CN107459566A

CN107459566A - 来源于百合的LhWDR蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN107459566A
Application number: CN201710897475.9A
Authority: CN
Inventors: 白锦荣; 窦晓莹; 王欢; 孔滢; 包放; 郎利新; 尚宏忠
Original assignee: BEIJING RADIATION CENTER
Current assignee: BEIJING RADIATION CENTER
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2037-09-28
Also published as: CN107459566B

Abstract

本发明公开了一种来源于百合的LhWDR蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的LhWDR蛋白具体为如下任一：1)氨基酸序列为序列1的蛋白；2)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；3)与1)或2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白；4)在1)‑3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。实验证明，WDR在拟南芥中过表达后会促进花青素苷合成途径下游基因DFR的表达。本发明对进一步了解百合花青素苷和合成及花色形成都具有十分重要的意义。

Description

来源于百合的LhWDR蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及来源于百合的LhWDR蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

百合(Lilium spp.)是百合科百合属植物的总称，是世界上著名的观赏花卉和主要切花之一。花色是百合的主要观赏性状，目前百合常见的颜色有白色、黄色、红色、橙色、粉色等。在影响花色形成的诸多因素中，花朵色素的种类和含量是最重要的因素。类黄酮、类胡萝卜素和甜菜色素是形成花色的三大主要化合物类群。类黄酮代谢分支途径合成的花青素形成红色、紫色和蓝色。类胡萝卜素形成黄色、橙色和红色等。在百合品种方面，目前对花色成分研究较多的主要亚洲百合和东方百合。粉色和棕色花中主要色素成分为花青素苷；黄色和橙色花的主要花色成分为类胡萝卜素；红色花中花青素苷和类胡萝卜素同时存在。不同色素的合成都有众多的结构基因及调控基因参与，包含了多个代谢步骤，作用机理较复杂。

传统的花色育种周期长且有较大的局限性，研究花色基因，对于通过分子育种手段人工修饰改变花卉颜色具有非常重要的意义。目前关于类黄酮代谢途径研究得较为深入，花青素是类黄酮代谢合成的分支产物，常见的花青素有矢车菊色素(cyanidin)、飞燕草色素(delphinidin)和天竺葵色素(pelargonidin)，它们主要积累在花瓣表皮细胞的液泡中，控制花的红色、紫罗兰色及蓝色等颜色变化。影响花青素代谢的基因有两类：一类是大部分植物都共同具有的结构基因，他们直接编码花色素代谢酶类；另一类是调节基因，负责控制结构基因的表达强度和模式。

百合中一些与花青素代谢相关的结构基因已经被分离和鉴定，如查尔酮合酶(LhCHS)、查尔酮异构酶(LhCHI)、黄烷酮3-羟化酶(LhF3H)、二氢黄酮醇4-还原酶(LhDFR)、花青素苷合酶(LhANS)等。调节类基因分为三大类，分别是R2R3-MYB类转录因子、bHLH(basic helix–loop–helix)类转录因子和WDR(WD-repeat，WD40)蛋白。R2R3-MYB类转录因子是个庞大的家族，通常特定的MYB类转录因子只调控特定的生物合成途径。而bHLH和R2R3-MYB常常共同发挥作用，R2R3-MYB结合在特定的转座子上活化转录，bHLH则使R2R3-MYB结构稳定并促进转录，WDR蛋白可以通过与bHLH相互作用促进MBW复合体的形成，激活类黄酮生物合成途径基因的转录。

目前已经从百合中分离出了参与花青素苷合成调控的R2R3-MYB转录因子LhMYB6和LhMYB12以及bHLH基因LhbHLH1和LhbHLH2，LhMYB6和LhMYB12都能与LhbHLH2发生相互作用，并且在共同表达时能活化百合鳞茎的整个花青素苷代谢途径。

目前在百合中还没有关于WDR蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于百合的LhWDR蛋白及其编码基因与应用

本发明所提供的蛋白来源于百合，名称为LhWDR，具体为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为序列表中的序列1的蛋白质；

(A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

标签序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明中，所述核酸分子具体可为如下任一：

(B1)序列表中序列2的第16-1128位所示的DNA分子；

(B2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

(B4)与(B1)-(B3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1302、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组载体中启动所述核酸分子转录的启动子为35S启动子。

更加具体的，所述重组表达载体为将所述核酸分子插入到pCAMBIA1302载体的35S启动子和GFP之间(NcoⅠ和SpeⅠ)所得的重组质粒。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述转基因细胞系或所述重组菌在如下(C1)或(C2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(C1)调控植物花青素代谢；

(C2)制备具有调控植物花青素代谢功能的产品。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述转基因细胞系或所述重组菌在如下(D1)或(D2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(D1)促进花青素苷合成途径下游基因表达；

(D2)制备具有促进花青素苷合成途径下游基因表达功能的产品。

本发明还提供了一种培育花青素苷合成途径下游基因表达量提高的植物的方法。

本发明所提供的培育花青素苷合成途径下游基因表达量提高的植物的方法，可包括使受体植物中所述蛋白质的表达量和/或活性提高的步骤。

其中，所述“使受体植物中所述蛋白质的表达量和/或活性提高”的方法可为任何能够使受体植物中所述蛋白质的表达量和/或活性提高的方法，包括基因编辑、代谢途径调控等手段。

进一步，本发明提供了一种培育花青素苷合成途径下游基因表达量提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育花青素苷合成途径下游基因表达量提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比花青素苷合成途径下游基因表达量提高。

其中，所述蛋白质的编码基因为如下任一：

(B1)序列表中序列2的第16-1128位所示的DNA分子；

(B2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(B4)与(B1)-(B3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述蛋白质的DNA分子。

在前文所述的应用或方法中，所述花青素苷合成途径下游基因具体为DFR基因。

在前文所述的应用或方法中，所述植物既可为双子叶植物，也可为单子叶植物。

在本发明的一个实施例中，所述植物为拟南芥，具体为拟南芥Columbia(Col)生态型。相应的，所述花青素苷合成途径下游基因为拟南芥来源的DFR基因。更加具体的，所述拟南芥来源的DFR基因的序列如序列表中序列3所示。

