裂解时间不宜超过5分钟，否则会造成染色体DNA的污染。

(4)加入150μl中和液(溶液III)，轻柔地颠倒混匀4-6次，此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。

(5)13,000rpm离心8-10分钟，将上清液小心转移到1.5ml或2ml离心管中，然后加入450μl纯化树脂(使用前充分混匀)，混匀3分钟。此步是通过离心去除染色体DNA及细菌碎片，并使处于高盐状态下的质粒DNA与纯化树脂结合。

(6)13,000rpm离心5秒，小心去除上清。用1ml 80％，异丙醇(或80％乙醇)将纯化树脂悬浮起来。13,000rpm离心5秒，小心去除上清。此步是洗涤质粒DNA中混有的杂质及盐类。

(7)用450μl 80％异丙醇(或80％乙醇)将纯化树脂悬浮起来，转移到离心纯化柱中，13,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。如果纯化柱底部残留有异丙醇(或乙醇)，可用滤纸吸干，否则将影响以后的酶促反应。

(8)将纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，加入50μl TE缓冲液或超纯水，静置1-3分钟后，13.000rpm离心1分钟。此步是将纯化树脂上的DNA洗脱下来。如果对质粒DNA的需求较大的话，则重复此步骤1-2次，这样可以获得高产量的质粒DNA。

(9)离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取1-2μl电泳(0.8％琼脂糖，120V，15-20分钟)检测其纯度并目测定量。若发现有RNA污染，可加入0.5μl RNaseA(10mg/ml)，37℃保温30分钟。此操作不影响其后续实验。

B.质粒DNA的酶切及其产物的纯化

(1)取上述质粒DNA 1.0-2.0μg，加入相应酶的10×缓冲液2.0μl，最后加入相应的限制性内切酶，混匀酶切反应体系，37℃酶切2-4小时。

(2)在1％的琼脂糖凝胶上电泳，分离片段。

(3)凝胶成像照相后，紫外下切割目的片段，采用凝胶回收试剂盒回收目的片段，同上。

(4)取2μl在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测回收目的片段大小和浓度。

C.DNA的连接

(1)按外源片段和载体比为1∶1-10∶1的量，加入相应量的片段。取回收的目的片段20-50ng，进行连接。

(2)加入10×T₄Ligation Buffer 1.0μl，3U T₄ DNALigase(Promega)，总体积不超过10μl。

(3)将上述混合液放到16℃水浴锅中16h。

(4)结束后将反应液取5μl至透析膜上对超纯水于4℃透析20分钟，取连接产物和20μl感受态细胞混合，进行电激转化。参数2KΩ。，330μF，330-350V。

(5)电激后将菌体转入1mlSOC中，37℃200rmp培养50分钟。后铺板于含卡那霉素(kan，50mg/L)的LB培养皿上。

D.连接产物的重组子鉴定

(1)挑取单菌落于相应的抗生素LB中，摇菌37℃过夜培养。

(2)采用碱裂解法提取质粒。

(3)取上述质粒DNA 1.0-2.0μl，加入相应酶的10×Buffer 2.0μl，最后加入相应的限制性内切酶，混匀酶切反应体系，37℃酶切2-4小时。

(4)在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测分离片段大小，是否和预计插入片段相符。如有必要，还可测序分析插入序列。

实施例二、发夹RNAi表达载体IRSACK转化水稻

一、材料

(1)水稻转化受体材料：水稻粳稻品种农院238和吉粳88。

(2)菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a和DH10B和根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacieus)菌株EHA105。

二、方法

1、农杆菌感受态细胞的制备

(1)将根癌农杆菌EHA105划板于LB(含利福平40mg/L形f)固体培养基上，28℃培养2-3天，挑取单菌落。

(2)把EHA105单菌落接种于2ml SOB培养液，12小时后取种子液，接种于400mlSOB培养液中，28℃，180rmp，培养至OD₅₅₀。＝0.5-0.6。以下操作在冰上进行。

(3)2200rpm，4℃，离心10分钟收集农杆菌，菌体用10％甘油悬浮。

(4)2500rpm，4℃，离心10分钟，收集菌体，去掉上清。再用10％甘油悬浮菌体。

(5)2500rpm，4℃，离心10分钟，收集菌体，去掉上清。加少量10％甘油重悬菌体，将农杆菌菌液分装到预冷的1.5ml离心管中，-70℃保存备用。

2、电激转化农杆菌

(1)用实施例一中构建好的发夹RNAi表达载体IRSACK，通过电激转化上述制备的感受态农杆菌细胞EHA105。电激参数为：200Ω，1700V，25μF。电激后将菌体转入1mlSOC中。

