CN103834672A

CN103834672A - 一种δ12-脂肪酸脱氢酶基因及其应用

Info

Publication number: CN103834672A
Application number: CN201410096716.6A
Authority: CN
Inventors: 张琦; 李凌彦; 何仕武; 胡彬彬; 魏云林; 林连兵; 季秀玲
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: CN103834672B

Abstract

本发明公开了一种从深黄被孢霉M6-22中分离的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，编码如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；通过构建重组载体并在酿酒酵母中表达，表达产物具有Δ12-脂肪酸脱氢酶功能，能催化油酸转化成亚油酸。

Description

一种Δ12-脂肪酸脱氢酶基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域和遗传工程领域，涉及从一种酵母-深黄被孢霉（Mortierella isabellina）中克隆的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因，具体讲是深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列及其应用；将该基因直接或与不同载体连接，转入细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶产生不饱和脂肪酸的方法和应用。

背景技术

Δ¹²-脂肪酸脱氢酶(Δ¹²-fatty acid desaturases)又称油酸脱氢酶(oleate desaturases)。Δ¹²-脂肪酸脱氢酶属于一类膜整合酶，由于分离和鉴定膜结合蛋白的难度很大[MaKeon，1981，酶学方法，12141-12147；wang等，1988，植物生理学生物化学，26:777-792]，因此很难得到包括Δ¹²-脂肪酸脱氢酶在内的各种膜结合蛋白性质脱氢酶高级机构，而只能通过对酶的核苷酸序列进行初步研究，或者在异源的受体内表达来研究酶的底物特异性。序列对比的结果表明，编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列具有共同的机构特性：存在三个组氨酸保守区，形成四次跨膜的结构[Kyte et al，1982，J.Mol.Biol.157:105-132]，这些都是维持脱氢酶所必须的。

Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的主要作用是在单不饱和脂肪酸油酸(oleic acid)的第12和13位碳原子之间插入一个双键, 形成含有2个双键的多不饱和脂肪酸-亚油酸(linoleic acid)。Δ¹²-脂肪酸脱氢酶是油酸脱氢形成亚油酸的关键酶, 是多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid)代谢ω-3、ω-6途径的限速酶, 控制着植物细胞中大多数不饱和脂肪的合成,只存在于植物和微生物中,人和哺乳动物细胞中缺乏在脂肪酸的第9位碳原子以上位置引入不饱和双键的脱氢酶，这些多不饱和脂肪酸必须从食物中获取。因此，亚油酸和α-亚油酸是人体必须脂肪酸，膳食性摄入亚油酸和α-亚油酸，经Δ6-脂肪酸脱氢酶催化转化成γ-亚油酸和十八碳四烯酸，它们又在其它相关酶的催化下可进一步转化成其它长链多不饱和脂肪酸[Horrobin DF，1992，Prog Lipid Res，31:163-194]。这些长链多不饱和脂肪酸是集体组着生物膜组成成分，起到维持细胞正常功能和增加机体抗逆性的作用[Napier JA et al，1999，Curr.Opin.Plant Biol，2:123-127]，因此包括亚油酸在内的多不饱和脂肪酸在保健和医疗方面有很广阔的应用前景。研究不饱和脂肪酸的合成和它的生理作用成为当前的热点。

对于脂肪酸脱氢酶的生物学功能，许多实验室采用了从各种生物体中克隆相关的基因并转入各种受体中，在受体中观察受体的脂肪酸改变的方法。目前，已从动物、植物、微生物等不同来源中分离到许多Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因的同源序列，并且证明具有相应的生物学功能。尤其是近几年来随着双功能Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的发现[Edgra B. Cahoon et al，2001，THE JOURNAL OF BIOLIGICAL CHEMISTRY ,26：2637-2643.]和共轭油酸在医疗保健功能的发掘，人们越来越认识到不饱和脂肪酸的重要性, 并且常规的生物化学方法很难分离纯化膜结合的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶, 研究其在自然环境中的生化特性比较困难，因此人们的注意力又开始转向对Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的研究上。

发明内容

本发明的目的是提供一种Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因，这是从深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中分离得到，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1194bp（碱基），其中1-1194为编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽或其片段。