本发明对百合花青素代谢相关的WDR基因进行了克隆，并对WDR基因在花青素合成过程中的作用进行了深入的研究和探讨，发现WDR在拟南芥中过表达后会促进花青素苷合成途径下游基因DFR的表达。本发明对进一步了解百合花青素苷和合成及花色形成都具有十分重要的意义。

附图说明

图1为LhWDR基因RT-PCR、RACE、cDNA区扩增结果。

图2为Southern blot分析LhWDR基因在百合品种‘索邦’中的拷贝数。

图3为LhWDR与其他植物WDR氨基酸序列比对图。

图4为植物WDR蛋白系统发育分析。标尺代表遗传距离；各节点处数字代表从1000次重复计算得到的bootstrap值。WDR蛋白名称、来源物种及Genbank登录号：GhTTG2(Gossypium hirsutum,AF530909),GhTTG4(Gossypium hirsutum,AF530912),PtWDR(Populus trichocarpa,X P_002301564),ATAN11A(Arabidopsis thaliana,U94746.1),ATAN11B(Arabidopsis thaliana,X97488.1),WDR2(Vitis vinifera,DQ517914),GmWDR(Glycine max,XP_003553993),OsWDR(Oryza sativa Japonica Group,BAD25387),PAC1(Zea mays,AY115485),Tan1(Sorghum bicolor,AFN17366),GhTTG3(Gossypium hirsutum,AF530911),PFWD(Perilla frutescens,AB059642),AN11(Petunia x hybrida,PXU94748),WDR1(Vitis vinifera,DQ517913),GhTTG1(Gossypium hirsutum,AF530908),TTG1(Arabidopsis thaliana,CAB45372),LhWDR(Lilium sorbonne),SbWDR(Sorghum bicolor,XP_002453914),OsWDR2(Oryza sativa Japonica Group,NP 001047751),MP1(Zea mays,AY339884)。

图5为LhWDR-GFP融合蛋白亚细胞定位。

图6为LhWDR基因在‘索邦’不同组织中的表达模式分析。A：RT-PCR检测LhWDR基因在‘索邦’根、茎、叶、鳞茎、开放花被片、花药中的表达；B：qRT-PCR检测LhCHI基因在‘索邦’根、茎、叶、鳞茎、开放花被片、花药中的相对表达量。

图7为LhWDR、LhbHLH2、LhCHS、LhCHI、LhDFR、LhANS基因在‘索邦’花发育S2-S5期相对表达量分析。

图8为拟南芥LhWDR基因超表达植株相关基因表达水平检测。A：RT-PCR检测拟南芥LhWDR基因超表达植株OE1-OE4和对照中LhWDR基因表达情况；B：Real-Time PCR检测OE1和对照中ATCHS,ATCHI,DFR,ANS,ATPAP1和GL3基因表达水平差异。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

东方百合品种‘索邦’(‘Sorbonne’)球茎购自荷兰，栽植于北京市辐射中心种质资源圃，于开花时期采集根、鳞茎、茎生叶、茎、开放花的内外轮花被片、花药、柱头等组织，液氮速冻后保存于-80℃备用。‘索邦’百合花蕾从显色到开花分为五个时期(Stage1-Stage5，S1-S5)，S1期：完全未着色的花蕾；S2期：花被片内侧开始出现斑点；S3：开始着色的花蕾；S4：完全着色未开放的花蕾；S5：完全开放的花。本研究取百合花发育的S1-5期的内轮花被片和花药，液氮速冻后保存于-80℃。以上材料用于基因克隆、RT-PCR和qRT-PCR分析所需的RNA提取，其中qRT-PCR用不同批次材料重复3次。

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia(Col)生态型。

pCAMBIA1302质粒：CAMBIA公司植物表达载体，带有35S启动子及GFP表达标签。

实施例1、LhWDR基因的克隆及生物信息学分析

一、实验方法

1、RNA提取

(1)先用液氮将研钵和研棒预冷；(2)将百合组织材料放入冷却的研钵中进行充分研磨；(3)研磨后的组织迅速转至1.5mL离心管中，加入750μL CTAB提取缓冲液，65℃恒温空气浴处理10min，其间颠倒混匀2-3次；(4)12,000rmp离心10min，取上清液；(5)加入750μL氯仿，剧烈震荡30s；(6)4℃，12000rpm离心8min；(7)吸取上层水相至另一新的1.5mL离心管中，加入1/3倍体积的8M的LiCl溶液，剧烈震荡，-20℃沉淀8-12hr；(8)4℃，12000rpm离心15min；(9)弃上清，加入1mL 70％乙醇洗涤；(10)4℃，8000rpm离心5min，弃上清；(11)室温晾干或真空干燥5-10min；(12)加入20～30μL DEPC处理过的灭菌水溶解RNA，取少量RNA进行浓度和纯度测定，其RNA可置于-80℃冰箱保存。

其中，CTAB提取缓冲液配方如下：2％CTAB(w/v)，100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mMEDTA，1.4M NaCl，1％(v/v)PEG 4000配制好后，高压灭菌，室温保存。使用前按终浓度15％的量加入β-巯基乙醇混匀。DEPC水配方如下：向1L水中加入1mL DEPC，充分混匀，在室温下放置过夜，然后高温高压灭菌后4℃保存，DEPC有毒，需在通风厨内操作。

2、cDNA反转录

先用DNase处理RNA样品中残留的DNA。具体操作如下：(1)根据如下表1加入对应成分及用量，37℃反应15min；(2)加入1μL Stop Solution混匀，70℃处理10min，终止消化反应；

表1用DNase处理RNA样品中残留的DNA的反应体系组成及用量

试剂	用量
		RNA	2-5μg
DNaseⅠ	1μL
		DNase reaction buffer	1μL
RNase Inhibitor	0.25μL
		DEPC-H₂O	将体系补至10μL

注：RNA总量不超过5μg。

然后进行cDNA第一链的合成。具体操作如下：采用Invitrogen公司M-MLV试剂盒，反应物在无菌无RNase的PCR管中混合，在PCR仪上进行，反应体系为25μL，依次加入如下表2所列组分；72℃处理10min，之后冰浴5min；再加入如下表3所列成分，混匀后瞬时离心，37℃反应90min，之后94℃处理5min终止反应。

