CN102021188A

CN102021188A - 白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途

Info

Publication number: CN102021188A
Application number: CN2010102845432A
Authority: CN
Inventors: 张丽静; 傅华; 刘永红
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2011-04-20
Also published as: CN102533804A; CN102533804B

Abstract

本发明公开白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。白沙蒿FAD2基因的制备是用白沙蒿的RNA反转录为cDNA，再根据其它植物的FAD2基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到白沙蒿FAD2基因的全长翻译区核苷酸序列；本发明的白沙蒿FAD2基因可用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。

Description

白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途

技术领域

本发明涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)及其制备与用途。

背景技术

Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是植物控制亚油酸合成的关键酶，利用相关植物的FAD2基因进行基因重组，所得到的转基因植物或者植物以外其它转基因生物将在脂质代谢、细胞识别、免疫反应、耐寒等诸多方面将有新的表现。例如：中国发明专利申请200580048074.1公开的编码植物脂肪酸去饱和酶基因的核酸分子及其使用方法中涉及了植物中种子贮存化合物的存在相关的蛋白质的编码核酸序列，涉及到在转基因植物中的用途。如：脂质代谢相关化合物的操作方法，以及在植物和种子中提高油水平和改变脂肪酸组成的方法；以及应用这些新的植物多肽刺激植物生长和/或提高产率和/或种子贮存，等内容。中国发明专利申请200810186867.5公开的双途径基因表达同步抑制获得高油酸低芥酸油菜的方法中介绍了利用改良的RNA干扰技术和基因工程手段，对油酸转化为其它脂肪酸的两条代谢途径①和②上的基因表达同时进行干扰沉默，最大限度阻止油酸转化为其它类型的脂肪酸，实现大幅度提高油酸含量和大幅度降低芥酸含量的方法。

在GenBank中已公布花生、芸薹、拟南芥、欧芹、茄和棉花等植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列。

发明内容

本发明提供一种取自沙生植物-白沙蒿的FAD2基因，以及这种基因的制备方法及用途。

本发明所述的白沙蒿FAD2基因序列为基因序列表中的SEQ 1。

本发明所涉及的白沙蒿FAD2基因制备方法是：首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列；根据测序得到的FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的白沙蒿AsFAD25’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿FAD2基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的5’端分别加入BamHI和SacI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

本发明具体采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下：

上游引物P1：

5’-AARAARGYYATYCCRCCVCAYTG-3’，

下游引物P2：

5’-TKCCAYCRYIKSATWATRWKG-3’；

P3为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，

P4为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3’，

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；

P5为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，

P6为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3’，

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’。

P7：5’-AGAGGATCCATGGGCGCTGGT-3’

P8：5’-GCGGAGCTCTCAGTCGTACTTGCTTC-3’

其中：R＝A or G；Y＝C or T；V＝A or C or G；K＝G or T；S＝C or G；W＝A or T。

本发明所涉及的白沙蒿FAD2基因可在油料作物的转基因工作中应用，也可在牧草等作物的转基因工作中应用，可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作中应用，也可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。

白沙蒿(Artemisia sphaerocephala krasch)是一种优良超旱生固沙植物，是我国沙区畜牧业的重要饲料之一，是我国西北、华北、东北荒漠半荒漠地区的特有植物，其抗风沙，耐旱、耐寒、耐贫瘠性能极强。白沙蒿叶、籽中均含亚油酸乙酯，水解后可得到亚油酸，白沙蒿籽油中亚油酸含量可达80％以上，总不饱和脂肪酸含量可达90％，是籽油中亚油酸含量最高的植物，参见：白寿宁，云秀芳“沙蒿油开发利用探讨”《粮食与油脂》，2000(3)：31-33。白沙蒿籽油中亚油酸含量极高，植物油中亚油酸含量最高的就是沙蒿油(参见表1)。

表1沙蒿油与其他植物油亚油酸含量

油名	亚油酸含量(％)	油名	亚油酸含量.(％)
				沙蒿油	77.4～78.3	棉籽油	40～52
葡萄籽油	58～78	芝麻油	35.2～48.4
				红花油	74.5	花生油	33.4～42
构祀籽油	66.6～67.8	米糠油	28～42

葵花籽油	66.2	沙棘籽油	40.3
				小麦胚芽油	44～65	米胚芽油	38
核桃油	62.2	橄榄油	3.9～15.0
				大麦胚芽油	62	茶籽油	11.4
玉米胚芽油	36～62	棕搁油	5～11
				大豆油	49.5～54.5	椰子油	1.5～2.5

