ES2643605T3 - Procedimiento de alto rendimiento para la producción de biobutanol - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de alto rendimiento para la produccion de biobutanol Campo de la invencion

La presente invencion versa sobre un procedimiento mejorado de produccion de alto rendimiento de butanol usando Clostridium acetobutylicum ATCC 10132. La presente invencion in particular documenta una cepa con mayor tolerancia al butanol en condiciones optimizadas. La presente divulgacion tambien versa sobre un metodo rapido y eficaz de estimacion cuantitativa del butanol durante el proceso de fermentacion. La presente divulgacion versa, en particular, sobre un metodo de cromatograffa lfquida de alta eficacia (HPLC) para la estimacion cuantitativa del butanol producida por fermentacion anaerobica llevada a cabo usando Clostridium acetobutylicum ATCC 10132.

Antecedentes de la invencion

El butanol o alcohol butflico (a veces denominado tambien biobutanol cuando es producido biologicamente) es un alcohol primario y una estructura con 4 atomos de carbono y la formula molecular C4H10O. Es usado fundamentalmente como disolvente, como intermediario en la smtesis qmmica y como combustible. En la actualidad hay un gran interes en producir combustibles como el butanol y el etanol usando microorganismos mediante fermentacion que se concentran en los aspectos medioambientales y en la naturaleza renovable de este modo de produccion. El butanol es un combustible superior y tiene mas valor calonfico que el etanol (Qureshi y Blaschek, 2000). El butanol tiene mayor contenido energetico que el etanol (110.000 Btu por galon (30.659 kJ por litro) para el butanol en vez de los 84.000 Btu por galon (23.412 kJ por litro) para el etanol). Es seis veces menos “evaporativo” que el etanol y 13,5 times menos evaporativo que la gasolina, puede ser transportado a traves de oleoductos existentes de combustibles, mientras que el etanol debe ser transportado mediante ferrocarril, barcaza o camion (Jones y Woods, 1986).

El butanol es un producto qmmico industrial importante. Comparado con el etanol, aditivo de combustible actualmente en boga, el butanol es mas miscible con la gasolina y el gasoleo, tiene una menor presion de vapor y es menos miscible con el agua, cualidades que hacen del butanol un aditivo de combustible superior al etanol. Los precios actuales del butanol como producto qmmico son del orden de $3,75 por galon (99 centavos de dolar por litro), con un mercado mundial de 370 millones de galones (1.400 millones de litros) por ano. Se espera que la demanda del mercado aumente drasticamente si puede producirse economicamente butanol ecologico a partir de biomasa de bajo coste. Ademas de su uso como combustible, el butanol puede ser usado como disolvente para una amplia variedad de procesos qmmicos y textiles, en la smtesis organica y como producto qmmico intermedio. Tambien se usa como disolvente de pintura y como disolvente en otras aplicaciones de revestimiento en las que se usa como disolvente latente de evaporacion relativamente lenta en lacas y esmaltes curados al medio ambiente. Encuentra otros usos, tales como un componente de lfquidos hidraulicos y de frenos (Mutschlechner et al., 2000). Tambien se usa como base para perfumes, pero por sf solo tiene un aroma intensamente alcoholico.

Desde la decada de 1950, la mayor parte del butanol en los Estados Unidos es producido comercialmente a partir de combustibles fosiles. El proceso mas comun parte del propano, al que se hace atravesar una reaccion de hidroformilacion para formar butanal, que a continuacion es reducido con hidrogeno hasta obtener butanol. El butanol se produce mediante fermentacion a partir de mafz, hierba, hojas, residuos agncolas y biomasa diversa.

La produccion de butanol y acetona industriales a traves de la fermentacion, usando Clostridium acetobutylicum, se inicio en 1916. Chaim Weizmann, alumno de Louis Pasteur, aislo el microbio que formaba la acetona. Hasta la decada de 1920, la acetona era el producto buscado, pero por cada kilogramo de acetona fermentado, se formaban dos kilogramos de butanol. Una creciente industria de pintura para la automocion dio la vuelta al mercado y ya en 1927 el butanol se volvio lo principal y la acetona se convirtio en el producto secundario.

La produccion de butanol por fermentacion declino desde la decada de 1940 y durante la de 1950, principalmente porque el precio de los productos petroqmmicos cayo por debajo del de los sustratos a base de fecula y azucar, tales como los de mafz y melaza. Los gastos generales del sistema de fermentacion por lotes, que requiere mucha mano de obra, combinados con las bajas producciones, contribuyeron a la situacion. La produccion de acetona y butanol derivados de la fermentacion ceso a finales de la decada de 1950.

La fermentacion de acetona-butanol-etanol (ABE) por Clostridium acetobutylicum es una de las fermentaciones industriales conocidas desde hace mas tiempo. Ocupo el segundo puesto en su escala de produccion, solo por detras de la fermentacion de etanol por levadura, y es uno de los mayores procedimientos biotecnologicos jamas conocidos. Sin embargo, la fermentacion en sf, ha sido muy complicada y difmil de controlar. La fermentacion ABE ha declinado continuamente desde la decada de 1950, y ahora casi todo el butanol se produce mediante rutas petroqmmicas. En una fermentacion ABE tfpica, en primer lugar, el C. acetobutylicum produce los acidos butmco, propionico, lactico y acetico, el pH del cultivo cae y experimenta un cambio metabolico “en mariposa” y se forman butanol, acetona, isopropanol y etanol. En fermentaciones ABE convencionales, la produccion de butanol a partir de glucosa es baja, normalmente de aproximadamente el 15 por ciento y rara vez superando el 25 por ciento.

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La produccion de butanol estuvo limitada por una grave inhibicion causada por el producto. El butanol a una concentracion del 1 por ciento puede inhibir significativamente el desarrollo celular y el proceso de fermentacion. En consecuencia, la concentracion de butanol en las fermentaciones ABE convencionales suele ser menor del 1,3 por ciento. El problema clave asociado con la produccion de butanol es la toxicidad del butanol o su inhibicion del microorganismo fermentador, lo que da como resultado un bajo tftulo de butanol en el caldo de fermentacion (Ezeji et al., 2007). El butanol es sumamente toxico para los organismos biologicos a concentraciones muy bajas del 2% (Jones y Wood, 1986). Esta toxicidad puede deberse a que el butanol se localiza en la membrana plasmatica y altera varios procesos fisiologicos, incluyendo la permeabilidad de la membrana, el transporte de solutos, el mantenimiento de la fuerza motriz de los protones, la conformacion y la actividad de las protemas intrmsecas de la membrana. Se estan haciendo esfuerzos para mejorar el nivel de tolerancia del butanol en diferentes especies de Clostridia con distintos grados de exito (Evan y Wang, 1988). El reciente interes en la produccion de butanol ha llevado a la reevaluacion de la fermentacion de acetona-butanol-etanol (ABE), incluyendo estrategias para reducir o eliminar la toxicidad del butanol para el cultivo.

En los ultimos veintitantos anos, ha habido numerosos intentos de diseno por mejorar la produccion de butanol en fermentacion ABE, incluyendo el reciclado de celulas y la inmovilizacion de celulas para aumentar la densidad de las celulas y la productividad del reactor y usando una fermentacion extractiva para minimizar la inhibicion del producto. A pesar de muchos esfuerzos, los mejores resultados jamas obtenidos para las fermentaciones ABE hasta la fecha siguen siendo de menos del 2 por ciento en concentracion de butanol, 4,46 g/L/h de productividad, y un rendimiento de menos del 25 por ciento a partir de glucosa. Hace tiempo que viene siendo una meta de la industria optimizar el proceso de fermentacion ABE.

Con ello en mente, se desarrollo un procedimiento alternativo usando cultivos inmovilizados continuos de Clostridium tyrobutyricum y Clostridium acetobutyltcum para producir una productividad optima de 4,64 g/L/h y un rendimiento del 42 por ciento. En terminos simples, un microbio maximiza la produccion de hidrogeno y acido butmco, mientras que el otro convierte el acido butmco en butanol. En comparacion con la fermentacion ABE convencional, este proceso elimina la produccion de los acidos aceticos, lactico y propionico, acetona, isopropanol y etanol. El proceso de fermentacion ABE solo produce hidrogeno, acido butmco, butanol y dioxido de carbono, y dobla la produccion de butanol de una fanega de mafz, de 1,3 a 2,5 galones (1,38 a 2,66 litros) por fanega. Las desventajas asociadas con tal proceso son dobles: tener que mantener dos conjuntos de condiciones para los dos cultivos, mantener completa anaerobiosis en el sistema inmovilizado, enfrentarse a los gases producidos durante la fermentacion y su efecto en el mantenimiento de la integridad de la matriz usada para la inmovilizacion.

En las fermentaciones ABE convencionales, la produccion de butanol a partir de glucosa es baja —del 15%-25%— y la concentracion de butanol en la fermentacion suele ser menor del 1,3%. (El butanol a una concentracion del 1% puede inhibir significativamente el desarrollo celular y el proceso de fermentacion). Ha habido numerosos esfuerzos a lo largo de los anos para mejorar la produccion de butanol usando diversas tecnicas para minimizar la inhibicion del producto.