表2 cDNA第一链合成的反应体系组成及用量(一)

成份	用量
		Oligo dT	2μL
DNase处理过的RNA	2-5μg
		DEPC-H₂O	至11μL

表3 cDNA第一链合成的反应体系组成及用量(二)

3、百合WDR基因保守片段的扩增

(1)简并引物设计，选取TTG1(Arabidopsis thaliana,CAB45372)，AN11(Petuniax hybrida,AAC18914)，PFWD(Perilla frutescens,BAB58883)，VvWDR1(Vitis vinifera,ABF66625)和PAC1(Zea mays,AAM76742)氨基酸序列保守区7-9个氨基酸序列，通过DNASTAR软件逆向翻译成核苷酸序列，得到简并引物序列，如下：

LhWDR-C-5'：5'-GTCACMTAYGATCMYC-3'；

LhWDR-C-3'：5'-GACATBGGATCAATCCC-3'。

其中，M为A或C；Y为T或C；B为G或C或T。

(2)以反转录的‘索邦’花被片cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系如表4所示。将上述PCR反应液混匀放入PCR仪中进行一下反应：94℃预变性2min；94℃变性20s，52℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃forever。

表4扩增体系

成分	体积(μL)
		LhWDR-C-5'(10μmol)	0.3
LhWDR-C-3'(10μmol)	0.3
		cDNA	1
rTaq DNA Polymerase	0.5
		10X PCR buffer	2
dNTP(2.5mM)	2
		ddH₂O	13.9

(3)对PCR产物进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)

(4)通过DNASTAR软件将测序得到的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，在NCBI上进行Blastp比对，比对出WDR同源蛋白，即得到了百合中的WDR基因片段。

4、WDR基因3’/5’RACE克隆

采用SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒。

根据测序所得的WDR基因保守区序列设计3’RACE扩增引物：

LhWDR-GSP3-1：5'-CACGCAATTGCATTAACCCCAGCCT-3'；

LhWDR-GSP3-2：5'-TCCCAGATAGTGCAGGTGGTGTCGATG-3'。

3’RACE反转录的反应体系1如表5所示。混匀，轻甩，置于PCR仪中，72℃反应3min，42℃冷却2min，14000转离心10s。3’RACE反转录的反应体系2如表6所示。混匀轻甩，42℃孵育90min，72℃热激10min。在反应后的体系中加入200μL Tricine-EDTA Buffer进行稀释。

表5 3’RACE反转录的反应体系1

表6 3’RACE反转录的反应体系2

成分	体积(μL)
		5×First-Stand Buffer	2
DTT(20μM)	1
		dNTP Mixture(10mM)	1
反应体系1	4.75
		RNase Inhibitor(40U/μL)	0.25
SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)	1

3’RACE PCR反应的第一轮反应体系(50μL)如表7所示。扩增程序：94℃30sec；68℃30sec，72℃3min，25cycles。3’RACE PCR反应的第二轮反应是将5μl第一轮的PCR产物用245μl Tricine-EDTA buffer进行稀释，在稀释后的PCR产物中取5μl作为第二轮PCR的模板，反应体系如表8所示，反应程序：94℃30sec；68℃30sec，72℃2min，20cycles。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表7 3’RACE PCR反应的第一轮反应体系

成分	体积(μL)
		3’RACE-Ready cDNA	2.5
UPM(10×)	5
		LhWDR-GSP3-1(10μM)	1
dNTP Mix(10mM)	1
		10×Advantage 2 PCR Buffer	5
50×Advantage 2 Polymerase Mix	1
		ddH₂O	34.5

表8 3’RACE PCR反应的第二轮反应体系

成分	体积(μL)
		10×Advantage 2 PCR Buffer	5
dNTP Mix(10mM)	1
		50×Advantage 2 Polymerase Mix	1
稀释后的第一轮PCR产物	5
		NUP Primer	1
LhWDR-GSP3-2引物(10μM)	1
		UPM(10×)	5
ddH₂O	31.5

5’RACE PCR反应

根据测序所得的EDR基因保守区序列设计5’cDNA扩增引物：

LhWDR-GSP5-1：5'-AGTTCTGCGCTCCCCTCACCTCCTT-3'；

LhWDR-GSP5-2：5'-GACTTCCTCCGTATCTGGCGCATCTCC-3'。

5’RACE反转录的反应体系1如表9所示。混匀，轻甩，置于PCR仪中，72℃反应3min，42℃冷却2min，14000转离心10s。5’RACE反转录的反应体系2如表10所示。混匀轻甩，42℃孵育90min，72℃热激10min；在反应后的体系中加入200μL Tricine-EDTA Buffer。

表9 5’RACE反转录的反应体系1

成分	体积(μL)
		Total RNA	2.75
5’-CDS Primer A	1

表10 5’RACE反转录的反应体系2

成分	体积(μL)
		5×First-Stand Buffer	2
DTT(20μM)	1
		dNTP Mixture(10mM)	1
反应体系1	3.75
		RNase Inhibitor(40U/μL)	0.25
SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)	1
		SMARTerⅡA oligo	1

5’RACE PCR反应的第一轮反应体系(50μL)如表11所示。扩增程序：94℃30sec；68℃30sec，72℃3min，25cycles。5’RACE PCR反应的第二轮反应是将5μl第一轮的PCR产物用245μl Tricine-EDTA buffer进行稀释，在稀释后的PCR产物中取5μl作为第二轮PCR的模板，反应体系如表12所示。反应程序：94℃30sec；68℃30sec，72℃2min，20cycles。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表11 5’RACE PCR反应的第一轮反应体系

成分	体积(μL)
		5’RACE cDNA	2.5
UPM(10×)	5
		LhWDR-GSP5-1Primer(10μM)	1
dNTP Mix(10mM)	1
		10×Advantage 2 PCR Buffer	5
50×Advantage 2 Polymerase Mix	1
		ddH₂O	34.5

