CN101314776A

CN101314776A - 二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因及其所编码的蛋白质

Info

Publication number: CN101314776A
Application number: CNA2008100224153A
Authority: CN
Inventors: 刘大钧; 马璐琳; 王秀娥; 亓增军; 陈佩度; 曹爱忠; 邢莉萍
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2008-07-11
Filing date: 2008-07-11
Publication date: 2008-12-03
Anticipated expiration: 2028-07-11
Also published as: CN101314776B

Abstract

本发明公开了一个二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(Ta－UGT)及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域。二磷酸尿核甘葡萄糖基因(Ta－UGT)的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，该基因来自小麦(Triticum asetivum L.)望水白，为小麦中首次报道，受deoxynivalenol(DON)诱导增强表达。试验证明，该基因的过量表达可以提高植物对DON的抗性。Ta－UGT导入易感赤霉病小麦品种，有望降低小麦籽粒中DON的含量。

Description

二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因及其所编码的蛋白质

一、技术领域：

本发明公开了一个来自小麦(Triticum asetivum L.)望水白的二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(Ta-UGT)及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域，该基因导入易感赤霉病小麦品种，可能降低小麦籽粒中DON的含量。

二、背景技术：

小麦赤霉病(FHB)是一种真菌性病害，现在已经变成了一个世界范围的破坏性疾病。它能对小麦，大麦等小禾谷类以及玉米等作物产生病害而直接造成作物减产。另一方面，收获的粮食由于被deoxynivalenol(DON)和其他一些trichothecenetoxins的污染而影响了品质。这些毒素对人和动物都是非常有害的。在这类毒素中，DON是包括中国在内的许多国家的粮食中最普遍存在的一类毒素。为了保护消费者的安全，目前很多国家都对小麦面粉中DON的含量做出了一定的限制。

人们最早将小麦对赤霉病的抗性分为抗侵染(Type I)和抗扩展(Type II)两种类型。后来的研究发现抗病品种存在能够阻止毒素DON合成或促使其降解的因素，于是又提出了第三类抗性(Type III)即抗毒素或降解毒素积累。自第三类抗性(Type III)提出后，人们在这方面做了很多的工作，已经发现了一些和抗毒素或降解毒素积累相关的基因，例如从抗病品种中分离出来的具有降解DON功能的镰刀菌乙酰基转移酶基因；近来还从拟南芥中克隆出了二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因家族中的DOGT1基因，对该基因的研究表明：DOGT1基因可将葡萄糖基添加到DON和15A-DON的3-OH位置上，使有毒的DON变成低毒物质而降低其毒性，转基因实验结果也显示DOGT1基因确实能降低DON对植物的伤害(Brigitte Poppenberger et alDetoxification of the Fusarium Mycotoxin Deoxynivalenol by aUDP-glucosyltransferase from Arabidopsis thaliana THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY Vol.278，No.48，Issue of November 28，pp.47905-47914，2003)。但是在小麦中还没有发现有这类基因的报道。小麦望水白是到目前为止普遍公认的对赤霉病抗性强，抗性稳定，籽粒中DON含量低的一个品种，所以我们从小麦望水白品种中克隆出的降解DON的二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因可以导入到其他易感赤霉病小麦品种中，从而有望增强小麦对DON的抗性，降低小麦籽粒中DON的含量。

三、发明内容：

技术问题：

本发明的目的在于公开一个来自小麦(Triticum asetivum L.)望水白品种中的二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(Ta-UGT)及其所编码的蛋白质，可作为目的基因导入别的小麦品种，从而降低小麦籽粒中的DON的含量，进行小麦品种改良。

技术方案：

本发明二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(Ta-UGT)及其所编码的蛋白质，来自小麦(Triticum asetivum L.)望水白，命名为Ta-UGT基因，其核苷酸序列为SEQID NO.1。该二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因及其所编码的蛋白质，命名为Ta-UGT蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