En este respecto, para desarrollar un procedimiento para la produccion y la tolerancia maximas de este importante combustible mediante diseno de procedimientos, estandarizacion de medios y de condiciones de fermentacion, la mejora de cepas es de suma importancia (Agarwal et al., 2005). Esta documentado que factores fisiologicos y nutricionales tales como la concentracion inicial de azucares, fuentes complejas de nitrogeno, tamano del inoculo, concentraciones del ion carbonato, pH y temperatura del medio de cultivo son los factores mas cnticos que afectan tanto al desarrollo celular como a la produccion de butanol (Samuelov et al., 1991; Nghiem et al., 1997; Lee et al., 1999).

La patente estadounidense 4.757.010 y la solicitud de patente europea EP 00111683 proporcionan una cepa mejorada de Clostridium para una mayor tolerancia al butanol. El documento JP03058782 proporciona la cepa de Clostridium pasteurianum CA 101 (FERM P-10817) como mutante del genero de bacteria Clostridium que tiene resistencia analogica al compuesto intermedio fermentado de butanol y la productividad de butanol. La patente estadounidense 4.539.293 demuestra el uso del cocultivo de microorganismos del genero Clostridium, favoreciendo uno de ellos la produccion de acido butmco y soportando el otro la formacion de butanol. La solicitud de patente japonesa JP 63157989 presenta la produccion de butanol cultivando una cepa diferente de Clostridium pasteurianum var. I-53 (FERM P-9074) en un medio lfquido que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrogeno y otras sales inorganicas a 28-33°C en una condicion de pH ligeramente acido en estado anaerobico durante 2-4 dfas.

Sin embargo, los problemas asociados en estas cepas modificadas son que el uso de cepas geneticamente modificadas para la produccion de combustible no puede competir con la forma natural, ya que hay que esterilizar la materia prima para cerciorarse de que no hay competencia para los organismos geneticamente modificados. Ademas, los organismos o diversas cepas geneticamente modificados son costosos de desarrollar y no hallan relevancia en productos de gran volumen.

Se usan diversas tecnicas alternativas in situ/en lmea de eliminacion de butanol, incluyendo sistemas a base de membranas, tales como pervaporacion, extraccion lfquido-lfquido y arrastre por gas.

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La patente estadounidense n° 4.777.135 describe un metodo de produccion de butanol por fermentacion que comprende cultivar en condiciones anaerobias microorganismos productores de butanol en un medio de cultivo que contiene fluorocarbono. Este procedimiento no es viable a escala comercial, dado que el fluorocarbono no es ecologico.

La patente estadounidense 4.605.620 proporciona un procedimiento para obtener butanol usando un medio que contiene un hidrato de carbono y fosfato, en el que los experimentos se llevaron a cabo con un contenido total de fosfato de 1,0-0,4 mmoles. Este procedimiento plantea una restriccion, porque se requiere el medio limitante de fosfato.

La patente estadounidense 4.560.658 proporciona un procedimiento para la produccion de butanol mediante fermentacion de compuestos con contenido de carbono con Clostridium acetobutylicum en el que la fermentacion se realiza en un medio acuoso que contiene una concentracion suficiente de monoxido de carbono disuelto. Sin embargo, el uso de monoxido de carbono hace el procedimiento poco seguro medioambientalmente.

La patente estadounidense 4.520.104 proporciona un procedimiento para la produccion continua de butanol por fermentacion de hidratos de carbono con C. acetobutylicum. Este procedimiento combina una produccion continua de inoculo con una tasa de disolucion elevada y el sometimiento del caldo de fermentacion a un ciclo a traves de material que adsorbe butanol, por lo que se mantiene una poblacion vigorosa de celulas en el reactor de fermentacion para periodos prolongados de tiempo. El proceso esta ideado para eliminar el butanol producido en el caldo para evitar su toxicidad sobre las celulas.

La patente japonesa JP 62278989 proporciona un procedimiento de fermentacion para la produccion de acetona y butanol manteniendo una cepa productora de butanol en estado de reposo, anadiendo una fuente de carbono a las celulas para efectuar la produccion de acetona y butanol en poco tiempo, recuperando y concentrando la cepa productora de butanol, sometiendola a un golpe de calor y anadiendola a un tanque de fermentacion. En el procedimiento se requiere un golpe de calor para activar las esporas de Clostridium, y es muy rutinario.

La solicitud de patente japonesa proporciona un germen celulolftico anaerobico; por ejemplo, se inoculan Clostridium cellobioparum ATCC15832 o Ruminococcus albus ATCC27211, y Clostridium saccharoperbutylacetonicum en un medio de cultivo que contiene un material que contiene celulosa —por ejemplo, madera, desperdicios de papel o pasta papelera— como fuente principal de carbono, y se cultiva a 25-45°C y 4-9 de pH en condiciones anaerobias durante aproximadamente 2-20 dfas para recoger del cultivo resultante el compuesto deseado, que contiene oxfgeno, y que consiste esencialmente en butanol. Este proceso lleva mucho tiempo y requiere aproximadamente 20 dfas para su terminacion; por ende, no es viable a gran escala.

La patente japonesa 63269988 da a conocer una fermentacion de butanol en la que se somete a levadura a una autodigestion en un tanque de fermentacion y a proliferacion antes de la inoculacion de la cepa productora de butanol. El espacio en el tanque de fermentacion se vuelve anaerobio y la temperatura aumenta por la proliferacion de la levadura para llevar a cabo la fermentacion de butanol. Una autodigestion ineficaz llevana a la contaminacion del caldo por la levadura.

El documento US20050233031 proporciona un procedimiento de produccion de butanol que incluye tratar material de origen vegetal para proporcionar un agua madre acuosa que contiene azucares en un proceso de fermentacion para producir un producto de fermentacion. El procedimiento implica varias etapas y, por lo tanto, resulta engorroso y tedioso.

La patente japonesa JP 200535328801 proporciona un metodo de produccion de butanol en el que se prepara una solucion de cultivo usando una formulacion del residuo alimenticio con posos de licor destilado japones y agua, y la fermentacion de butanol se lleva a cabo en la solucion de cultivo. El uso de licor destilado japones esta limitado a los experimentos de produccion llevados a cabo en Japon.

La patente francesa FR2550222 proporciona un procedimiento en dos etapas en el que una primera etapa de siembra con Clostridium acetobutylicum y una segunda etapa de siembra con una levadura que produce etanol, comenzando la segunda etapa cuando el pH del medio de fermentacion de la primera etapa ha alcanzado un valor mmimo. La invencion se aplica en particular a la produccion de butanol, acetona y etanol a partir de jugos de remolacha azucarera y de pataca. El proceso requiere un tratamiento previo, lo que lo hace engorroso.

Aunque hay informes sobre la explotacion de microbios para la produccion de butanol por fermentacion, aun esta por desarrollar un proceso biosintetico economicamente viable para la produccion de butanol (Jesse et al., 2002).

Mustafa et al proporcionaron espectroscopia infrarroja media unida a un analisis de inyecciones secuenciales para la monitorizacion en lmea del proceso de fermentacion de acetona-butanol. Esto implica el uso de instrumentos/tecnicas sumamente sofisticados que no estan disponibles en muchos laboratorios (Mustafa K. et al., Spectroscopy Letters, 38, 677-702 (2005)).

La cromatograffa de gases y sensores de pasarela para la estimacion en lmea del estado de fermentaciones complejas (fermentacion de butanol-acetona) mostraron un sistema de fermentacion que ha sido disenado para

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demostrar el uso de cromatograffa de gases (CG) para la monitorizacion en lmea del butanol-acetona y de otras fermentaciones sacaroltticas complejas (McLaughlin JK, Meyer CL, Papoutsakis ET. (1985) Biotechnology and Bioengineering, Volumen 27, Numero 8, paginas 1246 - 1257). Sin embargo, los parametros incluyen la concentracion de glucosa y la composicion de los gases, asf como varios parametros inobservables (tales como Yatp, exceso de ATP, y NAD reducida por FdH2), que caracterizan el estado de la fermentacion. Por ende, este metodo es muy tedioso, al requerir la monitorizacion de numerosos parametros.

Las patentes estadounidenses 4521516, 4520104, 4560658 y 4649112 dan a conocer metodos de determinacion de butanol por HPLC en los que los componentes eran analizados cromatograficamente por elucion con H2SO4 0,006N a partir de una resina de intercambio cationico en forma de hidrogeno. Los componentes eluidos fueron detectados por medio de un refractometro diferencial, trazados en un registrador y cuantificados usando un integrador electronico. El area bajo la curva que representa la concentracion de cada componente esta documentada como un porcentaje del area total. El procedimiento general seguido fue el dado en “Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography”, Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, pp. 43-46. Las separaciones se efectuaron en una columna HPX-87 de 1 pie (30 centimetros) en forma de hidrogeno, disponible en Bio-Rad Laboratories, Richmond, California. Los hidratos de carbono residuales totales (RTC) en el medio de fermentacion se midieron mediante el metodo de fenol/acido sulfurico que ha sido descrito con detalle por Dubois, et al, “Colorimetric Method Determination of Sugars and Related Substances”, Anal. Chem., 28, 350-356 (1956).

