CN101210242B - 花生△12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生△12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，是把花生△12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因全长序列插入到大肠杆菌表达载体pRSETB中，构建融合表达载体pRSET/HO-A，并转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)pLysS中，最后进行IPTG诱导表达。经检测证明，采用这种方法，△12脂肪酸脱氢酶基因获得了稳定表达，表达量高达15.8％，这也是目前所知的脂肪酸脱氢酶基因在原核生物中的最高表达量。
Description
技术领域
本发明属于遗传工程，尤其涉及一种花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法。
背景技术
花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一，其种子中富含油酸和亚油酸。Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是亚油酸合成的关键酶，催化油酸(18∶1)在Δ12位上脱氢生成亚油酸(18∶2)，其一般存在于植物细胞的内质网和叶绿体膜上。不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸等，在增加膜的流动性中发挥重要作用，通过改变脂肪酸脱氢酶的活性，调节膜脂的不饱和程度，增加生物体抗盐和抗寒能力。随着人们对高品质植物油的需求增加，利用基因工程手段调节不饱和脂肪酸含量的研究受到越来越多的关注。但由于Δ12脂肪酸脱氢酶本身的特性，目前还没有有效的方法将其纯化并在蛋白水平作进一步的研究，尚需对其结构和功能之间以及表达调控进行更深入全面的研究。
发明内容
本发明的目的是提供花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，是把花生Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因全长序列插入到大肠杆菌表达载体pRSETB中，构建融合表达载体pRSET/HO-A，并转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)pLysS中，最后进行IPTG诱导表达。
在构建融合表达载体pRSET/HO-A的过程中，先把FAD2基因进行RT-PCR扩增，目的片段连接入克隆载体pMD18，转化大肠杆菌DH5，获得阳性克隆pMD/HO-A，最后将pMD/HO-A与表达载体pRSETB连接。
在进行IPTG诱导表达的过程中，含有pRSET/HO-A质粒的BL21(DE3)pLysS单菌落在培养基中振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，22℃再继续培养10～15h。
在进行IPTG诱导表达的过程中，含有pRSET/HO-A质粒的BL21(DE3)pLysS单菌落在培养基中振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，22℃再继续培养12h。
在上述技术方案中，发明人采用了pRSET表达载体，PRSET表达系统是源于PUC19的高拷贝质粒，能产生是pET表达量5倍的基因剂量，从而导致大量 重组蛋白的融合表达。表达载体pRSET包含T7启动子，可通过表达菌株所产生的T7RNA聚合酶进行有效的转录，目的基因可插入其6XHis标签下游，形成N末端融合蛋白，6Xhis标签序列通常不影响表达产物的生物学活性，并且还可以方便地进行融合蛋白的分离与纯化。另外，表达菌株BL21(DE3)pLysS含有pLysS质粒，能降低靶基因的背景但并不干扰由IPTG诱导的表达水平，能降低外源蛋白对自身的毒害，保持质粒的稳定性。经检测证明，Δ12脂肪酸脱氢酶基因获得了稳定表达，表达量高达15.8％，这也是目前所知的脂肪酸脱氢酶基因在原核生物中的最高表达量。
附图说明
图1为融合表达载体pRSET/HO-A构建图。
图2为Δ12脂肪酸脱氢酶在大肠杆菌中表达产物的SDSXPAGE分析，其中A：蛋白标准条带，B：pRESTB空载体，C-D：包涵体蛋白，E-G：可溶蛋白分别在30℃、22℃和18℃，H：22℃条件下的总细胞菌蛋白；箭头所指为目的蛋白。
图3脂肪酸甲酯的气相色谱和气相色谱/质谱分析图，其中A：油酸甲酯标准品，B：脂肪酸甲酯分析。
具体实施方式
如图1所示，根据FAD2同源基因序列简并引物，在其两端各加一个特异酶切位点EcoRI、BamHI，以花生总RNA为模板进行RT-PCR扩增，获得一条约1200bp的片段，连接入克隆载体pMD18，转化大肠杆菌DH5，挑取阳性克隆进行测序，结果显示：该核苷酸序列包含一个1140bp的ORF，该序列递交GenBank，获得接收号为AY900663，命名为pMD/HO-A。将pMD/HO-A和表达载体pRSETB分别用EcoRI、BamHI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收1140bp目的条带和表达载体2900bp片段，将其按5∶1比例16℃连接过夜后，取10μl转化大肠杆菌Top10，次日PCR检菌，鉴定为阳性克隆的单菌落用质粒提取Kit提取质粒，酶切鉴定正确的质粒进行测序，确定目的基因在pRSETB中正确的读码框和插入方向。最后将正确的重组质粒转化入表达菌株BL21(DE3)pLysS中。感受态细胞制备采用Sangon高效感受态细胞转化Kit，重组质粒的转化、酶切鉴定及阳性克隆的筛选按常规分子生物技术进行。重组质粒命名为pRSET/HO-A。
挑取含有pRSET/HO-A质粒的BL21(DE3)pLysS单菌落在3ml LB培养基中活化14h后，按2％接种到20ml培养基中，培养基中加Amp、Chl抗生素，振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，22℃再继续培养 12h，培养液在4℃温度下经5000rpm离心10min收集菌体。菌体置于-70℃中保存备用。