本发明另一目的是提供一种含有Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因的重组表达载体，是将SEQ ID NO：1所示基因直接与不同表达载体（质粒、病毒或运载体）连接所构建的重组载体。

可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含编码深黄被孢霉M6-22Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等[Sambroook,et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]。所述的编码深黄被孢霉M6-22Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列可有效连接到表达载体的恰当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录，如腺病毒增强子。

本发明另一目的是提供一种含有Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因或上述重组表达载体的宿主细胞，该细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代，宿主细胞的代表性例子有：大肠杆菌；真菌细胞或酵母；植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体优化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期手机菌体，用CaCl₂、电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染法。显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。

本发明的核苷酸序列是DNA形式的，DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或是简并的变异体。

本发明还包括编码深黄被孢霉M6-22Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列的片段。如本发明所用，术语“片段”是指能编码基本上保持本发明天然的相同的生物学功能或活性的多肽的核苷酸序列。通过本文的阐述，这样的片段、被认为在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明中的多肽和核苷酸序列优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明中特异核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离核苷酸序列。这些技术包括但不局限于：（1）用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的核苷酸序列；和（2）表达文库的抗性筛选以检出具有共同结构特征的克隆的核苷酸序列片段。

本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：（1）从基因组DNA分离双链DNA序列；（2）化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。

上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成法是经常选用的方法。更经常选用的方法是DNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，用试剂盒也可从商业途径获得。而构建cDNA文库也是通常的方法。当结合聚合酶链式反应技术（PCR）时，即使极少的表达产物也能克隆。

本发明另一目的是将Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因应用在生产不饱和脂肪酸中。

本发明提供的核苷酸序列是一种高效的特异性的脂肪酸脱氢酶，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞体内生产不饱和脂肪酸，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发功能油脂等优点，可以用于商业化生产，直接改善油脂品质，更加具有实际应用价值。本发明应用基因工程技术构建特异性生产多不饱和脂肪酸的转基因酵母细胞生产不饱和脂肪酸，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为新一代转基因脂肪酸产品的品质改良奠定基础。

附图说明

图1为本发明的深黄被孢霉M6-22Δ¹²-脂肪酸脱氢酶和卷枝毛霉（Mucor circinelloides）Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列同源性比较示意图；

图2为本发明所构建的酿酒酵母表达载体pY3MID12；

图3为本发明含pYES3/CT空载体的转基因酵母的气相色谱图；

图4为本发明含重组质粒pY3MID12的转基因酵母的气相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：从深黄被孢霉M6-22中分离Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列

采用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（产品编号: SK8259）提取深黄被孢霉M6-22的基因组DNA，取1ul为模板进行聚合酶链式反应，根据所发表的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶同源序列的组氨酸保守区Ⅰ和Ⅲ区氨基酸序列设计简并引物（引物1和引物2），以上述提取的DNA模板在PCR仪（BIOER公司）上进行PCR扩增，反应所用引物、组份和扩增条件如下：

引物1：FD12CRF1: 5`-CA(T/C)GA(A/G)TG(T/C)GGICA(T/C)CA(A/G)(G/T)CITT-3`

引物2：FD12CRR3: 5`-(A/T)A(A/G)TG(A/G)TGI(A/G)(A/G/C)IAC(A/G)TGIGT-3`

PCR扩增体系（25 μL）组成如下：

10×Ex Taq Buffer 2.5 μL

dNTP（2.5 μmol/L） 2 μL

模板 1 μL

P1（10 μmol/L） 2 μL

R1（10 μmol/L） 2 μL

Ex Taq DNA polymerase（5U/μL） 2 μL

无菌ddH2O 补足至25 μL

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 1min、56℃ 1.5min、72℃ 2min进行30个循环，最后72℃ 10min。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增得到大小约750bp的片段，用多功能DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)（北京百泰克生物技术有限公司）回收，把回收片段亚克隆到pMD-18T（TaKaRa公司产品）中，连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素（100ug/ml）的LB固体平板上过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，通过菌落PCR验证阳性克隆。将验证阳性的克隆子接入LB液体培养基（含100ug/ml氨苄青霉素）中过夜培养，用高纯质粒小量制备试剂盒（离心柱型）（北京百泰克生物技术有限公司）提取质粒，经NcoⅠ和SacⅠ酶切再进一步进行验证，测序（北京三博志远北京三博远志生物技术有限责任公司）。测序结果显示所扩增得到的片段大小为705bp，通过其编码的氨基酸序列在Genebank数据库中用Blast程序进行同源检索，检索结果表明与该片段最相似的同源片段为Δ¹²-脂肪酸脱氢酶，但并不完全相同，证明所扩增的片段为新的潜在的脱氢酶基因的片段。