有益效果：

1、本发明公开了一个二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(Ta-UGT)及其所编码的蛋白质。二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因为小麦中首次报道，该基因来自小麦(Triticum asetivum L.)望水白品种，试验结果如图4所示：在20ppm浓度的DON培养基中，转基因阳性植株的T₂代幼苗的生长势明显要比非转基因对照要好，由此可证明Ta-UGT基因能提高拟南芥对DON的抗性。将该基因转化到易感赤霉病小麦品种中，有望提高小麦对赤霉病的抗性，降低小麦籽粒中的DON的含量，进行小麦品种改良。

2、利用本发明Ta-UGT基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。

四、附图说明

图1用M-2-F和M-2-R引物在DON诱导的小麦望水白穗部cDNA文库中对Ta-UGT基因的筛选结果：有281bp条带的为筛出的阳性单克隆；

图2植物表达载体pCAMBIA1301-220.6的构建模式图：

图3拟南芥阳性转化株和非转基因对照株的Northern杂交结果：A中CK为非转基因对照，1～6为不同的阳性转基因拟南芥株；B为Northern杂交前的总RNA；

图4转基因拟南芥阳性植株幼苗与非转基因对照幼苗在含有一定浓度DON的MS培养基上生长15天后情况：CK为非转基因对照，5为转基因拟南芥5号阳性株后代幼苗。

五、具体实施方式

1、利用芯片信息在经DON诱导的望水白穗部cDNA文库中进行候选基因的筛选

小麦品种望水白(公知公用材料，裴自友贾高峰等普通小麦籽粒DON含量的配合力分析作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2007，33(5)：731-737)抽穗期采用单花滴注法接种deoxynivalenol(DON)(Sigma)水溶液(100ppm)，用水接种作为对照。接种后12、24h取穗样，用TRIZOL(invitogen)按试剂说明书分别提取总RNA，DON诱导的2份RNA等量混合作为实验组，水接种的2份RNA等量混合作为对照组。实验组和对照组的RNA对Affymetrix wheat基因表达谱芯片(part number900559)(Affymetrix)进行杂交，该实验在“上海国家生物芯片工程中心”完成，实验步骤参照Affymetrix公司说明书“Expressed Analysis Technical Manual”(http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression manual.affx)。以实验组信号与对照组信号比值大于2为标准筛选上调表达基因，在上调表达的基因中发现增加倍数为2^5.5倍的探针CA695961(见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucest&id＝25417747)，该基因推导的功能与已报道的拟南芥中降解DON的基因DOGT1为同一家族的葡萄糖基转移酶基因家族。根据CA695961序列设计引物(引物序列分别为：M-2-F：5’-GAGGCTACAGAGGAGTTG-3’和M-2-R：5’-TGTATTCCCTTCATTTGG-3’)筛选DON诱导的望水白小麦穗组织cDNA文库(由本实验室提供)，以该cDNA文库2μl菌液为摸板进行PCR反应：10μM的5’引物和3’引物各0.5μl；2.5μl 10×buffer；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的mg2+；0.25μl(5U/μl)Taq polymerase(TaKaRa)，加水至25μl。反应条件为：94℃预变性3min；94℃45s，48℃45s，72℃1min，33个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选到的阳性单克隆提取质粒测序，测序由上海英骏公司完成。对测序结果经BLAST比较分析发现这是一个完整的cDNA序列SEQ ID NO.1，该基因全长1771bp，包含一个编码496个氨基酸的完整的ORF框，该基因推测为二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(Ta-UGT)。

2、植物表达载体的构建、农杆菌转化拟南芥及阳性拟南芥转化子的筛选和验证

植物表达载体pCAMBIA1301-220.6由pCAMBIA1301(公知公用材料，薛仁镐基因枪法转化大豆萌动种子影响因素的研究大豆科学第27卷第2期2008年4月)和pBI220.6(公知公用材料，Ya-Ping Chen et al Plastidial Glut athione Reductasefrom Haynaldia villosa is an Enhancer of Powdery Mildew Resistance in Wheat(Triticum aestivum)Plant and Cell Physiology 200748(12)：1702-1712)组合而成。