Por ende, estos metodos citados en lo que antecede, en los que generalmente se usa la CG para la estimacion de butanol (Bryant y Blaschek,1988), requieren extraccion o derivatizacion de butanol en hexano u otros disolventes antes de analizar las muestras. Esto hace el procedimiento tedioso y puede haber algunas perdidas durante las etapas de extraccion o derivatizacion. Se ha documentado un par de metodos de HPLC (Ehrlich et al., 1981) para la estimacion de butanol. Pero incluso en estos metodos, el tiempo de elucion es demasiado largo (30-50 min) para detectar el butanol. Por ende, no se puede usar tal metodo para analizar un gran numero de muestras.

Artfculo titulado “Development of a cost-effective glucose-corn steep medium for production of butanol by Clostridium beijerinckii”. Autores: M Parekh., J Formanek y HP Blaschek (vease Journal of lndustrial Microbiology & Biotechnology (1998) 21, 187-191). El artfculo evaluo un medio de agua de remojo de mafz (CSW) (1,6% solidos mas 6% glucosa) para el desarrollo y la produccion de butanol por la forma natural de Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 y por la cepa mutante BA101, hiperproductora de butanol e hiperamilolftica.

Patente estadounidense n° 4.757.010 titulada “Production of Clostridium Acetobutylicum mutants of high Butanol and Acetone productivity, the resultant mutants and the use of these mutants in the joint production of Butanol and Acetone” - Herman et al. Cesionario: Institute Frangaise du Petrole. La publicacion da a conocer el mutante Clostridium acetobutylicum IFP 904 (ATCC 39058) y que puede ser usado para producir una mezcla de butanol y acetona de mayor concentracion.

Artfculo titulado “Comparative investigations of growth and solvent formation in ‘Clostridium

saccharoperbutylacetonicum' and Clostridium acetobutylicum DSM 792” - Autor: H Biebl (vease Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1999) 22, 115-120).

Artfculo titulado “Production of solvents by Clostridium acetobutylicum cultures maintained at neutral pH”. Autor: Robert H. Holt (vease Applied and Environment Microbiology, diciembre de 1984, p. 1166-1170, Vol. 48, n° 6).

Artfculo titulado “Ethanol fermentation of beet molasses by Clostridium thermohydrosulfuricum”. Autor: Sedat Donmez y Filiz Ozgelik (vease Enzyme Microb.Technol, 1992, Vol. 14, mayo).

Artfculo titulado “Enhanced butanol production by Clostridium beijerinckii BA101 grown in semidefined P2 medium containing 6 percent maltodextrin or glucose”. Autor: Joseph Formanek et al (vease Applied and Environmental Microbiology, junio de 1997, pp. 2306-2310, Vol. 63, n° 6). El artfculo evaluo la produccion de butanol a partir del Clostridium beijerinckii BA101.

Objetos de la invencion

Dado que existe la necesidad de un procedimiento que de una mayor produccion de butanol, la presente invencion proporciona una condicion de cultivo ideal para la cepa natural de Clostridium que da como resultado una mayor tolerancia al butanol y, subsiguientemente, en la produccion de butanol.

Dado que existe la necesidad de desarrollar un metodo de analisis de butanol durante la fermentacion, la presente divulgacion proporciona un metodo eficaz y robusto de analisis de butanol mediante HPLC que supera los inconvenientes asociados con los metodos conocidos de analisis de butanol. La presente divulgacion proporciona un metodo de HPLC simple y rentable en el que se puede lograr la estimacion cuantitativa del butanol sin la necesidad de extraccion y en un tiempo de retencion corto. La presente invencion ha mejorado con exito la velocidad del analisis, monitorizando asf eficazmente el proceso de fermentacion.

El objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento mejorado para la produccion de butanol con rendimiento elevado sin ningun cambio en la cepa del microorgamsmo.

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El objeto de la presente invencion es proporcionar condiciones optimas de fermentacion para una mayor produccion de butanol, usando Clostridium acetobutylicum.

El objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento con condiciones optimas de fermentacion que de como resultado mayor tolerancia al butanol por parte del microorganismo.

El objeto de la presente invencion es proporcionar una condicion de cultivo para altos rendimientos de la fermentacion de butanol.

El objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para mayores producciones de butanol en condiciones de fermentacion en una sola tanda.

El objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para la obtencion de biobutanol usando biomasa diversa.

El objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento rentable y escalable industrialmente para la obtencion de butanol.

Compendio de la invencion

La presente invencion versa sobre un procedimiento eficaz para la produccion de butanol con alto rendimiento usando Clostridium acetobutylicum ATCC 10132, sin ningun cambio en la cepa del microoganismo, lo que da como resultado una mayor produccion de butanol. La presente invencion busca en particular proporcionar condiciones optimas de cultivo que resulten en mayor tolerancia al butanol por parte del microorganismo. La presente invencion busca, ademas, proporcionar un procedimiento rentable y escalable industrialmente para la produccion de butanol.

Un problema asociado con la fermentacion ABE por el C. acetobutylicum y el C. beijerinckii es la toxicidad del butanol para el cultivo. Esta toxicidad requiere la eliminacion continua de los productos toxicos durante el proceso para la maxima produccion de los disolventes. Un aspecto novedoso de la presente invencion es la produccion de altos rendimientos de butanol (hasta de 20 g/L) en un proceso en una unica tanda, sin arrastrar el butanol producido. El proceso no implica ninguna etapa de tanda de alimentacion que implicara la etapa adicional de adicion de nutrientes. Ni se requiere ningun arrastre de disolventes para alcanzar esta elevada produccion. A diferencia de muchos procedimientos documentados que emplean el modo continuo de fermentacion, aumentando con ello la probabilidad de contaminacion, el presente procedimiento puede completarse en un modo de lote unico. Una optimizacion cuidadosa del medio y la aclimatacion han dado como resultado una cepa que es capaz de producir y tolerar tales producciones elevadas de butanol en el caldo. Asf, todos estos parametros hacen el procedimiento de la presente invencion mas rentable. Ademas, los inventores tambien han podido demostrar con exito el procedimiento en la escala de 5 L.

La presente invencion proporciona un procedimiento para la produccion de butanol, comprendiendo el procedimiento:

establecer y mantener un cultivo en un fermentador, comprendiendo dicho cultivo el microorganismo solventogenico Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 y un medio nutriente que comprende hidratos de carbono asimilables, 5% de extracto de vacuno como fuente de nitrogeno y 0,5% de Na2CO3 y/o iones de calcio;

mantener la concentracion de hidratos de carbono en el fermentador a un nivel suficiente para mantener el proceso de produccion;

mantener la concentracion de Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 a un nivel suficiente para mantener el proceso de produccion;

en el que el proceso se lleva a cabo sin extraer butanol del fermentador;

en el que las condiciones de fermentacion estan optimizadas a una temperatura entre 33 y 39°C y a un pH en el intervalo de 5,0 a 7,0, para que el proceso de como resultado una produccion de butanol de 20 g/L o de como resultado una concentracion de butanol del 2,5% en el medio de fermentacion.

La presente invencion proporciona un procedimiento con mayor tolerancia al butanol sin la necesidad de modificar la cepa. En un aspecto preferente, la presente invencion proporciona tolerancia hasta una concentracion de butanol del 2,5% en condiciones optimizadas de medio dirigida a un procedimiento para proporcionar la mayor produccion de butanol proporcionada en esta invencion. La razon mas probable de su elevada tolerancia al butanol puede ser que la optimizacion de procesos haya dado como resultado el conjunto final de condiciones ffsico-qmmicas bajo las cuales las limitaciones mencionadas anteriormente se mitigan. Por ejemplo, el potencial redox, la osmolaridad y el flujo de electrones pueden haber sido alterados en las condiciones optimizadas. En las condiciones optimizadas, puede haberse activado o inducido cierto conjunto de enzimas requeridas para la tolerancia al butanol y su produccion. El cultivo puede haberse adaptado en el curso del proceso de optimizacion a un nivel de butanol elevado.

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En un aspecto, la presente invencion proporciona un procedimiento con mayor produccion de butanol. En un aspecto, la presente invencion documenta un aumento de hasta 9 veces en la produccion de butanol en botellas anaerobicas de 500 ml que contienen 300 ml del medio optimizado de azucar anaerobio (AnS) en contraposicion con el medio inicial no optimizado de AT (50 ml).