根据设计的特异性引物（引物3和引物4）以cDNA为模板进行PCR反应。先用真核细胞总RNA提取试剂盒（Promega公司产品）试剂盒提取细胞的总RNA，利用反转录试剂盒（fermentas公司产品）反转录合成第一条cDNA，然后以其为模板进行PCR反应；

引物3：MID12F:5`-ATTAAGCTTATGCCACCCAACGTAACGTCT-3`（SEQ ID NO:3）

引物4：MID12R:5`-GCACTCGAGTTAGTTTTTGAAGAACAAGACGT-3`（SEQ ID NO:4）

PCR扩增体系（25 μL）组成如下：

10×Ex Taq Buffer 2.5 μL

dNTP（2.5 μmol/L） 2 μL

模板 3 μL

P1（10 μmol/L） 2 μL

R1（10 μmol/L） 2 μL

Ex Taq DNA polymerase（5U/μL） 2 μL

无菌ddH2O 补足至25 μL

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 2min进行30个循环，最后72℃ 10min；PCR扩增产物采用上述相同的方法鉴定、测序。用DNAMAN软件进行序列分析，结果显示得到了一段1194bp长的序列，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

实施例2：所分离核苷酸序列的同源性搜索

将推测的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列在Genbank上进行同源性搜索，所得同源序列大部分为编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的序列，少数为假定蛋白的序列，选择已做功能验证的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶做同源性比较，其中与卷枝毛霉（Mucor circinelloides）Δ¹²-脂肪酸脱氢酶同源性最高，相同性为58%（图1）。图1显示本发明的深黄被孢霉M6-22中分离Δ¹²-脂肪酸脱氢酶和卷枝毛霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶（GenBank: BAB69056.1）的氨基酸序列同源性比较图，MID12为本发明的深黄被孢霉M6-22Δ¹²-脂肪酸脱氢酶，MCD12为卷枝毛霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶，Consensus：两序列之间相同的氨基酸序列。这说明本发明新的核苷酸序列所编码的酶具有潜在的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的功能。

实施例3：酿酒酵母重组表达载体的构建

根据SEQ ID NO:1所示编码区序列，设计出一对基因特异性扩增引物（引物3和引物4）分离其潜在的开放阅读框序列：

引物3：MID12F:5`-ATTAAGCTTATGCCACCCAACGTAACGTCT-3`

引物4：MID12R:5`-GCACTCGAGTTAGTTTTTGAAGAACAAGACGT-3`

此两个引物的5‵端下划线部分分别含有Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位点，所用的扩增条件和反应组分和以cDNA为模板的PCR反应相同，扩增产物的测序结果显示和SEQ ID NO:1所示1-1194bp的序列一致。然后取25ulPCR产物和10ulpYES3/CT分别进行双酶切，回收酶切大片段，并用T4连接酶在16度连接4h，连接产物转化大肠杆菌HD5α，通过质粒提取和PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。质粒构建结果见图2，所构建的含有Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因的酵母表达命名为pY3MID12。该质粒是由pYES3/CT（Invitrogen公司）和引物3和引物4的PCR产物构建而成。质粒和PCR产物分别经Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切后，电泳回收纯化，经T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选鉴定出重组质粒，命名为pY3MID12。

实施例4：重组表达载体转化酿酒酵母细胞

挑取酿酒酵母菌株INVSC1单菌落于5ml YEPD液体培养基中，30℃摇床过夜培养，按1%的接种量转接于100ml的YEPD液体培养基中，30℃摇床摇至OD600于1.3-1.5之间。4℃、4000g离心5min收集沉淀细胞，用100ml预冷的无菌ddH2O洗涤细胞，4℃、4000g离心5min收集沉淀细胞，再用50ml预冷的无菌ddH2O洗涤细胞，4℃、4000g离心5min收集沉淀细胞，用20ml预冷的1M山梨醇洗涤细胞，4℃、4000g离心5min收集沉淀细胞，细胞用0.5ml的预冷的1M山梨醇悬浮，每80ul分装于1.5ml预冷的离心管中。取1ug线性化的重组表达载体加入80ul的感受态细胞中，混匀后转至0.2cm的点转杯中，冰上孵育5min，转入电转仪中电击（电击条件：电压1.5kV，电容25uF，电阻200Ω，电击时间为4-10ms）。电击完毕后立即加入1ml 1M预冷的山梨醇并吹匀，30℃孵育2h后涂布于SC-Trp（无色氨酸）选择培养基上，置30℃培养3-4天。