(2)28℃，摇菌2-3小时后，取10μl按梯度涂布于含卡那霉素Kan(50mg/L Kan)和利福平Rif(40mg/L Rif)的固体培养基上。

(3)2天后，挑单菌落接种与含相应抗生素LB液体培养基中培养，抽提质粒，并且保存于20％的甘油中。

3、表达载体IRSACK在农杆菌中的稳定性检测

用相应限制性内切酶切割用表达载体IRSACK转化的农杆菌和含表达载体IRSACK的大肠杆菌中提取的质粒，观察二者的酶切带型是否一致。如果从农杆菌中所提质粒酶切效果不好，可以将此质粒电激导入大肠杆菌，再用相应的限制性内切酶进行酶切，观察酶切带型是否和预计一致。选择表达载体IRSACK在农杆菌中稳定的农杆菌于-70℃保存，以用于转化水稻。

4、农杆菌介导水稻遗传转化

(1)水稻基本培养基试剂配方

(2)植物激素母液配方

1)1.0mg/ml 2，4-D母液

①称取100mg 2，4-D，置于小烧杯内；

②加少量无水乙醇使之完全溶解；

③把2，4-D酒精溶液缓缓加入磁力搅拌器上的水中，如果出现沉淀，需要重新配制；

④定容至100ml，4℃保存。

2)1.0mg/mlα-NAA母液

①称取10Omgα-AA置于小烧杯内：

②用1N的KOH溶液溶解NAA；

③用水定容至100ml，4℃保存。

3)1.0mg/ml 6-BA母液

①称取100mg6-BA置于小烧杯内：

②加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；

③用水稀释并定容至100ml，4℃保存。

4)1mg/ml KT

称取100mg Kenetin，用少量1N KOH溶解，用水稀释定容至100ml，过滤灭菌后，分装入无菌小管中，-20℃保存。

5)100mM乙酰丁香酮(As)

称取196.2mg As，用5ml DMSO直接溶解，定容至10ml，分装入无菌小管中，-20℃保存。

(3)水稻培养基

诱导及继代培养基：N₆培养基十2.0mg/L 2，4-D+500mg/L脯氨酸+300mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3.0mg/L Phytagel；pH5.9

预培养培养基：N₆培养基+2.0mg/L 2，4-D+600mg/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+7.0g/L Agar+10.0g/L Glueose+100μmol/L As；PH5·6

共培养培养基：N₆培养基+2.0mg/L 2，4-D+800mg/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+7.0g/LAgar+10.0g/L Glueose+100μmol/L As；PH5·6

筛选培养基：N₆培养基十2.0mg/L 2，4-D+600mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7.0g/L Agar+50mg/L LHyg+200mg/L Carb：PH6.0

预分化培养基：MS培养基+2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L KT+0.2mg/LNAA+0.2mg/LIAA+600mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7.0g/L Agar+50mg/LHyg+200mg/L Cab；PH5.9

分化培养基：Ms培养基+2.0mg/L 6-BA+2.O mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.2mg/LLAA+1.0g/L 水解酪蛋白+30g/L 蔗糖+3.0g/L；Phytagel：pH6.0

生根培养基：1/2MS大量培养基+1/2MS微量培养基+铁盐+MS有机+20g/L蔗糖+3.0g/L Phytagel；PH5.8

农杆菌悬浮培养基：1/2N₆培养基+2.0mg/L 2，4-D+800mg/L水解酪蛋白+20mg/L蔗糖；PH5.4

YEB培养基：蛋白陈5g，酵母提取液1g，牛肉浸膏5g，蔗糖5g，MgSO₄·7H₂O 0.4929g，加水溶解，调节pH至7.0，定容至1000ml。若配制固体培养基加Agar15g/L，高压灭菌。

(4)胚性愈伤组织的诱导和继代培养

1)将农院238和吉粳88号各1000粒成熟种子剥去颖壳，用75％乙醇浸洗1分钟，转入0.1％升汞浸泡15分钟，再用灭菌超纯水冲洗5次后用滤纸吸干。

2)将种子置于愈伤组织诱导培养基上，25℃，暗培养3-4周。

3)从种子盾片附近长出的愈伤组织块剥离下来，置愈伤组织继代培养基上继代2-3次(每代15天)，25℃，暗培养。

4)然后转移到预培养基上25℃，暗培养一周，即可获得用于转化的愈伤组织。

(5)农杆菌的活化

将-70℃保存的发夹RNAi表达载体IRSACK的农杆菌划板于含Kan(50mg/L)和Rif(40mg/L)的LB固体培养基上，28℃暗培养2-3天，取单菌落摇菌于含相应抗生素的液体培养基YEB中，于28℃培养2天。离心收集农杆菌体，用悬浮液调节菌液浓度为D₆₀₀＝0.8-1.0，用于浸染愈伤组织。