La presente divulgacion proporciona un procedimiento para la evaluacion del biobutanol usando biomasa diversa. En un aspecto preferente, se usaron semillas de jatrofa y tallos de banano. Tambien se estudio la produccion de biobutanol usando semillas y tallos pretratados en condiciones diferentes, tales como alcalina, acida y la digestion por microondas.

En un aspecto, la presente invencion proporciona un proceso que puede graduarse al alza a gran escala. Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria y estan incluidos para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente divulgacion, las invenciones de la cual pueden entenderse mejor por referencia a uno o mas de estos dibujos en combinacion con la descripcion detallada de realizaciones espedficas presentadas en esta memoria.

La presente divulgacion proporciona un metodo simple, eficaz y reproducible para la estimacion cuantitativa del butanol empleando HPLC. Las condiciones para la HPLC han sido desarrolladas para obtener un tiempo de retencion menor que el de los metodos convencionales. Esto contribuye a reducir el tiempo para la estimacion del butanol y tambien contribuye a monitorizar de manera eficaz el avance de la fermentacion. El metodo de HPLC desarrollado tambien puede ser usado para el analisis rutinario de gran numero de muestras. La presente divulgacion proporciona en particular un metodo HPLC de determinacion del butanol durante su proceso de fermentacion.

La presente divulgacion describe la utilizacion de una columna seleccionada de una serie de columnas de intercambio ionico.

La presente divulgacion describe la utilizacion de un sistema detector que mide el mdice de refraccion.

La presente divulgacion versa sobre la determinacion del butanol durante el proceso de fermentacion mediante un metodo HPLC simple. El metodo es simple porque el analisis no requiere ninguna extraccion de producto y la muestra requerida para la inyeccion es el sobrenadante del medio de cultivo de fermentacion.

El analisis de la muestra implica la deteccion de butanol, que es lineal hasta el 2,5%. El procedimiento puede ser usado para la estimacion tanto cuantitativa como cualitativa del butanol. El metodo se usa, en particular, para la deteccion de butanol en el caldo de fermentacion, que puede ser aplicada para el analisis de un gran numero de muestras de forma rutinaria.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 muestra el efecto de pH diferentes en la produccion de butanol por Clostridium acetobutylicum despues de 84 h de incubacion.

Se observo que, aunque el butanol se produjo en el intervalo de pH de 5,0 a 7,0, el pH optimo para la produccion es 6,5, produciendo 3,2 g/l de butanol en 84 h.

La Fig. 2 muestra el efecto de diferentes temperaturas (°C) en la produccion de butanol por Clostridium acetobutylicum despues de 84 h de incubacion.

Los resultados sobre el efecto de diferentes temperaturas (25, 33, 37, 39 y 45°C) mostraron que se produdan 3,0 g/l de butanol a 37 ± 2°C en 84 h. Sin embargo, a 25 y 55°C, no se observo ninguna produccion de butanol significativa.

La Fig. 3 muestra el efecto de diferentes fuentes de carbono (2%) en la produccion de butanol.

Mientras se estudiaba el efecto de los factores nutricionales, se observo que ninguna de las fuentes de carbono sometidas a ensayo soportaba tanto butanol (3,2 gL-1) como el producido en el control, o sea, en glucosa. Esta fue seguida por el extracto de malta, que soporto 2,4 gL-1 de butanol en 84 h.

La Fig. 4 muestra el efecto de diferentes concentraciones de glucosa en la produccion de butanol.

Se hallo que una concentracion de glucosa del 2,0% p/v soporta una produccion maxima de 3,2 gL-1 de butanol.

La Fig. 5 muestra el efecto de diferentes concentraciones de extracto de malta en la produccion de butanol.

Se vario la concentracion de extracto de malta, la segunda fuente mejor de azucar, en el medio (1,0-10%). Se produjeron 4,82 gL-1 de butanol cuando se anadio un 5% de extracto de malta junto con un 2% de glucosa en el medio de AnS.

La Fig. 6 muestra el efecto de diferentes fuentes de nitrogeno (1,0%) en la produccion de butanol.

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Se hallo que el extracto de vacuno era la mejor fuente de nitrogeno entre diversas fuentes de nitrogeno sometidas a ensayo, dando como resultado la produccion de 5,2gL-1 de butanol.

La Fig. 7 muestra el efecto de diferentes concentraciones de extracto de vacuno en la produccion de butanol.

La optimizacion de la concentracion demostro que un 5,0% p/v de extracto de vacuno es optimo para la produccion de butanol (7,8 gL-1).

La Fig. 8 muestra el efecto de diferentes iones metalicos (0,5%) en la produccion de butanol.

Se logro un aumento significativo en la produccion de butanol (11,1 gL-1) cuando el medio optimizado hasta ese momento fue complementado con Na2CO3 al 0,5%. Esto es seguido por iones de calcio, lo que dio como resultado la produccion de 9,2 gL-1 de butanol. Un ion metalico como Cu no soporto ninguna cantidad de produccion de butanol.

La Fig. 9 muestra el efecto de diferentes concentraciones de carbonato sodico en la produccion de butanol.

Se observo que un 0,5% p/v de Na2CO3 es optimo para la produccion de butanol (11,0 gL-1).

La Fig. 10 muestra el efecto de la densidad de inoculo en la produccion de butanol.

Se observo que se produjeron 14,5 gL-1 de butanol a la densidad de inoculo de 1%. Sin embargo, con el aumento en la densidad de inoculo mas alla del 2%, la produccion de butanol decayo.

La Figura 11 muestra el perfil de fermentacion del butanol en una escala de 5 L.

El perfil de fermentacion en una escala de 5 L indica que la produccion de butanol es mucho mas rapida a una escala mayor, alcanzando la produccion 20 g/L en 48 h y alcanzando un estancamiento posteriormente.

La Figura 12 muestra el efecto del butanol en el desarrollo de C. acetobutylicum en un medio no optimizado de AnS.

La Figura 13 muestra el efecto del butanol en el desarrollo de C. acetobutylicum en un medio optimizado de AnS.

La Figura 14 muestra los resultados de un analisis de transferencia de Western para la deteccion de GroEL.

La Figura 15 muestra un cromatograma HPLC de butanol estandar.

La Figura 16 muestra un cromatograma HPLC del butanol presente en la muestra (caldo de fermentacion).

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones:

El termino “butanol” o “biobutanol”, usado en la presente memoria, se refiere al n-butanol.

La expresion “tolerancia al butanol”, usada en la presente memoria, se refiere a la capacidad de la bacteria de sobrevivir y desarrollarse en presencia de > 1,3% butanol en el medio.

El termino Clostridium acetobutylicum se refiere a la bacteria que tiene la capacidad de producir butanol junto con acetona y etanol en una fermentacion anaerobica.

El termino “produccion”, usado en la presente memoria, se refiere a la cantidad de butanol producida en el caldo de fermentacion en g/L.

El termino “HPLC”, usado en la presente memoria, se refiere a cromatograffa lfquida de alta eficacia.

El termino “impurezas”, usado en la presente memoria, se refiere a subproductos como la acetona, el etanol, etc. producidos durante el proceso.

Metodos para la produccion de butanol: Dado que el pH es uno de los factores importantes que afectan tanto al desarrollo como a la produccion de moleculas asociada al desarrollo, la produccion de butanol fue examinada a diferentes pH. El pH optimo para la produccion de butanol por parte del Clostridium acetobutylicum en la presente invencion fue 6,5. Esto coincide con los hallazgos de Robson y Jones (1982), que documentaron que el C. acetobutylicum P262 presentaba buenos niveles de produccion de disolvente en el intervalo de pH de 5,0-6,5. De modo similar, Bielbl (1999) documento que el Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 presentaba desarrollo y produccion de disolvente mucho mejores al pH de 5,5 que al pH 5,0 o inferior.

La presente invencion ha hallado que la temperatura de 37 ± 2°C es la temperatura optima para la produccion de butanol a partir del Clostridium acetobutylicum ATCC 10132. Esto contrasta con los hallazgos anteriores de McCutchan y Hickey (1954), que documentaron una disminucion (de hasta el 23%) en la produccion de disolvente por Clostridium sp. a 37°C, en contraposicion con los rendimientos bastante constantes de 31% a 30 y 33°C.

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Se estudio el efecto de las fuentes de carbono en la produccion de butanol por el Clostridium acetobutylicum ATCC 10132, y se observo que la glucosa soportaba la mayor produccion de butanol. Esta era seguida por el extracto de malta, la segunda mejor fuente de carbono. Sin embargo, fuentes de carbono como el glicerol y la sacarosa soportaron una cantidad moderada de butanol. Azucares como la ramnosa no fueron utilizadas en absoluto por la cepa. La razon mas probable podna ser que la cepa fuera incapaz de transportar el azucar 2-desoxi glucosa.