亚油酸作为一种不饱和脂肪酸，对于人类和动物具有不可忽视的营养价值，而不饱和脂肪酸又是植物生物体基本组成之一，具重要生理功能。它们既是细胞膜脂的主要成分，又是重要的能源物质，还是一些信号分子的前体。例如不饱和脂肪酸是生物膜功能所必需的。在生理温度下，仅含饱和脂肪酸的极性甘油脂不能在生物膜中形成双分子层排列。在饱和脂肪酸的适当位置引入一定数目的双键，可增加膜的流动性，这对激活一些结合在膜上的酶是非常重要的，反应了不同温度下生物膜流动性的维持能力。我们推测由于白沙蒿生长在干旱荒漠地区，长期经历干旱、高温、冻害等逆境胁迫，使其自身进化出一定的防御机制，从而提高亚油酸合成量。其亚油酸含量提高的作用机制之一有可能是其FAD2基因核苷酸编码的氨基酸在催化活性上有特殊性。其次，在干旱、高温、冻害和贫瘠等逆境胁迫下生长的白沙蒿具有抗旱、耐高温、耐冻和耐贫瘠性的品质。因此白沙蒿FAD2基因是一种可对植物，如油料作物，或者牧草作物，或其它的植物，甚至非植物的其它生物进行基因改造的最佳材料。

根据通常的作法，一般多是采用植物的籽种提取RNA。本发明经相关实验表明，采用白沙蒿的叶片提取其RNA较采用白沙蒿的其它组织提取RNA更为方便，并且本发明提取的FAD2基因在叶片中表达，因此在植物抗逆过程中保持膜脂流动性，发挥着更重要的作用。经反复试验表明，采用白沙蒿的叶片，特别是用3周龄的嫩叶提取会有极好的效果。

具体实施方式

以下提供本发明的具体实施方式及相关实验数据：

一、以白沙蒿为材料提取RNA，反转录为cDNA

白沙蒿(Artemisia sphaerocephala)种子采自内蒙古阿拉善左旗，播种在营养钵内，置于温室，按常规方法培养，3周龄时，取幼嫩的叶片为材料，按上海生工(上海生工生物工程技术服务有限公司，上海市松江区车墩工业区香闵路698号，邮编201611)UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行RNA提取。按照按宝生物(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，得到cDNA。

根据通常的作法，一般多是采用植物的籽种提取RNA。但实验表明，采用白沙蒿的籽种提取RNA非常的困难，经常无法实现操作，经反复试验表明，采用白沙蒿的叶片，特别是用3周龄的嫩叶提取会有极好的效果。

二、核心片段RT-PCR扩增

利用GenBank中已公布的花生、芝麻、芸薹、向日葵、拟南芥、欧芹、茄和棉花等植物FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计一对简并引物P1、P2。

在200μl PCR管中依次加入下列组分配置PCR反应液：

轻轻混匀，PCR反应条件为：

94℃预变性5min

72℃延伸10min

4℃ ∞

胶纯化和回收获得的目的基因产物，连接到pGM-T Vector，转化至E.coliDH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。得到长度大约为880bp白沙蒿FAD2核心片段。

三、白沙蒿FAD2基因5’和3’末端的克隆(5’-RACE和3’-RACE)

3.1白沙蒿总RNA反转录前处理(按照Invitrogen RACE试剂盒操作指南进行)

3.1.1白沙蒿总RNA脱磷酸基团

脱磷酸基团反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)50℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：

(1)加入90μl DEPC水、100μl酚∶氯仿(25∶24)，漩涡震荡30s。

(2)20℃下12000rpm离心5min，吸取上清(约100μl)转移至新的离心管中。

(3)依次加入2μl 10mg·ml^-1 Mussel Glycogen、10μl 3mol·L^-1NaAc(pH5.2)和220μl 95％乙醇，颠倒混匀，冰浴10min。

(4)4℃、12000rpm离心20min，弃上清，小心不要弃掉沉淀，加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀。