冷冻的菌体加100μl、20mM、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，充分悬浮，液N2速冻后42℃融化，反复冻融4次后，8000rpm4℃离心5min，取上清液入另一干净离心管中，分别加100μl2×SDS-PAGE buffer，取等量蛋白进行12％SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白电泳图通过凝胶成像仪进行分析。如图2所示，可以清楚地看到大小约为43KD的目的蛋白条带，重组质粒pRSET/HO-A转化的BL21(DE3)pLysS细胞总蛋白、上清和沉淀中均有相同大小特异条带，但在空载体中没有相应的目的蛋白条带的表达。初步说明可能是目的基因的重组蛋白获得了表达；并且大部分是可溶蛋白。凝胶成像仪扫描分析表明，目的蛋白的表达量约占总蛋白表达量的15.8％。
采用Clon-Tech蛋白纯化Kit将重组蛋白纯化，向纯化出来的蛋白中加入底物油酸和亮胰蛋白酶肽后，在20℃摇床培养6h，用等体积的氯仿、水与甲醇的混合物抽提，混合物中氯仿：甲醇：水＝2：1：2，取氯仿层，加入等体积1％H2SO4-甲醇进行甲基化处理，55℃水浴6h后，加入正已烷回溶。以亚油酸甲酯(Sigma)标准品、空载体转化的大肠杆菌细胞作为对照进行GC分析，如图3所示，只有前者产生保留时间为8.440min的特殊峰(B)，与亚油酸甲酯标准品的保留时间一致，而在其他对照中没有出现相应的峰。脂肪酸甲酯的GC-MS定性分析表明：通过NIST/EPA/NIH数据库的计算机检索，特殊峰为亚油酸甲酯，分子量为249。这些结果表明，pRSET/HO-A所编码的酶将外源式的油酸合成了亚油酸，具有△12脂肪酸脱氢酶活性。
培养条件对pRSET-HO-A/BL21(DE3)pLysS工程菌的蛋白表达量具有很大影响。发明人进行了多次试验，确定比较适宜的培养条件为：IPTG诱导的浓度为0.8～1.2mM，最佳诱导时间为10～15h，诱导温度为18～30℃。并确定IPTG诱导的最适浓度为1mM，最佳诱导时间为12h，诱导的最理想温度为22℃。其中诱导温度对蛋白表达量和可溶性蛋白含量均有较大影响，因为温度较低时有利于蛋白质的正确折叠，增加蛋白质的可溶性，保持酶的活性。
Claims (4)
1.一种花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，其特征在于：把花生Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因全长序列插入到大肠杆菌表达载体pRSETB中，构建融合表达载体pRSET/HO-A，并转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)pLysS中，最后进行IPTG诱导表达。
2.如权利要求1所述的花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，其特征在于：在构建融合表达载体pRSET/HO-A的过程中，先把FAD2基因进行RT-PCR扩增，目的片段连接入克隆载体pMD18，转化大肠杆菌DH5，获得阳性克隆pMD/HO-A，最后将pMD/HO-A与表达载体pRSETB连接。
3.如权利要求1或2所述的花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，其特征在于：在进行IPTG诱导表达的过程中，含有pRSET/HO-A质粒的BL21(DE3)pLysS单菌落在培养基中振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，22℃再继续培养10～15h。
4.如权利要求3所述的花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，其特征在于：在进行IPTG诱导表达的过程中，含有pRSET/HO-A质粒的BL21(DE3)pLysS单菌落在培养基中振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，22℃再继续培养12h。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1385539A (zh) * | 2002-05-24 | 2002-12-18 | 中山大学 | 一种石斑鱼生长激素基因、含有该基因的载体、菌株及其表达产物的生产和应用 |
| CN1724669A (zh) * | 2005-03-17 | 2006-01-25 | 东北师范大学 | 应用基因沉默技术提高大豆和花生种子的油酸含量的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1385539A (zh) * | 2002-05-24 | 2002-12-18 | 中山大学 | 一种石斑鱼生长激素基因、含有该基因的载体、菌株及其表达产物的生产和应用 |
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Non-Patent Citations (4)
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| PIRTLE IL, ET AL,.MOLECULAR CLONING AND FUNCTIONAL EXPRESSIONOF THE GENE FOR A COTTON DELTA-12 FATTY ACIDDESATURASE(FAD2).BIOCHIM BIOPHYS ACTA1522 2.2001,1522(2),122-129. * |
| 李明春，等，.Δ12－脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达.微生物学通报31 4.2004,31(4),43-48. |
| 李明春,等,.Δ12-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达.微生物学通报31 4.2004,31(4),43-48. * |
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