表12 5’RACE PCR反应的第二轮反应体系

5、LhWDR基因cDNA全长克隆

用DNAStar软件将所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列进行拼接，得到LhWDR基因基因的cDNA全长序列(序列2)，共1329个碱基。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html在线进行ORF查找，找到起始密码子和终止密码子的位置，并设计cDNA扩增全长引物，序列如下：

LhWDR-cDNA-1：5'-ATGGGCGCCAGCGCTGCC-3'；

LhWDR-cDNA-2：5'-TCAAACCCGGAGTATCTGCAGCTT-3'。

PCR扩增反应如表13所示。扩增程序：Step 1：94℃3min；Step 2：94℃30sec；Step3：54℃30sec；Step 4：72℃1min；Step 5：go to Step 2 30cycles；Step6：72℃5min；Step7：4℃for ever。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表13 LhWDR基因cDNA全长克隆的PCR扩增反应体系

成分	用量(μL)
		2×Taq PCR Mix	10
LhWDR-cDNA-1(10μM)	0.2
		LhWDR-cDNA-2(10μM)	0.2
S5期花被片反转录cDNA	1
		ddH₂O	补足至20μL

6、胶回收PCR产物

使用OMIGA胶回收试剂盒(D2500-01)。具体操作如下：(1)将PCR扩增的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中；(2)将吸附柱放入收集管中，在吸附柱中间加入300μL平衡液BL，室温下12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(3)向胶块中加入600μL溶胶液PN，55℃水浴放置10-15min，期间不断温和地翻转离心管，确保胶块充分溶解；(4)溶解后的胶块溶液转移至吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，将吸附柱重新放回收集管中；(6)重复步骤(5)；(7)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱开盖置于室温放置2min晾干；(8)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间加30μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min收集DNA溶液。

7、连接转化

(1)DNA回收片段连接T载体pEASY^@-Blunt Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)，连接体系如表14所示。反应条件：室温(20℃-37℃)反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上；(2)连接产物加到100μL Trans10大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，冰浴30min；(3)42℃水浴热激90s；冰浴2min；(4)加入500μL LB液体培养基，37℃摇床恢复培养45min；(5)12000rpm离心30s，弃上清，留100μL在离心管中，吹吸混匀涂于含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上，晾干；(6)37℃倒置培养14-16hr；(7)挑取单克隆菌测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

表14 DNA回收片段连接T载体pEASY^@-Blunt Cloning Vector的连接体系

成分	体积(μL)
		PCR产物	4μL
pEASY^@-Blunt Cloning Vector	1μL

8、LhWDR基因生物信息学分析

将获得的基因序列在NCBI的ORF finder预测开放阅读框，并在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast上进行序列比对和同源基因查询，应用DNAMAN 8软件对序列一致性进行分析，使用MEGA 6.0软件建立蛋白系统进化树。

二、实验结果

1、LhWDR基因克隆与序列分析

以百合品种‘索邦’开放内轮花被片RNA反转录的cDNA为模版，利用简并引物LhWDR-C-5'和LhWDR-C-3'扩增得到一个长度为602bp的中间片段(图1)，之后通过RACE方法分别获得871bp的5’末端以及922bp的3’末端片段(图1)，序列拼接后在NCBI的ORF finder预测开放阅读框，设计特异性引物LhWDR-cDNA-1和LhWDR-cDNA-2扩增基因cDNA区(图1)，得到1113bp的序列(序列2的第16-1128位)，扩增基因组DNA发现该基因无内含子区。推测其编码的蛋白由370个氨基酸残基组成，具有典型的WD重复序列，属于WD40蛋白超家族。将该基因命名为LhWDR(Lilium hybrid WD-repeat protein)。

LhWDR基因的全长cDNA序列如序列表中序列2所示，其中第16-1128位为ORF，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

2、基因拷贝数分析

为研究LhWDR在百合中的基因拷贝数，进行了Southern-blotting实验，以997bpLhWDR基因序列作为探针，用LhWDR基因内不包含的限制性酶切位点的(EcoRI、BamHI、XbaI)内切酶消化‘索邦’基因组DNA，通过探针进行杂交，结果如图2所示，探针与EcoRI、BamHI、XbaI三种内切酶消化后的基因组DNA杂交信号呈现两条或多于两条条带，说明LhWDR基因在百合中为多拷贝基因。

3、LhWDR序列同源性比对及进化树分析

将LhWDR氨基酸序列在NCBI上进行比对，发现其与矮牵牛中的AN11、玉米中的PAC1、紫苏中的PFWD、拟南芥中的TTG1等都有较高的序列相似性，这些基因都涉及到花青素苷的合成。通过DNAMAN将LhWDR、AN11、PAC1、PFWD和TTG1进行多重序列比对，如图3所示，它们序列相似性在67％以上，都具有保守的WD-repeat区域。因此，LhWDR是AN11在百合中的同源蛋白。将10种植物中的20个WD-repeat蛋白构建系统发育树发现，LhWDR与高粱、水稻、玉米等单子叶植物中的WD-repeat蛋白亲缘关系较近，与其聚为一类(图4)。

实施例2、LhWDR蛋白定位分析及基因表达模式分析

一、实验方法

1、半定量RT-PCR分析LhWDR基因表达模式

(1)以百合LhActin基因(基因登录号：AB438963)作为内参基因，设计特异性引物，如下：

LhActin-RT1：5'-CCTAACCGATTCTCTGATGAAGAT-3'；

LhActin-RT2：5'-TGTATACCAGTAGCTTCCATTCCA-3'。

设计LhWDR基因特异性引物，如下：

LhWDR-RT1：5'-GCAAGGACAAGAAGTACCGC-3'；

LhWDR-RT2：5'-GGGAATGAACATGGATTTGG-3'。

(2)半定量RT-PCR：分别以百合品种‘索邦’根、茎、叶、鳞片、花被片、花药RNA反转录的cDNA为模板扩增内参基因和LhWDR基因。PCR反应体系如表15所示。扩增条件：Step 1：95℃2min；Step 2：95℃30sec；Step 3：60℃30sec；Step 4：72℃30sec；Step 5：go to Step2 30cycles；Step 6：72℃5min；Step 7：4℃for ever。