转基因载体pCAMBIA1301-220.6-Ta-UGT的构建过程如下：根据Ta-UGT的全长序列SEQ ID NO.1设计能扩增出ORF的带有BamH I和Kpn I酶切位点的PCR引物(Ta-UGT-B：5’-ACTGGATCCCCAGCCTGACAGACTCCACT-3’和Ta-UGT-K：5’-ACTGGTACCTCACCTGTGAGCCTGGTACA-3)，以含Ta-UGT基因的质粒DNA作为模版进行PCR扩增(PCR体系：20ng质粒DNA；10μM的5’引物3’引物各0.5μl；2.5μl10×buffer；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的Mg2+；0.25μl(5U/μl)Taqpolymerase，加水至25μl。PCR程序：94℃预变性3min；94℃45s，58℃45s，72℃1.5min，33个循环；72℃延伸10min)，PCR产物用BamH I和Kpn I酶切电泳并回收，目的片段的回收和纯化按Biospin Gel Extration kit试剂盒(BioFlux)说明书进行；pCAMBIA1301-220.6也用BamH I和Kpn I酶切电泳并回收；两种回收产物用T4连接酶(Promega)连接形成重组质粒pCAMBIA1301-220.6-Ta-UGT，转入农杆菌C58c1(公知公用材料张彬等，农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究核农学报2007，21(2)：124～127)。

转基因程序：将含有pCAMBIA1301-220.6-Ta-UGT的农杆菌株接种于YEB液体培养基(含50mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)中扩大培养至菌液OD 600为0.6～0.8，离心收集菌体沉淀，将菌体再重悬于同体积的转化渗透液(1/2MS+20％蔗糖+0.2％Silvet77)中备用。野生型拟南芥哥伦比亚生态型(Co10)种子(公知公用材料，戴富明等农杆菌介导木霉几丁质酶基因转化拟南芥及其T₁代对油菜菌核病抗性提高上海交通大学学报农业科学版第23卷第1期2005年3月)浮于0.1％的琼脂中4℃条件下春化处理48h后，播种到基质(腐质营养土∶蛭石＝1∶1)中，22℃～25℃，16h光照/8h黑暗条件下生长。等生长至拟南芥初花期花瓣没有完全展开时，用备用的农杆菌的转化液对拟南芥小花进行喷雾接种转化。转化后保湿48h后再进行第2次接种，再保湿48h，以后在正常条件下生长，直到收获种子。

将农杆菌转化后收获的T₀代种子经0.1％的升汞消毒15min，无菌水清洗2遍后置于含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，4℃黑暗条件下春化处理48h后，转到22℃～25℃，16h光照/8h黑暗条件下生长大概7～10天后选取在1/2MS培养基上能正常生长的幼苗，移植到基质中在相同环境条件下继续生长。

3、阳性拟南芥转化植株Northern杂交

取经潮霉素筛选得到的阳性拟南芥转化植株及非转基因CK对照植株的叶片，用TRIZOL(invitogen)按试剂说明书提取总RNA，以Ta-UGT为探针进行Northern杂交。Northern杂交操作中的探针的标记、杂交、显色等程序按照DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit I试剂盒(Roche)说明书进行。Northern杂交结果如图3所示：Ta-UGT在所有转基因拟南芥阳性植株中都有表达，不同阳性植株的表达量有差异；在非转基因对照植株未检测到该基因的表达。

4、阳性转基因拟南芥抗DON的功能验证

取经Northern杂交分析后的转基因拟南芥阳性植株的T₂代种子和非转基因拟南芥种子，经0.1％的升汞消毒15min，无菌水清洗2遍后置于含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，同时将非转基因拟南芥种子置于不含潮霉素的1/2MS培养基上，4℃黑暗条件下春化处理48h后，转到22℃～25℃，16h光照/8h黑暗条件下生长大概1～2周，选取在两种不同培养基上的转基因阳性株和非转基因对照株的株高、大小、叶片数量、生长势基本一致的幼苗同时移植到DON浓度为20ppm的MS培养基上，继续在相同环境下生长大概2～3周后，观察分析转基因阳性苗和非转基因CK对照苗在DON环境中的生长情况。结果如图4所示：在20ppm浓度的DON培养基中，转基因阳性植株的T₂代幼苗的生长势明显要比非转基因对照要好，由此可证明Ta-UGT基因能提高拟南芥对DON的抗性。将该基因转化到易感赤霉病小麦品种中，有望提高小麦对赤霉病的抗性，降低小麦籽粒中的DON的含量。

序列表

<110>南京农业大学

<120>二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因及其所编码的蛋白质

<130>说明书

<140>00

<141>2008-07-03

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1771

<212>DNA

<213>小麦(Triticum asetivum L.)