实施例5：酵母工程菌的诱导表达

挑取SC-Trp（无色氨酸）选择培养基平板上出现的阳性转化子，接种于15ml SC-Trp（无色氨酸）选择培养基（含2%葡萄糖），30℃摇菌培养24h，转接于100ml的SC-Trp（含2%的半乳糖和1%的棉子糖）中使其初始OD600为0.4，30℃继续培养72h，4000g离心收集菌体，用去离子水洗涤三次，50℃烘干，研碎，取100mg加入5ml 5%的KOH-CH₃OH溶液中，70℃反应3h，反应结束后冷却至室温，用6M的盐酸调节溶液的pH值到2.0，加入4ml 14%BF₃-CH₃OH，70℃反应1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入10ml饱和的NaCl溶液，剧烈震荡混匀，转移至分液漏斗中，用8ml 1:4的氯仿：环己烷抽提两次，合并两次的提取液，加入适量的无水Na₂SO₄干燥提取液，静置1h，去掉Na₂SO₄，把含有脂肪酸甲酯的上清用氮气吹干，用200ul的正己烷回溶样品，最后用0.45um微孔滤膜过滤。

实施例6：脂肪酸气相色谱分析

采用气相色谱分析仪器分析转基因酵母工程菌的诱导表达情况，气相色谱分析仪器为岛津GC-7A，柱子：弹性石英毛细管柱，0.32×30m，固相支持物：聚二乙二醇丁二酸酯镀膜物：聚酰亚胺。载气：N2，线速10cm/s。分流比：100:1，气化室温度：250℃，柱温：180℃，尾吹：50ml/min，检测器：氢火焰离子化检测器。把上述制备的脂肪酸甲酯化样品进行GC分析，上样量为1ul;分析软件：Anstar。

色谱分析结果见图3、4，图3显示含pYES3/CT空载体的转基因酵母，图4显示含重组质粒pY3MID12的转基因酵母；与图3相比，图4中保留时间为13.7min对应的峰与亚油酸甲酯标准品一致，即为深黄被孢霉M6-22Δ ¹² -脂肪酸脱氢酶催化油酸产生的亚油酸。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1194