El estudio de la concentracion de los azucares revelo que un 2% de glucosa soportaba 3,2 gL"1 de butanol. Cifras similares fueron documentadas por Biebl (1999), que observo una produccion maxima de butanol por el C. acetobutylicum ATCC 824 en un medio que contema un 2,8% de glucosa. Sin embargo, en la mayona de los estudios, se ha descubierto que 6-7% es la concentracion optima de glucosa para la produccion de butanol. En esta direccion, Parekh et al. (1998) documentaron que un 6,0% de glucosa en el medio produda 10,0 g/l de butanol a partir de la cepa C. beijerinkii 8052 despues de 90 h de incubacion.

Posteriormente, cuando se variaron los niveles de extracto de malta en el medio en el intervalo 1,0 - 10% p/v mientras se mantema constante la concentracion de glucosa (al 2%), se produjeron 4,8 gL"1 de butanol a un 5% de extracto de malta. De forma similar, varios expertos han investigado el efecto de la limitacion de nutrientes en el inicio y el mantenimiento de la produccion de disolvente. Por ejemplo, Long et al. (1984) documentaron que en la fermentacion de lotes usando Clostridium acetobutylicum P262, solo se produdan acidos cuando se limitaba la concentracion de las fuentes de carbono.

Al complementar el medio con un 5% de extracto de vacuno, se produjo un maximo de 5,3 gL"1 de n-butanol en contraposicion con el control (1% de peptona), en el que se observaron 4,8 gL"1 de produccion de butanol. La razon mas probable de que el extracto de vacuno sea una buena fuente de nitrogeno es que no solo proporciona nitrogeno, sino tambien vitaminas y otros nutrientes que son esenciales para el desarrollo del microorganismo.

Es sabido que los iones metalicos desempenan un importante papel en el mantenimiento del metabolismo celular y las actividades enzimaticas (Isar et al., 2006). Se logro un aumento significativo en la produccion de butanol cuando el medio optimizado hasta ese momento fue complementado con Na2CO3. La razon podna ser que Na+ es un cofactor para la mayona de las enzimas implicadas en el sistema anaerobio. Strobel et al. (1991) y Lee et al., (2000) documentaron que los iones de sodio son un factor importante para la captacion de nutrientes. Estos iones estan implicados en la formacion de un gradiente de pH transmembrana y la regulacion del pH de intracelular. Entre las diferentes sales de iones de sodio investigadas, se hallo que el carbonato y el bicarbonato eran los radicales mas efectivos para la produccion, resultando en aproximadamente 11,2 gL"1 de butanol.

El cambio en la densidad de inoculo del 1 al 2% no influye significativamente en la produccion de butanol. Sin embargo, el aumento en la densidad del inoculo mas alla del 2% da como resultado un declive en la produccion del disolvente. La razon mas probable podna ser que cuando el tamano del inoculo aumenta mas alla del 2%, hay una limitacion de la nutricion.

La presente invencion proporciona el efecto de diferentes parametros fisiologicos y nutricionales sobre la produccion de butanol por el Clostridium acetobutylicum ATCC 10132. Esta cepa produjo inicialmente 0,2 gL"1 de butanol en 84 h en medio alternativo de tioglicolato.

Sin embargo, cuando se empleo la optimizacion del procedimiento, se produjeron 20,0 gL"1 de butanol en 300 ml del medio optimizado de AnS consistente en glucosa (2%), extracto de vacuno (5%), extracto de malta (5%), extracto de levadura (0,5%), K2HPO4 (0,3%), Na2COa (0,6%), (NH4)2SO4 (0,1%), CaCh^^O (0,02%), MgCh^O (0,02%), Na2S (0,002%), a un pH de 6,5 y 37°C, en condiciones estaticas (con agitacion manual intermitente suave) en 96 h. Curiosamente, tambien se observo que la cepa es tolerante a un 2,5% de butanol en un medio y condiciones optimizados.

La verificacion del proceso en un medio de 300 ml indico con claridad que el procedimiento puede ser aumentado de escala hasta un tamano mayor y que podnan producirse aproximadamente 20 gL"1 de butanol. La razon mas probable de este aumento en la produccion podna ser la disponibilidad de un mayor espacio vado en botellas de mayor tamano, en contraposicion con las botellas menores.

La cepa de Clostridium usada en la presente invencion ha mostrado tolerancia a un 2,5% de butanol. La razon mas probable de esta elevada tolerancia al butanol puede ser que la optimizacion del proceso ha dado como resultado el conjunto final de condiciones f^sico-qu^micas en el que se superan las limitaciones anteriormente mencionadas. Por ejemplo, el potencial redox, la osmolaridad y el flujo de electrones pueden haber sido alterados en las condiciones optimizadas. En las condiciones optimizadas, puede haberse activado o inducido cierto conjunto de enzimas requeridas para la tolerancia al butanol y su produccion. El cultivo puede haberse adaptado en el curso del estudio (proceso de optimizacion). Dado que el nivel real de tolerancia de esta cepa nunca ha sido documentado con anterioridad, tambien puede tratarse de una propiedad intnnseca no aprovechada de la cepa. En varios casos, una cepa de la que no consta que produzca normalmente una biomolecula empieza a crearla en cantidades significativas despues de una optimizacion de procedimientos (Isar et al., 2006).

Se llevaron a cabo estudios adicionales sobre la utilizacion de biomasa diversa para la produccion de butanol usando las condiciones descritas anteriormente. En particular, la biomasa estudiada fue la torta de semillas de

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jatrofa y tallos de banano. Se dieron diversos pretratamientos a la biomasa antes de su uso para la produccion de butanol. Estos pretratamientos ponen los azucares de la biomasa a disposicion de la fermentacion. Los pretratamientos incluyen su sometimiento a degradacion fungica, al tratamiento acido, al tratamiento alcalino o a la digestion por microondas.

La torta de semillas de jatrofa fue incubada con un cultivo fungico de Pluroteous osteratus a 23°C durante un mes y la biomasa fue extrafda con un tampon. Despues de su extraccion, la biomasa fue usada como suplemento a concentraciones diferentes (1, 3, 5 y 10%) en un medio azucarado anaerobio que tema un 0,5% de carbonato calcico. Se obtuvo una produccion de 8,4 g/l de butanol despues de 48 h usando un 3% de la torta de semillas de jatrofa pretratada fungicamente.

Ademas de esto, cuando se anadio un 1% de harina de soja en un medio de AnS complementado con un 0,5% de carbonato calcico y un 4% de extracto de vacuno, se obtuvo una produccion maxima de 10,5 g/L de butanol despues de 96 h.

Tambien se realizaron experimentos en tallos de banano y semillas de jatrofa pretratados con hidroxido sodico. La biomasa tratada con el alcali fue suplementada a diversas concentraciones en un medio de AnS que tema un 0,5% de carbonato calcico. Con una suplementacion del 1%, se obtuvo una produccion de 8,1 g/L butanol en un medio de AnS que contema tallos de banano predigeridos, en contraposicion de 5,0 g/L de butanol con torta de semillas de jatrofa predigerida.

Con suplementacion de biomasa digerida por microondas se obtuvo una produccion de 6,9 g/l de butanol despues de 84 h cuando se anadio un 2% de tallos de banano tratados por microondas a un medio de AnS que tema un 0,5% de carbonato calcico. Con una suplementacion del 1% de torta de semillas de jatrofa digerida por microondas, se obtuvieron 7,0 g/l de butanol despues de 84 h.

La suplementacion con biomasa tratada con acido sulfurico 0,1 N en un medio de AnS que tema un 0,5% de carbonato calcico dio como resultado una produccion de 5,0 g/l de butanol despues de 84 h para un 1% de tallos de banano y una produccion de 4,0 g/l de butanol despues de 84 h para un 1% de torta de semillas de jatrofa.

Cuantificacion por HPLC de la produccion de butanol

La presente divulgacion versa sobre el uso del metodo de HPLC para la estimacion cuantitativa del butanol, que lleva menos tiempo, resulta mas rentable, al tener mayor viabilidad industrial, al ser mucho menor el tiempo de elucion que indica la presencia de n-butanol: solo 7,3 min en comparacion con los 30-50 min de los metodos disponibles en el dominio publico. Los factores que son responsables de reducir el tiempo de ejecucion son la combinacion optima de los disolventes de la fase movil acetonitrilo y 0,5mM H2SO4 (1:9). El caudal tambien ha sido optimizado hasta 1,5 ml/min. El metodo es usado en particular para la deteccion de butanol en el caldo de fermentacion, que puede ser aplicada para el analisis de un gran numero de muestras de manera rutinaria.

La presente divulgacion versa sobre el desarrollo de un metodo rapido y eficaz de cromatograffa lfquida de alta eficacia (HPLC) para la estimacion del butanol producido a traves de la fermentacion anaerobica llevada a cabo usando Clostridium acetobutylicum ATCC 10132. Aqu se usa una columna PRP 300X (Hamilton) para la estimacion de butanol en un sistema HPLC en el que se usan acetonitrilo y 0,5mM H2SO4 (1:9) como fase movil, a un caudal de 1,5 ml/min a 37°C. Como detector se usa el IR.