<220>

<221>Ta-UGT基因cDNA全长序列

<222>(1)..(1771)

<223>

<400>1

ggccattacg gccgggggaa cacactacgg ttgccattgc accgcttcca agccctccca 60

gcctgacaga ctccactagc acttcagccg atcagccatg accttcgccg gcagcggtga 120

tggccagagc ggctctgcga gggcgcactt cgtgctggta cccatgatgg ctcaaggccg 180

taccatcccc atgaccgaca tggcgtgcct gctggcagag catggcgcgc aggtcagctt 240

catcaccacg ccggtcaacg ccgctaggtt ggaaggcttc gccgctaagg tggaggcggc 300

gggcctggtg gttcagctcg tggagctcca cttcccgagt gtagagttcg gcctaccaga 360

tgggtgcgag aacctcgaca tgatccaatc aaagaatttg ttctttaact tcatgaaggc 420

atgtgccgcg ctgcatgagc cgctcatggc gtacctccgt gagcagcagc gctcccctcc 480

tagctgcatc atatctgaca tggcgcactg gtggaccggt gacatcgcaa gggagctcgg 540

catcccgagg ctcaccttta gtggcttttg tggcttctcg tcccttgtca ggtacatcgt 600

ttttcacaac aatgtattgg agaatgtcac agatgacaat gagctcatca cgatcccggg 660

gttccctaca ccgctagagt tgacgaaggc taagttgcct ggaacccttt gtgttccggg 720

tatggagcaa atccgtgaga agatgtttga ggaggagctg agatgcgatg gtgagatcac 780

caatagcttc aaagagctcg agacattgta cattgaatcc tatgagcaga taacaaggaa 840

gaaggtctgg acgatcgggc caatgtgcct ctgccaccga aacagcaaca gaacggccgc 900

aagaggaaac aaggcgtcaa tggatgaggc acagtgcttg caatggcttg attcaaggaa 960

gccaggctca gtgatctttg tgagttttgg aagcctcgct tgcactacac ctcaacaact 1020

tgttgaactg ggactgggac ttgaagcctc caagaaacca tttgtttggg tgattaaagc 1080

aggagctaag cttccagaag tcgaggaatg gctcgcagat gggttcgagg agcgcgtcaa 1140

agacagaggt ctgatcataa ggggttgggc accacagctc atgatcctgc agcaccaagc 1200

cgttggagga ttcgtgacgc actgcgggtg gaactcaaca atagagggca tctgtgcagg 1260

tgtgcccatg atcacatggc cacactttgg ggagcagttt ttgaatgaga agctgcttgt 1320

ggatgtgctg caaatcggga tggaggttgg agtgaaagga gttacacagt ggggaagtga 1380

aaaccaggag gttatggtta ccagagatgc tgtggagaca gcagtgaaca ccctgatggg 1440

tgaaggggag gctacagagg agttgagaat gagagcagaa gactgcgcca ttaaggcaag 1500

gagggctttc gacgaggaag gttcttctta caacaacgta aggctgttaa ttcaagaaat 1560

gggaaacaag acgaatgcat gtggttgata gagattacct aagctcgctt tttcagtgta 1620

aacatgaagt gaaacatcct agagtacata tatcatcata tagaattttg taccaggctc 1680

acaggtgatt atttagagat tatagatgat ccaaatgaag ggaatatcaa ttatcctctc 1740

taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1771

<210>2

<211>496

<212>PRT

<213>小麦(Triticum asetivum L.)