<212> DNA

<213> 深黄被孢霉

<400> 1

atgccaccca acgtaacgtc tgagaacatc ttgacgcaac gcaatgtgcg 50

tgatgacaat gaaaatgaca aggacctcat catcgagaac gactggcaac 100

taccagaatt ctctatcaag gaaattcgtg atcatattcc tagcgaattg 150

tttcaaagag accttttgaa gtctttctac tgggttcttc acgatcttgt 200

tatcgtcggt ggtttgttct atgctgctac ccatattcat cgcttgccat 250

acaagttgca attcattgct tggcccgcat attggattgc ccagggtatt 300

gtagctaccg gtgtttgggt tttgggccac gagtgcggac atcaggcctt 350

cagcgactac agggttgtaa ataatacagt cggctgggtg cttcacagct 400

ttttgttggt tcctttccac tcatggagat tatctcactc tatgcatcac 450

aagaagactg gtcatattga gcatgatgaa gtattcttgc ctaaaactcg 500

cgccatggtt ggattgccca agcgtgaaaa tgatcctgaa gccgacggtc 550

ctcactccct gttcgaggag gcaccaatag tatcaatggc gaatctcatc 600

ttgaagctat tttttggctg gcctttgtat ctgactctca attctactgg 650

tcctcttgcc aagcgcaatg aaaagtatct gtctcacttc aatcccaaaa 700

cttccatcta tgaagccaaa cacttttggg atatcatcgt ttctgacatt 750

ggtgtagtct ccatgatcgg cgtgctcatc tacattgcca gattgacctc 800

cacgttggat gtgattcgtt attatgttat tccttattcc tgggtcaatt 850

tctggttggt tttgatcact taccttcagc acaccgatcc tgctctccca 900

cactactctg ccaaggtttg gaacttccaa cgcggcgctg ctcttaccat 950

cgaccgccca tatggctttg gcattgacta cttccagcat cacattgctg 1000

attcgcacgt agctcaccac tttttctcta ccatgcccca ttacaatgcc 1050

gtcaaggcca ctcactacat taagaaggct cttggtcctc attactgccg 1100

ggacgacact cccattccta ttgctgctta ccgtgctcag actttgtgcc 1150

ggtatattga agacgaaggt gacgtcttgt tcttcaaaaa ctaa 1194

<210> 2

<211> 398

<212> PRT

<213> 深黄被孢霉

<400> 2

MET Pro Pro Asn Val Thr Ser Glu Asn Ile Leu Thr Gln Arg Asn

1 10

Val Arg Asp Asp Asn Glu Asn Asp Lys Asp Leu Ile Ile Glu Asn

20 30

Asp Trp Gln Leu Pro Glu Phe Ser Ile Lys Glu Ile Arg Asp His

40

Ile Pro Ser Glu Leu Phe Gln Arg Asp Leu Leu Lys Ser Phe Tyr

50 60

Trp Val Leu His Asp Leu Val Ile Val Gly Gly Leu Phe Tyr Ala

70

Ala Thr His Ile His Arg Leu Pro Tyr Lys Leu Gln Phe Ile Ala

80 90

Trp Pro Ala Tyr Trp Ile Ala Gln Gly Ile Val Ala Thr Gly Val

100

Trp Val Leu Gly His Glu Cys Gly His Gln Ala Phe Ser Asp Tyr

110 120

Arg Val Val Asn Asn Thr Val Gly Trp Val Leu His Ser Phe Leu

130

Leu Val Pro Phe His Ser Trp Arg Leu Ser His Ser MET His His

140 150

Lys Lys Thr Gly His Ile Glu His Asp Glu Val Phe Leu Pro Lys

160

Thr Arg Ala MET Val Gly Leu Pro Lys Arg Glu Asn Asp Pro Glu

170 180

Ala Asp Gly Pro His Ser Leu Phe Glu Glu Ala Pro Ile Val Ser

190

MET Ala Asn Leu Ile Leu Lys Leu Phe Phe Gly Trp Pro Leu Tyr

200 210

Leu Thr Leu Asn Ser Thr Gly Pro Leu Ala Lys Arg Asn Glu Lys

220

Tyr Leu Ser His Phe Asn Pro Lys Thr Ser Ile Tyr Glu Ala Lys

230 240

His Phe Trp Asp Ile Ile Val Ser Asp Ile Gly Val Val Ser MET

250

Ile Gly Val Leu Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Thr Ser Thr Leu Asp

260 270

Val Ile Arg Tyr Tyr Val Ile Pro Tyr Ser Trp Val Asn Phe Trp

280

Leu Val Leu Ile Thr Tyr Leu Gln His Thr Asp Pro Ala Leu Pro

290 300

His Tyr Ser Ala Lys Val Trp Asn Phe Gln Arg Gly Ala Ala Leu

310

Thr Ile Asp Arg Pro Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Tyr Phe Gln His

320 330

His Ile Ala Asp Ser His Val Ala His His Phe Phe Ser Thr MET

340

Pro His Tyr Asn Ala Val Lys Ala Thr His Tyr Ile Lys Lys Ala

350 360

Leu Gly Pro His Tyr Cys Arg Asp Asp Thr Pro Ile Pro Ile Ala

370

Ala Tyr Arg Ala Gln Thr Leu Cys Arg Tyr Ile Glu Asp Glu Gly

380 390

Asp Val Leu Phe Phe Lys Asn ***

398

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attaagctta tgccacccaa cgtaacgtct 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcactcgagt tagtttttga agaacaagac gt 32

Claims

1.一种Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种含有权利要求1所述Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因的重组表达载体。

3.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求1所述的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因或权利要求2所述的重组表达载体。

4.权利要求1所述Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因在生产不饱和脂肪酸中的应用。