(5)4℃、12000rpm离心20min，小心吸去乙醇，再次离心弃去残留乙醇。

(6)20℃下干燥沉淀1-2min，加入7μl DEPC水溶解，为下步去帽反应备用。

3.1.2白沙蒿mRNA去除帽子结构

去帽反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。

3.1.3去帽后的白沙蒿mRNA和RNA oligo连接

连接反应：

(1)在含有0.25μg GeneRacer^TM RNA Oligo的离心管中加入7μl上述反应液，轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(2)65℃温育5min，消除RNA二级结构。

(3)冰浴2min，短暂离心。

(4)依次加入以下试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心。

(6)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。沉淀用10μl DEPC水溶解。

3.2第一链cDNA的合成

(1)在上述获得的10μl ligated RNA中加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)65℃温育5min以除去RNA二级结构，冰浴1min，短暂离心收集液体。

(4)于冰上依次加入下列试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(6)25℃温育5min，50℃温育1h，70℃温育5min，冰浴2min，短暂离心收集液体。

(7)加入1μl RNase H(2U·μl^-1)，37℃温育20min，短暂离心收集液体。

(8)-20℃保存备用或即可进行5’和3’外侧PCR扩增反应。

3.35’末端PCR扩增

根据已测序得到的FAD2基因核心片段序列分别设计5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对。以3.2中所述获得的白沙蒿cDNA为模板进行5’外侧和巢式PCR扩增反应。

5’外侧PCR扩增

在200μl PCR管中按下列组分配置PCR反应液：

轻轻混匀，短暂离心，PCR反应体系如下：

94℃预变性5min

72℃延伸10min

4℃ ∞

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

5’巢式PCR扩增

在200μl PCR管中按下列组分配置PCR反应液：

轻轻混匀，短暂离心，PCR反应体系如下：

94℃预变性5min

4℃ ∞

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

胶纯化和回收获得的目的基因5’端PCR产物，连接到pGM-T Vector，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。

3.4 3’末端PCR扩增

根据已测序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分别设计3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对。以3.2中获得的白沙蒿cDNA为模板进行3’外侧和巢式PCR扩增。

3’外侧PCR扩增

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

轻轻混匀后短暂离心，PCR反应条件如下：

94℃预变性5min

72℃延伸10min

4℃ ∞

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

3’巢式PCR扩增

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

轻轻混匀后短暂离心，PCR反应条件如下：

94℃预变性5min

4℃ ∞

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

经过测序，5’和3’RACE巢式PCR扩增产物分别为344bp和512bp，与前述所得到的白沙蒿Δ12-脂肪酸脱氢酶核心片段都有部分核苷酸重叠，并且在与GeneBank中比对发现扩增出来的片段与其他植物Δ12-脂肪酸脱氢酶基因5’和3’端具有同源性。因此，扩增得到的5’和3’RACE-PCR产物分别为同一cDNA的5’和3’端。

四、PCR扩增翻译区全长序列

根据已克隆到的白沙蒿AsFAD25’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿FAD2基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的5’端分别加入BamHI和SacI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

轻轻混匀后短暂离心，PCR反应条件如下：

94℃预变性5min

72℃延伸2min

72℃延伸10min

4℃ ∞

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

胶纯化和回收获得的目的基因产物，连接到pGM-T Vector，转化至E.coliDH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。得到全长为1158bp的白沙蒿FAD2基因全长翻译区cDNA序列，参见基因序列表中SEQ1。

Claims

1.白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因，其特征是其基因序列为SEQ 1。

2.权利要求1所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因的制备方法，其特征是首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列；根据测序得到的FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；将所得到的三段序列(白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列、5’末端核苷酸序列和3’末端核苷酸序列进行拼接，得到目标基因。

3.权利要求2所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因的制备方法，其特征是采用白沙蒿的叶片提取RNA。

4.权利要求2或3所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因制备方法中所用的相关引物，其特征是：

上游引物P1为：

5’-AARAARGYYATYCCRCCVCAYTG-3’，

下游引物P2为：

5’-TKCCAYCRYIYSATWATRW KG-3’；

P3为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，

P4为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3’，

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；

P5为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，

P6为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3’，

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’。

其中：R＝A or G；Y＝C or T；V＝A or C or G；K＝G or T；S＝C or G；W＝A or T

5.权利要求1所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因在油料作物的转基因工作中的应用。

6.权利要求1所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因在牧草作物的转基因工作中的应用。

7.权利要求1所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因在除权利要求4或5所述的植物外的植物中的转基因工作中的应用。

8.权利要求1所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因在除植物外的其它生物的转基因工作中的应用。