Segun se ha afirmado mas arriba sobre los informes previos sobre el uso de HPLC, el tiempo de ejecucion para la estimacion de butanol es de hasta 30-50 min, lo que dificulta el analisis de gran numero de muestras. De modo similar, el metodo de CG documentado para la estimacion de butanol requiera la extraccion o derivatizacion de la muestra, lo que puede llevar a una perdida por manipulacion.

Hasta la fecha no ha habido ninguna publicacion sobre los informes del uso de HPLC que muestre un tiempo de ejecucion reducido por debajo de 30 min para la estimacion de butanol. Los inventores han desarrollado un procedimiento que proporciona el tiempo de ejecucion, que es de solo 7,6 min para detectar una muestra y no requiere ningun procedimiento de extraccion. La importancia esta en que lleva muy poco tiempo (7,3 min) detectar eficazmente el butanol presente en el caldo de fermentacion. Por ende, puede analizarse un enorme numero de muestras de manera rutinaria en muy poco tiempo.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferentes de la invencion. Los expertos en la tecnica debenan apreciar que las tecnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan tecnicas que el inventor ha descubierto que funcionan bien en la puesta en practica de la invencion y que, asf, se puede considerar que constituyen modos preferentes para su puesta en practica.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Organismo y condiciones de desarrollo

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Se cultivo Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 en 125 ml de botellas anaerobicas que conteman 50 ml del medio de azucar anaerobio (AnS) con la composicion (gL-1): glucosa (20,0); peptona (10,0); extracto de levadura (5,0); K2HPO4 (3,0); NaCl (1,0); (NH4)2SO4 (1,0); CaCl2'2H2O (0,2); MgCh^O (0,2); y Na2COa (1,0), pH 6,5.

El medio fue esterilizado (15min, a 121°C) en botellas de vidrio selladas con tapones de caucho butflico. El espacio vado se lleno con N2, y se anadio Na2S9H2O (0,02%) para eliminar trazas de ox^geno disuelto (Samuelov et al. 1991; Lee et al., 2000). El medio reducido fue inoculado con un 2% de inoculo de siembra e incubado a 37 ± 1°C durante 96 h con agitacion suave intermitente.

Ejemplo 2: Metodos para la estimacion del butanol

Despues del periodo de incubacion deseado, el cultivo fue retirado de los viales sellados usando jeringas desechables esterilizadas y fue centrifugado a 8000 *g en una centrifugadora Eppendorf (modelo n° 54151) durante 10 min. El sobrenadante fue filtrado a traves de un filtro de 0,45 p. Las muestras (20 pl) fueron analizadas mediante HPLC, (Ehrlich et al., 1981) en una columna PRP 300X (Hamilton) usando acetonitrilo y 0,5mM H2SO4 (9:1) como fase movil, a un caudal de 1,5 ml/min a 37°C. El butanol fue detectado usando un detector del IR.

Ejemplo 3: Procedimiento en la fermentacion en lotes

Diversos medios sometidos a ensayo para la produccion de butanol fueron el medio de azucar anaerobio (AnS) (Isar et al., 2006); el medio clostridial reforzado (rC) (Lin y Blaschek, 1983); el medio de fecula soluble (SSM) (Moreira et al., 1981); medios alternativos de tioglicolato (AT) (Lin y Blaschek, 1983); medios de fecula de patata (PSM) (Fouad et al.,1976). Entre los medios sometidos a ensayo, el medio de AnS fue el mejor, produciendo 3,2 g/l de butanol (Tabla 1). La produccion de butanol fue optimizada en el medio de AnS, en el que se estudiaron los efectos de diferentes parametros fisiologicos y nutricionales.

Tabla 1: Produccion de butanol (g/l) en diferentes medios

Tiempo (h)

Medios

AnS

RC AT SSM PSM

12

0,31 - - - -

24

0,43 - 0,02 - -

36

0,6 0,01 0,03 - -

48

1,2 0,02 0,09 0,01 0,09

60

2,1 0,05 0,1 0,04 0,09

72

2,2 0,10 0,2 0,07 0,10

84

3,2 0,13 0,2 0,09 0,11

96

3,0 0,11 0,1 0,08 0,09

Subsiguientemente, se estudio el efecto del pH (5- 7) y la temperatura (25 - 45°C) en el medio seleccionado para la produccion de butanol. Se observo que el pH optimo para la produccion es 6,5, produciendo 3,2 g/l de butanol en 84 h (Fig. 1). Los resultados sobre el efecto de diferentes temperaturas (25, 33, 37, 39 y 45°C) demostraron que a 37 ± 2°C se produdan 3,0 g/l de butanol en 84 h (Fig. 2).

Se llevo a cabo la optimizacion de los parametros nutricionales, incluyendo la fuente de carbono, la fuente de nitrogeno y los iones metalicos requeridos para una produccion maxima de butanol. Diversas fuentes de carbono empleadas incluyen glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa, extracto de malta y glicerol a una concentracion del 2,0% p/v en el medio. Ninguna de las fuentes de carbono soporto tanta produccion de butanol (3,2 gL-1) como la glucosa en 84 h (Fig. 3). Ademas, 2,0% p/v de glucosa da el rendimiento mas alto, es decir, 3,2 gL-" de butanol (Fig. 4). Aproximadamente, se produjeron 4,82 gL-1 de butanol cuando se anadio un 5% de extracto de malta junto con un 2% de glucosa en el medio de AnS (Fig. 5).

Para la optimizacion de la fuente de nitrogeno, la peptona (1% p/v) del medio fue sustituida por diferentes fuentes de nitrogeno inorganicas (fosfato amonico acido, cloruro amonico, nitrato sodico y urea) y organicas (extracto de levadura, extracto de vacuno, agua madre de remojo de mafz y triptona) a la misma concentracion. Se hallo que el extracto de vacuno era la mejor fuente de nitrogeno, dando como resultado la produccion de 5,2 gL-1 de butanol (Fig.6). La optimizacion de concentracion demostro que un 5,0% p/v de extracto de vacuno es optimo para la produccion de butanol (7,8 gL-1) (Fig. 7).

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Para evaluar el efecto de los iones metalicos, se anadieron al medio, por separado, las sales carbonato/sulfato/cloruro de diferentes iones metalicos (Na+, Mg++, Ca++, Zn++, K+, Mn++) a la concentracion de 0,5%. Se logro un aumento significativo en la produccion de butanol (11,1 gL-1) cuando el medio optimizado hasta ese momento fue complementado con Na2CO3 al 0,5%. Un ion metalico como Cu no soporto ninguna cantidad de produccion de butanol (Fig.8).

Entre las diversas sales de sodio investigadas, incluyendo cloruro, carbonato, sulfato y fosfato, el carbonato fue la mas eficaz para la produccion, dando como resultado 11,2 gL-1 de butanol (Tabla 2). Ademas, tras optimizar la concentracion de Na2CO3, se observo que un 0,5% p/v es optimo para la produccion de butanol (11,0 gL-1) (Fig. 9).

Tabla 2: Efecto de diferentes sales del ion metalico seleccionado en la produccion de butanol

Sales minerales

Butanol, gL-1

Na2CO3

11,2

Na2SO4

9,1

NaCl

9,7

NaNO3

10,2

Na2HPO4

9,0

NaHCO3

11,1

Se investigo el efecto del tamano del inoculo en la produccion de butanol. El medio optimizado fue inoculado con diferentes tamanos de inoculo (1-10%). Se hallo que el inoculo al 1% produda el maximo de butanol (14,5 gL-1) (Fig. 10). Sin embargo, con el aumento en la densidad de inoculo mas alla del 2%, la produccion de butanol decayo.

Ejemplo 4: Determinacion de la tolerancia al butanol

Se evaluo la tolerancia de la cepa usada en la presente investigacion al nivel de butanol. La cepa fue inoculada en 50 ml del medio optimizado de AnS que contema diferentes concentraciones de butanol (0,5%, 1,0%, 1,3% 1,5%, 1,8%, 2,0%, 2,5%). Se incubaron botellas durante 96 h a 37°C en condiciones estaticas con agitacion manual intermitente suave. Se hallo que la cepa toleraba hasta un 2,5% de butanol en el medio.

Ejemplo 5: Verificacion del procedimiento en un medio de 300 ml

La produccion de butanol en el medio optimizado fue validada en botellas anaerobicas de 500 ml que conteman 300 ml del medio optimizado. Se anadio asepticamente en las botellas un 1% del inoculo con la ayuda de una jeringa y se incubo a 37°C durante 96 h. Se produjo un maximo de 20 gL-1 de butanol.