表15半定量RT-PCR反应体系

成分	用量(μL)
		2×Taq PCR Mix	10
5’引物(10μM)	0.2
		3’引物(10μM)	0.2
cDNA模板	1
		dH₂O	补足至20μL

(3)琼脂糖凝胶电泳后观察不同样品间LhActin扩增亮度差异，以LhActin基因的表达量为标准判断不同cDNA样品之间反转录产物产量是否一致，适当调整模板量，再次扩增，直到LhActin条带亮度一致。

(4)目的基因按照各样品中LhActin亮度一致时的模板量加PCR体系，用同样条件扩增，琼脂糖凝胶电泳后在紫外光下扫描得到的结果即为最终RT-PCR实验结果。

2、LhWDR亚细胞定位分析

(1)设计LhWDR基因编码区PCR扩增引物，上引物加NcoⅠ酶切位点，下引物加SpeⅠ酶切位点。

LhWDR-CDS-1：5'-CCATGGAAATGGGCGCCAGCGCTGCC-3'；

LhWDR-CDS-2：5'-ACTAGTAACCCGGAGTATCTGCAGCTT-3'。

PCR反应体系如表16所示。扩增条件：Step 1：95℃2min；Step 2：95℃30sec；Step3：54℃30sec；Step 4：72℃1min；Step 5：go to Step 2 30cycles；Step 6：72℃10min；Step 7：4℃for ever。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，胶回收，连接pEASY^@-BluntCloning Vector，转化Trans10大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌测序，测序结果比对正确，对该菌进行活化培养。

表16 PCR反应体系

成分	用量(μL)
		2×Taq PCR Mix	10
LhWDR-CDS-1(10μM)	0.2
		LhWDR-CDS-2(10μM)	0.2
开放的花被片cDNA模板	1
		dH₂O	补足至20μL

(2)质粒提取，采用OMEGA质粒小量提取试剂盒(D6943-01)，步骤如下：1)用1.5mL离心管分两次收集3mL培养好的菌液，室温下12000rpm离心30s集菌；2)加入250μL溶液I，充分震荡悬浮菌体；3)加入250μL溶液II，轻轻上下颠倒混匀，勿震荡；4)加入350μL溶液III，立即上下颠倒混匀，置于冰上5min后室温12000rpm离心10min；5)将离心柱套入收集管中，加入500μL平衡液，10000rpm离心1min，弃去收集管中的平衡液；6)将步骤4)离心后的上清转移至离心柱，室温放置1min；7)室温下以10000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；8)向离心柱内加入600μL漂洗液，室温下以10000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；9)重复步骤8)一次；10)10000rpm离心2min；11)将离心柱放入新的1.5mL离心管，向离心柱内的膜中央加入30μL 60℃预热的水，静置2min，室温以12000rpm转速离心1min，离心管中的液体即为提取的质粒DNA，可以直接使用或保存于-20℃。

(3)对LhWDR-T重组载体和pCAMBIA1302载体进行限制性内切酶反应，酶切体系如表17所示，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，切下1kb左右的LhWDR基因片段和10kb左右的pCAMBIA1302载体片段胶块，分别进行胶回收。

表17酶切体系

成分	体积(μL)
		质粒	2
NcoⅠ	0.5
		SpeⅠ	0.5
10x Buffer	2
		ddH₂O	15

(4)LhWDR基因片段和pCAMBIA1302载体片段通过T4连接酶进行连接，连接体系如表18所示，反应条件：16℃，1hr。

表18连接体系

成分	体积(μL)
		LhWDR片段	6
pCAMBIA1302载体	2
		T4连接酶	0.5
10x Buffer	1
		ddH₂O	0.5

(5)连接产物转化至Trans10大肠杆菌感受态细胞中。

(6)挑取单克隆测序鉴定，摇菌培养，提取质粒。

(7)质粒通过电击转化法转到农杆菌GV3101中，具体步骤如下：1)将电击杯洗净、晾干，置于紫外灯下灭菌5min；2)取0.5-1.0μL质粒加入到农杆菌感受态细胞中，冰浴5min；3)把冰浴后的农杆菌感受态细胞转入电击杯中，将电击仪(BIO-RAD)调到AGR档，按“pulse”键电击一次；4)加入800μL LB液体培养基于电击杯中并混匀，转移到原来的1.5mL离心管中，28℃摇床恢复培养1hr；5)取20-50μL菌液涂于含有卡那霉素(50mg/L)、利福平(25mg/L)和庆大霉素(25mg/L)的LB固体培养基上，晾干；6)28℃倒置培养36-48hr；7)采用菌落PCR的方法对长出的菌斑进行验证。菌落PCR体系如表19所示。扩增条件：Step 1：95℃2min；Step2：95℃30sec；Step 3：54℃30sec；Step 4：72℃1min；Step 5：go to Step 2 30cycles；Step 6：72℃10min；Step 7：4℃for ever。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表19菌落PCR体系

成分	用量(μL)
		2×Taq PCR Mix	10
LhWDR-CDS-1(10μM)	0.2
		LhWDR-CDS-2(10μM)	0.2
菌斑	枪头沾一点溶解在体系里
		dH₂O	补足至20μL

(8)本研究中采用农杆菌介导的花芽浸染法转化拟南芥(Clough and Bent,1998)，以下是具体的操作步骤：

1)将步骤(7)中鉴定正确的农杆菌单菌落接种于5mL含有卡那霉素(50mg/L)、利福平(25mg/L)和庆大霉素(25mg/L)抗性的LB液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养20-22hr；

2)按1:100培养好的菌液转接到150mL含有卡那霉素(50mg/L)、利福平(25mg/L)和庆大霉素(25mg/L)抗性的LB液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养至OD600＝1.2-1.6；

3)将菌液倒入离心杯中，28℃，3500rpm离心15min，收集菌体；

4)加入50mL 1/2MS培养液体悬浮菌体；

5)将上面重悬起来的菌液倒入适当大小的培养皿中，取盛花期的拟南芥植株，将其整个花序浸入菌液10s左右，然后取出平放到托盘上，连同托盘一起套入黑色塑料袋内，24hr后取出继续光照培养；