<220>

<221>ORF框氨基酸序列

<222>(1)..(496)

<223>

<400>2

Met Thr Phe Ala Gly Ser Gly Asp Gly Gln Ser Gly Ser Ala Arg Ala

1 5 10 15

His Phe Val Leu Val Pro Met Met Ala Gln Gly Arg Thr Ile Pro Met

20 25 30

Thr Asp Met Ala Cys Leu Leu Ala Glu His Gly Ala Gln Val Ser Phe

35 40 45

Ile Thr Thr Pro Val Asn Ala Ala Arg Leu Glu Gly Phe Ala Ala Lys

50 55 60

Val Glu Ala Ala Gly Leu Val Val Gln Leu Val Glu Leu His Phe Pro

65 70 75 80

Ser Val Glu Phe Gly Leu Pro Asp Gly Cys Glu Asn Leu Asp Met Ile

85 90 95

Gln Ser Lys Asn Leu Phe Phe Asn Phe Met Lys Ala Cys Ala Ala Leu

100 105 110

His Glu Pro Leu Met Ala Tyr Leu Arg Glu Gln Gln Arg Ser Pro Pro

115 120 125

Ser Cys Ile Ile Ser Asp Met Ala His Trp Trp Thr Gly Asp Ile Ala

130 135 140

Arg Glu Leu Gly Ile Pro Arg Leu Thr Phe Ser Gly Phe Cys Gly Phe

145 150 155 160

Ser Ser Leu Val Arg Tyr Ile Val Phe His Asn Asn Val Leu Glu Asn

165 170 175

Val Thr Asp Asp Asn Glu Leu Ile Thr Ile Pro Gly Phe Pro Thr Pro

180 185 190

Leu Glu Leu Thr Lys Ala Lys Leu Pro Gly Thr Leu Cys Val Pro Gly

195 200 205

Met Glu Gln Ile Arg Glu Lys Met Phe Glu Glu Glu Leu Arg Cys Asp

210 215 220

Gly Glu Ile Thr Asn Ser Phe Lys Glu Leu Glu Thr Leu Tyr Ile Glu

225 230 235 240

Ser Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Lys Lys Val Trp Thr Ile Gly Pro Met

245 250 255

Cys Leu Cys His Arg Asn Ser Asn Arg Thr Ala Ala Arg Gly Asn Lys

260 265 270

Ala Ser Met Asp Glu Ala Gln Cys Leu Gln Trp Leu Asp Ser Arg Lys

275 280 285

Pro Gly Ser Val Ile Phe Val Ser Phe Gly Ser Leu Ala Cys Thr Thr

290 295 300

Pro Gln Gln Leu Val Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Ala Ser Lys Lys

305 310 315 320

Pro Phe Val Trp Val Ile Lys Ala Gly Ala Lys Leu Pro Glu Val Glu

325 330 335

Glu Trp Leu Ala Asp Gly Phe Glu Glu Arg Val Lys Asp Arg Gly Leu

340 345 350

Ile Ile Arg Gly Trp Ala Pro Gln Leu Met Ile Leu Gln His Gln Ala

355 360 365

Val Gly Gly Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly

370 375 380

Ile Cys Ala Gly Val Pro Met Ile Thr Trp Pro His Phe Gly Glu Gln

385 390 395 400

Phe Leu Asn Glu Lys Leu Leu Val Asp Val Leu Gln Ile Gly Met Glu

405 410 415

Val Gly Val Lys Gly Val Thr Gln Trp Gly Ser Glu Asn Gln Glu Val

420 425 430

Met Val Thr Arg Asp Ala Val Glu Thr Ala Val Asn Thr Leu Met Gly

435 440 445

Glu Gly Glu Ala Thr Glu Glu Leu Arg Met Arg Ala Glu Asp Cys Ala

450 455 460

Ile Lys Ala Arg Arg Ala Phe Asp Glu Glu Gly Ser Ser Tyr Asn Asn

465 470 475 480

Val Arg Leu Leu Ile Gln Glu Met Gly Asn Lys Thr Asn Ala Cys Gly

485 490 495

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物Ta-UGT-B

<222>(1)..(28)

<223>

<400>3

ctggatcccc agcctgacag actccact 28

<210>4

<211>29

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221>引物Ta-UGT-K

<222>(1)..(29)

<223>

<400>4

Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly

1 5 10 15

Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Ala

20 25

Claims

1、二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因Ta-UGT，来自小麦(Triticum asetivumL.)望水白品种，命名为Ta-UGT基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2、权利要求1所述二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因Ta-UGT编码的蛋白质，命名为Ta-UGT蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。