(6)农杆菌浸染及共培养

挑取淡黄色、致密、颗粒状的胚性愈伤组织于小玻璃瓶中，用上述调节好浓度的农杆菌浸泡愈伤组织20分钟，期间摇动几次。取出愈伤组织，用滤纸吸去菌液，置于超净台中，用无菌风吹，然后转移到共培养基上，于25℃暗培养3天。

(7)抗性愈伤组织的筛选

将上述共培养后的愈伤组织取出，用无菌水冲洗5-7次后，在400ppm羧苄青霉素的无菌水中浸泡30分钟，取出愈伤组织置于滤纸上，在超净台里吹干(5个小时以上)。干燥后的愈伤组织转移到筛选培养基上，筛选2次，每次2周。

(8)抗性愈伤组织的预分化和分化

挑选直径为1-2mm生长状态好、结构致密、淡黄色的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基上，于25℃暗培养一周，然后转移至分化培养基上，于28℃，光照培养3-4周，愈伤组织开始分化出小苗。

(9)转化植株的生根培养和移苗

将3-4cm的幼苗转入生根培养基里，于28℃，光照培养，待根系生长良好后，打开瓶口，练苗1周，然后转移到温室或试验基地中生长。

实施例三转基因植株的矮化程度和育性

为了验证矮秆和花粉败育性状同时表现的转基因植株确系由本发明采用的RNAi技术导致的，选择转基因植株进行PCR扩增验证是否存在转化的基因序列。上游引物采用RTSF-B，下游引物根据RNAi载体pTCK303中的内含子(Intron)序列设计的引物In-cla(5′-＞3′GAGGCGGTACAATGATCA ACCATGA)，选择实施例二制备的转基因植株进行PCR扩增。其中，PCR扩增参数如下：

反应体系为：

反应参数：94℃变性5分钟，然后进入PCT循环，即94℃ 1min，56℃ 1min、72℃90秒，共进行37个循环，最后72℃延伸10分钟。

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果矮秆不育植株和表达载体IRSACK质粒扩增出有与预计大小(1371bp)一致的DNA片段(见图17)，而对照和没有矮化可育的植株没有扩增出此片段。

检测转化结果表明，农院238号共分化出1895棵转基因植株，完成抽穗开花的有955棵，通过I₂-KI法对花药染色镜检，花粉败育率达90％以上共有11棵，其中达99％有3棵，100％有6棵，其平均株高35.7cm，最高50cm，最矮26cm(图18是矮化不育植株照片)。吉粳88号共分化出1904棵转基因植株，完成抽穗开花的有774棵，通过I₂-KI法对花药染色镜检，花粉败育率达90％以上的共有39棵，其中败育率达99％有12棵，其平均株高35.5cm，最高50cm，最矮22cm，败育率达100％有17棵，其平均株高29.8cm最高57cm最矮18cm。这些矮秆不育植株的花药都发白，细小，有些呈镰刀状弯曲(如图19)。花粉镜检照片如图20所示，将花粉败育率达到99％以上植株各选一穗在未开花前套袋，在收获时检查结实率，结果所有套袋穗结实率为0％。上述实验结果表明通过将发夹RNAi表达载体IRSACK转化水稻，可以获得矮秆和花粉败育同时表现的水稻植株，进一步可以培育出矮秆和败育同时表现的水稻品(系)种。

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Claims (7)

1.一种DNA，其特征在于：该DNA包括：(a) 整体有义编码DNA片段，它由对茎杆有伸长作用的GA20-氧化酶基因序列如SEQ ID NO. 9中第12位至第301位所示序列，与编码花药发育相关的RTS基因序列如SEQID NO.10中第14位至第1012位所示序列正向连接而成；(b) 所述整体有义编码DNA片段的反向序列；(c) 间隔区，所述整体有义编码DNA片段通过间隔区与所述整体有义编码DNA片段的反向序列连接；(d)启动子序列，它与通过间隔区连接之后的DNA片段可操作地连接。

2.根据权利要求1所述的DNA，其特征在于：所述间隔区长度为400~600bp。

3.含有权利要求1或2所述的DNA的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其为植物表达载体。

5.一种培育雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株的方法，其包括以下步骤：

利用权利要求3所述的表达载体转化水稻，在转化的水稻植株中选择雄性不育与矮秆性状同时表现的水稻植株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：转化水稻采用基因枪法、农杆菌介导法、PEG介导法或花粉管通道法。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：转化水稻的受体品种是水稻粳稻品种或籼稻品种。

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