6)一般间隔10d左右，可再次对其进行浸染，以提高转化效率；

7)等到种子成熟以后，收取所有的种子，在加入潮霉素(25mg/L)的MS培养基上筛选带有转基因标记的植株；

8)将阳性的转基因植株移栽到土壤中，对转化T1代植株进行PCR鉴定，具体操作如下：

提取拟南芥转基因植株DNA：取1片新鲜的拟南芥叶片，在1.5mL的离心管中用塑料研棒将其研磨成匀浆；加300μL Edwards提取缓冲液，继续研磨混匀；室温放置3min后，12000rpm转速离心7min；将上清液转移到另外一个新的离心管中，加入300μL异丙醇混匀，冰浴5min；12,000rpm离心5min；加入400μL70％乙醇清洗沉淀，12000rpm离心2min，弃上清液；将得到的DNA沉淀倒置于吸水纸上晾干；加入20μL水溶解DNA，可-20℃保存。Edwardsbuffer：0.2M Tris-HCl(pH 8.0)；0.25M NaCl；0.025M EDTA(pH 8.0)；0.5％SDS。

PCR鉴定：反应体系如表20所示；扩增程序：Step 1：95℃2min；Step 2：95℃30sec；Step 3：60℃30sec；Step 4：72℃30sec；Step 5：go to Step 2 30cycles；Step 6：72℃5min；Step 7：20℃for ever。1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，有特异性条带的为具有35S-LhWDR-GFP重组载体插入的植株。

表20 PCR反应体系

成分	用量(μL)
		2×Taq PCR Mix	10
LhWDR-RT1(10μM)	0.2
		LhWDR-RT2(10μM)	0.2
拟南芥转基因植株DNA	1
		dH₂O	补足至20μL

8)在荧光显微镜下观察T1代转基因株系根细胞内GFP信号，转入pCAMBIA1302空载的拟南芥做为对照。

二、实验结果

1、蛋白定位分析

为了明确LhWDR蛋白在细胞内的定位，构建了由35s启动子驱动LhWDR基因编码区并在C端融合GFP蛋白的表达载体35s:LhWDR-GFP，将重组载体进一步整合到农杆菌中，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥(Col)植株中。对转基因后代植株根中GFP荧光信号进行观察，同时通过PI染色确定根细胞轮廓，发现荧光信号主要定位于细胞质中(图5，绿色荧光部分)。作为对照的35s:GFP载体则在细胞核及细胞质内都有分布(图5)。因此LhWDR是位于细胞质内的蛋白。这个结果与矮牵牛中的AN11、紫苏中的PFWD蛋白的定位结果基本一致，它们都定位于细胞质中。

2、LhWDR基因表达模式分析

通过半定量RT-PCR分析LhWDR基因在不同组织的表达情况，结果如图6中A所示，LhWDR基因在百合根、茎、叶、鳞茎、开放的花被片、花药中均有表达。再通过实时定量qRT-PCR具体分析LhWDR基因在不同组织中相对表达量，发现其在鳞茎和开放花瓣中的表达量高于其他组织(图6中B)。说明LhWDR在百合中属于组成型表达的基因，在有花青素苷合成的鳞茎及开放花被片中表达量高于根、茎、叶、花药等组织，其可能与花青素苷的代谢相关。在花发育的S2-S5期，LhWDR基因表达量呈上升趋势(图7)，在花被片出现大量花青素苷沉积的S4和S5期，其表达量明显高于前两期。

为了探究LhWDR基因与百合花青素代谢途径相关基因间的关系，研究了LhbHLH2、LhCHS、LhCHI、LhDFR、LhANS基因在花发育的S2-S5期的表达规律，发现这五个基因在S2期相对表达量都非常低，从S3期开始表达水平开始上升，LhbHLH2、LhDFR、LhANS基因在S4期时表达水平达到顶峰，而位于花青素苷代谢早期的结构类基因LhCHS和LhCHI则在S5期时达到顶峰，表达规律与LhWDR基因基本一致(图7)。

实施例3、LhWDR过表达株系的建立及功能验证

一、实验方法

1、构建35S:LhWDR超表达拟南芥植株

构建方法同实施例2中LhWDR蛋白亚细胞定位部分中的相应方法。

2、拟南芥LhWDR基因超表达植株花青素苷代谢相关基因表达水平检测

(1)拟南芥LhWDR基因超表达植株RNA提取

TRIZOL法提取植物总RNA(提取RNA所用的器皿都需经过DEPC水处理或高压灭菌或150℃烘烤后才能使用)。

1)先用液氮将研钵和研棒预冷；2)将拟南芥组织材料放入冷却的研钵中进行充分研磨；3)研磨好的组织迅速转至1.5mL离心管中，加入1mL预冷的Trizol，充分摇匀，室温放置5min，使其充分裂解；4)加入200μL氯仿，用力振荡30s，室温放置3min；5)4℃，12000rpm离心15min；6)将上层水相至另一新的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇混匀，室温放置10min；7)4℃，12000rpm转速离心10min；8)弃上清，加入1mL 75％乙醇清洗沉淀；9)4℃，8000rpm离心5min，弃上清；10)室温晾干或真空干燥5-10min，注意避免时间过长使RNA过分干燥难于溶解；11)加入20～30μL DEPC处理过的灭菌水溶解RNA；12)取少量RNA进行浓度和纯度测定，其余RNA可置于-80℃冰箱保存。DEPC水配方：向1L水中加入1mL DEPC，充分混匀，在室温下放置过夜，然后高温高压灭菌后4℃保存，DEPC有毒，需在通风厨内操作。

(2)反转录成cDNA

用DNase处理RNA样品中残留的DNA，根据表21加入对应成分及用量，37℃反应15min；加入1μL Stop Solution混匀，70℃处理10min，终止消化反应。