Ejemplo 6: Graduacion al alza de la produccion del biobutanol a escala de 5 L

Se graduo al alza la produccion de butanol en un medio optimizado usando Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 hasta un nivel de 5 L en un fermentador de 10L (Bioflow IV, NBS, EE. UU.). El medio optimizado de AnS fue esterilizado in situ a 110°C durante 15 min. El medio fue inoculado con un 2% del inoculo de siembra (OD660nm = 0,6) y la fermentacion se llevo a cabo a 37±1°C durante 84 h. La velocidad de la helice fue ajustada inicialmente a 100 rpm e inicialmente se lavo durante 30 min con N2 esteril comprimido para crear un entorno anaerobio y posteriormente se asperjo con el intermitentemente en el fermentador a una cadencia de 0,5 vvm. Se tomaron muestras periodicamente en un intervalo de 12 h y fueron analizadas en busca de su produccion de butanol usando HPLC y Cg. Se monitorizaron y regularon continuamente parametros de fermentacion tales como temperatura, suministro de N2 y frecuencia de agitacion.

La produccion de butanol comenzo a las 24 h en el fermentador y en 48 h se produjo un maximo de 20,3 gL-1 de butanol. Posteriormente, no hubo ningun aumento significativo en la produccion de butanol (Figura 11 y Tabla 3), indicando una reduccion significativa en el tiempo de produccion de butanol a mayor escala.

Tabla 3: Perfil de fermentacion en la escala de 5 L

Periodo de incubacion (h)

Produccion de butanol (gL-1)

12

-

24

5,9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Periodo de incubacion (h)

Produccion de butanol (gL-1)

36

14,6

48

20,3

60

21,2

72

19,4

84

19,1

Ejemplo comparativo 7: Estudio de biomasa diversa para la produccion de biobutanol

En la Tabla 4 se enumeran los resultados obtenidos usando biomasa diversa.

1. Pretratamiento de semillas de jatrofa con un cultivo fungico de Pluroteous osteratus

Se suspendieron semillas de jatrofa finamente molidas (100 g, tamano aproximado de tamiz, 50 mm) en 50 ml de medio salino basal (0,5% glucosa, 0,1% KH2PO4, 0,05% MgSO4-7H2O, 0,05% KCl, 0,05% extracto de levadura). A esto se anadieron 50 ml de la solucion madre I y otros tantos de la solucion madre II (solucion madre I: 0,02% FeSO4-7H2O y solucion madre II: 0,016% M^CHsCOO^^O, 0,004% Z^NOsM^O, 0,1% Ca(NO3)2'4H2O, 0,006% CuSO4'5H2O). Toda la mezcla fue sometida a autoclave a 121°C durante 30 min y fue inoculada con 5-6 bloques pequenos (1 cm * 1 cm) de agar con extracto de malta (2%) de Pluroteous osteratus de dos semanas de edad (cultivado a 25°C). El matraz fue incubado a 23°C durante 30 dfas. Despues de la incubacion, se anadieron 500ml de 50mM de tampon de citrato (pH 5,0) y el contenido se mezclo completamente por agitacion en el agitador giratorio (200 rpm) durante 2 h. El contenido del matraz fue estrujado usando tela de muselina y la biomasa solida fue usada como suplemento a diferentes concentraciones (1, 3, 5 y 10%) en 50 ml de medio azucarado anaerobico (AnS) que tema un 0,5% de carbonato calcico contenidos en 125 ml de las botellas anaerobicas selladas. Se obtuvo una produccion maxima de 8,4 g/l de butanol despues de 48 h usando un 3% de la torta de semillas de jatrofa pretratada fungicamente.

Ademas de esto, cuando se anadio un 1% de harina de soja en el medio de AnS complementado con un 0,5% de carbonato calcico y un 4% de extracto de vacuno, se obtuvo una produccion maxima de 10,5 g/L de butanol despues de 96 h.

2. Metodo de digestion de tallos de banano y semillas de jatrofa pretratados con hidroxido sodico

(a) El tallo de banano fue cortado en trozos pequenos y 100 g de estos trozos de tallo de banano fueron mantenidos en 500 ml de NaOH 0,5M durante 24 h con agitacion suave intermitente. Despues de 24 h, estos trozos fueron lavados con agua corriente de grifo para eliminar el alcali y fueron anadidos al medio de AnS que tema 0,5% de CaCO3 a diferentes concentraciones para estudiar su efecto sobre la produccion de butanol. La mayor produccion de butanol de 8,1 g/L se logro en un medio de AnS que contema un 1% de los tallos de banano predigeridos.

(b) Las semillas de jatrofa fueron finamente molidas y fueron puestas en 500 ml de NaOH 0,5M durante 24 ha temperatura ambiente. Despues de 24 h, estos trozos fueron lavados con agua corriente de grifo para eliminar el hidroxido sodico. Las diferentes concentraciones de la torta de semillas de jatrofa pretratadas fueron anadidas al medio de AnS (que contema 0,5% de carbonato calcico). La mayor produccion de butanol de 5,0 g/L se logro cuando se anadio un 1% de las semillas de jatrofa predigeridas a un medio de AnS que tema un 0,5% de carbonato calcico.

3. Digestion de microondas para tallos de banano y semillas de jatrofa

(a) El tallo de banano fue cortado en trozos pequenos y parcialmente digerido en un horno microondas durante 10 min. El tallo de banano digerido fue molido en una batidora y el banano finamente molido fue digerido de nuevo en un microondas durante 5 min. El azucar fue analizado mediante el metodo DNS. Se obtuvo una produccion maxima de 6,9 g/l de butanol despues de 84 h cuando se anadio un 2% de tallos de banano tratados por microondas a un medio de AnS que tema un 0,5% de carbonato calcico.

(b) Las semillas de jatrofa finamente molidas (20g) fueron anadidas a 500 ml de agua destilada y cocidas durante 10 min en un horno microondas. Las semillas de jatrofa tratadas por microondas se enfriaron y volvieron a ser tratadas durante 10 min en el horno microondas. El azucar fue analizado mediante el metodo DNS. Los resultados mostraron que se obtuvo un maximo de 7,0 g/l de butanol despues de 84 h usando un 1% de la torta de semillas de jatrofa tratada en microondas en un medio de AnS complementado con un 0,5% de carbonato calcico y 0,5 ml de glicerol.

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4. Tallos de banano and semillas de jatrofa pretratados con acido sulfurico 0,1N

(a) El tallo de banano fue cortado en trozos pequenos. Aproximadamente, 100 g de estos trozos de tallo de banano fueron mantenidos en 500 ml de acido sulfurico 0,1N durante 24 h. A continuacion, estos trozos fueron lavados con agua corriente de grifo y secados completamente. Las diferentes concentraciones de estos tallos de banano pretratados fueron anadidas a medios de AnS que conteman un 0,5% de carbonato calcico. Los resultados mostraron que se obtema una produccion maxima de 5,0 g/l de butanol despues de 84 h cuando se anadio un 1% de tallos de banano tratados con acido a un medio de AnS que contema un 0,5% de carbonato calcico.

(b) La torta de semillas de jatrofa fue molida. Aproximadamente 50 g de las semillas de jatrofa molidas fueron tratadas con 500 ml de acido sulfurico 0,1 N durante 24 horas. Despues de 24 h, estos trozos fueron lavados con agua corriente de grifo para eliminar el acido sulfurico. La torta de semillas de jatrofa predigerida fue secada completamente. Esta torta de semillas de jatrofa pretratada fue anadida a medios de AnS (que conteman un 0,5% de carbonato calcico) a diferentes concentraciones. Se obtuvo una produccion de 4,0 g/l de butanol despues de 84 h usando un 1% de torta de semillas de jatrofa pretratada con acido.

Tabla 4. Produccion de butanol usando biomasa

Biomasa

Pretratamiento Butanol, g/L

Torta de semillas de jatrofa

Tratamiento fungico con Pluroteous osteratus 8,4

NaOH 0,5 M

5,0

Acido sulfurico 0,1 N

4,0

Digestion por microondas

7,0

Tallos de banano

NaOH 0,5 M 8,1

Acido sulfurico 0,1 N 5,0

Digestion por microondas 6,9

Ejemplo 8: Tolerancia del Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 a los disolventes

Se estudio la tolerancia del Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 al butanol sometiendo las bacterias a diversas concentraciones de butanol en el medio de cultivo que oscilaban entre el 1,5% y el 3,5%. Se comprobo la tolerancia tanto en el medio no optimizado de AnS como en el medio optimizado de AnS. Las botellas fueron inoculadas con Clostridium acetobutylicum ATCC 10132. Despues de la inoculacion, el medio fue incubado a 37°C durante 144 h y la OD a 600 nm fue monitorizada a un intervalo regular de 12 h. Los resultados indican claramente que la forma natural del Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 puede tolerar hasta un 3,0% de butanol en condiciones no optimizadas (Fig. 12) y 3,5% de butanol en condiciones optimizadas (Fig. 13).

Ejemplo 9: Mecanismo de la tolerancia a los disolventes en el Clostridium acetobutylicum ATCC 10132

Se evaluo el mecanismo de tolerancia a los disolventes en el Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 buscando la sobreexpresion de la protema de choque termico GroEL. La cepa Clostridium acetobutylicum ATCC 10132, tolerante al butanol, fue cultivada en un vial anaerobico sellado de 125 ml que contema 50 ml de un medio azucarado anaerobico (AnS) con un 2,3% de butanol, mientras que la capa no adaptada de Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 fue cultivada en un medio de AnS carente de butanol. Las botellas fueron incubadas durante 24 h a 37°C en condiciones estaticas.