表21用DNase处理RNA样品中残留的DNA的反应体系

注：RNA总量不超过5μg。

反转录：采用Invitrogen公司M-MLV试剂盒，反应物在无菌无RNase的PCR管中混合，在PCR仪上进行，反应体系为25μL，依次加入表22中组分：72℃处理10min，之后冰浴5min；再加入表23所列成分，混匀后瞬时离心，37℃反应90min，之后94℃处理5min终止反应；

表22反转录组分一

成份	用量
		Oligo dT	2μL
DNase处理过的RNA	2-5μg
		DEPC-H₂O	至11μL

表23反转录组分二

试剂	用量(μL)
		10μM dNTP	4
5×AMV buffer	5
		25mM MgCl₂	4
AMV	0.5

qRT-PCR：以T2代转基因拟南芥幼苗反转录的cDNA为模板，通过480II荧光定量PCR仪检测转基因拟南芥中ATCHS、ATCHI、DFR、ANS、ATPAP1、GL3基因表达量变化情况，以转入pCAMBIA1302质粒的拟南芥为对照，内参基因为18S。不同批次样品重复3次。应用Microsoft Excel 2010软件对数据进行计算和处理，采用2^-ΔΔCt法分析基因的相对表达情况。

其中，用于检测ATCHS基因的引物为：

ATCHS-F：5’-GTCTCCGTCCTTCCGTCAAG-3’；

ATCHS-R：5’-GTCAAGGTGGGTGTCAGAGG-3’。

用于检测ATCHI基因的引物为：

ATCHI-F：5’-TCCCGGTTCATCGATCCTCT-3’；

ATCHI-R：5’-GACACACCGTTCTTCCCGAT-3’。

用于检测DFR基因的引物为：

DFR-F：5’-ATGCCGCCTAGCCTTATCAC-3’；

DFR-R：5’-CCCATGTCCGTCAGCTTCTT-3’。

用于检测ANS基因的引物为：

ANS-F：5’-AAGGCTCTCTCTGTCGGTCT-3’；

ANS-R：5’-GTGACCCATTTGCCCTCGTA-3’。

用于检测ATPAP1基因的引物为：

ATPAP1-F：5’-AGCATCAGTCGACAGGCAAA-3’；

ATPAP1-R：5’-CCTCCACCTCCAGCAACAAT-3’。

用于检测GL3基因的引物为：

GL3-F：5’-ACAGCTTCTCCGAGCAGAAC-3’；

GL3-R：5’-CGCCCCTTCAACAAACGTTT-3’。

用于检测内参基因18S的引物为：

18S-F：5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’；

18S-R：5’-TGTCACTACCTCCCCGTGTCA-3’。

二、实验结果

为了证实LhWDR基因在植物花青素合成中的作用，本发明构建了LhWDR在拟南芥中超表达的转基因植株。共获得了35株带有35S-LhWDR重组载体的转基因植株。随机挑选4株(OE1-OE4)进行表型观察和基因检测(参见实施例2)，如图8中A所示，转基因植株都带有外源LhWDR基因表达。另外我们还检测了拟南芥中花青素苷代谢相关基因的表达水平，如图8中B所示，DFR基因(序列3)表达水平明显上升，是野生型对照的一倍；GL3基因上升了0.4倍；其他基因如ATCHS、ATCHI、ANS和ATPAP1则没有明显变化。该实验结果表明当LhWDR基因在拟南芥幼苗中超表达时能促进花青素苷合成途径下游基因DFR基因表达量上升，说明LhWDR可能通过此方式参与调节花青素代谢。而转入pCAMBIA1302质粒的拟南芥与野生型拟南芥中各检测基因的表达量基本一致，无统计学差异。

<110> 北京市辐射中心

<120> 来源于百合的LhWDR蛋白及其编码基因与应用

<130> GNCLN171758

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 370

<212> PRT

<213> 百合（Lilium spp.）

<400> 1

Met Gly Ala Ser Ala Ala Asp Ile Val Asp Thr Ala Ala Ser Ala Ser

1 5 10 15

Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Ala Thr Ala Pro Ser Asp Glu Gln Gln

20 25 30

Arg Arg Ser Glu Ile Tyr Thr Tyr Glu Ala Pro Trp Pro Val Tyr Ala

35 40 45

Met Asn Trp Ser Val Arg Lys Asp Lys Lys Tyr Arg Leu Ala Ile Ser

50 55 60

Ser Phe Leu Glu Gln Cys Val Asn Arg Val Glu Ile Val Gln Leu Asp

65 70 75 80

Asp Ser Thr Gly Glu Ile Gln Ser His Pro His Leu Ser Phe Glu His

85 90 95

Pro Tyr Pro Ala Thr Lys Ser Met Phe Ile Pro Asp Arg Asp Cys Leu

100 105 110

Arg Pro Asp Leu Leu Ala Thr Ser Ala Asp Phe Leu Arg Ile Trp Arg

115 120 125

Ile Ser Asp Asp Arg Val Asp Leu His Ser Leu Leu Asp Gly Asn Lys

130 135 140

Asn Ser Glu Phe Cys Ala Pro Leu Thr Ser Phe Asp Trp Asn Glu Ser

145 150 155 160

Glu Pro Arg Arg Ile Gly Thr Ser Ser Ile Asp Asn Thr Cys Thr Ile

165 170 175

Trp Asp Ile Glu Arg Glu Thr Val Asp Thr Gln Leu Ile Ala His Asp

180 185 190

Lys Glu Val Leu Asp Ile Ala Trp Gly Gly Val Gly Val Phe Ala Ser

195 200 205

Val Ser Gly Asp Gly Ser Val Arg Val Phe Asp Leu Arg Asp Lys Glu

210 215 220

His Ser Thr Ile Ile Tyr Glu Ser Ile Asp His Thr Pro Leu Val Arg

225 230 235 240

Leu Gly Trp Asn Lys Gln Asp Pro Arg Tyr Met Ala Thr Ile Ile Met

245 250 255

Asp Ser Val Lys Val Val Val Leu Asp Ile Arg Phe Pro Thr Leu Pro

260 265 270

Val Val Glu Leu Gln Arg His Gln Ala Gly Val Asn Ala Leu Ala Trp

275 280 285

Ala Pro His Ser Ser Cys His Ile Cys Thr Ala Gly Asp Asp Ser Gln

290 295 300

Ala Leu Ile Trp Asp Leu Ser Ser Phe Gly Gly Ser Gly Val Gln Gln

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Val Ala Ala Val Asp Gly Gly Leu Asp Pro Ile Leu

325 330 335

Ala Tyr Thr Ala Gly Ala Glu Ile Glu Gln Leu Gln Trp Ser Ser Thr

340 345 350

Gln Pro Asp Trp Val Ala Ile Ala Phe Ser Asn Lys Leu Gln Ile Leu

355 360 365

Arg Val

370

<210> 2

<211> 1329

<212> DNA

<213> 百合（Lilium spp.）

<400> 2

cccaccaccg gcgaaatggg cgccagcgct gccgacatcg tcgacaccgc cgcctccgcc 60

tccggcgacc ctgccccggt ccccgccacc gccccctccg acgagcagca gcgccgttcc 120

gagatctaca cctacgaagc cccctggcct gtttacgcca tgaattggtc cgtccgcaag 180

gacaagaagt accgcctcgc catctcctcc ttcctcgaac aatgcgtcaa ccgcgtcgag 240

atcgtccagc tcgacgactc caccggcgag atccagtccc accctcacct ctccttcgag 300

cacccctacc ccgccaccaa atccatgttc attcccgatc gtgactgcct ccgtcccgac 360

ctcctcgcca cctccgcgga cttcctccgc atctggcgta tctccgacga tcgcgtcgac 420

ctccactccc tcctcgatgg caacaagaac tcagagttct gtgcccccct cacttccttc 480

gactggaacg agtccgagcc ccgccgcatc ggcacctcct ccatcgacaa cacctgcaca 540

atctgggaca tcgagcgcga gaccgtcgac acgcagctca ttgcgcacga taaagaagtc 600

ttagacatcg cctggggcgg cgttggggtc tttgcctccg tctccggcga tggctccgtc 660

cgcgtatttg acctccgcga caaagaacac tccactatca tctacgagtc catcgaccac 720

acccccctcg tccgcctcgg gtggaacaag caggacccgc gttacatggc taccattatc 780

atggactctg tgaaggtcgt tgttcttgac atccgctttc cgacgctccc ggtggtcgag 840

ctgcagcggc accaggctgg cgtaaacgcc ctagcctggg ccccgcacag ctcctgccac 900

atctgcactg cgggtgatga ttcacaggcg cttatctggg atttgtcgtc gtttggcggg 960

agtggggtgc agcagggggg tgcagcggtt gcagcggtgg atgggggcct ggatccaata 1020

ctggcgtaca ctgctggggc ggagattgag cagctgcagt ggtcgtcgac acagccggac 1080

tgggtggcga ttgctttctc aaataagctg cagatactcc gggtttgagt tcctcggtta 1140

tatcatatca tgatatatta gtatttatta ctgttctctg ataagctagt tcatagtctt 1200

ggaaatggaa ttatatgcta ctcagttacc tgaccgtatc attaggaaat tgtaacttta 1260

gttgtagact tttggatgtg ttccgtttgc tatggtataa tctaggctgt tcattggttt 1320

cttgttaca 1329

<210> 3

<211> 1149

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 3

atggttagtc agaaagagac cgtgtgtgta accggcgctt cgggtttcat cggttcatgg 60

ctagtgatgc gattactaga acgtggttac tttgttcgtg ccaccgttcg agatcccggt 120

aatttgaaga aagtacaaca tcttcttgat ttgccaaacg ccaagacgct actcacttta 180

tggaaggctg atttatctga ggaaggaagc tacgatgatg ccataaacgg atgtgacggt 240

gttttccacg tggcaacacc catggatttt gaatcaaaag atcctgagaa cgaagtgata 300

aagccgacag tgaatggaat gttggggata atgaaagcat gtgttaaggc aaagaccgta 360

cgaagattcg tatttacttc atctgccgga accgttaatg tagaagaaca tcagaagaat 420

gtctatgatg aaaatgattg gagtgatctt gagtttatca tgtccaaaaa gatgacagga 480

tggatgtatt tcgtgtcaaa aacgttagcg gagaaagcag cgtgggattt cgccgaagag 540

aaaggattag atttcattag tattattcca acattggtgg tcggtccatt catcacaacg 600

tctatgccgc ctagccttat caccgcgctc tctcctatca ctcggaacga ggcgcattac 660

tcgatcataa gacaaggaca gtatgtgcat ttggacgact tatgcaacgc tcatatcttc 720

ttatacgaac aagcagccgc caagggacgt tatatttgtt cctctcatga tgcaaccatt 780

cttactatct ccaaatttct caggccaaaa taccccgaat ataacgtacc ttcaacgttt 840

gaaggtgttg atgagaatct aaagagcatt gaattcagtt ccaagaagct gacggacatg 900

gggtttaact tcaagtatag tctcgaggaa atgtttattg aatctattga gacatgtcgt 960

caaaagggtt ttctcccggt ttcattatcg taccaatcca tatcggagat caagactaag 1020

aatgaaaaca ttgacgtcaa aaccggagat ggtttaaccg atggtatgaa gccatgtaac 1080

aagacagaaa cggggataac cggcgagaga accgatgctc ccatgctagc acaacagatg 1140

tgtgcctag 1149

Claims

1.蛋白质，为如下任一：

(A1)氨基酸序列为序列表中的序列1的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下任一：

(B1)序列表中序列2的第16-1128位所示的DNA分子；

(B2)序列表中序列2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(C1)或(C2)中的应用：

(C1)调控植物花青素代谢；

(C2)制备具有调控植物花青素代谢功能的产品。

6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(D1)或(D2)中的应用：

(D1)促进花青素苷合成途径下游基因表达；

7.一种培育花青素苷合成途径下游基因表达量提高的植物的方法，包括使受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性提高的步骤。

8.一种培育花青素苷合成途径下游基因表达量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比花青素苷合成途径下游基因表达量提高。

9.根据权利要求6-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述花青素苷合成途径下游基因具体为DFR基因。

10.根据权利要求4-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。