Se busco en las celulas, mediante transferencia de Western, la sobreexpresion de GroEL. Despues del periodo de incubacion deseado, se retiro 1,0 ml del cultivo de cada vial con la ayuda de una jeringa esterilizada desechable y se centrifugo a 10.000 rpm a 4°C durante 20 min. El granulo fue recogido y distribuido en 100 pl de tampon de Tris 0,1 M (pH 8,0). El granulo fue sometido a ultrasonidos y centrifugado durante 1 min a 8500 rpm a 4°C. Se recogio el sobrenadante como extracto en bruto. Para la electroforesis de protemas, se eluyeron extractos en bruto de la cepa tolerante al butanol y de la cepa no tolerante sobre gel de dodecilsulfato sodico-poliacrilamida (SDS-PAGE). En el extracto se normalizo la concentracion de protemas del extracto.

Analisis de transferencia de Western

Despues de la electroforesis, las protemas fueron transferidas a membranas Immun-Blot de difluoruro de polivinilideno de 0,2 pm (Bio-Rad). Las membranas fueron bloqueadas con un 5% de leche desnatada en suero fisiologico con tampon de Tris mas Tween 20 (TBST) durante 12-16 h antes de la hibridacion.

La membrana bloqueada fue incubada durante 1 h con anticuerpo anti GroEL producido en conejo (Sigma), a disoluciones de 1:10.000. Despues de la incubacion, la membrana fue lavada tres veces con tampon de TBST durante 5 min cada vez. Como anticuerpo secundario se usaron inmunoglobulinas monoclonales anticonejo - fosfatasa alcalina, anticuerpo producido en raton a una disolucion de 1:10.000 (Sigma). La membrana fue incubada 5 con el anticuerpo secundario durante 1 h. Todas las disoluciones de anticuerpos fueron preparadas en tampon de TBST. La membrana fue lavada con tampon de TBST tres veces durante 5 min cada vez. La membrana se revelo con 5 ml de solucion BCIP-NBT (Sigma). La cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 tolerante a los disolventes muestra la presencia de una banda prominente de GroEL (Fig. 14, lmea 2), mientras que, en la cepa no adaptada, la banda es apenas visible (Fig. 14, lmea 1).

10 Ejemplo 10: Purificacion de butanol mediante destilacion fraccionaria

Para la purificacion de butanol a partir del caldo de fermentacion, el caldo fue centrifugado para la separacion de las celulas. El sobrenadante fue sometido a destilacion fraccionaria. Se recogio la fraccion de destilado obtenida a temperatura de vapor de 96°C y las fracciones fueron analizadas mediante CG en busca de su contenido de butanol en un cromatografo de gas Agilent equipado con una columna capilar DB Wax 624 de 30 m * 0,53 mm (J & W

15 Scientific, EE. UU.) y un detector de ionizacion a la llama. Se uso N2 como gas de arrastre. La relacion de separacion fue fijada en 10:1. La temperatura del detector fue de 300°C. Se inyecto un microlitro de la muestra (temperatura del inyector, 250°C) en el sistema para su analisis. La recuperacion mediante destilacion fraccionaria fue del 47%, con una pureza del 91% (Tabla 5).

Tabla 5. Recuperacion de butanol

Muestra

Volumen Cono de butanol (g/L) Butanol total % Recuperacion

Caldo inicial

200 ml 15,0 g/L 3,0 g

Fraccion

2,4 ml 612 g/L 1,4 g 47

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Ejemplo comparativo 11: Parametros generales para la determinacion basada en HPLC

(a) Evaluacion de diferentes columnas, fases moviles y tiempos de retencion

Se probaron tres columnas y fases moviles diferentes para estimar el butanol en la HPLC (monitor Shimadzu RID-10A, bomba LC-10AT, horno de columna LTO-10AS). Estas incluyen:

(i) Columna

- Rezex ROA, 300 mm * 7,8 m (Phenomenex, EE. UU.)

Detector

- fndice de refraccion

Temperatura horno

del - 37°C

Fase movil

- Agua MilliQ

Caudal

- 0,6 ml/minuto

Tiempo de retencion

- 42,0 min

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(ii) Columna

- Aminex HPX -87H (Biorad)

Detector

- fndice de refraccion

Temperatura del horno

- 37°C

Fase movil

- 0,5 mM H2SO4

Caudal

- 0,6 ml/minuto

Tiempo de retencion

- 32,0 min

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(iii) Columna

- Hamilton PRP-X 300 (Hamilton)

Detector

- fndice de refraccion

Temperatura horno

del - 37°C

Fase movil

- Acetonitrilo: 0,5 mM H2SO4 (1:9)

Caudal

- 1,5 ml/minuto

Tiempo retencion

de - 7,3 min

En las dos primeras columnas —es decir, las columnas Rezex Organic y Aminex HPX—, el tiempo de retencion para la estimacion del butanol fue de 42 y 32 min, respectivamente. Sin embargo, en la columna Hamilton PRP300X, el butanol podfa ser eluido en solo 7,3 min.

(b) Evaluacion del metodo en diferentes momentos de muestreo de la fermentacion para seguir la velocidad de la reaccion

Se recogieron muestras en diferentes periodos de incubacion hasta las 96 h y fueron analizadas para hallar su concentracion de butanol usando una columna PRP 300X. La concentracion de butanol aumenta gradualmente hasta que alcanza un maximo a las 84 h. Posteriormente, la concentracion de butanol permanece casi constante.

Ejemplo comparativo 12: Condiciones estandarizadas de analisis

La columna usada es Hamilton PRP 300X.

La fase movil es acetonitrilo:0,5 mM H2SO4(1:9).

El dispositivo de deteccion implica el mdice de refraccion (IR) a un caudal de 1,5 ml/min a 37°C.

Preparacion de la muestra:

Las muestras fueron sacadas de los viales sellados usando jeringas esterilizadas desechables. A continuacion, estas muestras fueron centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante fue filtrado a traves de un filtro de 0,45 p antes de su analisis.

El procedimiento de muestreo del medio de cultivo de la fermentacion implica la recogida del caldo de las botellas anaerobicas selladas, usando jeringas esterilizadas desechables, despues del periodo de incubacion deseado. A continuacion, el caldo es centrifugado a 8000*g en una centrifugadora Eppendorf durante 10 min. Acto seguido, el sobrenadante es sacado y filtrado a traves de un filtro de 0,45 p y se inyectan 20 pl des esta muestra filtrada del sobrenadante en la columna PRP 300X (Hamilton).

El analisis: La muestra (20 pl) fue inyectada en la columna usando una jeringa Hamilton. Se registro que el tiempo de retencion del butanol fue 7,3 min. La concentracion del butanol fue calculada eluyendo el butanol estandar (Sigma) en el intervalo de 0,5-50 g/L, como resulta evidente por las Figuras 15 y 16. Los cromatogramas mostrados en estas figuras indican claramente que el n-butanol estandar se eluye en un tiempo de retencion of 7,3 min (Fig. 15). La muestra tambien presento un pico a los 7,3 min que indicaba la presencia de n-butanol (Fig. 16).

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Referencias

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Claims (9)

1. 5

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   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la produccion de butanol, comprendiendo el procedimiento:

   establecer y mantener un cultivo en un fermentador, comprendiendo dicho cultivo el microorganismo solventogenico Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 y un medio nutriente que comprende hidratos de carbono asimilables, 5% de extracto de vacuno como fuente de nitrogeno y 0,5% de Na2CO3 y/o iones de calcio;

   mantener la concentracion de hidratos de carbono en el fermentador a un nivel suficiente para mantener el proceso de produccion;

   mantener la concentracion de Clostridium acetobutylicum ATCC 10132 a un nivel suficiente para mantener el proceso de produccion;

   en el que el proceso se lleva a cabo sin extraer butanol del fermentador;

   en el que las condiciones de fermentacion estan optimizadas a una temperatura entre 33 y 39°C y a un pH en el intervalo de 5,0 a 7,0, para que el proceso de como resultado una produccion de butanol de 20 g/L o de como resultado una concentracion de butanol del 2,5% en el medio de fermentacion.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que el hidrato de carbono asimilable es glucosa.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 2 en el que la concentracion de glucosa en el medio nutriente es el 2%.
4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que el hidrato de carbono asimilable es extracto de malta.
5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 4 en el que la concentracion de extracto de malta en el medio nutriente esta entre el 1% y el 10%.
6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que el hidrato de carbono asimilable es glucosa y extracto de malta.
7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 6 en el que la concentracion de glucosa en el medio nutriente es el 2% y la concentracion de extracto de malta en el medio nutriente es del 5%.
8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la fermentacion se lleva a cabo a una temperatura de 37°C.
9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que los microorganismos se encuentran en una densidad de inoculo del 1-2%.